DE69219613T2

DE69219613T2 - Vorvaskularisierte polymerimplantate für organtransplantation

Info

Publication number: DE69219613T2
Application number: DE69219613T
Authority: DE
Inventors: James Gilbert; Donald Ingber; Robert Langer; James Stein; Joseph Vacanti
Original assignee: Childrens Medical Center Corp; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Childrens Medical Center Corp; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1991-10-30
Filing date: 1992-10-28
Publication date: 1997-11-27
Anticipated expiration: 2012-10-29
Also published as: CA2121040A1; ATE152631T1; JPH07508663A; JP2002200162A; DE69219613D1; EP0610423A1; WO1993008850A1; EP0610423B1; JP3524919B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Diese Erfindung liegt allgemein auf dem Gebiet der Medizin und Zellkultur und insbesondere auf dem Gebiet implantierbarer Organe, die auf biologisch kompatiblen künstlichen Matrices gebildet werden.
Der Verlust einer Organfunktion kann sich aufgrund von Erbdefekten, Verletzungen oder Krankheit ergeben. Oft reicht eine Behandlung mit Arzneimitteln oder ein chirurgischer Eingriff selbst nicht aus und der Patient stirbt oder bleibt stark beeinträchtigt. Ein Ansatz zur Behandlung war bisher die Transplantation von Spenderorganen oder -gewebe auf den Patienten. Arzneimittel wie Cyclosporin können zur Verhinderung einer Gewebeabstoßung verwendet werden. Es besteht jedoch eine gewaltige Verknappung an Spenderorganen, von welchen die meisten von einem kurz zuvor verstorbenen Individuum stammen müssen.
Es gab eine Anzahl Versuche, abgetrenntes Gewebe zu kultivieren und die Zellen direkt in den Körper einzupflanzen. Beispielsweise wurde die Transplantation von Pankreasgewebe, entweder als ganzes Organ oder als Teil eines Organs, an einem diabetischen Patienten versucht. Unter Verwendung dieser Technik läßt sich offensichtlich Serumglucose stärker physiologischen Verhältnissen entsprechend steuern. Das Fortschreiten von Komplikationen läßt sich dadurch verlangsamen. Ein früherer Versuch, mit Hilfe dessen jedoch keine langanhaltende Besserung erreicht werden konnte, bestand in der Transplantation von Inselzellen durch Injizieren isolierter Cluster von Inselzellen in den Pfortaderkreislauf mit Implantation in das Gefäßbett der Leber. Neuere Verfahren umfaßten das Umhüllen von β-Zellen aus der Bauchspeicheldrüse zur Verhinderung eines Immunangriffs durch den Empfänger und das Injizieren von β-Zellen eines Fötus unter die Nierenhülle. Obwohl sich ein kurzzeitiges Funktionieren zeigte, waren die Langzeitergebnisse weniger zufriedenstellend (D.E.R. Sutherland, Diabetologia 20, 161-185 (1981); D.E.R. Sutherland, Diabetologia 20, 435-500 (1981)). Zur Zeit ist die Transplantation des ganzen Organs Bauchspeicheldrüse die bevorzugte Behandlung.
Eines der Probleme bei der Implantation abgetrennter Zellen in den Körper besteht darin, daß diese keine dreidimensionalen Strukturen ausbilden und Zellen durch Phagocytose und Zerreibung verlorengehen. Ein Versuch zur Lösung dieses Problems wird durch das US-Patent Nr. von Lim, in welchem Zellen in Kügelchen eingeschlossen und dann implantiert werden, beschrieben. Bei diesem Verfahren lassen sich zwar manchmal lebensfähige funktionierende Zellen erhalten; die Zellen bilden jedoch keine Organe oder Strukturen und es ergibt sich selten ein langfristiges Überleben und eine langfristige Replikation der eingeschlossenen Zellen. Die meisten Zellen bedürfen zum Zwecke der Replikation und des Arbeitens des Anhaftens an eine Oberfläche.
Die ersten Versuche zum Züchten von Zellen auf einer Matrix zur Verwendung als künstliche Haut, wobei die Bildung einer dünnen dreidimensionalen Struktur erforderlich ist, wurden von Yannas und Bell in einer Reihe von Veröffentlichungen beschrieben. Sie verwendeten collagenartige Strukturen, welche mit Zellen beimpft und dann über die entblößte Fläche placiert wurden. Ein Problem bei der Verwendung der Collagenmatrices bestand darin, daß sich die Geschwindigkeit des Abbaus nicht gut steuern läßt. Ein weiteres Problem bestand darin, daß in das Innere dicker Stücke der Collagenmatrix implantierte Zellen nicht überlebten.
Ein Verfahren zur Bildung von künstlicher Haut durch Beimpfen eines faserartigen Gitters mit Epidermiszellen wird im US-Patent Nr. 4 485 097 von Bell, das ein in Kombination mit Kontraktionsmitteln, wie Plättchen und Fibroblasten, und Zellen, wie Keratinozyten, zur Herstellung eines Hautäquivalents verwendetes hydratisiertes Collagengitter umfaßt, beschrieben. US-Patent Nr. 4 060 081 von Yannas et al. beschreibt eine als synthetische Haut verwendbare Mehrschichtmembran, die aus einem in Gegenwart von Körperflüssigkeiten und Enzymen nicht abbaubaren unlöslichen nicht immunogenen Material, z.B. quervernetzten Verbundmaterialien aus Collagen und einem Mucopolysaccharid, gebildet wird, wobei dieses Material mit einem nicht-toxischen Material, z.B. einem synthetischen Polymer, zur Steuerung des Feuchtigkeitsflusses der Gesamtmembran überzogen ist. US-Patent Nr. 4 458 678 von Yannas et al. beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines hautäquivalenten Materials, in welchem ein aus mit Glycosaminoglycan quervernetztem Collagen gebildetes faserförmiges Gitter mit Epidermiszellen beimpft ist.
Ein Nachteil der ersten beiden Methoden besteht darin, daß die Matrix aus einem "permanenten" synthetischen Polymer gebildet ist. Das '678-Patent weist ein Merkmal auf, das keines der beiden vorherigen Patente zeigt, nämlich eine biologisch abbaubare Matrix, die unter Verwendung der geeigneten Zellen zur Herstellung eines Organs, wie der Haut, in einer beliebigen Form gebildet werden kann. Ungünstigerweise lassen sich die Zusammensetzung und die Konfiguration der letzteren Matrices, da sie primär auf Collagen-Basis beruhen, nicht steuern. Da Collagen ferner sowohl unter enzymatischem Einfluß als auch im Laufe der Zeit durch Hydrolyse abgebaut wird, erfolgt der Abbau in sehr unterschiedlichem Ausmaß.
US-Patent Nr. 4 520 821 von Schmidt beschreibt einen ähnlichen Ansatz, der zur Bildung von Leitungen zum Reparieren von Defekten im Harnsystem verwendet wurde. Epithelzellen wurden auf synthetische Matrices implantiert, wo sie während des Abbaus der Matrix eine neue röhrenförmige Leitung bildeten. Die Matrix erfüllte einen zweifachen Zweck - Zurückhalten von Flüssigkeit während der Replikation der Zellen und Halten und Leiten der Zellen bei der Replikation.
In EP-0 299 010 mit dem Titel "Chimeric Neomorphogenesis of Organs Using Artificial Matrices", das am 20. November 1986 an Josef P. Vacanti und Robert S. Langer erteilt wurde, wurde ein Verfahren zum Züchten abgetrennter Zellen auf biologisch kompatiblen, biologisch abbaubaren Matrices zur späteren Implantation in den Körper beschrieben. Dieses Verfahren war darauf angelegt, ein bei früheren Versuchen auftretendes Hauptproblem, Zellen zur Bildung von dreidimensionalen Strukturen mit einem größeren Durchmesser als Haut zu züchten, zu lösen. Vacanti und Langer erkannten, daß bei einer zur Bildung von Organen verwendeten Matrix zwei Elemente vorliegen mußten: eine zur Implantation eines großen Zellvolumens in den Körper adäquate Struktur und Oberfläche, um die verlorengegangene Funktion zu ersetzen, und eine Matrix, die so ausgebildet war, daß beim Anhaften und Wachsen der Zellen eine adäquate Diffusion von Gasen und Nährstoffen durch die Matrix zum Aufrechterhalten der Lebensfähigkeit bei Fehlen einer Gefäßbildung möglich war. Nach der Implantation und Gefäßbildung war die zur Diffusion der Nährstoffe und Gase erforderliche Porosität nicht mehr kritisch.
Jedoch selbst bei dem von Vacanti beschriebenen Verfahren wurde das Implantat zuerst in vitro aufgebaut und dann implantiert. Es wäre sehr wünschenswert, die in-vitro-Stufe vermeiden zu können. EP-0 422 209 von Vacanti et al. beschreibt einen Ansatz, mit dem dieses Problem angegangen wird. Im Hinblick auf die Notwendigkeit der Gefäßbildung zum Behalten des Implantats in vitro, mit der sich zuerst die Patentanmeldung von Vacanti et al. 1986 befaßt hatte, wurde das Implantat in vitro beimpft und dann sofort in ein gefäßreiches Gewebe, das Mesenterium, implantiert. Ein Nachteil bestand hierbei darin, daß das Implantat nur in dieser Körperfläche hergestellt werden und daß eine Reihe dünner Implantate zum Erzielen der erforderlichen Zellenzahl verwendet werden mußte.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung eines Implantats, welches die erforderliche Zellenzahl zum Ersatz einer verlorengegangenen Organfunktion umfaßt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ferner die Bereitstellung eines biologisch kompatiblen, polymeren Implantats, welches mit Zellen ohne vorherige in-vitro-Kultur implantiert werden kann und sich dann mit gesteuerter Geschwindigkeit während einer gewissen Zeitspanne während der Replikation und Ausbildung einer Organstruktur der implantierten Zellen abbaut.

