KR20030043937A - 혈관분포된 조직 이식편 - Google Patents

Abstract

본 발명은 챔버 내에 내포되어 있으며 공여자에 이식된 혈관경을 이용하는 혈관분포된 조직을 생성하는 방법에 관한 것이다. 또한, 이식을 위해 적합한 혈관분포된 조직 이식편에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 혈관분포된 조직 이식편을 이용하여 조직 결손을 수복하는 방법에 관한 것이다.

Description

혈관분포된 조직 이식편{VASCULARISED TISSUE GRAFT}

상동성 출발 물질을 이용하는 조직 공학은 생체 조직(living tissue)의 새로 생성된 신체 부분의 복위 결여(replacing missing) 또는 비-기능성에 대한 예측을 제공한다. 조직 공학은 통상의 재구성 수술이 행해진 공여 부위의 통증 및 조직 손실을 최소화하거나, 공여 부위가 없는 특정 조직을 재생성하는 잠재성을 가지는 한편, 이종성 이식에서 필요한 장기간의 면역 억제를 미연에 방지한다.

조직 공학은 조직 배양 기술, 생체-적합성 물질의 생성 기술 및 혈관형성 조작 기술을 결합하여, 손상된 조직 또는 선천적으로 없는 조직을 대체하는 신규의 혈관분포된 조직을 생성시킨다.

조직 공학에서 직면한 주요 도전 과제 중의 하나는 적당한 크기 및 형태의 분화된 조직을 생성시키는 것이다. 기능성 혈관 구조 없이 생성된 조직은 산소 확산의 제한에 의하여 그 크기가 엄격히 제한된다; 그 조직이 너무 큰 경우에는 숙주가 신규의 혈관 공급을 생성하기 위한 시간을 갖기 전에 조직이 괴사될 것이다. 그래서, 기능성 혈관 구조를 포함하는 신생 조직을 생성하는 것에는 많은 이점이 있다. 또한, 신생 조직이 신체의 결손 부위로부터 멀리 떨어진 한 부위에 생성되거나, 면역 억제된 운반체 동물(carrier animal) 상의 한 부위에 생성되거나, 또는 체외 순환이 있는 생체외의 한 부위에 생성될 필요가 있을 수 있기 때문에, 그 신생 조직을 위한 혈액 공급은 그것이 재구성 부위에 완전한 조직을 제공할 수 있도록 규정되어야 한다.

피부 플랩(skin flap), 피부의 생체 복합체 및 그 하부 지방의 생성법은 재구성 수술에서 결손 조직을 재구성하는데 사용하는 통상의 기술이다. 상기 피부 플랩은 그 혈액 공급을 지속시켜 이식 후 생존 가능성을 유지시켜야 하므로, 상기 피부 플랩의 기관은 해부학적으로 인식되는 혈관 공급원이 있는 곳으로 제한된다. 이러한 제한을 극복하기 위하여, 혈관 단편을 소정 부위에 이식하고, 그 결과로서 생기는 혈관형성을 이용하여 소정 크기 및 조성의 피부 플랩에 혈관을 형성시킴에 의하여, 피부 플랩을 "예비-조작"할 수 있다. 이어서, 정밀수술에 의해 상기 혈관분포된 피부 플랩을 당해 영역으로 이동시킬 수 있다. 그러나, 이러한 기술은 공여 조직의 이용 가능성 및 공여 부위에 초래되는 변형(disfigurement)에 의하여 제한된다.

이러한 기술에 대한 개선에 있어서, 에롤(Erol) 및 스피라(Spira)(1980)는 피부 이식편 밑에 합류된 동정맥(AV) 루프(loop)를 형성시켜, 혈관분포된 피부 "플랩"을 생성킬 수 있다는 것을 입증하였다.

그러나, AV 루프를 이용한 혈관분포된 피부의 생성이 입증되었지만, 이식에 적당한 다른 혈관 혈성된 조직의 생성은 알려지지 않은 채로 남아있다. 예를 들어,혈관분포된 지방 조직이 종종 재구성 과정에서 요구된다; 그러나, 공여자의 성숙한 지방 조직은 너무 무르고, 즉시 기능성 혈액 공급에 재연결되지 않으면 빠르게 괴사될 것이다. 또한, 종래의 자가 이식 기술을 이용하면 "피터에게 빼앗아서 폴에게 주는 것"이 되어, 공여 부위에 변형을 초래하게 된다. 한정된 혈관 구조를 갖는 신생 조직을 형성시키는 능력은 이러한 주요 단점을 극복시킬 것이다.

코우리(Khouri) 등(1993) 및 다나카(Tanaka) 등(1996)은, 동정맥 루프를 신체에서 운반하여 콜라겐 기질의 판 사이에 끼우고, 플라스틱 챔버 내에서 주위 조직으로부터 분리하는 경우에, 상기 동정맥 루프가 본질적으로 신규의 혈관분포된 조직을 생성시킬 수 있음을 입증하였다. 코우리 등에 의해 기술된 모델에 있어서, 혈소판-유도 성장 인자의 재조합 BB-호모다이머(BB-PDGF)의 첨가에 따르는 신생 조직의 생성은, 보충이 있는 경우에도, 15일에 용적이 최고로 되고 30일까지 함몰되는 등 조직이 불안정하다. 유사하게, 챔버에 β-섬유아세포 성장 인자(β-FGF 또는 FGF-2)를 보충하는 다나카 모델에 있어서의 조직 성장은, 용적 증가가 계속되어 2주에 최고로 되나, 4주 후에 미보충 대조군 챔버 수준으로 되돌아간다. 이러한 AV 루프 모델은 조직 공학 분야에 일반적으로 공지되어 있는 것은 아니다.

성숙한 조직은 줄기세포(stem cell)를 포함하지 않는다는 고전적인 견해는 최근 수년간 상당히 변화되었다. 이전에 널리 비-자기(non-self) 신생으로 여겨졌던 다수의 성숙 조직은 이제 줄기세포 군집을 포함하고 있는 것으로 고려된다. 이러한 줄기세포들은 환경에 응답하여 그 표현형을 변화시킬 수 있으며, 자기-보충 줄기세포 군집을 제공할 수 있다(Prockop, 1997). 미세 환경 신호는 줄기세포의 작용을 결정하는데 있어서, 예를 들어, 줄기세포 분열 및 분화의 개시 및/또는 줄기세포 정지 상태의 유지에 있어서 매우 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 상기 미세 환경 신호 및 그러한 과정의 배후에 있는 메카니즘은 이해하기 어렵다. 그러나, 줄기세포의 보급, 자극, 증식 및 분화가 조직 공학의 요점임은 분명하다. 줄기세포의 작용에 대해서는 시험관내 연구가 널리 행해졌다. 다만, 소수의 생체내 연구에서는 성숙한 기관의 협막 아래에 또는 전식적으로 주사한 경우의 줄기세포의 작용을 조사하였다. 이러한 연구들은 조직 공학에 있어서 줄기세포를 사용하는 지식을 전개시키는데 많은 제한을 가지고 있었다. 특히, 줄기세포를 성숙한 기관에 주사하는 경우에, 그들은 확립된 미세 환경과 상호 작용하여 그 숙주 기관으로부터 제한된 신생 혈관 구조를 유도하여야만 했다; 그들을 전신적으로 주사하는 경우에, 그들은 넓게 분산된다. 줄기세포가 기관을 생성하도록 하기 위하여, 신생 조직의 생성을 조절하고 도움을 제공하기 위한, 확장 가능한 혈관 공급이 요구될 것이라는 점이 예상된다. 또한, 줄기세포 확장, 발달 및 분화로 나아가는 데 있어서의 보조를 위하여, 불활성 지지체 및/또는 세포외 기질을 포함하는 확장 가능한 미세 환경이 요구될 것이 예상된다. 이제, 본 발명자들은 이러한 요구를 만족시키고 줄기세포 연구를 매우 유망하게 해주는 모델을 개발하였다. 조직 공학에 대한 그 적용은 당해 기술 분야에 상당한 진전을 제공하는 것이다.

본 명세서에서는 다수의 선행 기술 공개 문헌을 참고 인용하지만, 이들 참고 문헌 중 임의의 것이 호주 또는 기타 어느 나라에서 본 기술 분야의 통상의 일반적인 지식의 일부를 구성하는 것으로 인정되는 것은 아니라는 점은 명백히 이해될 것이다.

이제, 본 발명자들은 혈관분포된 이식편 조직을 생성하기 위한 시스템을 개발하였는데, 이 시스템은 이식 및 재구성 수술에 있어서 유용하며, 또한 유용한 모델 시스템을 제공한다.

본 발명은 조직 공학(tissue engineering) 및 이식 분야에 관한 것이다. 특히, 혈관분포된 조직(vascularised tissue)의 생성에 관한 것이다.

도 1은 정밀수술에 의하여 대퇴부 동맥 및 정맥을 유사한 직경의 정맥 이식편에 문합시켜 루프(단락)를 형성하는 방법을 도시한 것이다. 도시한 바와 같이, 상기 AV 루프를 플라스틱 챔버(이것은 폴리카르보네가트 또는 폴리-L-락트산 등으로 제조한 것임) 내에 배치하고, 리드를 덮고, 그 챔버에 세포 또는 성장 인자를 첨가하거나 첨가하지 않으면서 세포외 기질을 임의로 충진시킨다. 외부 구멍을 통한 지지 봉합에 의하여 상기 챔버를 주위 조직에 관계되는 위치에 고정시킨다.

도 2는 챔버의 리드를 반구 형태로 하고, 그 챔버의 가장자리를 좀 더 원형으로 하여 손상 파손을 최소화한다는 것을 제외하고는 도 1에 도시한 것과 유사한 배열 구조를 도시한 것이다.

도 3은 경(pedicle) 모델에 사용되는 얇은 벽 챔버의 예를 도시한 것이다. 이 경우에 있어서, 동맥 및 정맥은 그 말초 부위를 결찰시키고, 서로 근접하게 배치한다. 상기 동맥 및 정맥 사이의 극미세 연결을 수행하고, 도 1 및 도 2에 도시한 바와 유사한 방법으로 AV 루프를 형성시킨다.

도 4는 도 3에 도시한 것과 유사한 모델 챔버를 나타내나, 그 챔버의 어느 말단에 혈관용 유출구가 있다는 점이 다르다. 이것은, 세포외 기질로 둘러싸인 일부 변형체에 있어서, 분할되지 않고 절개된 길이의 혈관으로서 나란히 배치된 혈관이 신생 조직을 형성할 수 있도록 한다.

도 5는 삽입 7일 후 AV 루프-함유 챔버의 내부 양태를 도시한 것이다. 형광현미경을 이용하여 x 160 배율로 관찰한, 챔버 표면을 가로질러 고르게 분포하는 표지된 섬유아세포를 나타낸다. (실시예 2를 참조하라).

도 6은 수컷 래빗에 재구성한 "흉부"를 도시하는 것이다. 이 때, 혈관분포되고 조직 조작된 지방 및 당해 래빗의 원격 부위(서혜부)에서 형성된 결합 조직 플랩을 이용하여 상기 흉부를 구성하였다. (실시예 10을 참조하라).

발명의 요약

첫 번째 실시 양태에 있어서, 본 발명은 치료가 필요한 수용자 동물에게 이식하기에 적당한 공여자 혈관분포된 조직을 생성시키는 방법으로서,

(a) 공여 피검자 내의 혈관경(血管莖; vascular pedicle)에 기능적인 순환을 생성시키는 단계;

(b) 조립 챔버 내에 상기 혈관경을 부분적으로 또는 완전히 넣는 단계;

(c) 분리된 세포 또는 조직 단편으로 상기 챔버를 씨딩하는 단계;

(d) 그러한 해부학적 구성물이 생성될 수 있는 부위에서 공여자 환자내로 상기 혈관경을 함유하는 챔버를 이식하는 단계; 및

(e) 혈관분포된 신생 조직을 성장시키기에 충분한 기간 동안 상기 챔버를 상기 이식 부위 내에 유지시키는 단계

를 포함하는 방법을 제공한다.

하나의 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 (a) 단계 후에 상기 혈관경을 첨가된 세포외 기질 및/또는 기계적 지지체로 둘러싸는 단계를 포함한다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 방법은 (b) 단계 후에 상기 챔버에 성장 인자, 약물, 항체, 억제제 또는 기타 화학 물질을 첨가하는 단계를 포함한다.

(e) 단계에서, 상기 챔버를 이식 부위에 4주 이상 동안 유지시키는 것이 바람직하고, 6주 이상 동안 유지시키는 것이 더욱 바람직하다.

상기 혈관분포된 조직은 생체내 또는 시험관 내에서 성장시키거나, 또는 숙주의 계내에서 성장시킬 수 있다.

상기 챔버를 공여자의 피부 밑에 이식하는 것이 더욱 바람직하다. 다만, 피하 삽입으로 제한되는 것은 아니다. 조직/기관 성장 중에 상기 챔버의 외부화가 이론적으로는 가능하지만, 감염 위험성이 높기 때문에, 그것은 좀처럼 대안으로 이용되지 않는다.

본 명세서에서 사용한 용어 "공여 피검자"는 동물, 구체적으로 포유동물, 가장 구체적으로 인간을 의미하는 것인데, 여기에서, 공여자 혈관분포된 조직이 형성된다. 본 명세서에서 사용한 용어 "수용자 동물"은 동물, 구체적으로 포유동물, 가장 구체적으로 인간을 의미하는 것인데, 이는 공여자 혈관분포된 조직 이식편을 수용하게 된다. 신규 맥관계의 형성에 있어서, 모든 항온 동물에서의 혈관형성은 본질적으로 동일한 생리학적 및 병리학적 과정과 관련되며, 본 명세서에 공개된 방법은 모든 항온 동물에게 직접적으로 적용할 수 있는 것이라는 점을 당업자들은 이해할 수 있을 것이다. 상기 공여자는 포유동물인 것이 바람직하며, 인간 또는 인간 이외의 동물일 수 있다. 바람직한 포유동물로는 설치류, 고양이과 동물, 개과 동물, 유제 포유동물, 예컨대, 말, 소, 양 및 염소, 돼지 및 영장류 등이 있다. 특히 바람직한 실시 태양에 있어서, 공여자 및 수용자는 인간이다.

당업자는 "혈관경"이 그 구성물 부위로 혈액을 유입하는 동맥 및 혈액을 유출시키는 정맥을 포함하는 혈관 또는 혈관 대체물의 인공적 또는 천연 발생적 배열이라는 것을 이해할 것이다. 상기 혈관경은 동정맥 (AV) 루프 또는 단락(shunt)을 포함하는 것이 바람직하다. AV 루프 또는 단락에 있어서, 동맥은, 혈류를 방해하지 않도록 정맥에 직접 결합되거나, 유사한 직경의 이식편을 통하여 연결된다(예를 들어, 도 1에 도시된 도면 참조). 하나의 대안적인 배열에 있어서, 동맥과 정맥은 모두 결찰되고, 혈류는 양자 사이의 극미세 연결부를 경유한다(예를 들어, 도 3에 도시된 도면 참조). 다른 대안에 있어서, 동맥 및 정맥은, 혈관이 반쯤 폐쇄된 챔버의 한 쪽 단부로 유입되고 반대쪽 단부로 유출되는 "유통(flow through)" 배치내에 존재한다(예를 들어, 도 4에 도시된 도면 참조).

본 명세서에서 사용한 용어 "기능성 순환"은 하기 성질들 중 하나 이상을 갖는 순환을 기술하는 것임을 당업자들은 이해할 것이다: 그 순환을 구성하는 도관(vessel)은 개방되어 있으며; 상기 도관은 그것을 통하여 흐르는 혈액 또는 혈액-대체물을 유지할 수 있다; 상기 도관은 영양분 및/또는 산소를 주변 조직에 공급할 수 있다; 그리고, 상기 도관은 분아(budding)에 의하여 신생 혈관을 형성할 수 있다.

임의로, 상기 챔버에 추가의 세포외 기질을 공급할 수도 있는데, 예를 들어, 계내 세포 재구성된 기저막 표본이 침착된 기질, 예컨대, 매트리겔(Matrigel; 등록 상표) 또는 라미닌(마우스 기원), 암겔(Amgel; 등록 상표), 휴매트릭스(Humatrix; 등록 상표) 또는 라미닌(인간 기원 모두)(기질 금속단백분해효소 억제제가 있거나없음), 폴리락트산-폴리글리콜산 변형체(PLGA), 피브린 또는 혈장 접착제(plasma glue)(자가 유래성 또는 이종성)(섬유소용해 억제제가 있거나 없음), 또는 천연 콜라겐(자가 유래성 또는 이종성)(콜라겐분해효소 억제제가 있거나 없음) 등을 공급할 수 있다.

바람직한 실시 태양에 있어서, 폴리락트산-폴리글리콜산 스폰지, 덱손 (Dexon; 등록 상표) 스폰지 또는 시 스폰지(sea sponge) 등의 세포외 기질을 상기 챔버에 첨가한다. 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, PLGA 스폰지를 1종 이상의 다른 기질-형성 성분(예, 피브린, 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐, 저분자량 히알루로난 및 비트로넥틴)으로 피복한 기질 배합물을 이용할 수 있다. 근육과 같은 조직 또는 간과 같은 기관의 동결 건조 단편을 성장 인자 및 기질의 공급원으로 이용할 수 있다. 상기 조직 또는 기관의 단편은 공여자와 동일한 종으로부터 얻는 것이 바람직하고, 공여 개체에서 얻는 것이 가장 바람직하다.

본 발명의 특히 바람직한 실시 태양에 있어서, 상기 공여자는 수용자 동물과 동일한 개체이다. 즉, 이식편이 자가 유래성인 것이다. 대안적으로, 상기 공여자는 면역약화 동물, 예를 들어, 무흉선 마우스 또는 돼지일 수 있고, 상기 수용자는 상이한 개체일 수 있다. 즉, 이식편이 이종성인 것이다. 이들 과정의 다른 조합으로는 자가 유래성 또는 면역약화 혈관, 세포, 조직 단편 또는 성장 인자 등을 원래의 공여자 또는 상이한 수용자 개체에게 이식하는 방법이 있을 수 있다. 상기 이식편의 "성숙"이 이종 이식편에 면역보호를 부여하는지 여부는 통상의 기술을 이용하여 시험할 수 있는 또 다른 변형예이다.

상기 챔버에 사용하는 조직 또는 세포는 순환 외인성 성장 인자로부터 줄기세포를 끌어들이는 "유도(homing)" 인자로 구성된 군으로부터 선택되는 추가의 성장 인자로 보충할 수 있다. 여기에서, 상기 외인성 성장 인자의 예로는 α-섬유아세포 성장 인자(αFGF 또는 αFGF-1), β-섬유아세포 성장 인자(βFGF-1 또는 βFGF-2), 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF-A,B,C,D 또는 E), 앤지오포이에틴-1 및 앤지오포이에틴-2, 인슐린류 성장 인자(IGF-1), 골형성 단백질(BMP-2 및 BMP-7), 전환 성장 인자-α 및 전환 성장 인자-β(TGF-α, TGF-β), 표피 성장 인자(EGF), 결합 조직 성장 인자(CTGF), 줄기세포 성장 인자(HGF), 인간 성장 호르몬(HGH), 각질세포 성장 인자(KGF), 종양 괴사 인자-α(TNF-α), 백혈병 억제 인자(LIF), 신경 성장 인자(NGF), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 기타 인자, 예컨대, 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX), 인슐린, 인도메타신, 덱사메타손, 히알루로난 헥사사카라이드, PPAR-γ리간드 트로글리타존, 산화 질소, 프로스타글란딘 E1, 트랜스페린, 셀레늄, 부갑상선 호르몬(PTH), 부갑상선 호르몬 관련 펩티드(PTHrP) 등이 있는데, 이들 중 다수의 것은 혈관형성 또는 맥관형성을 촉진시킨다. 또한, 화학 매개체의 억제제 또는 상기 성장 인자들 중 일부에 대한 항체, 작용제 또는 길항제를 사용하여, 형성되는 조직의 유형 및 그 형성 속도에 영향을 줄 수 있다. 당업자들은 어떠한 성장 인자(들), 항-성장 인자 항체 또는 억제제, 또는 그들의 조합이 어느 주어진 상황에 가장 적당한 것인지 용이하게 시험할 수 있다.

상기 챔버는 자가 세포 또는 이종 세포와 함께 사용할 수 있다. 상기 자가세포 또는 이종 세포의 예로는 골격근 표현형의 형성을 촉진하기 위하여 Myo-D로 형질감염된 근원세포(myoblast), 적당한 분화 인자를 갖는 줄기세포, 얼굴 및 목 재구성용의 얇은 피부 구성물을 생성하기 위하여 씨딩된 각질세포 등이 있다. 임의로, 상기 챔버는 근원세포, 섬유아세포, 예비-지방 세포 및 지방 세포, 심근원세포, 각질 세포, 내피 세포, 평활근 세포, 연골 세포, 혈관주위 세포, 골수-유래 간질 전구세포(bone marrow-derived stromal precursor cell), 배아 줄기세포, 중배엽(mesenchymal) 줄기세포, 조혈 줄기세포, 말초 신경계 및 중추 신경계의 쉬반 세포(Schwann cell) 및 기타 세포, 후각 세포, 간 세포 및 간의 기타 세포, 신장의 사구체 간질세포 및 기타 세포, 췌도 β-세포 및 도관 세포, 갑상선 세포 및 기타 내분비 기관의 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 동계 이식 또는 자가 유래성 세포를 포함할 수도 있다.

대안적으로, 상기 챔버는 추가로 골격 또는 심근, 이자, 간, 부고환 및 기타 피하 지방, 신경(말초, 혈관-관련 등), 신장, 장, 난소, 자궁, 고환, 후각 조직 또는 내분비 기관에서 유래한 샘 조직의 자가 유래성 또는 동계 이식편 부분과 함께 사용할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 용어 "조직의 조각"은, 동물에게서 직접 취하거나 조직 배양에서의 세포 조작의 결과로서 생성되거나 또는 이 둘의 조합에 의한 세포외 기질과 같은 추가의 세포외 물질을 갖거나 갖지 않는 임의의 세포 집합체를 포함하는 의미이다. 다른 변형예에 있어서, 그러한 조직 단편은 허혈, 세포-고갈 또는 괴사에 의해 생존 줄기세포 및 기타 조직 발달에 영향을 줄 수 있는 세포에게 신호를 제공할 수 있다.

세포에 제공되는 보충의 성질에 따라, 혈관분포된 조직이 분화될 수 있다. 특히 바람직한 실시 태양에 있어서, 적당한 세포외 기질 및 성장 인자 보충물과 함께 줄기세포를 상기 챔버에 공급하여, 혈관분포되고 분화된 조직 또는 기관을 생성시킨다.

적당한 다능성 줄기세포는:

a) 혈액;

b) 골수;

c) 중배엽 줄기세포를 비롯한 특정 기관 또는 조직;

d) 형질감염 또는 분화될 수 있는 배양된 세포; 또는

e) 태반 줄기세포 은행

에서 유래한 것일 수 있다.

지금까지, 본 발명자들은 골수, 허혈성 골격근 및 피하 지방 조직 등의 공급원을 사용하여 왔다. 다능성 줄기세포의 기타 잠재적 공급원으로는 혈액, 특히 태아 또는 신생아 개체에게서 얻어진 혈액 및 성인에게서 얻어진 혈액, 및 태반이 있다. 골수 또는 대혈 은행(cord blood bank)과 같은 다수의 줄기세포 은행이 이미 설립되어 있다. 인간 배아는 줄기세포의 잠재적인 임상적 공급원이다. 다만, 일부 국가에서는 현재 법률상 및 도덕상의 문제로 인하여 그들의 사용을 금지하고 있다.

생성되는 분화된 세포의 유형은 그 줄기세포의 기원, 국소 환경, 조직-특이적 성장 또는 분화 인자의 존재 및 기타 인자에 따라 달라진다. 예를 들어, 예상 외로, 본 발명자들은 AV 루프와 함께 상기 챔버에 넣은 허혈성 골격근이 4 내지 6주 후에 주로 지방 조직으로 분화되는 것을 관찰하였다. 어느 메카니즘에 의한 제한을 의도하는 것은 아니지만, 본 발명자들은, 이 경우에, 근육내 중배엽 줄기세포가 산성 허혈성 대사 산물의 자극과 함께 상기 분화에 잠재적인 책임이 있는 것으로 생각한다. 줄기세포를 사용하는 주된 이점은, AV 루프 및 상기 챔버를 씨딩하기 위한 커다란 콜로니를 생성시키는 데 비교적 소수의 세포만을 필요로 하는 그들의 큰 증식능이다.

AV 루프와 같은 혈관경은 정맥 이식편(이는 또한 정맥에 결합됨)에 결합되는 동맥을 포함하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 상기 AV 루프는 정맥에 직접 결합된 동맥을 포함한다. 또는, 상기 AV 루프는 정맥 이식편, 동맥 이식편 및 정맥에 연속적으로 결합된 동맥을 포함한다. 정밀수술에 의한 혈관 문합이 기술적으로 어렵거나 불가능한 경우에 유용한 또 다른 변형예에 있어서, 상기 챔버와 나란히 배치된 동맥 및 정맥(예, 대퇴부 정맥)의 결찰된 스텀프를 포함하는 경(莖; pedicle)을 혈관 공급기에 사용할 수 있다. 본 발명의 또 다른 바람직한 실시 태양에 있어서, AV 루프 도관은 동일한 가장자리로부터 상기 챔버의 안쪽 및 바깥쪽으로 흐른다. 또 다른 변형예에 있어서, 동맥 및 정맥은, 챔버의 한 측면으로 흘러들어오고 대향하는 다른 측면으로 흘러나가는 대신에, 단락으로 분할되거나 형성되지 않는다(예를 들어, 도 4를 참조하라). 매우 작은 혈관에 적당한 세 번째 변형예에 있어서, 동맥 및 정맥은 분할되어 상기 챔버와 나란히 배치되며, 상기 혈관 모두는 동일한 가장자리로부터 들어온다; 이는 도 3에 도시되어 있다.

AV 루프의 이식편 부분은 숙주로부터 또는 별도의 공여자로부터 유도할 수있다. 냉동 저장 또는 미리 조립된 도관을 사용할 수도 있다.

본 발명의 한 바람직한 실시 태양에 있어서, 추가의 단계는 신경 스텀프의 혼입에 의하여 상기 챔버 내의 조직이 신경지배될 수 있도록하는 것을 포함한다. 예를 들어, 골격근은 그 유지 및 성숙을 위하여 신경에 근접할 것이 요구된다; 그렇지 않으면, 그것은 위축될 것이다.

상기 혈관경을 포함하는 챔버는 구획된 내부 치수를 갖는 것이 바람직하다. 내부 치수, 용적 및 형태를 변화시켜, 생성되는 신생 조직의 용적 및 형태에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어:

a) 더욱 얇은 벽을 제공함으로써 상기 챔버의 외부 크기는 변경시키지 않으면서 상기 챔버의 내용적을 증가시킬 수 있다;

b) 상기 챔버의 형태를 표적 기관 또는 신체 일부(예, 귀, 코, 흉부, 이자, 간, 신장, 손가락 또는 기타 관절)의 형태와 유사하게 구성할 수 있다;

c) 상기 챔버 벽의 투과성 정도를 변화시킬 수 있다; 예를 들어, 상기 챔버에 반투막 성분을 포함시켜, 그 챔버 내로 들어오거나 나가는 분자를 선택적으로 관류(perfusion)하거나, 또는 상기 챔버 벽에 다수의 천공을 배치하여, 대사 산물 및 대사 부산물, 성장 인자, 및 상기 챔버 내부 및 외부 간의 세포 생존, 성장 및 분화에 영향을 주는 기타 인자의 흐름을 증가시킬 수 있다. 상기 천공의 크기, 형태 및 개수는 공여자 혈관분포된 조직의 크기 및 이식 부위와의 직접 접촉으로부터 분리된 챔버의 함유물을 유지하기 위한 필요에 따라 선택할 수 있다.

대안적으로,

d) 반투과성 성분을 챔버 내에 배치시켜, 면역 반응에서 "공급자(feeder)" 세포를 분리할 수 있다.

마지막 예에 있어서, 섬유아세포 또는 기타 세포들의 군집을 형질감염시킨 후, 상기 챔버 내에서 형질감염된 유전자 생성물의 공급원으로서 사용할 수 있다. 이러한 구성물은 숙주의 면역계와 접촉하고 있지 않은 반투성 포켓 내에 배치한다. 약물 전달을 이용하여 형질감염된 유전자를 온(on) 또는 오프(off)시킬 수 있다. 이들 세포는, 그들이 적당한 영양분을 공급받는 한, 확산에 의하여 살아남을 것이나, 종국적으로는 사멸할 것이다.

상기 챔버 벽 표면의 화학적 성질을 개질시켜, 조직과 챔버 벽 사이의 상호작용을 개질시키거나, 분화를 위한 자극을 제공하거나, 또는 구배(gradient)를 형성하는 화학 약품 또는 생물학적 약제의 느린 방출을 매개하는 겔(예, 알지네이트)을 포함시키거나, 그러한 겔로 피복시킬 수 있다.

상기 챔버 내의 내부 지지체의 정도는 다양할 수 있다. 예를 들어:

a) 지지체가 없는 경우;

b) 신생 조직의 성장을 유도, 촉진 또는 억제하거나, 신생 조직을 배제하거나, 신생 조직 내로 혼입되는 고체 지지체의 경우;

c) 재흡착성 물질을 주성분으로하는 일시적 지지체의 경우;

d) 세포 및 혈관 내부 성장을 지지하는 다공성 지지 물질로서, 예를 들어, 발포(blown) PTFE 물질, 다양한 조성 및 다공성의 PLGA 스폰지 등과 같은 스폰지-형 물질과 같이, 신생 조직이 생성될 수 있는 골격을 제공하는 다공성 지지 물질의경우;

e) 탈석회화, 과립화된 골 또는 하이드록시아파타이트와 같이 조직 분화를 유도하는 물질로부터 형성된 지지체의 경우

등이 있을 수 있다.

상기 챔버의 외부 표면은 그 챔버를 신체의 소정 영역에 부착 및/또는 고정시킬 수 있는 수단을 포함하는 것이 바람직하다.

두 번째 실시 양태에 있어서, 본 발명은 혈관분포된 조직 이식편을 제공한다. 즉, 상기 챔버의 함유물은 성숙한 혈관 공급이 있는 분화된 조직 또는 기관을 포함한다.

상기 이식편은 주로 지방 조직, 연골, 골, 골격근, 심근, 성긴 결합 조직, 인대, 건, 신장, 간, 신경 조직, 장, 내분비 및 샘 조직으로 구성된 군으로부터 선택되는 조직을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 이식편은 주로 혈관분포된 지방 조직, 골격근, 연골 또는 골 조직, 또는 췌도 및/또는 도관 세포, 신장 세포 또는 간 세포를 포함하는 조직을 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

세 번째 실시 양태에 있어서, 본 발명은 조직 결손의 수복이 필요한 환자에게 본 발명에 따른 조직 챔버를 이식하는 단계를 포함하는 조직 결손의 수복 방법으로서,

a) 본 발명의 방법에 따라 조직 또는 "기관" 이식편을 형성시키는 단계;

b) 성숙되기에 충분한 시간 동안, 즉, 소정의 크기, 혈관분포 정도 및 분화 정도를 달성하기에 충분한 시간 동안, 상기 이식편을 유지시키는 단계;

c) 수용자의 소정 부위에 상기 이식편을 전달하는 단계; 및

d) 정밀수술에 의하여 상기 이식편의 혈관을 국소 동맥 및 정맥에 문합시키는 단계

를 포함하는 조직 결손의 수복 방법을 제공한다.

본 명세서에 있어서, 용어 "조직 결손(tissue deficit)"은 수용자 조직의 정상적 용적, 구조 또는 기능에 부족이 있는 것을 포함하는 의미이다. 그러한 조직은 표면 조직, 예컨대, 피부 및/또는 하부 지방, 근육, 연골, 골 또는 기타 신체의 구조 또는 지지 요소, 또는 기관의 일부 또는 전부로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 미용 목적으로 정상적인 조직을 확대하는 것, 예를 들어, 흉부 확대술도 본 발명에 의해 제공될 수 있다. 당업자들은, 그러한 조직 결손이 외상, 수술 또는 기타 치료 처리의 결과이거나, 선천적인 것일 수 있음을 용이하게 이해할 것이다.

네 번째 실시 양태에 있어서, 본 발명은 유전자 산물을 피검자에게 제공하는 방법으로서,

a) 본 발명에 따라 조직 챔버를 구성하여, 그러한 치료가 필요한 환자에게서 혈관분포된 조직을 생성시키는 단계;

b) 혈관분포된 조직이 있는 상기 챔버를 제거하여, 시험관내에서 챔버 어셈블리를 배양하는 단계;

c) 소정 유전자로 상기 챔버 내의 조직 세포를 형질전환시키는 단계; 및

d) 챔버 또는 그 챔버를 제외한 함유물을 상기 환자에게 이식하는 단계

를 포함하는 방법을 제공한다.

조직-생성 세포의 유전 공학적 형질전환의 시점은 환경에 적당하게 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 세포들은 상기 챔버 구성물의 구성 시, 항온 처리 중, 또는 이식 직전에 형질전환시킬 수 있다.

유전자 산물의 공급은 몇몇 형태를 취할 수 있다. 한 예로, Myo-D 유전자를 사용한 근원세포의 형질감염을 통하여 정상적인 골격근의 표현형을 갖는 조직을 생성시키는 것이 있다. 그 다음, 상기와 같이 형질감염된 세포를 소정 챔버, 기질 및 AV 루프 내로 씨딩하여 혈관분포된 골격근을 생성시킨다. 이것은 근육 퇴행 위축 및 기타 유전학적으로 유전된 근육 질병의 치료를 위한 이식을 포함할 수 있다. 두 번째 예로, "건강한" 표현형으로 췌도 세포를 형질감염하고, 그것을 챔버 내로 씨딩하는 것이 있다. 이러한 접근법은 당뇨병 환자의 치료에 유용한 것으로 입증될 수 있다. 세 번째 예로, PDGF, bFGF 또는 VEGF와 같은 혈관형성-촉진 유전자 또는 성장 인자를 사용하여 세포들을 형질감염시킨 후, 그것을 AV 루프 및 선택된 기질과 함께 챔버 내로 씨딩하는 것이 있다. 이러한 성장 인자의 연속 생산은 신생 조직/기관의 발생 속도 및 신생 조직/기관 내의 신생 혈관형성 속도를 향상시키도록 디자인된다.

다섯 번째 실시 양태에 있어서, 본 발명은 본 발명의 혈관경을 포함하는 조직 챔버, 및 임의로, 신장 투석 여과기 및 체외 순환 장치에 작동가능하게 연결된 세포외 기질을 포함하는, 혈관분포된 조직을 위한 모델 시스템을 제공한다. 상기 신장 투석 여과기 및 체외 순환 장치는 임의의 적당한 통상적인 유형의 것일 수 있다. 상기 챔버 내의 조직을 형성하는 세포들이 이종성 유전자를 발현시키도록 임의로 형질감염시킬 수 있다. 이러한 모델 시스템은, 시험관내 또는 생체내에서, 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 조직의 거동을 연구하고, 그러한 줄기세포 또는 전구세포를 포함하는 조직을 배양, 보급 및 성장시키는데 사용할 수 있다. 성장 인자, 분화 인자 및 화학 인자의 첨가를 통하여 상기 챔버의 환경을 변경시킬 수 있기 때문에, 이러한 방법에 의하여 매우 다양한 조직 및 기관을 생성시킬 수 있다.