Zusammenfassung der Erfindung

Es wird ein Verfahren angegeben, bei welchem Zellen mit einer gewünschten Funktion auf und in ein biologisch kompatibles, biologisch abbaubares oder nicht abbaubares Polymergerüst, welches zuvor einem Patienten implantiert wurde und welches von Blutgefäßen und Bindegewebe durchzogen ist, geimpft werden, wobei ein funktionsfähiges Organäquivalent hergestellt wird. Das hierbei entstehende Organoid stellt eine aus Parenchymelementen des Spendergewebes und Gefäß- und Matrixelementen des Empfängers gebildete Chimäre dar.
Die Matrix sollte aus einem biegsamen nichttoxischen, injizierbaren porösen Templat zum Gefäßeinwachsen bestehen. Aufgrund der Porengröße, gewöhnlich zwischen etwa 100 und 300 µm, sollte ein Einwachsen von Gefäßen und Bindegewebe in etwa 10 bis 90% der Matrix und das Injizieren von Zellen, wie Leberzellen, ohne Schädigung der Zellen oder des Patienten möglich sein. Die eingeführten Zellen haften am Bindegewebe und werden durch die Blutgefäße ernährt. Das bevorzugte Material zur Ausbildung der Matrix oder der Trägerstruktur ist ein biologisch abbaubares synthetisches Polymer, z.B. Polyglykolsäure, Polymilchsäure, Polyorthoester, Polyanhydrid oder deren Copolymere oder ein aus Polyvinylalkohol abgeleiteter Schwamm. Die Elemente aus diesen Materialien können mit einem zweiten Stoff zur Verstärkung der Zellhaftung beschichtet sein. Die Polymermatrix muß so konfiguriert sein, daß zur Bildung zum Anheften der zur Lebens- und Funktionsfähigkeit erforderlichen Zellenzahl adäquater Stellen einwachsende Gewebe erreicht werden können und eine Vaskularisierung und Diffusion von Nährstoffen zum Erhalten der ursprünglich implantierten Zellen möglich ist. Ein Vorteil des biologisch abbaubaren Materials besteht darin, daß Verbindungen, z.B. angiogene Faktoren - biologisch aktive Verbindungen, die das Einwachsen der Blutgefäße verstärken oder ermöglichen - und lymphatisches Gewebe oder Nervenfasern, in die Matrix zur langsamen Freisetzung während des Abbaus der Matrix eingearbeitet werden können.
Zellen einer oder mehrerer Arten können ausgewählt und auf der Matrix wachsen gelassen werden. Eine bevorzugte Zellart sind Parenchymzellen, z.B. Leberzellen, die unter Normalbedingungen schwierig zu züchten sind. Gentechnisch derart veränderte Zellen, daß sie Gene enthalten, die sonst nicht vorhandene Proteine - z.B. bei Leberproteinmangelzuständen und Stoffwechseldefekten, wie cystischer Fibrose, - kodieren, können durch dieses Verfahren implantiert werden.
Bei der bevorzugten Ausführungsform zur Implantation von Zellen mit hohem Sauerstoffbedarf, z.B. Leberzellen, wird das einen innewohnenden Katheter enthaltende poröse Implantat in das Mesenterium implantiert, eine bestimmte Zeitspanne, z.B. 5 Tage, vorvaskularisiert und es werden Zellen in dieses injiziert. In der bevorzugten Ausführungsform für Leberzellen werden unmittelbar vor der Polymerimplantation portokavale Shunts gesetzt, wodurch den Implantaten zur Verstärkung der Replikation und Funktionsfähigkeit trophische stimulatorische Faktoren zugeführt werden können.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 gibt das Gewebeeinwachsen (µ) in Ivalon nach 4, 5 und 6 Tagen an.
Die Fig. 2a und 2b geben die Gefäßneubildung von Ivalon mit der Zeit - Gefäße/HPF (Fig. 2a) und Gefäßfläche (µ²) (Fig. 2b) nach 4, 5, 6 und 14 Tagen - an.
Fig. 3 ist die Darstellung der Wirkung einer hepatotrophen Stimulation auf das Implantatwachstum - Zellfläche (µm²) zur Kontrolle, bei 70%iger Hepatektomie allein, und bei portokavalem Shunt in Kombination mit 70%iger Hepatektomie.
Fig. 4 ist die Darstellung der Leberzellenüberlebensrate in Ivalon - Leberzellenfläche (µ²) zur Zeit Null, nach 24 h und nach einer Woche bei 5 Millionen und 10 Millionen Zellen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Es wird ein Verfahren zur Bereitstellung funktionsfähiger Organäquivalente unter Verwendung künstlicher Substrate als Gerüst zur Zellübertragung und -implantation angegeben. Die Zellform wird durch die Zellgerüstbestandteile bestimmt und das Anhaften an die Matrix spielt bei der Zellteilung und der Differenzierungsfunktion eine wichtige Rolle. Werden dissoziierte Zellen als Suspension ohne Zellhaftung in ein fertiges Gewebe gegeben, bereitet es ihnen möglicherweise Schwierigkeiten, Haftstellen zu finden, Polarität auszubilden und ihre Funktion zu erfüllen, da sie ohne intrinsische Organisation starten. Dadurch wird die Gesamtzahl der implantierten Zellen, die zur Organisation, Proliferation und Funktionsfähigkeit lebensfähig bleiben können, beschränkt.
Damit ein Organ aufgebaut wird, erfolgreich implantiert wird und seine Funktion erfüllen kann, müssen die Matrices eine genügend große Oberfläche und Aufnahmefähigkeit für Nährstoffe besitzen, so daß vor dem auf die Implantation folgenden Einwachsen von Blutgefäßen Zellwachstum und -differenzierung erfolgen kann. Die zur erfolgreichen Implantation und zum erfolgreichen Zellwachstum in der Matrix erforderliche Zeit läßt sich durch Vorvaskularisierung der Fläche, in die die Matrix implantiert werden soll, stark verringern. Nach der Implantation muß die Konfiguration eine Diffusion von Nährstoffen und Abfallprodukten und das kontinuierliche Einwachsen von Blutgefäßen bei stattfindender Zellproliferation ermöglichen.
Zellen können entweder nach dem Beimpfen einer Matrix implantiert oder in eine bereits an der gewünschten Stelle implantierte Matrix injiziert werden. Letztere Methode weist den Vorteil auf, daß die Matrix zur Vorvaskularisierung der Stelle verwendet werden kann.