동정맥 루프 또는 적당한 혈관경을 형성시킬 수 있는 신체의 해부학적 부위 어느 곳에 규정된 조성의 자가 혈관분포된 조직을 생성시킬 수 있는 능력은 다른 많은 용도를 갖는다. 국소 부위에 있어서, 상기 챔버 중의 조직을, 예를 들어,

a) 유전자 형질감염,

b) 국소 약물 또는 기타 "인자"의 투여, 또는

c) 순환 줄기세포 유도 부위의 생성

에 의하여 조작할 수 있다.

또한, 상기 챔버의 조직 및 삼출물을 용이하게 수거하여 조직 성장 및 발달 진행 경과를 모니터할 수 있다. 전술한 모두는, 본 발명을 기타의 것들과 구별시키는, 신생 혈관형성되고 분화된 조직 또는 유기관(organoid)을 성장시키고 이식할 수 있는 능력이 있다.

본 명세서에 있어서, 용어 ".. 을 포함하는(comprising)"은 "...을 비롯한 ..., 단, 이에 한정되는 것은 아니다(including but not limited to)"를 의미하는 것이고, 용어 "포함한다(comprises)"는 그에 상응하는 의미라는 것은 명백히 이해될 것이다.

발명의 상세한 설명

이제, 하기 비제한적 실시예 및 도면을 참고하여 본 발명을 상세히 설명할 것이다.

실험 과정

조직 챔버의 제조

주문 제작한 폴리카르보네가트 챔버를 제조하였다. 그것은 상단과 하단을 구비하며, 두 개의 절반을 함께 밀봉하는 경우, 내용적은 0.45 내지 0.50 ml이다. 상기 챔버의 일반적 구조를 도 1에 도시한다.

래트에 사용하기 위한 기본 챔버는 폴리카르보네가트로 제조한다. 한 변형예에 있어서, 상기 챔버는 폴리락트산 또는 PLGA로 제조한다. 상기 챔버는 외부 직경이 14 mm이고, 높이가 4 mm인 원통형이며, 한 측면에 톱니 모양 절단부가 있어서 혈관 유입 및 유출용 개구가 형성되어 있다. 다른 변형예는 챔버의 대향면 상에 절단 개구를 형성하여, 혈관이 한 쪽 면으로 유입되고, 다른 쪽 면으로 유출될 수 있도록 구성한 것이다. 상기 챔버는 기저부 및 제거 가능한 리드를 구비한다. 상기기저부는 구멍을 보유하고 있어, 상기 챔버가 피하 조직에 고정될 수 있도록 한다. 상기 내용적은 대략 0.45 내지 0.50 ml이다. 심지어 식품 저장에 이용하는 표준 플라스틱 필름만큼 얇은 것일 수 있는 얇은 벽을 이용하여, 상기 기본 챔버의 외용적은 동일하게 유지하면서 그 내용적만을 변화시킬 수 있다. 대안적인 디자인은 도 2에 도시한 바와 같이 그 가장자리를 좀 더 둥글게 처리한 "반구형"의 것이다. 다른 변형예로는 도 3에 도시한 바와 같은 연장되고 납작한 여송연 형태의 것이 있다. 이것은 서혜부내 피하 공간 내에 용이하게 맞춰지는 형태이다. 특정 이식편에 있어서, 챔버의 형태를 특정 신체 부위(예, 인간의 손가락 관절 또는 엄지 손가락, 인간의 귀, 인간의 코, 인간의 흉부 등)의 형태 또는 윤곽과 유사하게 디자인할 수 있다.

상기 챔버의 크기는 숙주의 크기에 맞춰서 크거나 작게할 수 있다. 그래서, 마우스에 사용하는 챔버의 내용적은 대략 0.1 내지 0.2 ml이고, 래빗에 사용하는 챔버의 내용적은 대략 10 내지 12 ml일 수 있으나, 인간에 사용하는 챔버의 내용적은 대략 최대 100 내지 200 ml일 수 있다.

상기 챔버는 임의로 밀봉시킬 수 있다. 표준적인 방법에 있어서, 개구는 주위 조직과의 제한된 접촉 및 혈액 공급부와의 완전 연속된 접촉을 허용한다. 밀봉된 변형예에 있어서, 상기 개구를 조작하여, 혈관의 손상 없이, 단지 들어오는 동맥 및 나가는 정맥을 위한 충분한 공간을 허용할 수 있다. 피브린 접착제(fibrin glue) 등을 사용하여 상기 도관 문(vessel port)을 밀봉시킴으로써 발생 이식편이 주위 조직과 접촉하는 것을 막을 수 있다.

상기 폴리카르보네가트 챔버의 표면을 그 원래의 소수성 상태로 남겨놓을 수 있고, 또는 폴리-L-라이신의 얇은 필름으로 폴리카르보네가트를 예비 처리하거나 폴리락트산을 사용하여 상대적으로 좀 더 친수성이되도록 할 수도 있다. 하나의 유용한 배열 구조에 있어서, 상기 챔버의 표면에 다수의 천공을 포함시킴으로써 주위 조직에 있는 성장 인자와의 접촉을 증대시킬 수 있다. 상기 천공의 크기 및 모양을 재단하여 소정 인자의 통과를 최적화하면서 세포의 통과를 최소화하거나 막을 수 있다.

상기 챔버를 유리 또는 파이렉스로 제조하는 경우에, 실리콘으로 피복할 수 있다.

상기 챔버의 디자인은 수용 부위에 이상적으로 편안하게 들어맞아야 하며, 상처 손상을 피하기에 충분히 작은 크기이고 둥글려진 형태이어야 한다.

상기 챔버의 내부 함량은 조절된 속도로 약물, 성장 인자, 항체, 억제제 또는 기타 화학 물질을 송달하기 위한 삼투 펌프[예, 알젯(Alzet; 등록 상표) 삼투 미니 펌프]를 수용하기에 충분히 크다. 약물/인자 송달의 한 대안적 방법에 있어서, 챔버의 내부(예, AV 루프의 중앙)에 위치하는 삼투 펌프에서 유도되는 플라스틱 관을 구비하는 챔버의 외부 피하에 상기 삼투 펌프를 배치할 수 있다.

조직 챔버의 내부에 동정맥(AV) 단락 루프의 생성

다나카 등(1996)은 기본 모델을 기술하였다. 간단히 말하면, 수컷 스프라그 -다울리(Sprague-Dawley) 래트(225 내지 285 g)를 복강내 페노바비톤 (phenobarbitone)(50 mg/kg; 6 mg/ml 용액 2.5 ml)으로 마취시켰다. 멸균 조건하에서, 우측 서혜부에 하부 피부 플랩(inferior-based flap)을 형성시킴으로써 대퇴부 관이 서혜부 인대(inguinal ligament)로부터 표면 상복부 분지로 노출되도록 하였다. 죄측 서혜부를 세로 방향으로 절개하여, 좌측 대퇴부 정맥을 서혜부 인대로부터 상기 표면 상복부 분지로 수집하였다. 상기 정맥 이식편(대략 1.5 내지 3 cm 길이; 통상 2 cm)을 수용자 우측 대퇴부 정맥 및 동맥 사이에 삽입하되, 10 내지 0의 봉합을 이용하는 정밀수술 기술에 의하여 표면 상복부 수준으로 삽입하였다. 단락을 상기 챔버 내에 배치하고, 리드를 덮고, 상기 챔버의 기저부 상에 있는 소형 구멍을 이용하여 상기 구성물을 서혜부 근육 조직에 봉합하였다. 상기 챔버 위에 지방층을 배치하고, 상처를 4-0 실크 봉합사로 봉합하였다.

AV 단락을 보유하는 성장 챔버를 이식 후 2, 4 또는 12 주 후에 수거하였다.

혈관분포 및 조직 생성의 평가

연구 중의 특정 시점에, 상기 챔버를 개방하고, 관을 세정하여, 개방성(patency)에 대하여 시험하였다. 챔버의 입구에서, 5-0 실크 봉합사로 상기 관을 묶어 혈행을 멈추게 한 후, 상기 피부 플랩을 수거하였다. 각 군에서 5 마리의 래트 중 2 마리에 있어서, 묵즙(India ink)을 이용하여 대동맥을 통하여 상기 피부 플랩을 관류시킨 후, 수거하였다(이하에 상술함). 상기 피부 플랩을 용적 및 중량에 대하여 평가하고, 조직학적 조사를 위하여 10 % 완충 규정 염수(BFS)에 넣었다. 검사가 완결된 시점에서, 나트륨 펜타바비톤을 심장내 용량(250 mg/ml 용액 ∼3 ml)으로 사용하여 상기 동물들을 치사시켰다.

조직 질량 및 용적

상기 챔버 중의 조직을 제거하여, 그 습윤 중량 및 용적을 기록하였다. 표준 수 치환 기법(standard water displacement technique)에 의하여 상기 조직의 용적을 평가하였다. 디지탈 저울 상에서 미리 영점 조절된 표준 염수의 용기 내에 5-0 실크 봉합사로 상기 조직을 매달았다. 표본을 포함하는 상기 용기를 건드리지 않도록 주의하였다. 기록된 중량은 조직 표본(이는 표준 염수의 밀도 1.00 g/ml와 동일한 밀도를 가짐)의 용적였다. 상기 조직이 상기 용기의 기저부에 남아있게 하여 그 중량을 기록함으로써, 동일한 디지탈 저울 상에서 동일한 시간에 상기 표본의 질량을 평가하였다.

묵즙 관류

묵즙을 이용하여 상기 피부 플랩을 관류시키기 위하여, 복부 중앙을 절개하여 개복하였다. 장을 부드럽게 말초까지 수축시키고, 대동맥 주위 지방을 박리시켰다. 인접 대동맥 및 하대정맥을 결찰시켰다. 22-게이지의 혈관카테터 (angiocatheter)를 대동맥에 삽관하였는데, 이 때, 상기 혈관카테터 및 대동맥 둘레는 말단 봉합으로 고정하였다. 상기 하대정맥에서 정맥 절제를 수행하였다. 상기 대동맥을 헤파린처리된 염수 10 ml로 관류시켜 잔류 혈액을 세정하고, 심장 내에 소듐 펜타바비톤(250 mg/ml 용액 3 ml)을 주입하여 상기 동물들을 치사시키고, 상기 대동맥에 10 % 완충 규정 염수(BFS) 3ml를 주입한 후, 10 % 젤라틴 중의 묵즙 5 ml를 주입하였다. 그 다음, 상기 피부 플랩 관을 묶어 혈행을 차단하였다. 상기 챔버로부터 조직을 제거하여, BFS에 고정시키고, 삼나무 오일 중에서 세정한 후, 투과광 및 영상 분석법을 이용하여 상기 관의 패턴을 현미경적으로 가시화하였다[비디오 프로(Video Pro)(등록 상표) 영상화].

조직학

표본을 완충 규정 염수에 고정시키고, 파라핀 중에 매립하였다. 단편(5 ㎛)을 절단하고, 해마톡실린 & 에오신 (H&E) 또는 매손의 트리크롬(Masson's Trichrome)을 사용하여 염색하였다.

실시예 1 - AV 루프를 가진 챔버내에서 혈관분포된 조직의 생성

각각 5마리의 래트로 이루어진 3개 군을 사용하였다. 각각의 군에 대하여 전술한 바와 동일한 방법을 사용하였고, 이식 후 2주, 4주 또는 12주된 시점에서 AV 단락을 가진 성장 챔버를 수거하였다.

삽입 전 AV 단락 혈관의 평균 질량은 0.020 g(방혈됨) 및 0.039 g(혈액이 차 있는 상태)였다. 삽입 후 2주에서, AV 단락 및 이를 둘러싼 조직의 중량은 0.18 ±0.03 g이었다. 4주에서 질량은 점차 증가되어 0.24 ±0.04 g이었고, 12주에서는 0.28 ±0.04 g이었다. 새로운 조직의 부피는 그 중량과 밀접하게 대응하고 있었다. 2주 내지 12주 사이에 부피가 아닌 중량의 증가는 통계적으로 유의성이 있었다(p < 0.05, ANOVA/Dunnett 테스트).

이식 후 2주에서, AV 루프는 가변량의 응고된 혈액을 함유하는 응고된 삼출액 덩어리로 둘러싸여 있었다. 4주에서, 루프 주변 조직의 덩어리(특히, 그 중심부에서)는 더욱 커지고 단단했다. 12주까지, 루프를 둘러싼 신생 조직은 부피가 더욱 증가되었고, 현 시점에서 챔버의 대략 2/3를 차지하였다. 표면 응고물은 더 이상 관찰되지 않았고, 그 전체 덩어리는 균일하게 단단한 조도를 갖고 있었다.

2주간의 항온처리 후, AV 단락은 이 단락에 대해 대략 수직하게 배치된 맥관의 스프라우트(sprout), 섬유아세포 및 얇은 콜라겐 섬유로 이루어진 신생 결합 조직의 커프(cuff)로 둘러싸여 있었다. 염증 세포인 호중구와 대식세포 모두는 신생 조직의 외부 및 둘러싸고 있는 응고된 염증성 삼출액 덩어리에서 통상적인 수치로 존재하였다. 어떤 영역에서는, AV 단락의 정맥 관강으로부터 생성되는 신생 혈관 가지들을 확인할 수 있었다.

4주의 항온처리 군에서는, 신생 조직이 더욱 성숙되었다. AV에 가장 인접한 영역은 성숙한 콜라겐 간질내에 매립된, 신생 혈관의 조밀총을 함유하였다. 이 층의 외부는 2주된 표본에서 신생 조직과 유사한 덜 성숙한 영역이었다. 둘러싸고 있는 응고물의 대부분은 더 이상 관찰되지 않았고, 단지 소수의 염증 세포만이 신생 조직에 존재하였다. 2주에서, AV 단락 및 신생 혈관 사이의 소통이 일부 영역에서 관찰되었다.

항온처리 후 12주에서, 신생 조직은 더욱 성숙되었고, AV 단락의 외부 영역에 평행하게 위치한 섬유아세포를 가진 밀집된 콜라겐성 결합 조직으로 이루어져 있었다. 혈관분포에 있어서 명백한 감소는 없었고, 신생 혈관은 결합 조직을 통해 조밀총을 형성하였다. 염증 세포는 거의 관찰되지 않았다.

모든 3개의 시점에서, 묵즙을 주입한 표본은 신생 맥관계의 범위 및 밀도에 관한 명확한 영상을 제공하였다. 대부분의 표본에서, 거의 모든 혈관은 그 관강내에 탄소를 함유하였는데, 이는 이들 혈관이 AV 단락과 소통하고 있음을 의미하는 것이었다.

이상적으로, 신생 조직은 안정하고, 그 형태를 유지할 수 있어야 한다. AV 루프 주변에 형성된 조직은 이러한 특성 모두를 가진다. 2주에서 챔버내 덩어리는 유연하고, 쉽게 변형된다. 4주에서, 이것은 더욱 단단하고 더욱 강성을 띄게 되고, 12주에서 이것은 성숙한 결합 조직의 물리적 특성을 가진다. 놀랍게도, 성장은 이식 후 적어도 12주간 연속적이고, 점점 성숙하며, 신생 조직의 재흡착 또는 퇴행의 징후는 없었다.

실시예 2 - 래트 피부 섬유아세포를 가진 챔버

래트 피부 섬유아세포의 배양

동종번식된 스프라그-다울리 래트계(모나쉬 유니버시티 애니멀 서비시즈, 오스트레일리아 빅토리아 클레이톤 소재)의 서혜부로부터 6 cm x 4 cm 타원형의 래트 피부를 취하였다. 동종번식된 계통은 적어도 20 세대의 브라더-씨스터 교배로부터 얻은 동물을 포함하였다.

표피를 깎아서 정리하였다. 피부 단편을 2 mm x 2 mm 사각형으로 절취하고, 10개의 조각을 멸균 페트리 디쉬상에 두고, 래트 혈장 "접착제"를 사용하여 저부에 부착시켰다. 이 접착제는, 스프라그 다울리 래트로부터 제조된 래트 혈장 2 ml를 2% 염화칼슘 0.3 ml에 첨가하여 제조하였다. 이 풀을 37℃에서 10분간 경화시켰다. 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM), 10% 태아 송아지 혈청, 페니실린 및 스트렙토마이신 및 글루타민을 함유하는 완전 배지를 배양 접시에 첨가하였다. 피부 단편을 방해받지 아니한 상태로 7일간 방치한 후, 배지를 교환하였다. 10일째까지 섬유아세포의 상당한 성장이 관찰되었는데, 이 시점에서 피부 단편을 회수하였다. 섬유아세포를 일주일 간격으로 2회 이차배양하고, 매회 각각 75 cm²및 175 cm²배양 플라스크 내에서 세포를 성장시켰다.

섬유아세포를 2가지 형광 표지, 즉 비스벤즈아미드(BB) 및 카르복시플루오레세인 디아세테이트(CFDA)로 표지하였다. pH 7.4의 인산염 완충 염수(PBS) 중 0.1% 트립신 3 ml를, 융합된 섬유아세포를 함유하는 175 cm²의 세포 배양 플라스크에 37℃에서 5분간 첨가하였다. 완전 DMEM 배지 17 ml를 첨가하여, 이 트립신을 중화시켰다. 세포 현탁액을 2000 x g로 10분동안 원심분리하였다. 이 세포 펠릿을 3 ml의 배지중에서 재현탁시켰고, 현탁액을 3개의 1 ml 분취량으로 하여 에펜도르프 튜브에 옮겼다. 각각의 에펜도르프 튜브에 10% CFDA 용액 13.5 ㎕ 및 BB 20 ㎕를 첨가하였다. 이 튜브를 37℃에서 1시간동안 항온처리하고, 매 15분마다 가볍게 흔들어주었다. 이어서, 세포를 175 cm²플라스크에 옮기고, 재배양하였다. CFDA는 배양된 세포의 세포질에 존재하고, 세포가 딸세포로 분할된 후에도 남아있었다. CFDA 형광은 513 nm에서, BB 형광은 > 430 nm에서 최고치를 나타내었다. 최대 형광을 유지하기 위해, 표지된 세포를 광으로부터 보호하였다.