Planung und Bau des Gerüsts

Die Planung und der Bau des Gerüsts ist von primärer Bedeutung. Die Matrix sollte aus einem biegsamen nichttoxischen injizierbaren porösen Templat zum Gefäßeinwachsen bestehen. Die Poren sollten Gefäßeinwachsen und die Injektion von Zellen, wie Leberzellen, ohne Schädigung der Zellen oder des Patienten ermöglichen. Dies sind im allgemeinen miteinander verbundene Poren im Bereich zwischen etwa 100 und 300 µ. Die Matrix sollte so geformt sein, daß die Oberfläche maximal ist, so daß eine adäquate Diffusion von Nährstoffen und Wachstumsfaktoren zu den Zellen und das Einwachsen neuer Blutgefäße und von Bindegewebe möglich werden. Gegenwärtig ist eine gegenüber Druck und/oder Zug beständige poröse Struktur bevorzugt.
In der bevorzugten Ausführungsform besteht die Matrix aus einem biologisch absorbierbaren oder biologisch abbaubaren synthetischen Polymer, z.B. einem Polyanhydrid, Polyorthoester, Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Copolymeren oder Mischungen hiervon. Es können auch nicht abbaubare Materialien zur Bildung der Matrix verwendet werden. Beispiele geeigneter Materialien sind Ethylenvinylacetat, Derivate von Polyvinylalkohol, Polytetrafluorethylen (Teflon ) und Nylon. Die bevorzugten nicht abbaubaren Materialien sind ein Polyvinylalkoholschwamm oder dessen Alkylierungs- und Acylierungsderivate sowie deren Ester. Ein nicht absorbierbarer Polyvinylalkoholschwamm ist im Handel als Ivalon , von Unipoint Industries, erhältlich. Verfahren zur Herstellung dieses Materials sind in US-Patent Nr. 2 609 347 von Wilson; 2 653 917 von Hammon, 2 659 935 von Hammon, 2 664 366 von Wilson, 2 664 367 von Wilson und 2 846 407 von Wilson, deren Angaben hier als Referenz mit einbezogen seien, beschrieben. Collagen kann verwendet werden, ist jedoch nicht in gleicher Weise steuerbar und ist nicht bevorzugt. Diese Materialien sind alle im Handel erhältlich. Nicht biologisch abbaubare Polymerwerkstoffe einschließlich Polymethacrylat und Siliciumpolymere können verwendet werden, wobei dies von der Enddisposition der wachsenden Zellen abhängt.
In einigen Ausführungsformen wird das Anhaften der Zellen an das Polymer durch Überziehen der Polymere mit Verbindungen, wie grundlegende Membranbestandteile, Agar, Agarose, Gelatine, Gummiarabicum, Collagene der Arten I, II, III, IV und V, Fibronectin, Laminin, Glycosaminoglycane, Mischungen hiervon, und andere den Fachleuten auf dem Gebiet der Zellkultur bekannte Materialien verstärkt.
Alle für die Matrix verwendbaren Polymere müssen die erforderlichen mechanischen und biochemischen Parameter zur Lieferung einer entsprechenden Unterstützung der Zellen zum anschließenden Wachsen und zur Proliferation erfüllen. Die Polymere lassen sich im Hinblick auf die mechanischen Eigenschaften, wie die Zugfestigkeit, unter Verwendung eines Instron-Testers, bezüglich des Polymermolekulargewichts durch Gelpermeationschromatographie (GPC), bezüglich der Glasübergangstemperatur durch Differentialrasterkalorimetrie (DSC) und bezüglich der Bindungsstruktur durch Infrarotspektroskopie (IR), bezüglich der Toxikologie durch Ames-Ansätze und in-vitro-Teratogenitätsansätze umfassende Grundreihenuntersuchungen und Implantationsuntersuchungen bei Tieren bezüglich der Immunogenität, Entzündungswirkung, Freisetzung und Abbauuntersuchungen charakterisieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Matrix Katheter zur Injizierung der Zellen in das Innere der Matrix nach der Implantation und dem Einwachsen von Gefäßen und Bindegewebe. Aus medizinischem Silicongummi-Schlauchmaterial mit verschiedenen Durchmessern und unterschiedlichen Ausgängen für eine mögliche gleichmäßige Verteilung der Zellen durch die Matrix gebildete Katheter nach der Beschreibung in den folgenden Beispielen sind besonders geeignet. Andere Verfahren, z.B. die Formung von Verteilungskanälen vom Äußeren in verschiedene Teile des Matrixinneren oder die direkte Injizierung von Zellen durch Nadeln in miteinander verbundene Poren in der Matrix, können ebenfalls verwendet werden.

Herstellung von Zellen zur Implantation:

Zellen können direkt aus einem Spenderorgan, aus der Zellkultur von Zellen eines Spenderorgans oder aus bestehenden Zellkulturlinien erhalten werden. Bei den bevorzugten Ausführungsformen werden Zellen direkt aus einem Spenderorgan erhalten, gewaschen und direkt in eine vorimplantierte, vorvaskularisierte Matrix implantiert. Die Zellen werden unter Verwendung von Fachleuten auf dem Gebiet der Gewebekultur bekannten Verfahren gezüchtet.
In einer Abwandlung des Verfahrens mit Verwendung einer einzigen Matrix zum Anhaften von einer oder mehreren Zelllinie(n) ist das Gerüst so aufgebaut, daß das ursprüngliche Zellanhaften und -wachstum getrennt für jede Population innerhalb der Matrix geschieht. Alternativ kann ein einheitliches Gerüst aus unterschiedlichen Werkstoffen zur Optimierung des Anhaftens verschiedener Zellarten an speziellen Stellen gebildet werden. Das Anhaften ist sowohl eine Funktion der Zellart als auch der Matrixzusammensetzung. Das Anhaften und die Lebensfähigkeit der Zellen läßt sich unter Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie, Histologie und quantitativer Bestimmung durch Radioisotope bestimmen
Als zur Zeit bevorzugte Ausführungsform wird zwar eine in einen Empfänger implantierte einzige Matrix verwendet. Es gibt jedoch Situationen, in denen die Verwendung von mehr als einer Matrix, die jeweils zur für das Wachstum der anhaftenden Zellen optimalsten Zeit implantiert werden, erwünscht sein kann, wobei aus den verschiedenen Matrices eine funktionsfähige dreidimensionale Organstruktur gebildet wird.
Die Funktion der implantierten Zellen muß sowohl in vitro als auch in vivo bestimmt werden. In-vivo-Untersuchungen der Leberfunktion lassen sich durch Plazieren einer Kanüle in den Ductus communis der Galle des Empfängers durchführen. Die Galle läßt sich dann in Einzelproben sammeln. Gallenfarbstoffe lassen sich durch Suche nach nicht derivatisierten Tetrapyrrolen durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie oder nach der Umwandlung in Azodipyrrole durch Reaktion mit diazotiertem Ethylanthranilat entweder mit oder ohne Behandlung mit P-Glucuronidase durch Dünnschichtchromatographie analysieren. Zweifachkonjugiertes und einfachkonjugiertes Bilirubin läßt sich ebenfalls durch Dünnschichtchromatographie nach alkalischer Methanolyse der konjugierten Gallenfarbstoffe bestimmen. Im allgemeinen nimmt bei Zunahme der Anzahl funktionsfähiger transplantierter Leberzellen die Konzentration von konjugiertem Bilirubin zu. Einfache Leberfunktionstests, z.B. Tests der Albuminproduktion, lassen sich auch an Blutproben durchführen. Analoge Organfunktionsuntersuchungen lassen sich unter Verwendung von den Fachleuten bekannten Techniken nach den Erfordernissen zur Bestimmung des Ausmaßes der Zellfunktion nach einer Implantation durchführen. Untersuchungen unter Einsatz von markierter Glucose sowie untersuchungen unter Einsatz von Proteinansätzen lassen sich zur quantitativen Bestimmung der Zellmasse auf den Polymergerüsten durchführen. Diese Untersuchungen der Zellmasse können dann mit Zellfunktionsuntersuchungen zur Bestimmung der geeigneten Zellmasse korreliert werden.