세포 계수

세포를 챔버에 첨가하기 전에, 섬유아세포 배양 플라스크를 트립신분해하고, 이 트립신을 중화시켰다. 현탁된 세포 10 ㎕는 1:10 비율로 0.05% 에반스 블루 염색 시약 및 혈구계산기를 사용하여 계수하였다. 이 용액을 원심분리하고, 생성된 세포 펠릿을 적당한 부피의 소 콜라겐 용액 중에 현탁시켜 1 백만 세포수/ml의 세포 농도를 얻었다.

래트 꼬리 건 콜라겐(RTTC)

6마리의 래트 꼬리로부터 건을 수집하고, 2 x 2 x 2 mm의 입방체로 잘랐다(수율 약 10 g). 0.5 M 빙초산 400 ml를 첨가하고, 혼합물을 균질화하여 4℃에서 24시간동안 교반하였다. 균질물을 원심분리(3000 rpm x 20 분)하고, 상청액을 수집하였다. 0.5 M 빙초산 300 ml를 추가로 첨가하여 이 추출 과정을 2회 반복하였다. 이 합쳐진 추출물에 5 M NaCl 용액을 4℃에서 자기 교반하면서 천천히 첨가하여 염의 최종 농도가 약 0.7 M이 되게 하였다(추출물 600 ml당 5 M NaCl 100 ml를 첨가함). 이 용액을 1시간동안 방치하여 천연 콜라겐을 완전히 침전시켰다. 이 침전물을 원심분리에 의해 수집하고(3000 rpm x 20 분, 4℃), 0.5 M 아세트산 200 ml에 재용해시키고, 0.5 M 빙초산 2 ℓ에 대하여 24시간동안 2회 투석하고, 멸균 냉증류수에 대하여 2회 투석하고, 최종 투석 용액은 표면에 클로로포름 몇방울을 함유하였다. 이것은 약 3 mg/ml의 RTTC 멸균 모액을 생성하였고, 그 농도는 제1형 콜라겐 표준을 사용하는 브래포드 단백질 분석(바이오 라드)에 의해 검사하였다.

챔버의 제조

모든 과정은 멸균 기법을 사용하여 세포 배양 후드에서 실시되었다. 2.5 mg/ml RTTC 용액(pH 7.4) 200 ㎕를 각각의 하프 챔버에 첨가함으로써, 챔버 내부를 RTTC로 코팅하였다. 챔버를 37℃에서 1시간동안 항온처리하여 겔을 형성시키고, 24시간동안 건조시켰다. PBS로 세척하여 남아있는 염 결정들을 제거한 후, 완전 DMEM 150 ㎕ 중 형광 표지된 섬유아세포 0.25 x 10⁶개를 각각의 하프 챔버에 첨가하였다.1시간 동안 세포를 부착시킨 후, 챔버를 완전 DMEM 중에 침지시키고, 37℃의 대기중 5% CO₂하에서 24시간동안 항온처리하였다. 표지된 세포의 밀도는, a x 10 대물 렌즈(objective)를 사용하여 각각의 하프 챔버로부터 무작위적으로 선택된 7개 영역에서 세포수를 계수함으로써 측정되었다.

챔버의 삽입

6마리의 동종번식된 수컷 스프라그-다울리 래트의 2개군(중량은 230 내지 280 g임)을 사용하였다. 2개의 챔버, 즉 AV 단락(전술한 바와 같이 제조함)을 함유하는 우측의 챔버 및 단락을 함유하지 아니한 좌측의 챔버를 각각의 래트의 서혜부내로 삽입하였다. 6마리의 래트에서는, 챔버를 이식 후 2일에서 제거하였다. 이식 후 7일에서, 남아있는 6개의 챔버를 회수하였다.

회수 후 챔버의 검사

챔버를 회수하고, AV 단락은 그 효능을 검사하고, 플랩을 회수하였다. 0.05% 에반스 블루 염색 시약 10 ㎕를 각각의 하프 챔버에 첨가하고, 37℃에서 5분간 항온처리하였다. 이어서, x 10 접안 렌즈를 사용하여 각각의 하프 챔버의 저부를 검사하여, 7개의 무작위적으로 선택된 현미경 영역에서 에반스 블루로 염색된 형광 세포의 개수를 측정하였다. 이어서, AV 단락 표면상의 7개의 무작위 영역에서 표지된 세포의 개수를 측정하였다.

삽입 후 2일에서, 단락과 이를 둘러싼 조직은 챔버 표면의 대략 20%를 피복하고 있었고, 7일까지 이것은 대략 30%로 증가하였다. 이를 기초로, 챔버 표면의 세포 밀도, 및 AV 단락 표면상에 표지된 세포의 20%(2일) 또는 30%(7일)를 합계해서, AV 단락을 함유하는 챔버내 세포의 전체적인 밀도를 계산하였다.

쌍을 이루는 t-테스트를 사용하여, 마이크로소프트 엑셀(상표명) 및 그래프 패드 프리즘(상표명) 소프트웨어(미국 캘리포니아주 샌디에고)에 의해 대조군 및 실험 챔버에서 격자 당 세포수와 격자 당 처리전 세포수를 비교하였다.

계수가 끝난 후, 단락과 이를 둘러싼 조직을 10% 규정 염수중에 고정시키고, 메타크릴레이트 중에 매립하고, 얇은 단편을 제조하고, 헤마톡실린 및 에오신 또는 매손의 트리크롬으로 염색하였다.

비스벤즈아미드(BB) 및 카르복시플루오레세인 디아세테이트(CFDA)를 사용한 표지화 간의 비교

시험관내 배양물 및 생체내 챔버 모두에 있어서, 검사된 2개의 파장(BB에 대해서는 430 nm; CFDA에 대해서는 573 nm)에서 표지된 세포의 개수 및 분포는 동일하였다. 단 하나의 형광 염색 시약만으로 표지된 것으로 확인된 세포는 없었다. 따라서, 이후의 결과에서 "형광 세포"는 BB 및 CFDA 양자로 표지된 세포로 간주된다.

현미경 관찰

AV 루프는 각각의 챔버내에서 개방되어 있었다.

삽입 후 2일에서, AV 단락은 챔버 표면의 약 20%를 피복하고 있었다. 7일까지 AV 단락에 의해 피복된 영역과 그것으로부터의 신생 조직은 약 30%로 증가하였다.

단락의 2일 평균 중량은 0.12 ±0.017 g이었고, 평균 부피는 0.12 ±0.014 ml였다. 7일까지, 평균 중량은 0.23 ±0.018 g으로 증가되었고, 평균 부피는 0.21±0.015 ml로 증가되었다.

표지된 세포의 밀도

비어있는 챔버와 AV 단락을 함유하는 챔버에서 표지된 세포의 밀도를 표 1에 제시한다.

비어있는 챔버와 AV 단락을 함유하는 챔버에서 처리전 그리고 삽입 후 제2일 및 7일에서 표지된 세포의 밀도(평균 개수/격자)

삽입 후 시간	처리전	비어있는 챔버	AV 단락을 함유하는 챔버
			챔버내	총계*
2일	8.6 ±1.74	4.0 ±0.94	4.8 ±0.59	5.7 ±0.62
7일	10.2 ±1.7	4.8 ±1.3	11.7 ±1.4	15.5 ±1.1＃

^*챔버 표면상의 세포수/격자 + AV 단락을 둘러싼 조직의 표면에 표지된 세포의 20%(제2일) 또는 30%(제7일)

^#7일에서 비어있는 챔버에서의 상기 밀도 증가는 유의성있음(p = 0.011).

모든 챔버에서 세포 밀도는 이식 후 초기 단계에서 감소하였다는 것과, 모든 제2일 챔버의 수치는 이의 삽입 전 밀도에 비해 작다는 것을 알 수 있었다. 삽입 후 2일에서, 비어있는 챔버와 AV 단락을 함유하는 챔버의 밀도에 있어서는 유의성있는 차이가 없었다.

7일에서, 비어있는 챔버의 세포 밀도는 삽입 후 2일에서의 밀도와 유의성있게 다르지 않았다. 대조적으로, AV 단락을 함유하는 챔버의 세포 밀도는 그 2일째 수치의 거의 3배로 증가되었고, 격자중 세포의 밀도 및 밀도(단락을 둘러싼 조직에서 표지된 세포수를 허용함) 둘다는 비어있는 챔버의 밀도에 비해 유의성있게 컸다(p = 0.013).

에반스 블루 염색 결과, 검사된 모든 챔버에서 실질적으로 모든 표지된 섬유아세포가 관찰되었고, 세포의 1% 미만이 에반스 블루 염색 시약으로 염색되었다.

조직학적 관찰

2일간의 항온처리 후, AV 단락의 혈관은 혈병 및 응고된 염증성 삼출액으로 둘러싸여 있었다. 소수의 섬유아세포가 맥관 외막으로부터 응고물로 이동하는 것이 관찰되었다.

7일까지, 더욱 많은 섬유아세포가 응고물내에 존재하였고, 초기 맥관 스프라우트가 AV 단락의 외측으로부터 생성되는 것이 관찰되었다.

2일 및 7일에서의 형광 연구에서는, AV 단락을 둘러싼 응고물 표면상에 표지된 섬유아세포가 나타났지만, 표지된 세포는 그 물질 내부에서 관찰되지 않았다. 삽입 후 7일에서 회수된 AV 단락을 함유한 챔버의 내측을 도 5에서 도시한다.

실시예 3 - 이식된 조직 챔버에서 줄기세포의 분화

골격근, 췌장, 지방, 간 및 신장을 4마리의 동종번식된 스프라그-다울리 래트로부터 무균적으로 회수하였다. 이들을 1 mm 입방체로 잘라서, 완전 무혈청 DMEM 1-2 ml를 함유하는 조직 배양-등급의 페트리 디쉬(배양 표면 7cm²당 15-20 조각)내에 두었다. 이어서, 이들을 최소 24시간 내지 3일간 항온처리하였다. 적절한 시점에, 4-6개의 조직 조각을 혈장 응고물내에서 실시예 2에 기재된 형태의 챔버의 각 면에 부착시켰다. 이어서, 이 챔버에 AV 루프를 이식하고 밀폐시켰다. 대퇴 신경의인접한 말단을 골격근 이식편을 함유하는 챔버의 반쪽내에 두었다. 4 내지 6주 후, 래트를 치사시키고, 챔버를 검사하였다.

4 내지 6주 후, 조직 이식편을 가진 챔버의 내용물은, 이들이 새롭고 다른 세포 표현형을 포함하고 있다는 점에서, 조직 이식편이 없는 챔버의 내용물과 상이하였다. 모든 경우에서, 괴사 조직 이식편 대부분을 새로운 세포의 덩어리로 교체하였다.

이들 실험에서 가장 급격한 것으로서, 골격근 이식편이 이식된 11개의 챔버중 8개는 얇은 캡슐에 의해 둘러싸인 성숙한 골격근 섬유, 및 성숙하고 잘 혈관분포된 지방 조직을 그 부피의 2/3까지 함유하였다. 신생 조직의 성숙한 부위는 혈관분포된 지방 조직을 90%까지 함유하였다. 남아있는 챔버는 또한 성숙한 지방 조직 및 골격근 섬유를 보다 소량 함유하였다.

췌장 조직의 일부를 이식한 챔버는 잘 구획된 큰 난형의 호산성 세포, 다수의 거대 세포 및 다른 보다 작은 세포의 큰 군집을 가진다.

어떠한 제안된 메커니즘에 의해 제한되기를 바라는 것은 아니지만, 본 발명자들은 괴사성 조직 이식편에 의해 순환하는 줄기세포 근원으로부터 챔버내로 유인되거나, 또는 조직 이식편내에 함유된 "줄기세포" 군집이 새로운 조직을 생성시킨다고 믿는다. 상기 어떠한 경우에서든, 줄기세포를 분리하기 위해 요구되는 많은 양에 비해, 극소량의 이식편 조직이 사용되었고, 우리의 결과는 이것이 줄기세포를 얻는 신규하고도 유효한 방법임을 의미한다. 줄기세포들은, 관찰된 다른 세포 유형으로 증식 및 분화하기 위해, 상이한 이식편의 특수한 미세환경에 의해 발현되는신호에 응답했을 수 있거나, 또는 특정한 조직 유형에 일치하는 정도와 관련하여 다를 수 있다.

본 명세서에 기재된 캡슐화된 지방 조직의 생산은, 본 발명자들이 아는 한 이러한 신-유기관이 그 자신의 동맥 및 정맥상에서 새로이 성장되었다는 것에 대한 첫번째 보고이다.

챔버에서의 시공-일시적이고 역학적인 변화, 및 이러한 현상이 신-기관(neo-organ)을 생성하는 메커니즘에 관한 상세한 연구는 생체내 줄기세포 이용률 및 거동을 정의하는 데 있어서 유용할 수 있다. 이러한 챔버 모델은 지금까지 이용가능한 다른 어떤 생체내 모델에 비해 양호한데, 그 이유는 이것이 챔버 내용물 및 환경 및 줄기세포 근원에 대한 광범위한 조작을 가능하게 하기 때문이다. 또한, 확립된 조직에서의 줄기세포 성장과는 달리, 이것은 다른 인접한 조직에 영향을 주지 않고 천연 환경에서의 줄기세포 연구를 가능하게 한다.

근육 이식편이 거의 전적으로 성숙한 지방 조직으로 이루어진 신 장기를 생성시킬 수 있다는 발견은 다음을 의미한다:

a) 줄기세포 군집은 챔버에 성공적으로 씨딩될 수 있다는 점;

b) 챔버 모델은 줄기세포의 유연성을 지지한다는 점;

c) 만족스럽고, 적절하며, 그리고 충분한 맥관신생이 조직 구성물로 진행되고, 통합되며, 이를 지지한다는 점;

d) 구성물은 섬유아세포의 내적-성장(in-growth)에 의해 회복(overcome)되지 않는다는 점; 및

e) 구성물은 염증 세포에 의해 회복되지 않는다는 점.

이들 결과는 챔버 모델을 조직 조작에 적용하는 것이 실행가능함을 증명하며, "조직 조작" 기술분야에 있어서의 상당한 진보를 나타낸다.

실시예 4 - 매트리겔의 효과

AV 루프와 20분간의 접촉시키는 동안, 매트리겔의 임의의 초기 손실이 있는지 여부를 결정하기 위해 파일럿 연구를 설계하였다. 파일럿 연구의 결과에 기초하여, 2, 4 및 8주의 기간을 선택하였다. 4주의 기간에서, 성장 인자를 줄인 매트리겔을 사용하여 추가의 비교를 수행하였다. 1군당 6마리의 수컷 스프라그-다울리 래트를 사용하였고, 그 각각의 중량은 220 내지 280 g이었다. 동맥-정맥 루프 절차는 실험 절차에 기재된 바와 같이 수행하였다.

매트리겔(콜라보레이티브 리써취 인코포레이티드, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재)을, 겐타마이신 10 ㎍/ml을 함유하는 DMEM(벡톤 디킨슨) 중 12 mg/ml의 적당한 농도의 멸균 10 ml 분취량으로 분할하였다. 매트리겔을 -20℃에서 저장하고, 사용전에 4℃에서 밤새 해동하였다. 제조 과정을 통해, 매트리겔을 얼음상에서 유지하고, 사전냉각된 피펫을 사용하여 조작하였다. 성장 인자를 줄인(GFR) 매트리겔은 문헌[Vikicevic et al (1992)]에 기재된 바와 거의 동일하게 매트리겔로부터 제조되었다. 이것은 황산암모늄 분획 단계를 추가로 포함하였다. 생성된 GFR 매트리겔의 단백질 농도는 배드포드 단백질 분석에 의해, 그리고 SDS-PAGE 후 쿠마지 블루 염색에 의해, 정상 성장 인자로 충만한 매트리겔의 것과 일치하는 것으로 증명되었다.

멸균 조건하에서, 매트리겔 0.5 ml를 실온에서(여기서, 매트리겔은 급속히(15초이내) 겔화됨) 각각의 멸균 챔버에 첨가하였다. 이어서, 매트리겔이 함유된 챔버를 래트의 우측 서혜부에 두었다. 매트리겔은 실온에서 젤라틴 모양이므로, 그 내부에서 루프의 침지를 가능하게 한다. 파일럿 연구에서, AV 루프를 제조하고, 이식 전 20분 동안 매트리겔에 침지시켜, 매트릭스의 액화에 기인하는, 챔버로부터 매트리겔의 임의의 최초 손실이 있었는지 여부를 결정하였다.

시간 과정 연구에서, 새로운 조직 플랩을 2주, 4주 및 8주의 기간에서 수집하였다. 이 플랩을 상기 시간 주기에서 수집하였고, 중량, 부피 및 조직학에 대하여 평가하였다. 2주, 4주 및 8주군을 상호 그리고 AV 루프 단독과 비교함으로써 통계학적 분석을 실시하였다(실시예 1 참조). 4주에서 매트리겔, GFR 매트리겔 및 AV 루프 단독에 대한 추가의 비교 연구를 실시하였다.

파일럿 연구에서, 매트리겔은 시험관내 조작이 용이한 것으로 입증되었다. AV 루프와 20분간 접촉시킨 후에, 매트리겔의 최소 손실이 있었다.