Implantationsverfahren

Die hier beschriebene Technik kann zur Lieferung vieler verschiedener Zellarten zur Bildung verschiedener Gewebestrukturen verwendet werden. Beispielsweise können Inselzellen der Bauchspeicheldrüse in einer zu der speziell zur Implantation von Leberzellen verwendeten ähnlichen Weise zum Erzielen der Glucoseregulierung durch entsprechende Insulinausschüttung zur Heilung von Diabetes geliefert werden. Andere endokrine Gewebe können ebenfalls implantiert werden. Die Matrix kann in vielen unterschiedlichen Körperflächen passend zu einer speziellen Applikation implantiert werden. Außer dem Mesenterium bilden Subkutangewebe, Retroperitoneum, der Properitonealraum und der Intramuskularraum zur Injektion von Leberzellen bei einer Implantation geeignete Stellen.
Eine Implantation an diesen Stellen kann auch von einer portokavalen Shuntbildung und Hepatektomie unter Verwendung von chirurgischen Standardverfahren begleitet sein. Die Notwendigkeit dieser zusätzlichen Verfahren hängt von der speziellen klinischen Situation, in der die Versorgung mit Leberzellen notwendig ist, ab. Treten beispielsweise beim Patienten wegen der zugrundeliegenden Leberkrankheit Signale auf, die eine Aktivierung der Regeneration von Leberzellen bedeuten, auf, so ist keine Leberentfernung nötig. Tritt in ähnlicher Weise eine signifikante portosystemische Shuntbildung durch Seitenkanäle als Teil einer Leberkrankheit auf, so ist kein portokavaler Shunt zur Stimulierung der Regeneration des Transplantats nötig. Bei den meisten anderen Applikationen sollte die Notwendigkeit eines portokavalen Shunts oder einer Hepatektomie nicht bestehen.
Die im vorhergehenden geschilderten Verfahren unter Einsatz von Polymerimplantaten und mit Prävaskularisation lassen sich unter Bezug auf die folgenden Beispiele genauer verstehen.

Beispiel 1: Bestimmung der zum in-vivo-Überleben von Zellen erforderlichen Faktoren

Zur Bestimmung der relativen Bedeutung verschiedener Faktoren beim Überleben der Zellen nach einer Implantation wurden in früheren Patentanmeldungen beschriebene Verfahren verwendet. Die Leberzellen wurden unmittelbar nach der Isolierung, bei der in-vitro-Plazierung auf Polymergebilden, und zu verschiedenen Zeitpunkten, beginnend beim Zeitpunkt Null, nach der Implantation untersucht. Es wurden Standardtechniken zur Isolierung von Leberzellen eingesetzt. Die Implantation umfaßte das Anhaften von Zellen mit unterschiedlicher Dichte auf einem Polymerfaserkomplex in vitro und die anschließende Implantation dieses Komplexes. Die Implantationsstelle war das Eingeweidemesenterium.
Die Ergebnisse zeigten, daß die Erzielung einer ziemlich hohen Lebensfähigkeit eines Vorimplantats aus gut funktionsfähigen Leberzellen möglich war. Die Lebensfähigkeit lag im Bereich von 85 bis 90%. Eine routinemäßige Percoll-Trennung verbesserte die Lebensfähigkeit. Ferner wurde festgestellt, daß die Lebensfähigkeit und Funktionsfähigkeit auf den Polymergebilden in vitro hoch blieb. Im Gegensatz dazu ging unter Verwendung des Verfahrens des Standes der Technik die Zellebensfähigkeit und -funktionsfähigkeit nach der Implantation rasch und massiv verloren. Zur quantitativen Analyse dieser Faserkomplexe wurden morphometrische Versuche durchgeführt. Hierbei traten jedoch Schwierigkeiten auf, da die lebensfähigen Zellen im Transplantat so selten waren. Quantitative Abschätzungen des Zellverlusts lagen zwischen 95 und 97%. Histologisch gesehen, schienen die nach den ersten 24 bis 28 h übrigbleibenden Zellmassen stabil zu sein und gemäß der Dokumentation durch die histochemische Anfärbung von Albumin in situ eine Langzeitübertragung und Funktionsfähigkeit dieser Zellen bis zu einem Jahr aufzuweisen. Die Leberzellen verblieben in Clustern, deren Durchmesser zwischen 100 und 250 µ variierte. Diese Cluster waren unabhängig von der Zelldichtenapplikation und der Lokalisierung der Implantationsstelle im Aussehen konsistent. Die Cluster waren in den zum ursprünglichen Gewebe und den Blutgefäßen nächstliegendsten Bereichen immer vorherrschend. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, daß die Diffusionseinschränkungen, insbesondere von Sauerstoff, am wahrscheinlichsten zum Absterben von Leberzellen beitrugen. Im Gegensatz dazu erwiesen sich ähnliche Experimente unter Verwendung von Chondrozyten zur Bildung von neuem Knorpel mit der Bildung homogener Platten aus Knorpel äußerst erfolgreich, was wiederum zu der Annahme führte, daß die spezielle Empfindlichkeit von Leberzellen gegenüber einer hypoxischen Schädigung das Problem darstellte.

Beispiel 2: Vorvaskularisierung und Implantation von Zellen auf Matrices aus Polymilchsäure und Polyglykolsäure

Aufbau der Polymere

Schlauchmaterial aus Silicongummi (0,3 mm ID) wurde in Stükke von 2,5 Zollänge geschnitten. Ein Ende wurde verschlossen. In den Schlauch wurden Löcher von 0,25 mm geschnitten. Diese Injektionskatheter wurden zentral in 1-cm-Scheibchen aus Polyvinylalkoholschaumstoff (Ivalon, Unipoint Indust.) mit einer Dicke von 5 mm eingeführt. Diese Vorrichtungen wurden dann zur Implantation sterilisiert.

Tierimplantation

Fisher-344-Ratten von 200-250 g wurden mit Methoxyfluran betäubt. Der Bauch wurde vorbereitet. Ein Mittellinienschnitt wurde durchgeführt. Auf steriler Gaze wurde das Mesenterium sorgfältig ausgelegt. Das Polymer wurde dann auf das Mesenterium plaziert und anschließend zur Umhüllung wieder mit diesem bedeckt. Das Polymer wurde mit einer einzigen 6-0- Prolene (Ethicon)-Naht an seinem Platz fixiert. An diesem Punkt wurde in der seitlichen Bauchwand ein Einschnitt gemacht und der Injektionskatheter durch den Muskel zu einer Unterhauttasche geführt und fixiert. Der Bauchraum wurde geschlossen und die Haut angenähert. Zu dieser konnte dann später zur atraumatischen Einführung von Leberzellen ein Zugang erfolgen.

Histologische Prüfung

Nach einer geeigneten Fixierung mit Formalin wurden die einzelnen vorvaskularisierten Implantate an vier bestimmten Stellen senkrecht zur Achse des Injektionskatheters abgeteilt. Es erfolgte eine Anfärbung mit Hämatoxylin und Eosin (H&E). Die Abschnitte wurden in bezug auf Gefäßbildung, Gewebeeinwachsen und Fläche der lebensfähigen Leberzellen beurteilt. Die Quantifizierung dieser Parameter wurde unter Verwendung eines Bildanalysators Modell 3000 durchgeführt.