AV 루프 단독에서(첨가된 매트릭스 없음), 4주 후 형성된 신규 조직 플랩의 평균 중량은 0.24 ±0.04 g이었고, 평균 부피는 0.23 ±0.03 ml였다. 이들 결과는 이 실험 및 실시예 5에 대한 대조군으로 사용하였다.

2주에서, 매트리겔을 보충한 챔버내 플랩의 평균 중량은 0.32 ±0.03 g이었고, 평균 부피는 0.30 ±0.03 ml였다. 이는 4주의 루프 단독의 플랩에 비해 유의성있게 큰 것이었다(p=0.05). 4주에서 플랩은 0.35 ±0.03 g의 평균 중량 및 0.33 ±0.03 ml의 평균 부피를 가져서, 2주의 플랩에 비해 약간 더 무거웠다. 이들 2개군의 비교 결과는 어떠한 통계학적인 유의성을 보이지 않았다. 중량(p=0.01) 및 부피(p=0.01)는 둘다 루프 단독에 의해 생산된 대조 플랩에 비해 유의성있게 컸다.

8주에서, 플랩은 퇴행하여, 평균 중량은 0.18 ±0.02 g이었고 평균 부피는 0.16 ±0.02 ml였다. 통계학적 분석 결과, 2주된 플랩 및 4주된 플랩의 중량(p=0.0005) 및 부피(p=0.0003)와 비교할 때, 이것이 중량(p=0.002) 및 부피(p=0.001)에 있어서 매우 유의성있는 것임을 알게 되었다. 이러한 보다 장시간에 있어서, 감염 및 열개를 보정하기 위해 8마리의 래트를 수술하였다. 이러한 문제를 보이지 않았기 때문에, 모든 8마리의 래트를 분석에 포함시켰다.

GFR 매트리겔 플랩은 4주에서 중량 평균이 0.27 ±0.02 g로서, 정상 매트리겔 플랩에 비해 더 작았다. 중량 비교에서는 어떠한 통계학적인 유의성을 보이지 않았다. 부피는 0.24 ±0.01 ml였고, 이것은 정상 매트리겔에 비해 유의성있게 적은 것이었다(p=0.04). GFR 플랩은 동일한 시간 주기에서 루프 단독에 비해 더 컸다(통계학적으로 유의성있는 것은 아님). 챔버 중 하나가 감염되어서, 제거해야 했다. 그 결과, 이 군에서는 5마리의 동물이 검사되었다.

2주 및 4주에서는, 0일에서 루프만을 함유한 챔버에 비해, 유의성있는 조직 플랩이 형성되었다. 챔버내에는 잔여 매트리겔이 있었고, 플랩 가장자리로부터 매트리겔에 이르는 미소혈관의 섬사(strand)를 관찰할 수 있었다. 마이크로필(microfil) 주입 결과, 발달하는 미소혈관을 비롯하여 플랩 혈관의 양호한 충전이 나타났다. 플랩이 더 작고, 보다 균일하고 평활한 표면을 가졌을 때, 이 외관은 8주에서 분명하지 않았다. 8주에서, 챔버내에는 단지 잔여 유체만이 존재하였고, 점성 매트리겔은 관찰되지 않았다.

조직학적 검사 결과, 2주에서는 말초 조직내에서 출혈이 있었고, 플랩 가장자리에까지 확장되는 다수의 미성숙 혈관이 존재함을 알 수 있었다. 플랩내에 포함되지 않은 매트리겔 및 중심부에서 초기 콜라겐 형성이 있었다.

4주에서, 혈관은 소동맥 및 세정맥으로 성숙하였고, 더 큰 가지 혈관은 말초부의 더 작은 가지 및 루프로부터 생성되었다. 일부의 미포함된 매트리겔과 소량의 출혈이 있었다. 미포함된 매트리겔은 희소한 섬유아세포와, 간혹 혈관을 함유하였다. 일반적인 효과는 양호한 혈관분포도를 가진, 성숙하지만 여전히 성장중인 플랩의 것이었다.

8주에서, 플랩 조직은 더욱 성숙한 것으로 나타났고, 더욱 농후한 콜라겐과 더욱 큰 혈관은 루프에 더 근접하여 존재하였다. 그것은 더 적은 혈관을 가지는 덜 세포성을 띄는 것이었다. 캡슐은 생성된 조직 주변에서 형성되기 시작하였고, 플랩내에는 남아있는 잔여 매트리겔이 존재하였다.

GFR 매트리겔 플랩은 더욱 성숙한 것으로 나타났고, 중앙에 더 큰 혈관을 가졌으며, 말초부에서는 혈관형성 활성이 보다 약했다. 초기 캡슐 형성이 명백하였고, 일부 표본에서는 더 많은 염증 세포가 존재하였다.

모든 시점에서, 마이크로필 주입은 루프 및 플랩 혈관 사이의 양호한 맥관 결합을 증명하였다.

실시예 5 - 폴리-L-락트산 폴리글리콜산(PLGA)의 효과

(a) 염-침출법에 의해 제조된 PLGA

문헌[Patrick et al (1999)]에 기재된 바와 같은 특정 침출법을 사용하여 조직 챔버를 위한 PLGA 삽입체를 작제하였다. 본질적으로, PLGA를 클로로포름에 용해시키고, NaCl과 혼합하였다. 클로로포름을 증발시킨 후, 생성된 스캐폴드를 소정의 형상으로 기계가공하였다. 이어서, 염이 그로부터 침출되어, 상호연결된 포어가 생겼다. 포어 크기는 사용된 염 입자 크기를 반영한다. 이 실험에서, 300 내지 400 ㎛의 포어와 84%의 다공성이 얻어졌다. PLGA를 폴리카르보네이트 챔버 내부에 맞도록 2부분으로 기계가공하였다. 하부는 루프에 대한 홈을 가진 기저 플레이트를 포함하였고, 상부는 루프 및 기저 플레이트를 커버하는 평평한 디스크를 포함하였다. PLGA 디스크는 직경이 1.4 mm이고 두께가 2.5 mm였다. PLGA를 멸균하고, 그리고 기계 교반기 상에서 100% 알코올중에 30분간 침지시킨 후 기계 교반기 상에서 멸균 염수 세척액중 30분간의 세척을 3회 실시하여 사전에 습윤시켰다.

동정맥 루프를 전술한 바와 같이 제조하고, 챔버내에 놓인 PLGA의 기저 플레이트내에 두었다. 양호한 디스크를 밀폐된 챔버와 상부상에 두었다. 각 군의 래트는 6마리의 수컷 스프라그-다울리 래트로 구성되었는데, 각각의 래트의 중량은 220 내지 280 g였다. 챔버를 2주 또는 4주에서 수집하였다. 중량, 부피 및 조직학을 양쪽 시간 주기에서 평가하였다. α-액틴에 대한 플랩 단편을 면역조직화학 염색하여 근섬유아세포를 검출하였다. 각각의 군에서, 하나의 챔버를 제외하였는데, 하나는 감염에 기인하였고, 다른 하나는 열개에 기인하였다. 따라서, 각각의 군에 5마리의 래트가 남았다.

2주에서, 혈관은 구성물을 거의 완전히 혈관분포시켰고, 선단부에 약간의 관련되지 않은 PLGA가 있었다. 캡슐은 문맥 근처에서 인접하여 형성되기 시작하였다. 4주에서, 구성물은 완전히 캡슐화되었고, 챔버면으로부터 움츠러들어, 수축되고 오그라들어 있었다. 마이크로-필 주입은 혈관 침투 정도를 보여주었다.

2주에서 플랩의 중량은 0.43 ±0.05 g이었고, 부피는 0.38 ±0.04 ml였다. 4주에서 플랩의 중량은 0.33 g ±0.04 g이었고, 부피는 0.29 ±0.04 ml였다. 2주된 군과 4주된 군의 비교로부터, 2주에서 4주 사이에 플랩의 크기가 감소됨을 알 수 있었다. 이 결과가 통계학적으로 유의성있는 것은 아니다. 다른 실험과의 추가의 비교는 플랩내에 존재하는 PLGA의 존재(이는 결과를 왜곡시킴)로 인해 가능하지 않았다.

2주 및 4주 모두에서, 광범위한 혈관 성장이 관찰되었는데, PLGA의 가장자리에까지 가지 난 혈관들이 관찰되었다. 소동맥이 형성되었고, 건강한 가지 난 혈관형성이 루프로부터 나타나는 것이 관찰되었다. 세포 침윤물은 매트릭스 상에, 그리고 구조물의 표면상에 존재하였다. 단지 2주에서 플랩 인접부 상에 캡슐이 형성되었다. α-액틴 염색은, 이 캡슐이 근섬유아세포를 함유하였음을 보여주었다. 4주에서, 캡슐은 인접한 곳에서 더욱 두꺼웠으며, 더 많은 근섬유아세포를 가졌고, 전체 플랩을 감쌀 정도로 확장되었다.

(b) 섬유 방적법에 의해 제조된 PLGA

실시예 1에 기재된 맥관 루프 모델을 이 실험에서 사용하였다. AV 루프를, 스캐폴드로서 PLGA 디스크(75% 폴리-L-락트산/25% 폴리글리콜산)로 가득 찬 둥근 폴리카르보네이트 챔버(0.5 ml 부피)내에 두었다. PLGA 스캐폴드는 전술한 염 침출법 또는 섬유 방적법에 의해 제조되었다. 각각의 군은 5마리의 동물을 포함하였다. 4주의 항온처리 후 그리고 수집 직전에, 헤파린화된 묵즙을 5분간 정맥내로 주입하였다. 챔버로부터 조직을 수집하고, 10% 완충 규정린 중에 고정시키고, 파라핀에 매립하고, 5 ㎛ 단편으로 절단하고, 평가를 위해 헤마톡실린 & 에오신(H & E)으로 염색하였다.

염이 침출된 PLGA는 섬유 방적된 PLGA의 단단하고 밀집된 조도에 비해 상대적으로 조밀하지 않았다. 이것은 조직학적 평가를 위한 후속적인 조직/PLGA 블록의 절단에 의해 증명되었다. 염이 침출된 PLGA는 손상되기 쉽고, 부서지는 경향이 있었다. 섬유 방적된 PLGA는, 이것이 고체 조도를 가지고 부서지지 아니하므로, 절단이 용이하였다.

조직학적 검사 결과, 이들 각각의 군에 있어서 모든 표본에 대한 일관적인 패턴이 나타났다. 염이 침출된 PLGA군에서는, 전체적으로 PLGA로 미소맥관계 및 신생 조직의 상당한 침투가 관찰되었으며, 인디아 핑크로 충전된 다수의 미소맥관은 뚜렷하였다. 섬유 방적 PLGA는 특성이 상이하였다. 맥관신생 및 조직 신생은 2차원 평면에서 우세하게 진행되었다. 초기에, PLGA를 침투하는 대신에, 조직은 우선적으로 PLGA 디스크를 둘러쌌고, 챔버의 가장자리를 향해 이동하였다. 조직은 매우 느린 속도로 매트릭스를 침입하였다. 일단 디스크의 가장자리가 침출되면, 디스크 주위에 새로운 조직의 비후화가 일어났지만, 4주 후 이를 완전히 충혈(engorge)시키지는 않았다.

섬유 방적 PLGA에 대한 추가의 개질(예를 들어, 포어 크기의 증가 및 밀도감소)로 인해, 이 기법은 염이 침출되는 PLGA 제제에 대한 실행가능한 대안이 될 수 있다.

실시예 6 - 혈관분포된 조직에 대한 모델 시스템

본 발명의 조직 챔버 및 이식 시스템은, 생성시에 시험관내에서 발달하는 조직을 유지하기 위해 체외 순환 기계를 사용함으로써, 혈관분포된 조직의 거동을 검사하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 이 챔버 내용물은 실시예 1에서 구체화한 바와 같이 정해진다. 숙주 혈액 또는 적합한 수혈된 혈액(적어도 90 ml)을 취하고 헤파린화시킨다(50 유닛/ml 이하). 혈관 단부를 실리콘 튜브에 연결시키고, 혈액은 신장 투석 필터를 통해 산소화한다. 산소화된 혈액은, 이러한 목적에 적합한 통상의 집중 관리 유닛 장치를 사용하여 조직을 통해 펌핑되고, 조직/장기가 성숙할 때까지 이러한 방식으로 시험관내에서 유지된다. 이 상에서, 혈액 샘플을 지속적으로 모니터링하여, 응고 정도 및 지혈의 지속 정도를 평가한다. 생체내 연구에서와 유사한 방식으로, 세포 생산 조직을 유전적으로 조작하는 방법을 이 모델에 적용할 수 있다. 최종적으로, 생성된 조직/장기를 미소수술적 방법에 의해 숙주내의 적절한 부위에 재배치한다. 이 방법의 주된 이점은 맞춤의, 재고(off-the-shelf) 부분 및 장기를 생산하는 능력이다.

우리의 모델을 시험하는 데 있어서 다음 단계는 줄기세포를 이 시스템에 첨가하여, 조직이 새로이 생성되었는가를 보는 것이다. 챔버내로의 "줄기세포" 분리, 확장 및 이식은 그 자체로서 배우 방대한 연구 분야이고, 아직 유아기 상태에 머물러 있다. 다양한 이유로 인해, 본 발명자들은 예측하지 못한 결과를 가진, 환경적인 신호와 줄기세포를 가하는 특수한 방법을 선택하였다. 본 발명자들은 챔버내에 생체내 배치된 손상된/괴사성 조직 이식편의 거동을 검사하였고, 근육의 지방으로의 전환을 증명하였다(실시예 3 참조).

이와 같은 실험에서 시험될 가설은, 이들 작은 조직 이식편이 적어도 소수의 줄기세포를 은닉(harbour)할 수 있다는 것인데, 이 줄기세포는 그 원래의 장기에 대한 손상을 인지하고, 조직 재생을 개시함으로써 응답한다. 본 발명자들은 또한 지방, 간 및 신장을 비롯한 다수의 조직을 시험하였고, 이내 신경, 자궁, 난소, 갑상선 및 선 조직을 검사할 것이다. 그 결과는 매우 성공적이었는데, 왜냐하면 시험된 모든 조직은 미지의 메커니즘에 의해, 챔버에 정상적으로 존재하지 않는 세포 표현형의 생성을 유도하였기 때문이다. 기계적으로, 이들은 인지가능한 3차원적 조직 및 표현형을 가진 혈관분포된 조직을 생성시키는 것을 포함하여, 챔버내 세포성/혈관형성 응답을, 주로 섬유아세포로 이루어진 조직의 신규 생성을 비롯한 "염증 및 반흔 형성"에 유사한 것으로부터 태아에서의 "반흔 없는" 조직 복구로서 알려진 "조직 재생 및 생성"에 유사한 것으로 전환시켰다. 신생 조직은 섬유아세포의 내적-성장 및 염증 세포가 없다는 점이 중요하다.

실시예 7 - 조직 성장 챔버내에서 저산소증의 평가

챔버내에서 세포의 저산소증을 연구하기 위하여, 실시예 1에서 기술한 바와 같이 마취시킨 수컷 래트에서 AV 단락 루프를 생성하였다. 표준 크기의 챔버(0.5 ml 부피)를 사용하였다. 실시예 5에 기재된 바와 같이 챔버를 매트리겔로 채우고, 전체 표면적에 걸쳐 분포된 불멸 래트 L6 근원세포(1 x 10⁶세포수/0.5 ml 매트리겔)를 씨딩하였다. 이어서, 챔버를 래트의 서혜부에 배치하였다.

챔버는 3일, 7일, 2주 및 4주간 항온처리에서 수집하였다. 연구시에, 나트륨 페노바리톤(30 mg/ml)을 사용하여 동물을 다시 마취시키고, 챔버 수집 2시간 전에 니트로이미다졸(60 mg/kg, i.p.)을 주사하여 저산소증을 평가하였다. 챔버를 수집한 후, 치사량의 펜토바르비톤 나트륨(325 mg/ml 용액 3 ml)으로 래트를 치사시켰다. 챔버내의 표본을 조직학에 대하여 처리하고, 니트로이미다졸 항체를 사용하여 면역염색하였다. 이들 조건하에서, 표지된 세포만이 저산소증이며(< 10 mmHg) 증식중인 세포이다.

3일 및 7일에서 조직의 산소화도를 평가함에 있어서, 양 시점에서 맥관 루프에 바로 근접한 부위에 증식하는 저산소증 세포가 존재하였다. 2주 후, 유일하게 표지된 세포들은 성장하는 신생 조직 덩어리의 주변부에 존재하였다. 4주에서, 니트로이미다졸로 표지된 세포는 없었다.

이 연구로부터의 결과는, 저산소증 및 활성 생합성 상태는 혈관 루프에 인접한 세포에 존재하는 것임을 의미한다. 이것은 저산소증이 특히 제1주에서 폴리카르보네이트 챔버내 혈관형성에 대한 추진력임을 강하게 시사한다. AV 루프에서 떨어진 세포는 확실히 저산소증이었지만, 증식하고 있지 않았다. 제2주에서, 저산소증의 증식성 세포는 신생 조직의 진행성 가장자리에 위치하였지만, 제4주의 마지막에서 챔버는 전체적으로 양호하게 산소화되었고, 조직 신생은 상당히 느려졌다. 이와 같은 연구는, 연구자들이 어떻게 저산소증이 챔버내에서 신생 조직의 성장에 영향을 줄 수 있는가를 검사할 수 있게 한다.

실시예 8 - 래트 AV 루프 모델에서 챔버에 첨가된 분리되고, 배양된 세포

(a) 챔버에 근원세포의 첨가

신체 다양한 부위의 골격근(예를 들어, 비복근, 대퇴직근, 광배근 등)을 이유 후 5일된 신생 래트로부터 수집하였다. 콜라게나아제 분해하고, 2 ng/ml의 bFGF를 함유하는 20% 태아 송아지 혈청을 함유한 Ham's F10 배지에서 배양함으로써, 이들 수집된 조직으로부터 근원세포를 생성시켰다. 데스민 면역염색에 의해 근원세포를 확인하였다. 섬유아세포가 반시간 이내에 플라스틱에 부착하는 데 반해 근원세포는 그 시간이 지난 후 부착한다는 사실을 이용하여, 연속 서브클로닝에 의해 섬유아세포를 제거하였다. 다량의 근원세포(2-4 x 10⁶세포수)를 (1) 매트리겔 단독(약 0.5 ml) 또는 (2) 매트리겔(약 0.15 ml)에 삽입하였고, PLGA가 그 나머지 부피를 차지하고 있었다. 이들 매트릭스를 전술한 바와 같이 표준 0.5 ml 챔버내에서 AV 루프 주위에 배치하였다. 이들 구성물을 피하적으로 2, 4, 6, 12 또는 16주동안 항온처리하였다. 실험시에, 래트는 일반적인 마취 상태에 있었고, 챔버내에 형성된 조직("플랩"으로도 알려져 있음)을 회수하였다. 조직의 약 절반을 이소펜탄 중에서 동결시켰고, 나머지 절반은 포르말린 중에 고정시키고, 단편화한 후, 형상적, 조직학적 및 면역조직화학 염색을 실시하였다.

1. 매트리겔만의 군

A군 - 2주(n=6)

6마리의 래트로부터의 챔버를 2주에서 검사하였다. 이들 중 4마리에서, 다량의 근육이 관찰되었고, 다시 이들 중 3마리는 확인가능한 데스민-양성 근원세포와미오튜브 형성의 징후를 가졌다. 다른 2마리는 어떠한 데스민-양성 조직을 가지지 않았다.

B군 - 6주(n=9)

이 군의 9마리 가운데, 2개의 구성물은 근육과 미오튜브를 가졌고, 4개의 플랩은 어떠한 확인가능한 근육을 가지지 않았으며, 3마리의 래트는 조기에 죽었다.

C군 - 12주(n=11)

이 군의 11마리 가운데, 어떤 구성물도 근육을 가지지 않았고, 5개의 플랩은 근육을 가지지 않았지만, 약간(이미 확인된 바와 같이)의 조직을 가졌고, 2개의 챔버는 어떠한 플랩도 가지지 않았고(이것이 챔버로부터 미끄러져 버리기 때문일 가능성이 있음), 3마리의 래트는 조기에 죽었다.

2. PGLA/매트리겔 군

A군 - 2주(n=3)

이 군에 대한 결과는 없음

B군 - 6주(n=6)

이 군의 6마리 가운데, 2개의 구성물은 근육과 미오튜브를 가졌고, 4개의 플랩은 근육을 가지지 않았다. 챔버에 이식하기 전 근원세포를 CFDA로 형광 표지한 하나의 챔버에서, 생체내에서 4주간의 항온처리후에 여전히 살아남은 근원세포의 징후가 관찰되었다.

C군 - 12주(n=7)

이 군의 7마리 가운데, 2개의 구성물은 데스민 염색된 근원세포를 함유하였고, 5개의 플랩은 미확인된 조직을 함유하였지만, 근육을 함유하지는 않았고, 1마리의 래트는 조기에 죽었다.

D군 - 16주(n=5)

이 군에 대한 결과는 없음.

2주간의 항온처리 후 H&E 염색된 플랩 단편에서, 근원세포는 일부 조직 표본에서 명백하였고, 이들의 존재는 데스민의 면역염색에 의해 확인되었다. 2주내에, 근원세포 핵의 군이 정렬되어, 디스트로핀에 대하여 양성으로 염색된 미오튜브를 형성하였고, 줄무늬의 성숙한 골격근을 형성하였다. 6주까지, 일부 표본에서는 미오튜브 및 성숙한 근육이 존재하였지만, 다른 표본에서는 결합 조직이 생성되었다. 2, 4 및 6주에서, 단핵 백혈구 침윤물이 존재하였는데(매트리겔을 사용하는 데 따른 것일 가능성이 있음), 이는 마우스 세포에서 기원한 것이었다. 그러나, 12주까지, 다량의 플랩 조직이 재흡착되었다. 흥미롭게도, 이식된 "덜 순수한" 근원세포를 사용한 일부 초기 연구에서, 골양(osteoid)의 분리된 낭(뼈 조직) 및 지방 조직(지방)이 매트리겔만을 사용한 실험에서 2주 및 4주 후에 관찰되었다.

예비 실험에서, 말초부에서 분리된 대퇴 신경을, 이식된 근원세포에 의해 둘러싸여 있고 루프에 인접한 매트리겔 매트릭스내로 포함시켰다(n=6, 2주의 항온처리). 데스민 양성 근육 세포가 감소되는 경향이 나타났지만(1A군의 무신경 대조군에 비해), 대부분의 신생 조직에서 S100(쉬반 세포 마커)에 대하여 양성의 면역염색이 나타났다.

본 발명자들은 이전의 작업으로부터, 이러한 모델이 양호한 혈관형성 자극을제공함을 알고 있으며, 지금까지 본 발명자들은 이러한 모델이 근원세포의 생존, 확장 및 분화를 유지할 수 있음을 보여주었다. 혈관분포된 챔버는 또한 이 세포주를 지지할 수 있고, 선택된 세포가 정상적이고 예측된 방식으로 분화될 수 있는 최적의 환경을 제공할 수 있다. 조직학적 징후는 이식된 근원세포가 미오튜브를 형성하기 위해 생존하고 분화한다는 것을 증명하는데, 이 모델에서 상기 미오튜브는 나중에 유착하여 2주라는 짧은 기간동안 성숙한 골격근을 형성한다.

(b) 줄기세포 첨가

동일한 AV 루프 모델을 사용하여, 본 발명자들은 표지된 녹색 형광 단백질(GFP) 및 표지되지 않은 래트 골수-유래 줄기세포의 이들 챔버로의 진로에 대하여 연구하였다.

정상적인 염수를 흘려서 골수 유래의 간질 세포를 씻어서, 이 세포를 래트 대퇴골로부터 수집하였다. 이어서, 이들 세포를 표지하고, FACS 기계 상에서 정렬하였다. 20% 태아 송아지 혈청을 함유한 α-MEM 배지중에서 배양하여 이 간질 세포 소군집을 확장시켰다. 확장된 세포들을 녹색 형광 단백질(GFP) 및 네오마이신 플라스미드를 사용하여 레트로바이러스에 의해 형질감염시켜, 이들이 우리의 플랩내에서 추적가능하도록 하였다. 충분한 세포가 이용가능한 경우에는, 본 발명자들은 우리의 AV 루프 챔버 모델내로 매트리겔 0.5 ml당 2 x 10⁶의 농도로 이 세포를 배치하였다.

이들 줄기세포를 함유하는 챔버내에서, 매트리겔만을(n=8) 또는 매트리겔/PLGA(n=1) 및 매트릭스를 사용하여 9개의 AV 루프를 작제하였다.2주(n=4) 또는 4주(n=4)에서 래트를 검사하였다. 동결된 영역에서는, 이것이 진정한 GFP 형광인지 자가형광인지가 분명치 않았지만, 이들 표본에서 약간의 형광이 관찰되었다. 이후의 실험에서는, 우리의 GFP 표지된 플랩으로부터 얻어진 조직을 네오마이신이 농후한 배지 존재하에서 배양하였다. 챔버내에서 2주 및 4주 후 이러한 조건하에서 살아남은 GFP-표지 세포를 검출하였으나, 비-GFP-표지 세포는 이들 조건하에서 생존하지 못했다. 하지만, 지금까지 본 발명자들은 이들 이식된 세포로부터 생성된 새로운 조직에서 클론 형성 또는 특이적인 조직 표현형의 징후는 발견하지 못했다.

실시예 9

이식가능한 췌장 유기관을 형성하기 위한 래트 AV 루프 모델에서 챔버에 첨가된 췌장 세포

모든 실험은 동종번식된 스프라그-다울리 래트를 이용하여 수행하였다. 사용된 실험 모델, 즉 내용적이 0.5 ml인 폴리카르보네이트 챔버 내에 위치되며, 우측 서혜부내 정맥 이식편로 생성된 동정맥(AV) 누출관은 모든 실험을 통해 일정하게 유지하였다.

래트는 이전 실시예에서 기술한 바와 같이 처리 이전에 펜토바르비톤으로 마취시켰다. 이식을 위한 췌장 조직은 여러 가지 방법으로 제조하였다:

(a) "피콜 섬(Ficoll islets)" : 성체 공여 래트를 이용하였으며, 분리된 췌장은 시험관 내에서 콜라게나제 P(독일, 뵈링거 만하임)로 분해하고, 피콜 밀도 구배 상에서 원심분리에 의해 상기 섬을 분리하였다.

(b) "히스토파크 섬(Histopaque islet)" : 성체 공여 래트를 이용하였으며, 췌장의 맥관계는 생체 내에서 콜라게나제(미국 워싱턴 바이오케미칼스) 7 ml를 이용하여 1.3 U/ml로 관류하였다. 얻어진 섬은 분리하고, 히스토파크(참조: Liu 및 Shapiro, 1995)를 이용하여 정제하였다.

(c) "분해된 췌장" : 성체 공여 래트를 이용하였으며, 분리된 췌장은 시험관 내에서 콜라게나제 P(독일, 베링거 만하임)를 이용하여 분해하였으나, 얻어진 제제는 임의의 추가 처리를 수행하지 않았다.

(d) "여과된 췌장" : 성체 공여 래트를 이용하였으며, 분리된 췌장은 효소적으로 분해하지 않고, 단지 균질화하였으며, 미정제 추출물은 상이한 크기 범위의 필터를 통해 체질하였다. 450 ㎛ 필터는 통과하나 100 ㎛ 필터는 통과하지 못하는 분획은 추가 실험에 사용하였다.

섬 제제를 씨딩하기 위해 지지체로서 사용한 세포외 매트릭스는 다음과 같은 구성중 하나를 사용하였다:

(i) 챔버는 매트리겔로 충전하였으며, 섬은 완전히 분산시켰다.

(ii) 챔버는 매트리겔로 충전하였으며, 섬/췌장 조직은 챔버/AV 루프의 중앙에 위치시켰다.

(iii) 섬/췌장 조직을 함유하는 매트리겔 150 ㎕는 AV 루프에 근접한 챔버의 중앙에 위치시켰다.

(iv) 섬/췌장 조직을 함유하는 래트 혈장 응고물 150 ㎕는 AV 루프에 근접한 챔버의 중앙에 위치시켰다.

실험군은 다음과 같이 구성하였다:

제1 군. 노령(400-500 g)의 동종번식된 스프라그 다울리 래트를 사용하였다. "피콜 섬"은 매트리겔 내에 위치시켰다. 3마리의 수용 래트를 이용하였다. 본 발명자들은 2.5:1(공여자:수용자)의 비율로 사용하였으며, 10일 내지 17일 동안 항온처리하였다.

제2 군. 노령(400-500 g)의 동종번식된 래트를 사용하였다. "분해된 췌장"은 매트리겔 내에 위치시켰다. 3마리의 수용 래트를 이용하였다. 본 발명자들은 1:1(공여자:수용자)의 비율로 사용하였으며, 11일 동안 항온처리하였다.

제3 군. 성체(230-260 g) 동종번식된 래트를 이용하였다. "분해된 췌장"은 매트리겔 내에 위치시켰다. 6마리의 수용 래트를 이용하였다. 본 발명자들은 1:1(공여자:수용자)의 비율로 사용하였으며, 7일 내지 14일 동안 항온처리하였다.

제4 군. 성체(230-260 g) 동종번식된 래트를 이용하였다. "히스토파크 섬"은 매트리겔 내에 위치시켰다. 8마리의 수용 래트를 이용하였다. 본 발명자들은 1:1 및 4:1(공여자:수용자)의 비율 둘 다 사용하였으며, 6일 내지 21일 동안 항온처리하였다.

제5 군. 성체(230-260 g) 동종번식된 래트를 이용하였다. "여과된 췌장"은 혈장 응고물 내에 위치시켰다. 8마리의 수용 래트를 이용하였다. 본 발명자들은 1:2(공여자:수용자)의 비율로 사용하였으며, 8일 내지 24일 동안 항온처리하였다.

시험관내 실험

섬은 매트리겔 내의 배양물중에 유지하였는데, DMEM 배지를 주 2회 교환하는동시에 상기한 바와 같이 생체내 시험을 통해 배양액 중에서 섬의 수명을 테스트하였다. 1개월 및 2개월에 상기 몇가지 배양물에 대해 인슐린 면역염색을 수행하여 양성 염색 결과를 얻었다.

혈청 인슐린 수치 측정

챔버 수거시, 루프 동맥 및 정맥과 전신성 정맥 순환으로터 혈액 샘플(100 ㎕)을 채취하고, 래트 동형태에 대한 방사능면역분석법을 이용하여 인슐린 수치를 측정하였다.

챔버 수거 및 플랩 조작

챔버는 상기 시점에서 수거하였으며, 조직은 완충 규정 염수 및 일반적인 조직학적 제제 내에서 보존하였으며, 이어서 파라핀에 매립하였다. 조직학적 절편은 일반적인 염색(H&E) 및 면역염색(인슐린 및 글루카곤용)하였다.

시험관내 배양

섬의 생존은 배양중 4주 및 8주에 확인하였다. H&E 염색 및 인슐린 염색 결과 이들 시점에서 기능적인 생존이 확인되었다. 섬 클러스터는 4주와 8주 사이에 개개의 세포 및 세포의 덩어리로 분리되기 시작하였다.

혈청 인슐린 수치

혈청 인슐린 수치는 상기한 제3 실험군 및 제4 실험군에서 테스트하였다. 정맥(유출)혈은 대부분의 동물에서 동맥(유입) 혈청내에서의 인슐린 수치 보다 30 내지 50% 더 낮은 혈청 인슐린 수치를 나타냈다. 두 동물에서, 인슐린 수치는 정맥계에서 40% 내지 100% 더 높았다.

챔버의 분석

상기 챔버내의 조직은 4개의 부분으로 나누고, 일련의 절편을 제조하였다. 다량의 혈관 형성 및 콜라겐 침착을 확인하였으며, 이는 최초 모델에 부합하는 것이었다. H&E 염색 결과, 모든 실험군에서 종종 섬 유존(遺存)이 확인되었으나, 모든 플랩에서 확인된 것은 아니었다. 염증성 침윤은 대부분의 플랩 내에 존재하였는데, 이는 주로 림프구로 구성되어 있었다. 확인성 면역조직화학법은 수행하지 않았음에도 불구하고, 도관 요소는 제5 실험군인 "여과된 췌장" 챔버에서 관찰되었다. 인슐린 및 글루카곤 면역조직화학법을 수행한 결과, 종종 양성 염색, 특히 글루카곤에 대해 양성 염색이 확인되었다.

이들 실험 결과, AV 루프 챔버 모델은 최대 24일까지의 기간 동안 상당한 수의 구성물에서 섬의 생존을 지지하는 적합한 환경을 생성함을 확인할 수 있었다. 인슐린 및 글루카곤 생성은 상기 동일한 기간 중에 조직의 조직학적 절편의 면역염색에 의해 확인하였다. 그러나, 이 새로운 "유기관"의 장기간의 생존능 및 그의 계속된 인슐린 생성은 평가해야할 문제로 남아있다.

실시예 10

대형 챔버를 이용하는 래트 모델에서 조직 양의 증가

(a) 래트 실험

표준 챔버 모델을 이용하여 래트에서 생성된 조직의 양(∼0.3 ml)은 상기 동물의 신체 크기에 비해 꽤 상당한 양이며, 신체 내의 작은 "흉부" 또는 작은 "장기"에 상응하는 것이었다. 인간에서 이러한 발견을 재현하기 위해, 조직 생성의 한계를 테스트하는 것은 필수적이다. 이는, 더 큰 용적의 챔버를 사용함으로써 래트에서 먼저 수행될 수 있다. 따라서, 본 연구의 목표는 더 큰 챔버 내부에서 더 많은 양의 조직이 더 오랜 시간(4 내지 8주) 동안에 걸쳐 성장할 수 있는지 여부를 조사하는 것이었다. 이러한 방식으로, 상기 방법이 필요에 따라 그 자신의 혈관경 상에서 동일한 개체의 다른 부분으로 이전할 수 있는 임상적으로 유용한 양의 신생 조직을 생성하는데 사용할 수 있음을 제안하였다.

밀봉된 성장 챔버 내의 동정맥(AV) 단락 루프의 기본 모델은 실시예 1에 상세히 기술되어 있다. 상기 AV 단락은 돔형 챔버 내에 위치시켰다(도 2). 상기 챔버는 폴리카르보네이트로 제조되어 있으며, 상기 혈관경을 위한 인접 개구를 보유하며, 기판과 리드도 갖추고 있다. 기부 직경은 17 mm이며, 기부의 중심에서 돔 상부까지의 거리는 1.3 mm이며, 내용적은 1.9 ml였다. 대조적으로, 이전의 연구에서 기술된 표준 챔버(예를 들어, 실시예 1 및 2)의 용적은 0.5 ml였다. 상기 AV 단락은 2개의 주문제작한 PLGA 디스크 사이에 개재되어 있는데, 이 디스크는 챔버를 충전하기 위한 매트릭스로서 사용되었다. 상기 PLGA는 문헌(참조: Patrick 등, 1999)에 기술된 바와 같은 염 침출법에 따라 제조하였다. 공극 크기는 300 내지 420 nm이며, 공극률은 80 내지 90%였다. 상기 디스크는 100% 에탄올 내에서 30분 동안 4 사이클의 기계적 교반에 의해 멸균하였으며, 이어서 사용 전에 인산염 완충 염수로 3회 멸균하였다.