Leberzellenisolierung

Leberzellen wurden unter Einsatz einer Modifizierung der Seglan-Technik [Aiken, 1990 #13] isoliert. Eine syngene Fisher-344-Spenderratte mit 200-250 g wurde mit Methoxyfluran betäubt. Die Leber wurde freigelegt und in das IVC über eine Kanüle 16 g Angiocath eingeführt. Dann wurde eine 6-minütige Perfusion mit einer calciumfreien gepufferten Perfusionslösung bei 38ºC durchgeführt. Danach folgte eine Perfusion mit 0,05% Collagenase D (Boehringer Mannheim) in einem 0,05 M Calciumchlorid enthaltenden Puffer bis zum Erreichen einer adäquaten Dissoziation von Leberzellen. Die Leberzellen wurden dann unter Einsatz von Percoll-Dichtezentrifugation gereinigt. Die Lebensfähigkeit wurde durch Trypanblau-Kernausschluß bestimmt.

Leberzelleninjektion

Leberzellen wurden mit 1 x 10&sup7; und 2 x 10&sup7; lebensfähigen Zellen/cm³ in Williams-E-Nährmedium (Gibco) suspendiert. Nach 5-tägiger Vorvaskularisierung des Polymers wurden die Ratten zum Empfang der Zellinjektion betäubt, der Katheter zur subkutanen Injektion angebracht und 0,5 cm³ der Zellsuspension injiziert. Die Tiere wurden unmittelbar nach der Injektion, einen Tag nach der Injektion und sieben Tage nach der Injektion geerntet. Die Katheter wurden in die Unterhauttasche zurückgegeben. Die Haut wurde wieder angenähert.

Ergebnisse

Gewebeeinwachsen

Die Einrichtungen wurden 1 bis 14 Tage nach der Vorvaskularisierung geerntet. Das Gewebeeinwachsen erfolgte im zeitlichen Verlauf mit einer sehr konsistenten Geschwindigkeit. Zwischen Tag 1 und Tag 3 wurde eine Ablagerung von Fibrinklümpchen mit steigender Zellbildung festgestellt. Während dieser Zeit ließ sich keine Gewebeorganisation oder ein Gefäßeinwachsen beobachten. Am Tag 4 konnten organisiertes Gewebe und auch Gefäße, welche sich in die miteinander verbundenen Zwischenräume der Einrichtung erstreckten, festgestellt werden. Das Gewebeeinwachsen erfolgte symmetrisch von beiden Seiten der Einrichtung, bis am Tag 7 der Vorvaskularisierung ein Zusammenfließen erreicht war. Die Geschwindigkeit des Gewebeeinwachsens war zwischen Tag 4 und 7 entsprechend Fig. 1 mit 604 µm/Tag (Bereich 575-627 µm/Tag) konstant.
Es scheint wesentlich zu sein, daß zwischen dem Polymer und dem Gewebe Räume auf Dauer erhalten bleiben. Gerade dieser Raum schafft Kanäle zur Injektion und Implantation von Leberzellen.

Gefäßbildung

Die Gefäßbildung wurde auf zwei Arten bewertet. Zunächst wurde die Gefäßzahl pro Einheitsfläche an mehreren vorbestimmten Stellen innerhalb des Polymers bestimmt und der Mittelwert errechnet. Als zweites wurde die Gefäßfläche innerhalb dieser gleichen Felder bestimmt. Das mengenmäßig erfaßte Feld war das mit dem am stärksten im Mittelbereich bezüglich des Einwachsens von organisiertem Gewebe liegende Feld. Die Ergebnisse sind graphisch in den Fig. 2a und b dargestellt. Sobald eine Gewebeorganisation auftrat, erreichte die Gefäßanzahl/HPF am Tag 5 der Vorvaskularisierung eine maximale Dichte von 17, bevor sie auf neun Gefäße/HPF am Tag 14 absank. Dies stand im Gegensatz zur Gefäßfläche, die über die Zeit konstant blieb, was ein Fortschreiten von kleineren zu größeren Gefäßen während dieser Zeitspanne anzeigt.

Verteilung und Überleben von Leberzellen

Die Leberzellen verteilten sich zum Zeitpunkt der Zellinjektion gleichmäßig über das Polymer. Lebensfähige Zellen lokalisierten sich im Verlaufe der Zeit stärker an der Grenzfläche zwischen Mesenterium und Polymer. Es ließ sich histologisch zeigen, daß die ursprünglich lebensfähigen Zellen zum Überleben ein Anhaften an fibrovaskulärem Gewebenetzwerk benötigen. Die hiermit nicht in Kontakt stehenden Zellen sterben innerhalb von 24 h ab. Nach einer Woche waren Leberzellen nur noch am äußeren Rand der Einrichtung vorhanden. Die Zellen schienen selbst nach einem Anheften zum Gewebeeinwachsen nicht in den Zentralteil des Polymers zu drängen. Es erfolgte eine Umordnung und die aufwachsenden Zellen wurden in das fibrovaskuläre Gewebe als Inseln aus 4- 5 Zellen oder als Fläche aus 2-3 Zellagen an den äußeren Rändern des Polymers aufgenommen. Die Fläche an Leberzellen innerhalb des Polymers wurde zur Bewertung des Überlebens geprüft. Es zeigte sich eine 40%ige Abnahme der Fläche an lebensfähigen Leberzellen während der ersten 24 h mit einer allmählichen Abnahme auf 25% der ursprünglichen Fläche an Leberzellen nach einer Woche. Die Untersuchung der Implantate nach 4 Monaten zeigte eine kontinuierliche Abnahme der Fläche an Leberzellen auf zwischen 5 und 10% der zur Zeit implantierten Zellen. Eine Erhöhung der injizierten Zellen um 100% lieferte eine 100%ige Steigerung der Fläche an lebensfähigen Leberzellen mit einer hierzu proportionalen Abnahme der Fläche mit der Zeit.

Beispiel 3: Implantation von Leberzellen unter Verwendung von porösen Implantaten aus Polyvinylalkohol