상기 챔버내에 루프를 위치시킨 후, 챔버의 리드를 닫고 서혜부 피부 아래에 매립시키고 3개의 6-0 프롤렌 유지 봉합사로 봉합하였다. 환부는 4-0 실크 봉합사로 봉합하였다. 일반적인 마취 상태에서 항온처리 2주, 4주, 6주 및 8주에 래트로부터 챔버를 수거하여 추가 분석하였다(1군당 n=6). 최종적으로 상기 동물은 과량의 레토바르브(3 ml)를 심장내 주사하여 치사시켰다.

전재(whole mount) 표본은 완충 규정 염수(BFS)내에서 고정하고, 1 mm 조각으로 절단하였다. 이들 조각의 1/2은 번갈아 파라핀 내에 매립시켰으며, 새롭게 형성된 조직 및 그의 맥관계의 성숙도를 조직학적으로 비교하기 위해 H&E로 염색하였다. 이들 조각의 나머지 1/2은 100% 에탄올 내에 저장하였으며, 격자 상에서 점 계수를 위해 사용하여 표본 내에 새롭게 형성된 조직, 잔류 PLGA 및 AV 루프의 백분율을 평가하였다. 100개의 점으로 이루어진 모든 5번째 필드는 각 조직 조각의 전방 및 후방에서 계수하였다. 이 목적을 위해, 상기 조각은 계수하기 전에 해마톡실린에 가볍게 침지시켰다. 이는 새롭게 형성된 조직을 PLGA와 구별하는 것을 가능하게 해준다. 격자 상에서 점 계수의 결과를 통해 새롭게 형성된 조직, 잔류 PLGA 및 AV 루프의 백분율을 조사하였으며, 이를 2주, 4주, 6주 및 8주의 결과와 비교하였다. 새롭게 형성된 조직 중량과 PLGA 중량의 시간 경과에 따른 통계학적 차이는 통계학적 유의값이 p<0.05인 스튜던트 t-테스트를 이용하여 계산하였다.

중량 및 용적 측정: 챔버로부터 수거한 모든 표본은 용적과 부피에 대해 평가하였다. 유체 변이(fluid displacement)에 의해 측정한 표본의 용적은 측정된 중량과 통계학적으로 현저히 상이하지 않았다. 표본의 총 평균 중량(부피와 균등함)은 시간이 경과함에 따라 점차 감소하였다. 각 표본 군의 총 평균 중량 ±표준 오차(SD)는 각각 2주, 4주, 6주 및 8주에서 1.07±0.06, 1.03±0.06, 0.96±0.06 및0.81±0.18 g이었다. 이는 4주 또는 그 이상의 벌어진 시점 사이에 표본 중량의 통계학적으로 유의적인 감소를 야기시켰는데, 이는 PLGA 매트릭스의 점진적인 재흡착에 기인한 것일 수 있다.

상기 표본 내의 PLGA 및 조직의 양을 연구하여 그들과 표본의 전체적인 중량 감소와의 관련성을 평가하였다. 모든 표본은 격자와 현미경을 이용하여 점 계수하여 PLGA 또는 조직에 의해 점유되고 있는 표본의 백분율을 결정하였다. 표본 습윤 중량의 감소는 PLGA의 재흡착에 2주, 4주, 6주 및 8주에서 PLGA의 총 평균 중량 ±SD는 각각 0.89±0.07, 0.56±0.14, 0.34±0.07 및 0.20±0.09 g이었다. 한편, 상기 표본의 새롭게 형성된 조직 성분은 시간이 경과함에 따라 중량의 점진적인 증가를 나타냈다. 2주, 4주, 6주 및 8주에서 조직의 총 평균 중량±SD는 0.13±0.04, 0.42±0.09, 0.57±0.06 및 0.58±0.10 g이었다.조직 중량의 증가는 모든 연속적인 기간(6주 및 8주 범위는 제외함)에서 통계적으로 유의적이었다(p<0.05). 상기 6 내지 8주의 기간에 걸쳐, PLGA로 충전된 더 작은 크기의 챔버 내에서 수행한 이전 실험(실시예 5)에서 고지한 바와 같이 조직 성장은 감소되지 않았음에도 불구하고, 조직 성장은 정점에 이르렀다.

거시적 발견 : 인디아-잉크 주사후, 조직 처리 중에 신생혈관분포를 용이하게 확인할 수 있다. 신생 맥관계는 어떤 시점에서도 PLGA 스캐폴드의 외측 가장자리에 도달하지 않았다. 그러나, 본 발명자들은 챔버를 래트 내에서 10분 동안 부주의하게 방치하여 한가지 뜻하지 않은 발견을 하게 되었다. 수거하였을 때, 상기 챔버는 완전히 연질의 결합 조직으로 가득했으며, 이는 혈관분포가 양호하게 이루어졌고, 조직 "플랩"에 개방 혈관에 의한 영양 공급이 이루어졌음을 의미하는 것이다.

(b) 래빗 파일롯 실험

래트 실험에서 얻은 예비적인 결과로부터 대형 챔버가 표준 챔버 보다는 조직을 더 오랜 기간 동안 더 성장시킬 수 있음을 확인하였다. 대형 챔버의 벽에는 다수의 구멍을 천공하는 경우, 신생 조직 성장 속도, 생성된 조직의 양 및 상기 챔버의 가장자리에 대한 성장에서 추가의 개선이 이루어졌다(참조: Tanaka Y, 2000 미공개 발견). 이들 후자의 조건은 상기 모델에서 조직 성장을 위한 최적 조건에 접근한다. 본 파일롯 연구의 중요 목표는 조직 생성이 래트 크기의 8 내지 10배 크기의 동물에서 스케일업될 수 있는지 여부를 평가하는 것이며, 또한 상기 조직이 그 크기와 형태로 유지될 수 있는지 여부를 평가하는 것이다.

사용된 실험 모델은 밀봉된 성장 챔버 내의 기본적인 AV 단락 루프이나, 실험 동물은 뉴질랜드 화이트 래빗을 사용하였다.

카르프로펜(1.5 mg/kg, 피하주입)의 형태로 처리전 진통제를 투여하였다. 뉴질랜드 화이트 래빗(2.0 내지 2.8 kg)은 펜토바르비톤(30 mg/kg)을 정맥내 주사하여 마취시켰으며, 할로탄 및 산소(2.0 ℓ/분)를 이용하여 안면 마스크한 상태로 유지하였다. 멸균 조건 하에서, 4 내지 6 cm의 이식편(래빗)을 각각 좌측 대퇴부 정맥으로부터 수거하였으며, 분리된 우측 대퇴부 동맥 및 정맥의 인접 단부 사이에 AV 단락을 생성시키는데 사용하였다. 상기 AV 단락은 돔형 챔버(이 경우, 폴리우레탄으로 제조하였으며, 대략적인 치수는 직경 3.0 cm, 높이 2.0 cm이고, 혈관 투입및 유출용 개구가 구비되어 있음; 도 2 참조) 내에 위치시켰다. 몇몇 경우에, 래빗의 해부는 AV 루프 보다는 AV 경(莖)의 사용을 허용하는데, 그 이유는 상기 경을 둘러싸는 조직내의 작은 연결 혈관이 이를 자연 발생하는 유통 루프로 만들기 때문이다. 후자의 예에서, AV 혈류의 효과는 필적할만하나, 처리 시간 및 처리후 통증은 감소된다. 통상적인 배치에서, 상기 챔버는 챔버 벽에 다수의 천공이 구비되어 있다. 서혜부내 피하 지방은 지방세포 및 지방세포 생성 전구세포의 소스로 사용하였다(참조: Zuk 등, 2001). 상기 지방 조직은 18 게이지 바늘로 주사하여 미정제 슬러리로 형성하였다. 이들 세포는 동일한 래빗에서 얻은 것이며, 다시 동일한 래빗에 이식하였다.

챔버에 맞게 기계가공된 PLGA, 매트리겔, 1형 돼지 피부 콜라겐 또는 유사 적합한 조성물, 및 전지방세포가 풍부한 지방 조직 슬러리의 조합물로 제조된 3차원 매트릭스로 충전된 챔버내에 상기 AV 단락 루프 또는 경을 위치시켰다. 이어서, 상기 매트리겔은 겔화하였다. 리드를 덮고, 챔버를 서혜부 피부 아래에 매립하였다. 환부는 4-0 나일론 봉합사로 봉합하였다.

약 6-8주후, 동물을 다시 일반 마취시키고, 그의 관련 혈관을 가진 챔버는 서혜부 및 챔버로부터 제거하였다. 2개의 플랩은 지금까지 분석되어 왔다.

상기 챔버 내의 조직을 제거하고, 그의 습윤 중량을 기록하였다. 또한, 상기 조직은 미세 면 봉합사에 매달고, 균형을 맞추어 물이 담긴 비이커에 완전히 침지시켰다. 밀도가 1.00 g/ml로 추정되는 덩어리는 조직 용적이다. 표본은 완충 규정 염수(BFS) 내에 고정하고, 파라핀내에 매립하고, H&E 또는 매손의 트리크롬(결합조직 염색)으로 염색하였다.

성장 8주후에 생성된 신생 조직의 용적은 10 내지 11 ml 였다(챔버의 총 용적에 비교하면 12 ml로 예상됨). 상기 플랩의 조성은 지방 및 기타 결합 조직의 혼합물인 것으로 판명되었다. 동일한 암컷 래빗의 유두 밑에 상기 동물에서 중간 크기의 흉부를 구성하기에 충분한 용적을 이전하는 경우, 형태는 보존되었다(참조: 도 6).

본 발명자들은 래트 및 래빗에서 임상적으로 유용한 양의 조직 생성을 실현하였다. 따라서, 생성된 조직은 흉부 재구성 및 유사한 용도에 잠재적으로 적합한 크기와 형태를 가진 것이다. 그들의 관련된 개방 혈관을 가진 플랩과 같은 플랩은 잠재적으로 재구성을 목적으로 신체의 다른 부분에 이전될 수 있다.

실시예 11

마우스에서 혈관분포된 조직 조작의 신규 모델

조직 조작의 근본적인 과정을 조사하기 위해, 다음과 같은 이유로 인해 마우스 내에서 적합한 조직 조작 모델을 개발하는 것이 필요하다:

유전자 기법: 트랜스게닉 및 유전자 녹아웃 기법은 마우스에서 훨씬 더 진보되었으며, 본 발명자들은 이를 이용하여 성장 촉진제 및 억제제와 같은 조직 조작에 관련된 다수의 인자의 영향을 조사하였다.

줄기세포 생물학: 줄기세포는 모든 조직을 발생시키는 다능성 세포이며; 이들은 매우 내구성이 있으며, 따라서 이론적으로 상기 챔버의 적대적인 초기 허혈성 환경에 대한 내성을 가질 수 있다. 이러한 이유로 인해 줄기세포는 상기 챔버내에씨딩하기에 매력적인 세포이다. 줄기세포 생물학자는 특정 조직 유형을 생성시키려고 시도하는 마우스 모델에 씨딩할 수 있는 매우 다양한 줄기세포 아형을 마우스에서 클로닝하여 왔다.

비용: 또한, 마우스의 이용에는 상당한 비용적 잇점이 존재한다. 마우스의 구입, 사육 및 관리는 더 큰 동물에 드는 비용 보다 저렴하다. 또한, 성장 인자와 같은 고가의 실험 기자재의 이용을 줄일 수 있을 것이다.

본 발명자들은 마우스에서 이용하는 최적 기법을 결정하기 위해, 이전의 연구에서 혈관형성성으로 확인되어 온 맥관 배치의 2가지 상이한 유형을 조사하였다. 첫째는 혈행을 멈추게 한 대퇴부 동맥 및 정맥의 동정맥경(AVP)이며, 둘째는 "루프를 통한 유통"경(flow through loop pedicle; FTLP) 배치이다(참조: Morrison 등, 1990; 도 4).

래트 모델에서 사용하는 경우, 상기 폴리카르보네이트 챔버는 정밀수술용 동정맥 고유동 루프의 개방 속도에 좋지않은 영향을 미치지 않았다. 또한, 상기 챔버는 이들 동물에서 잘 용인되었다. 그러나, 이 물질은 경질이고, 느낄수 있을 정도로 날카로운 가장자리를 보유하고 있으며, 마우스 내에서 더 작은 직경의 도관 및 제안된 맥관 배치의 더 낮은 유속으로 인해 상기 동물 내에서 개방 속도에 좋지 않은 영향을 미칠 수 있다. 따라서, 폴리카르보네이트 챔버를 더 부드러운 실리콘 챔버와 비교하여 챔버를 구성하는데 어느 물질의 더 적합한지 결정하였다. 또한, 본 발명자들은 래트 모델에서 사용한 2개의 주요한 세포외 매트릭스(매트리겔과 PLGA)를 비교하여 마우스에서 어느 것이 혈관생성과 조직 성장에 더 적합한지 판단하였다. 총 88마리의 C57BL/6 야생형 마우스(수컷 및 암컷; 체중 18-24 g)를 사용하여 본 실험을 수행하였다.

먼저, 특이적으로 구성된 폴리카르보네이트 챔버를 이용하여 2개의 맥관 배치를 조사하였다. 첫째는 래트에서 문헌(참조: Khouri 등, 1993)에 기술된 바와 같이 마우스 대퇴부 동맥 및 정맥의 혈행을 멈추게 한 AVP 였다(도 3). 둘째는 문헌(참조: Morrison 등, 1990)에 기술된 바와 같은 폴리카르보네이트 챔버를 변형한 챔버내에 캡슐화된 표면 상복부 혈관을 포함하는 FTL 경이었다(도 4). 모든 맥관 배치에 대해 6마리의 동물로 이루어진 3개의 군이 존재하였다. 각각의 배치는 2주, 4주 및 6주에 조사하였다. 본 실험은 세포외 매트릭스로서 매트리겔(등록상표)과 PLGA를 이용하여 수행하였다(n = 2 x 2x 3 x 6 = 72).

모든 처리는 일반 마취 상태(클로랄 히드레이트, 체중 1 g당 4 mg, 복강내 투여)에서 수행하였다. 우측 서혜부 및 상각은 면도하고, 제모 크림을 이용하여 무모 상태를 유지하였다. 피부는 알콜 제제를 이용하여 탈오염화하였다. 혈행을 멈춘 경 기법은 서혜부 주름으로부터 피부를 통해 볼 수 있는 복재 혈관(saphenous vessel)으로부터 즉시 상쇄되는 무릎까지 수직 절개를 필요로한다. 상기 복재 혈관은 무릎에서 혈행을 멈추게한 후, 해부하였는데, 서혜부 인대에서 대퇴부 동맥의 기원으로 신경 역행이 일어나지 않도록 하였다. 상기 유통 모델은 서혜부 지방 패드 바로 위에 위치하는 횡방향 서혜부 절개부를 이용하여 수행하였다. 표면 상복부(SE) 혈관은 서혜부 지방 패드 내로의 그들의 진입과는 약 1 cm 거리의 대퇴부 혈관에서 그들의 기원으로부터 주변 조직 없이 절개하였다. 여기서, 상기 혈관은 그들 주위의 지방 및 선 조직에 영양 가지를 보내는 지방 패드를 통해 순환하였다. 이어서, 이들은 서혜부 인대의 측벽으로부터 지방 패드에 들어가기 위해 서혜부 인대의 측면에서 복부 벽을 천공하는 장골서혜부 혈관(신하동맥의 직접적인 가지)과 직접 문합하였다. 전체적인 지방 패드는 피부 및 하부 근육 없이도 움직이며, 차후에 챔버가 투입될 공간을 생성한다. 따라서, SE 혈관은 본 발명자들이 본 모델에서 장기간의 개방 속도를 증가시킬 것으로 느끼는 양 측면으로부터의 동맥성 유입 및 정맥성 유출을 보유한다. 본 발명자들의 지식에 따르면, 이는 상기 맥관 배열이 마우스에서 기술된 이래 처음 있는 일이다. 이어서 SE 혈관의 첫 cm(이 부분에 지방 패드는 없음)는 한쪽 측면에 틈이 있는 변경된 폴리카르보네이트 챔버 내에서 캡슐화되었으며, 적합한 세포외 매트릭스(매트리겔 또는 PLGA)는 상기 챔버 내에 삽입되었다. 이어서, 상기 챔버는 인접 단부에서 측면 틈을 따라 용융 골밀랍(에티론 본 왁스(상표명))을 이용하여 밀봉하였는데, 용융 골밀랍이 직접 혈관에 닿지 않도록 주의하면서 밀봉하였다. 상기 밀봉은 측면 틈의 한 단부에 위치된 10/0 나일론 미세봉합사에 의해 증강되었으며, 챔버 전체는 상기 SE 혈관의 기원 근처의 하부 근육에 고정시켜 처리후의 움직임에도 상기 경이 제거되는 것을 예방하였다. 혈관이 지방 패드 내로 진입하였을 때 상기 혈관을 둘러싸는 소량의 지방 조직은 상기 챔버의 이격 단부를 "막는(plug)"것이 가능하였다. 이어서, 이 플러그는 왁스 밀봉제로 강화하고, 전체적인 구성물은 서혜부내에 조심스럽게 위치시켜 대퇴부 혈관 측면의 절개된 공간에 자리잡도록 하였다. 환부는 매립 차단 매트리스 봉합사 및 러닝 봉합사(둘 다 6/0 실크)를 병용하여 봉합하였는데, 그 이유는이들 동물은 그들의 환부를 깨무는 경향이 있기 때문이다.

상기 결과에 대한 초기 분석 후, 혈행을 멈추게 한 AVP 군 각각에서 실험을 중단하였다. 그 이유는 혈전 생성 속도가 허용할 수 없을 정도로 높아졌고(11/14 동물), 이 라인의 추적 조사는 쓸모없고 동물을 낭비하는 것으로 생각되었기 때문이다. 이 관찰은 래트에서 수행한 코우리(Khouri)의 연구와 대조적인데, 래트와 래빗에서 본 발명자들의 경험은 대부분의 경우 혈행을 멈추게 한 AVP에서 명백한 것이었다. 본 발명자들의 연구에서 혈전 생성 속도가 높아지는 주원인은 마우스 혈관이 매우 작고(내경이 약 0.2 mm임), 절개에 매우 민감하기 때문일 것으로 생각된다. 또한, 상기 크기의 혈관에서의 유속은 매우 낮다. FTLP 군에서 혈전 생성 속도는 더 양호하나(3/11), 여전히 과도하게 높은 것으로 보인다.

본 발명자들은 사용하고 있는 폴리카르보네이트 물질이 마우스의 약한 혈관에 너무 경질이고, 날카로운 것으로 생각하였다. 본 발명자들은 실험 계획을 변경하여 의료용 실리콘으로 제조한 챔버를 보유한 동물 군집을 포함시켰다(이러한 변경은 동물 윤리 위원회의 승인을 득한 것이다). 4마리 동물의 3개 군으로 이루어진 2개의 군집(PLGA를 보유한 한 군집과 매트리겔(등록상표)을 보유한 또다른 한 군집)을 유통 맥관 배치만을 이용하는 상기 변경된 실험(n = 2 x 3 x 4 = 24)에 사용하였다. 표본의 용적과 중량에 대한 정확한 예상은 불가능한 것으로 판명되었다. 상기 챔버의 용적은 약 80 내지 100 ㎕였다. 이는 몇몇 이유, 예를 들어 상기 챔버의 도입 지점에 침입하는 왁스 또는 지방의 양에 따라 달라진다. 또한, 각 챔버내에 사용된 세포외 매트릭스의 정확한 용적을 측정하는 것은 어렵다. 매트리겔은 일반적으로 액체로 첨가되며, 생체 내에서 겔화된다. 챔버내로의 주입이나 조작중에 일부 유출이 발생할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 매트리겔의 용적이 처음 2주에 걸쳐 50% 이상 감소한 것에 주목하였는데, 제거된 표본의 크기는 삽입시의 크기 보다 실제로 더 작았다.

각 챔버에 사용된 PLGA의 중량은 정확히 측정할 수 있으나, 용적을 확인하는 것은 불가능하였는데, 그 이유는 상기 구조가 다공성이고, 작은 챔버 내에 장착하기 위해 조각으로 분해되어야 하기 때문이다. 이러한 부정확성으로 인해, 본 발명자들은 챔버 조직을 정량적으로 평가하려고 시도하지 않았으며, 상기 장치의 더 정성적인 측면, 예를 들어 새롭게 형성된 조직의 형태를 관찰하였다. 혈관의 개방성은 정밀수술 탐지 및 묵즙 관류 연구에 의해 결정하였다. 챔버 내에서 혈관에 광범위하게 혈전이 생성되는 경우, 일반적으로 작동 현미경으로 이를 관찰할 수 있다. 그러나, 최종적인 개방성을 확인하는 것이 항상 불가능한 것은 아니다. 따라서, 묵즙 관류 연구는 치사 이전에 각각의 동물을 일반적으로 마취한 상태에서 수행하였다. 작동 현미경 하에서, 서혜부 절개부를 다시 열어 경이 손상되지 않도록 조심스럽게 챔버를 노출시켰다. 이어서, 절개술을 처리하고, 복부 대동맥은 대정맥이 없도록 해부하고, 미세한(30G) 보어 실리콘 튜브를 이용하여 신장 혈관 바로 밑에 삽관하였다. 이어서, 이를 헤파린처리된 염수로 플러싱하여 상기 캐뉼라가 올바른 위치를 갖도록 하였다. 이어서, 상기 동물의 간이 완전히 흑색으로 변할때까지 수압을 이용하여 부드럽게 순수한 시판용 묵즙(10 IU 헤파린/ml을 함유함) 용액을 주입하였다. 또한, 이전의 연구 결과를 통해 이 용액 내에 젤라틴을 사용할 수도 있었으나, 그러한 기법을 예비적으로 시험해본 결과 본 발명자들은 젤라틴이 미세한 보어 튜브를 막는 덩어리를 형성함으로써 결과적으로 실험과정을 중단시킨다는 사실을 확인하였다(이러한 상황은 주입 이전에 젤라틴을 체온으로 가온하는 경우에도 발생하였다). 개방성은, 상기 묵즙이 혈관경을 따라 챔버내로 트랙킹하는 것을 명백히 확인할 수 있기 때문에, 투명 챔버의 직접적인 시각화를 통해 확인할 수 있었다. 이 실험후, 동물은 치사량 이상의 페노바르비톤으로 치사시키고, 챔버는 그들을 장치내로 도입할 때 처럼 플러싱하면서 조심스럽게 경(들)을 절단하여 제거하였다.

상기 표본은 포르말린에 고정하고, 등급 알콜 용액을 통해 무수 알콜내로 취하였다. 이어서, 이들은 메틸 살리실레이트 내에 침지하고, 72 시간 동안 세정하였다. 이는 묵즙로 관류된 혈관구조의 직접적인 시각화를 가능하게 해준다. 이어서, 모든 표본은 마이크로카터 하에서 전재 제제로 조사하였으며, 혈관 계수를 수행하였다. 그후, 표본은 조직학적 조사를 위해 처리하고, 왁스 내에 매립하였다. 이어서, 왁스 블록은 5 ㎛로 절단하고, 해마톡실린과 에오신을 이용하여 표준 방식으로 염색하였다. 혈관 면적 밀도는 이들 작은 조직 표본의 깊이 전체의 시각화를 가능하게 한 마이크로카터를 이용하여 모든 세정된 표본에 대해 산정하였다. 이들 필드는 500 ㎛의 3개의 깊이 간격에서 무작위 선택하였으며, 혈관 밀도는 입체측정 격자를 이용하여 평가하였다. 상기 과정을 완료한 후, 표본에 대해 조직학적 과정을 수행하였다. 염색된 절편은 혈관생성 및 새롭게 생성된 조직의 세포적 특징의 관점에서 형태학적으로 평가하였다. 개방 속도 및 혈관 밀도의 단변량 분석은 스튜던트t 테스트를 이용하여 수행하였다. 개방 속도는 2개의 맥관 배치에 대해 평가하였으며, 상기 챔버를 구성하는 데 사용한 상이한 물질에 대해 평가하였다.

혈행을 멈추게 한 동정맥경에 대한 개방 속도는 유통경에 대해 21% 대 88%였다. 폴리카르보네이트 챔버 내에서의 개방 속도(혈행을 멈추게 한 AV 경 군은 제외함)는 실리콘 챔버내의 개방 속도에 대해 88% 대 97%였다. 혈행을 멈추게 한 AVP 군에서의 신생 혈관은 챔버 외부로부터 상승하고, 혈전 생성된 경을 따라 성장하는 것으로 확인되었다. 유통 챔버 내에서의 혈관 밀도는 2주, 4주 및 6주에 유사하였다. 유사하게, PLGA와 매트리겔(등록상표) 간에 혈관 밀도의 차이는 없었다. 매트리겔(등록상표)과 PLGA 사이에 형태학적으로 양호한 혈관 생성이 존재하였으나, 정성적으로 매트리겔(등록상표)에서의 혈관 생성이 더 양호하였다. 신생 혈관은 매트리겔(등록상표) 내에서 더 많았으며, 그 내의 구성물 전체를 통해 발생하였다. PLGA 내에서의 혈관 생성은 중심에서 더 적은 혈관을 가진 구성물의 주변에 더 많았는데, 이는 ECM의 고체 특성에 기인하는 것이라 생각된다.

세포 형태의 관점에서, PLGA는 주로 섬유상 외래체 유형 반응을 촉진하는 것으로 보인다. 섬유아세포는 매트릭스가 챔버에 대해 위치하는 주변 및 매트릭스 물질내의 중심 둘다에서 현저히 관찰되는 세포이다. 또한, 매트리겔(등록상표) 군은 ECM-챔버 계면에서 섬유아세포성 응답을 나타냈다. 한편, 매트리겔(등록상표)의 중심은 매트릭스를 통해 명백히 이동되고 아마도 새롭게 생성된 혈관 구조에 의해 영양을 공급받아 생존하는 지방의 챔버내 존재를 나타낸다. 이 현상은 이전에 성장 인자와 전지방세포를 이용하는 마우스 내에서의 비캡슐화된 매트리겔(등록상표)에서 보고되어 왔다. 챔버내에 생존가능한 성숙 지방 세포의 존재는 이 모델이 지방세포 및 그들의 전구체의 이동, 성숙 및 재생을 지원할 수 있음을 암시하는 것이다. 암컷 동물에서, 지방 패드는 몇몇 유방 조직 및 관련 도관을 함유하는데, 이는 상기 조직이 "플러그"로서 사용되어 이격된 천공을 밀봉하는 챔버의 이격 단부에서 종종 발견되었다. 매트리겔 군에서, 본 발명자들은 이들 동물중 일부에서 흉부 도관/포상 조직은 매트리겔 내로 성장하는 것으로 보이며, 나머지 동물에서는 새롭게 형성되는 도관/포상 조직의 명백한 형태학적 증거가 존재하는 것을 관찰하였다. 이는 상기 챔버가 선 조직 뿐만 아니라 지방의 발생을 지지할 수 있음을 암시하는 것이다. 본 발명자들의 지식에 따르면 이는 이전에 보고되지 않은 것이다.

본 발명자들은 C57 임모르토(Immorto) 마우스로부터 배양한 마우스 중배엽성 줄기세포의 클론 및 또한 마우스 유방 종양 세포주를 상기 챔버에 씨딩하였다. 이들 둘 다는 형광 마커(GFP 또는 CFDA)로 표지하였으며, 본 발명자들은 이식된 세포가 48시간, 4일, 2주, 4주 및 8주에 생존하고 있음을 확인할 수 있었다. 유방 종양 세포주는 4주에 조직학적으로 조사하였는데, 그 결과 상기 챔버는 더 긴 기간 동안 세포주를 지지할 수 있었다. 또한, 본 발명자들은 면역결핍성 SCID 마우스에서 태아 췌장, 간, 심장, 장 및 사지 눈(limb bud)(합성 피부, 뼈, 연골, 혈관 및 신경)을 성공적으로 성장시켰다. 이뿐만 아니라 본 발명자들은 야생형 마우스(C57BL6) 내에서 배양된 성숙 췌도를 생존시키고, 2주 및 10주에 호르몬을 생성하는데 성공하였다. 이는 췌장 이식의 다른 모데에서 실현하지 못했던 이들 동물 내에서의 기능성 섬 동종이식편의 성장을 본 발명자들이 성공하시켰음을 효과적으로 의미하는것이다. 이는 상기 챔버가 그 내부에서 성장하는 세포에게 몇몇 면역특권 상태를 제공할 수 있음을 의미하는 것이다. 이는 당뇨병의 치료로서 국소 면역억제 또는 세르톨리세포 동시배양과 함께 또는 단독으로 상기 챔버 내에서 부합되지 않은 동종이식편 또는 심지어 이종이식편을 이용할 수 있다는 점에서 치료학적 의미를 갖고 있다.

지금까지 명료한 이해를 목적으로 본 발명을 다소 상세하게 기술하였지만, 당업자라면 본원에 기술된 발명의 범위를 벗어나지 않는 한도에서 본원에 기술한 실험과 방법에 변경과 변형을 가하여 실시할 수 있을 것이다.

본원에 참고 인용한 문헌의 목록은 다음과 같으며, 다시 한번 강조하지만 이들은 전적으로 참고 인용한 것이다.

참조 문헌

Claims (27)

1. 처치가 필요한 수용자 동물 내로 이식하기에 적합한 공여자 혈관분포된 조직을 생성하는 방법으로서,

   (a) 공여 피검자 내의 혈관경(血管莖)에 기능적인 순환을 생성시키는 단계;

   (b) 조립 챔버 내에 상기 혈관경을 부분적으로 또는 완전히 넣는 단계;

   (c) 분리된 세포 또는 조직 단편으로 상기 챔버를 씨딩하는 단계;

   (d) 그러한 해부학적 구성물이 생성될 수 있는 부위에서 공여 피검자내로 상기 혈관경을 함유하는 챔버를 이식하는 단계; 및

   (e) 혈관분포된 신생 조직을 성장시키기에 충분한 기간 동안 상기 챔버를 상기 이식 부위 내에 유지시키는 단계

   를 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계 이후에 첨가된 세포외 매트릭스 및/또는 기계적인 지지체로 혈광경을 둘러싸는 단계를 포함하는 것인 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 (b) 단계 이후에 상기 챔버에 하나 이상의 성장 인자, 약물, 항체, 억제제 또는 기타 화학물질을 첨가하는 단계를 포함하는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 혈관경이 동정맥 루프(AV loop) 또는 동정맥 단락(AV shunt)을 포함하는 것인 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 혈관경이 결찰된 동맥 및 정맥을 포함하는 것인 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 챔버는 4주 이상 동안 이식 부위 내에 유지시키는 것인 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 (e) 단계에서 챔버는 6주 이상 동안 이식 부위 내에 유지시키는 것인 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 챔버내에 함유된 생성된 혈관경은 체외 순환에 연결시키는 것인 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 공여 피검자가 포유동물인 방법.
10. 제9항에 있어서, 상기 포유동물이 인간인 방법.
11. 제1항에 있어서, 상기 혈관분포된 신생 조직을 자가 수용자 내로 이식하는 단계를 포함하는 방법.
12. 제1항에 있어서, 상기 혈관분포된 신생 조직을 이종 수용자 내로 이식하는 단계를 포함하는 방법.
13. 제2항에 있어서, 상기 첨가된 세포외 매트릭스는 재구성된 기저막 제제물, 폴리락트산-폴리글리콜산 변형체(PLGA), 피브린 또는 혈장 접착제, 및 천연 콜라겐으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 PLGA는 PLGA 스폰지를 포함하는 것인 방법.
15. 제3항에 있어서, 상기 챔버에 첨가된 추가의 성장 인자, 약물, 항체, 억제제 또는 기타 화학물질은 성장 인자, 순환으로부터 줄기세포를 유인하는 유도 인자, 외인성 성장 인자 및 혈관형성 또는 맥관형성 촉진인자로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
16. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 분리된 세포 또는 조직 단편은 숙주에 대해 자가 물질인 방법.
17. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 분리된 세포 또는 조직 단편은 숙주에 대해 이종 물질인 방법.
18. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계의 분리된 세포 또는 조직 단편은 줄기세포, 허혈성 골격근 조직, Myo-D로 형질감염된 근원세포, 각질세포, 근원세포, 섬유아세포, 전지방세포, 지방세포, 심근세포, 내피세포, 평활근세포, 연골세포, 혈관주의세포, 골수 유도된 간질 전구세포, 말초신경계와 중추신경계의 쉬반세포 및 기타 세포, 후각세포, 줄기세포 및 간의 기타 세포, 신장의 사구체 간질세포 및 기타 세포, 갑상선세포, 기타 내분비 기관의 세포, 골격근 또는 심근의 일부, 췌장, 간, 정소 및 기타 피하 지방, 신경, 신장, 장, 난소, 자궁, 고환, 및 내분비 기관의 선 조직으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
19. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 혈관경에 대한 기능적 순환이 동맥 및 정맥을 포함하는 것인 방법.
20. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 혈관경에 대한 기능적 순환이 동맥, 정맥 이식편 및 정맥을 포함하는 것인 방법.
21. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 혈관경에 대한 기능적 순환이 동맥, 정맥 이식편, 동맥 이식편 및 정맥을 포함하는 것인 방법.
22. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 혈관경에 대한 기능적 순환이 옆으로 나란히 배치된 동맥 및 정맥의 결찰된 스텀프를 포함하는 것인 방법.
23. 제1항의 방법에 의해 생성된 혈관분포된 조직 이식편.
24. (a) 제23항의 혈관분포된 조직 이식편을 생성하는 단계;

    (b) 소정의 크기, 혈관분포 및 분화도를 가진 조직을 생성하기에 충분한 기간 동안 공여 피검자 내에 상기 이식편을 유지시키는 단계;

    (c) 수용자의 소정 부위에 상기 이식편을 전달하는 단계; 및

    (d) 국소 동맥 및 정맥에 상기 이식편의 혈관을 문합하는 단계

    를 포함하는, 조직 결손의 수복 방법.
25. (a) 제23항의 혈관분포된 조직 이식편을 생성하는 단계;

    (b) 소정의 크기, 혈관분포 및 분화도를 가진 조직을 생성하기에 충분한 기간 동안 공여 피검자 내에 상기 이식편을 유지시키는 단계;

    (c) 수용자의 소정 부위에 상기 이식편을 전달하는 단계; 및

    (d) 국소 동맥 및 정맥에 상기 이식편의 혈관을 문합하는 단계

    를 포함하는, 조직 증강 방법
26. (a) 제1항의 방법에 따른 조직 챔버 내에 혈관분포된 조직을 생성하는 단계;

    (b) 혈관분포된 조직을 보유한 챔버를 제거하고 시험관 내에서 챔버 어셈블리를 배양하는 단계;

    (c) 소정 유전자를 보유한 챔버 내에서 상기 조직의 세포를 형질전환하는 단계; 및

    (d) 이러한 처치가 필요한 환자내로 챔버와 함께 또는 챔버없이 혈관분포된 조직을 이식하는 단계

    를 포함하는, 피검자내로 유전자 생성물을 전달하는 방법.
27. 제1항의 방법에 의해 생성된 분리된 혈관경을 포함하는 조직 챔버를 포함하는 혈관분포된 조직을 위한 모델 시스템으로서, 상기 조직 챔버는 체외 순환 장치 및 신장 투석 필터에 작동가능하게 연결되어 있는 것인 모델 시스템.