Eine Anzahl Untersuchungen einschließlich Beispiel 1 ergab, daß bei Verwendung der Technik eines Anheftens von Leberzellen an Polymerfasern aus Polyglykolsäure in Zellkulturen und anschließendes Einpflanzen dieser Polymerzellgebilde in das Eingeweidemesenterium ein massiver Verlust an Leberzellen eintrat. Zur Beschäftigung mit diesen Problemen wurden neue Ansätze zum Messen der Zellebensfähigkeit und -funktion vor, während und nach einer Zellimplantation, alternative Zellisolationsverfahren, neue Materialien zur Verbesserung der Zellebensfähigkeit und Systeme zur Vorvaskularisierung zur Verbesserung der vaskularisierten Oberfläche zur Implantation entwickelt. Als Ergebnis dieser Anstrengungen wurde festgestellt, daß die Hauptursache für Zelltod mit Variablen zum Zeitpunkt der Implantation in Beziehung stand. Zelltod trat am häufigsten innerhalb der ersten 6 h nach einer Implantation auf. 95-97% der Leberzellen gingen während dieser frühen Zeitspanne nach der Implantation verloren.
Es wurden morphometrische Verfahren zur Analyse von Gewebeabschnitten der Implantate in vivo entwickelt. Diese in-vivo-Analyse wurde mit der Entwicklung quantitativer "Northern"-Blot-Analyse gekoppelt, wobei die Gesamt-RNA sowie die leberspezifische Albumin-mRNA im Implantat gemessen wurden. Diese in-vivo-Beobachtungen konnten sowohl mit der in-vitro-RNA-Analyse von Zellen auf dem Polymer als auch der Messung der Albuminproduktion unter Einsatz von Gelelektrophorese verglichen werden. Bei diesem Ansatz wurde in-vitro- und in-vivo-Analyse, bei der die Lebensfähigkeit unter Verwendung von MTT(30), 4,5-Dimethylthiazol-2-yl(-2,5-diphenyltetrazoliumbromid), gemessen wurde, verwendet. Dieser biochemische Ansatz wurde als nichtspezifischer Marker der Zellebensfähigkeit verwendet und mit Säurephosphatase-Messungen verglichen.
Es wurde ein System, das poröse Polymere aus Polyvinylalkohol verwendet und erfolgreiche Transplantationen, - definiert als Langzeitaufwachsen und Organisieren von Leberzellen und gallengangähnlichen Strukturen -, ermöglicht, entwickelt. Die Zellüberlebensrate stieg durch die Entwicklung von Polymersystemen, die eine Vorvaskularisierung zu schwammähnlichen porösen Materialien erlauben, in den Bereich von 60-70%. Die Wirksamkeit der Versorgung mit Zellen wird auf zwischen 40 und 60% nach 24-28 h nach der Implantation geschätzt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Strategie einer Vorvaskularisierung zu einer schwammähnlichen Geometrie mit einer sekundären Einführung von Leberzellen einen frühen Zellverlust signifikant reduziert.
Gunn-Ratten (150-250 g) wurden betäubt und mit portokavalen Shunts (End-zu-Seit) versehen. In Mesenteriumhüllen oder Subkutantaschen (n = 20) wurden polymere Schwämme der Abmessungen 1,5 x 1,5 cm mit zentralen mit vielen Öffnungen versehenen Silicongummiröhrchen zur Zellinjektion plaziert. Nach 5 Tagen Prävaskularisierung wurden aus einer syngenen Wistar-Ratte durch Collagenase-Perfusion Leberzellen isoliert. Es wurden 1 x 10&sup7; Leberzellen injiziert. Drei Tage nach der Implantation wurde eine 70%ige Hepatektomie durchgeführt. Die Implantate wurden serienmäßig abschnittweise durch H&E bis zu sechs Monate bewertet. Die individuellen Querschnittsflächen der Duktusstrukturen in nativer Leber, heterotopen Transplantaten und der Implantate wurden durch morphometrische Quantifizierung verglichen. Varianzanalyse wurde zur Bewertung des statistischen Gewichts verwendet.
Ein Anwachsen und die Reorganisation von Leberzellen erfolgte bei allen Implantaten während sechs Monaten. Organisierte Klümpchen von bis zu 1 mm wurden mit in Platten angeordneten Leberzellen identifiziert. 30% der Implantate nach 4 und 6 Monaten (n = 10) enthieltend röhrenförmige durch kubisches Epithel verbundene Strukturen mit einem histologischen Aussehen ähnlich dem heterotoper Transplantate mit Gallenganghyperplasie. Die Fläche dieser Gänge wurde mit interlobulären Gängen, den kleinsten Gallenstrukturen mit kubischem Epithel, in heterotopen Transplantaten und nativer Leber verglichen. Die Gänge in den Implantaten wiesen eine mittlere Fläche von 745 µ²±47, die hyperplastischen Gänge im heterotopen Transplantat 815 µ²±41 (p = 0,34) auf, während die Gänge mit vergleichbarer Morphologie aus der Pfortadertriade von nativer Leber einen Mittelwert von 1360 µ²±105 (p< 0,001) aufwiesen.
Es zeigten sich sowohl eine Langzeittransplantation als auch die Entwicklung gangförmiger Strukturen innerhalb organisierter Klümpchen von Lebergewebe bei sowohl mesenterischen als auch subkutanen Leberzellimplantaten. Diese Strukturen, die morphologisch und morphometrisch den bei Gallengang-Hyperplasie bei heterotopen Lebertransplantaten beobachteten ähnlich sind, bilden zum ersten Mal einen Hinweis auf eine Organisation zu einem Gallengang nach einer Transplantation von Leberzellen.

Beispiel 4: Vergleich von Matrices aus Polymerfaser mit Schwammatrices aus Polyvinylalkohol

Leere Polymere wurden zur Ermöglichung eines fibrovaskulären Einwachsens in den Komplex vor der Einführung von Leberzellen zur Erhöhung der vaskularisierten Oberfläche implantiert, wodurch kürzere Diffusionsabstände zur Versorgung mit Sauerstoff möglich werden. Es wurden mehrere geometrische Konfigurationen, umfassend 1) nur biologisch absorbierbare Polymerfasern, 2) nicht abbaubare Polymerfasern, 3) Gemische aus abbaubaren und nicht abbaubaren Fasern, 4) Celluloseschwämme, 5) Ivalon-Schwämme, getestet.
Alle Faserkomplexe ohne Träger waren aus zwei Gründen zur Vorvaskularisierung ungeeignet. Erstens wiesen sie nicht genügend Druckfestigkeit auf und es erfolgte daher beim Wandern von fibrovaskulärem Gewebe eine Kontraktion. Dies führte ferner zu einem sehr hohen Widerstand gegen die Einführung von Leberzellen, unabhängig davon, ob sie durch direkte Injektion oder durch einen vorliegenden Katheter mit vielen Öffnungen eingeführt wurden. Eine direkte Injektion verursachte ein Verlaufen in die Zwischenräume des Implantats.
Daraufhin wurde ein Schwammodell entwickelt, da es eine größere Druckbeständigkeit aufzuweisen schien und das Erhalten möglicher Räume erlaubte. Es wurden viele Untersuchungen sowohl mit Ivalon-Schwämmen als auch mit Celluloseschwamm zur Bestimmung des zeitlichen Verlaufs der Vaskularisierung durchgeführt. Bei beiden Modellen erfolgte ein gutes Gefäßeinwachsen. Das Standard-Ivalon-Schwammimplantat bestand aus einer Scheibe eines Durchmessers von 1 cm und einer Höhe von 0,3 cm. Es erfolgte ein gutes Gefäßeinwachsen im Verlauf von 5 Tagen und ein sehr gutes Gefäßeinwachsen im Verlauf von 11 Tagen. Die Poren wiesen eine ganz einheitliche Größe auf und waren alle miteinander verbunden. Es wurde ein System entworfen, in dem ein zentraler Katheter mit vielen Öffnungen in der Ivalon-Scheibe plaziert wurde, so daß Leberzellen entweder als Einzelinjektion oder als Mehrfachinjektion eingeführt werden konnten. Der Celluloseschwamm wies zwar bei minimaler Entzündung ein gutes Gefäßeinwachsen auf, die Poren waren jedoch von sehr inkonsistenter Größe und ließen den Celluloseschwamm daher weniger geeignet als den Ivalon- Schwamm erscheinen.

Verfahren

Vorvaskularisierter Ivalon-Schwamm

Ivalon-Schwämme wurden in das Mesenterium von Fisher-344- Ratten plaziert. Sie wurden eine unterschiedliche Anzahl von Tagen vorvaskularisieren gelassen. Zu bestimmten Zeiten wurden durch den zentral angeordneten Silicongummikatheter Leberzellen injiziert. Die Konzentration der Leberzellen und das in den Schwamm infundierte Gesamtvolumen wurden variiert. Die Tiere wurden zur Zeit 0 und drei Tage nach der Injektion von Leberzellen mit Formalin durchströmt. Diese Wahl wurde aufgrund einer früheren Arbeit, die nach diesem Zeitpunkt ein ziemlich konsistentes Zellüberleben und den Verlust der Leberzellen während der ersten 24 h aufgezeigt hatte, getroffen. Die Zell/Polymer-Gebilde wurden dann in Abschnitte geteilt und bezüglich Gewebeeinwachsen, Gefäßbildung, Leberzellenverteilung und -lebensfähigkeit bewertet. Die mengenmäßige Bestimmung der lebensfähigen Leberzellen wurde unter Einsatz von morphometrischer Bildanalyse durchgeführt.
Zur Bestimmung der Zellenzahl wurde jedes Implantat in vier Stücke geteilt und aus jedem von diesen ein Abschnitt hergestellt. Jeder dieser Abschnitte wurde dann in drei Querschnitten mikroskopisch geprüft, wobei die Zellfläche bestimmt wurde. Dann wurden die mittlere Zellfläche und das Volumen bestimmt und die Zellenzahl auf das Volumen des Schwamms extrapoliert.

RNA-Isolierung aus Polymerimplantaten

Leberzellen wurden durch Collagenase-Perfusion und Zentrifugieren durch Percoll isoliert. Vor der Injektion in vorvaskularisierten Ivalon-Schwamm wurde Zell-RNA in einer Suspension mit 10 µCi/ml ³H-Uridin markiert. Eine Vormarkierung von Leberzellen-RNA ermöglicht die Unterscheidung zwischen Leberzellen-RNA und der RNA infiltrierender Zellen. Anschließend wurden 5 x 10&sup6; markierte Leberzellen nach der sonstigen Beschreibung in Ivalon-Schwamm injiziert. In früheren Experimenten unter Verwendung von Polyglykolsäure (PGA) wurden Zellen auf ein Polymer in einer Gewebekulturschale appliziert, über Nacht in 10 µCi/ml ³H-Uridin inkubiert und in der geschilderten Weise implantiert.
Zur Isolierung von RNA wurden Implantate zu bestimmten Zeitabständen entnommen und in eine Lyselösung mit Guanidiniumisothiocyanat gegeben. Mehrfache aliquote Teile dieser Lösung wurden über den Schwamm gegeben und miteinander kombiniert. Die RNA wurde durch aufeinanderfolgende Extraktionen mit Phenol-Chloroform und Fällungen mit Lithiumchlorid und Ethanol gereinigt. Die hierbei erhaltenen RNA-Proben wurden unter Verwendung einer Slot-Blot-Apparatur (Schleicher und Schuell) auf ein Nitrocellulosefilter appliziert. Nach der Hybridisierung mit einer für Albumin-mRNA spezifischen ³²P- markierten cDNA-Sonde wurde das Filter gewaschen und auf einen Röntgenfilm gelegt. Die hierbei entstehende Autoradiographie wurde mit einem Densitometer zur mengenmäßigen Erfassung der relativen Mengen an Albumin-mRNA in jeder Probe gerastert. Alternativ können RNA-Proben zur Abtrennung der mRNA-Spezies einer Elektrophorese unterworfen, auf Nitrocellulose geblottet und in der üblichen Weise bestimmt werden. Dieses letztere Verfahren wird als "Northern"-Blot-Analyse bezeichnet.

Ergebnisse

Vorvaskularisierter Ivalon-Schwamm

Gewebeeinwachsen

Eindringendes Gewebe überbrückte die Breite von Ivalon von 3 mm innerhalb von 7 Tagen. Das Ausmaß der faserförmigen und Gefäßkomponenten nimmt mit der Zeit zu. Gefäßreiches minimal faserförmiges Gewebe war nach 5 Tagen vorhanden. Zu diesem Zeitpunkt waren im Gewebe zentral noch relativ hypozelluläre Flächen vorhanden. Das Gewebe wurde bis zum Tag 14 stärker organisiert, wobei der mögliche Raum für eine Zellimplantation abnahm.

Verteilung der Zellen bei der Injektion

Die Zellverteilung blieb während des gesamten Zeitverlaufs konsistent, wobei die Verteilung der Zellen unmittelbar nach der Injektion gleichförmig war. Während der auf die Injektion folgenden drei Tage wurde das Zellüberleben am Rande, wo das neue Gewebe stärker organisiert war, dominanter.

Überleben der Leberzellen

Das Überleben der Leberzellen wurde über eine Zeitspanne von drei Tagen unter Vergleich der Zellflächen von 10 bis 14 Feldern pro Abschnitt und vier Abschnitten pro Schwamm bestimmt. Dadurch war der Vergleich der Zellüberlebensrate von Leberzellen, die in eine ähnliche Gruppe von Ratten injiziert waren, aus der gleichen Leberzellen-Isolierung möglich. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 angegeben.
Bei der ersten Tiergruppe ergab die Morphometrie für die lebensfähigen Zellen eine mittlere Fläche von 3153±645 (S.E.M. zur Zeit 0 nach der Injektion). Nach drei Tagen betrug die mittlere Fläche von lebensfähigen Zellen 1960±567.
Diese Zellflächen korrelierten mit einer mittleren Zellüberlebensrate von 62% vom Tag 0 bis zum Tag 3. Bei Berechnung der Zellenzahl auf der Basis einer bestimmten mittleren Zellgröße und einem bestimmten Schwammvolumen sind 3,6 x 10&sup6; lebensfähig Leberzellen am Tag 3 vorhanden.
Bei einer zweiten Tiergruppe zeigte die Zellüberlebensrate zum Zeitpunkt 0 nach der Injektion eine Zellfläche von 1089± 334 und nach 24 h eine Zellfläche von 1175±445. Dies stellt innerhalb der Fehlergrenze des Verfahrens ein vollständiges Überleben über diesen Zeitraum dar.
Die Gesamtzahl der lebensfähigen Zellen betrug bei diesen 9 Implantaten 1,8 bzw. 1,9 x 10&sup6; Zellen pro Schwamm.

RNA-Isolierung aus Polymerimplantaten

Proben von PGA- und Ivalon-Schwämmen wurden bezüglich der Albumin-mRNA-Konzentrationen verglichen. Beim PGA-Experiment wurden für jeden Zeitpunkt vier Polymerstücke kombiniert, während beim Ivalon-Experiment für jeden Zeitpunkt eine doppelte Probe des Schwamms verarbeitet wurde. Die quantitative Bestimmung der Slot-Blot-Analyse zeigte eine 33-fache oder 97%ige Abnahme der Albumin-mRNA bei den Leberzellen auf dem PGA-Polymer zwischen 0 und 24 h, was mit den früheren Ergebnissen der Northern-Blot-Analyse konsistent ist. Im Gegensatz dazu zeigen Proben des Ivalon-Schwamms eine 1,6-fache (36%ige) Abnahme nach 24 h. Darüber hinaus ist die erhaltene Gesamtmenge an Ivalon-RNA von 0 bis 24 h ähnlich, während diese auf PGA-Polymer ebenfalls dramatisch abfiel. Diese Ergebnisse zeigen, daß Leberzellen den größten Teil ihrer Funktion in vivo, gemessen am Grade der Albumin-Genexpression, auf Ivalon-Schwamm, jedoch nicht auf PGA-Polymer beibehalten.

Beispiel 5: Wirkung hepatotropher Stimulation auf das Weiterleben von Transplantaten bei Verwendung vorvaskularisierter Matrices

Diese Ergebnisse zeigen, daß die Vorvaskularisierung eines Schwammodells bei der Leberzellen-Implantation das Überleben von Zellen in den ersten 24 h nach der Implantation signifikant verbessert. Eine weitere Steigerung des Überlebens läßt sich durch die Verwendung von portokavaler Shuntbildung und Hepatektomie und die direkte Zugabe von O&sub2; in implantierte Zellen unter Einsatz einer zeitweilig implantierten Gewebeperfusionskammer erzielen.

Verfahren

Polymerimplantation

Aus Inzucht hervorgegangene Lewis-Ratten von 250-350 g (Charles River) wurden mit Methoxyfluran betäubt. Ein Mittellinienschnitt wurde durchgeführt. Das Mesenterium wurde auf eine sterile Gaze ausgebreitet. Scheibchen aus Ivalon (Unipoint Industries)-Schaumstoff mit einem zentral plazierten Injektionskatheter aus Silicongummi wurden in eine Mesenteriumtasche fixiert. Die Injektionskatheter wurden an eine entfernte subkutane Stelle geführt. Das Mesenterium mit Polymer wurde in die Bauchhöhle zurückgebracht und der Schnitt geschlossen. Die Tiere erhielten eine Einzeldosis von Kefzol mit 100 mg/kg.

Portokavaler Shunt

Unmittelbar vor der Polymerimplantation wurden portokavale Shunts gelegt. Die Pankreasduodenalvene wurde unterbunden und durchgeschnitten. Die Pfortader wurde vom Leberhilum zur Milzvene gelegt, wobei auf die Umgehung der Leberarterie sehr geachtet wurde. Die Vena cava wurde posteromedial von der linken Nierenvene zum unteren Rand der Leber gelegt. An dieser Stelle wurde die Pfortader am Leberhilum abgebunden und auf der Höhe der Milzvene eine nicht zerstörende Klammer appliziert. Eine teilweise verschließende Klammer wurde auf die anteromediale Oberfläche der Vena cava appliziert. Eine Venotomie wurde durchgeführt und ein End-zu-Seit-portokavaler Shunt mit durchlaufendem 8-0-Prolene TM (Ethicon)-Nahtgarn gebildet. Nach Wiederherstellung eines adäquaten Durchflusses wurden die Implantate wie im vorhergehenden geschildert plaziert.

Leberzellenisolierung

Eine modifizierte Seglan-Technik [Aiken, 1990 #13] wurde zur Leberzellenisolierung verwendet. Nach adäquater Betäubung mittels Methoxyfluran wurde die Vena cava mit einer Kanüle versehen und die Leber mit Calcium&spplus;&spplus;-freier Kochsalzpufferlösung und anschließend 0,05%iger Collagenase-D (Boehringer Mannheim)-Kochsalzpufferlösung mit 0,05 M CaCl retrograd durchströmt. Die Perfusion wurde bei 39ºC durchgeführt. Sobald eine adäquate Dissoziation von Leberzellen erfolgt war, wurde die Leber herausgeschnitten und eine sanfte Dissoziation in Williams-E-Nährmedium (GIBCO) durchgeführt. Die Lebensfähigkeit wurde unter Verwendung von Trypanblau-Kernausschluß als Kriterium für die Lebensfähigkeit bewertet.
Die Leberzellen wurden anschließend unter Verwendung von 87%iger Percoll-Zentrifugierung zur Dichtetrennung gereinigt. Die Leberzellenfraktion wurde anschließend in Williams-E-Nährmedium mit 2 x 10&sup7; Zellen/cm³ suspendiert.
Die gesamte ex-vivo-Isolierung wurde bei etwa 4ºC durchgeführt.

Leberzellenimplantation und Hepatektomie

Auf der Grundlage früherer Untersuchungen mit Leberzelleninjektion in vorvaskularisiertes Ivalon wurden die Polymere 5 Tage lang vorvaskularisiert. Dies lieferte ein optimales Gewebe- und Gefäßeinwachsen für das Transplantat. Die Tiere wurden leicht durch Metaphan betäubt. Es wurden Injektionskatheter gesetzt und Leberzellen injiziert. Pro Schwamm wurden 1 x 10&sup7; Zellen (0,5 cm³) injiziert.
Zu diesem Zeitpunkt wurden bei ausgewählten Tieren mit und ohne PC-Shunts partielle Hepatektomien durchgeführt. Es wurde eine standardmäßige 70%ige Hepatektomie durchgeführt.

Bewertung der Implantate

Die Zellpolymergebilde wurden eine Woche nach der Zellinjektion geerntet. Sie wurden fixiert, in Abschnitte geteilt und mit H&E angefärbt. Die Quantifizierung wurde unter Verwendung eines Bildanalysators Modell 3000 und von computergestützter morphometrischer Analyse durchgeführt. Jede Einheit wurde an vier Stellen in konsistenter Weise in Abschnitte eingeteilt. Die Leberzellenfläche wurde mengenmäßig auf vier Querschnitten von jeweils vier histologischen Abschnitten bestimmt. Dies lieferte ein konsistentes Bewertungsmittel. Die statistische Signifikanz wurde mittels Varianzanalyse bewertet.

Ergebnisse

Drei Experimentgruppen wurden bewertet. Eine Kontrollgruppe (I) ohne Hepatektomie oder portokavalem Shunt (n = 6); eine zweite Gruppe (II) mit nur 70%iger Hepatektomie (n = 6); und eine letzte Gruppe (III) mit portokavalem Shunt und 70%iger Hepatektomie (n = 6). Die Leberzellenfläche pro Schwamm betrug im Querschnitt 2643 µ² (SEM ± 1588) für die Kontrollproben und 12809 µ² (SEM ± 4074) bei Tieren mit nur Hepatektomie. Bei den Tieren mit maximaler hepatotropher Stimulation mit PC-Shunt und 70%iger Hepatektomie erreichte die Leberzellenfläche 34372 µ² (SEM ± 9752). Dies ist in Fig. 3 graphisch dargestellt.
Dieses verstärkte Anwachsen in den Tieren mit PC-Shunt und Hepatektomie läßt sich in eine zwölffache Steigerung gegenüber den Kontrollproben und eine fast dreifache Steigerung gegenüber Hepatektomie allein übersetzen.
Die histologische Bewertung lieferte ferner signifikante morphologische Unterschiede zwischen den Gruppen, die sich folgendermaßen zusammenfassen lassen. Kontrolltiere ohne hepatotrophische Stimulierung zeigten ein Anwachsen nur am äußeren Rand des Polymers in der Nähe der Grenzfläche zum Mesenterium. Nach früheren Arbeiten war dies ein fortschreitendes Phänomen, wobei die Zellen ursprünglich durch die Zwischenräume des Polymers wachsen, jedoch im Zentralbereich der Einheit das Anwachsen verloren geht. Die Zellen wuchsen ferner in Laminaten aus 2-3 Zellschichten auf. Es wurde festgestellt, daß bei zusätzlicher partieller Hepatektomie Zellen in einer acinaren Anordnung in 5-6 Zellschichten dicken Inseln aufwuchsen. Noch überraschender war die bei zusätzlichem Legen eines portokavalen Shunts erzeugte Morphologie. Große Zellaggregate konnten im gesamten Polymer aufgezeigt werden. Diese Zellen erschienen viel gesünder. Die Zellen wiesen sowohl eine acinare Anordnung als auch eine Anordnung in Streifen mit dem kordelähnlichen Aussehen von nativer Leber auf. Ein weiteres interessantes Merkmal war das Vorhandensein röhrenförmiger kanalartiger Strukturen. Da diese Strukturen Gallengängen so ähnlich waren, wurde eine morphometrische Bewertung durchgeführt. Die intralobulären Gänge von nativer Leber und heterotopen Transplantaten wurden als Kontrollen für diese Strukturen untersucht. Das histologische Aussehen der Leberzellstrukturen war ziemlich ähnlich zu dem heterotoper Transplantate. Die morphometrische Quantifizierung zeigte verblüffend ähnliche Größen der Gänge der Implantate (745 µ²±47) und der Transplantate (814 µ²±40); die Gänge von nativer Leber (1360 µ²±97) waren signifikant größer (p< 0,001).
Diese Erfindung wurde zwar mit Bezug auf spezielle Ausführungsformen beschrieben, doch sind Variationen und Modifikationen des Verfahrens und der Maßnahmen zum Aufbau künstlicher Organe durch Züchten von Zellen auf Matrices mit maximaler Oberfläche und Aussetzen der Zellen der umliegenden Nährstoffe enthaltenden Umgebung dem Fachmann offenkundig. Derartige Modifikationen und Variationen sollen im Umfang der beigefügten Ansprüche liegen.

Claims

1. Poröse, biegsame, nicht-toxische Matrix, die innerhalb des Körpers gegen Druck oder Zug beständig ist und sich für die Einführung von Zellen (in die Matrix) und für ein Gefäß- und Bindegewebeeinwachsen, um eine gefäßreiche Stelle zu bilden, in Kombination mit Mitteln zum Einführen von Zellen in die Matrix nach der Implantation in einen Patienten eignet.

2. Matrix nach Anspruch 1, zusätzlich umfassend Verbindungen, ausgewählt aus der Gruppe Nährstoffe, Wachstumsfaktoren, Cofaktoren, eine Gefäßbildung stimulierende Verbindungen, Immunmodulatoren, entzündungshemmende Mittel, Regressionsfaktoren, eine Differenzierung stimulierende Faktoren, biologisch aktive Moleküle, die das Einwachsen eines lymphatischen Netzwerks stimulieren, Faktoren, die ein Nervenwachstums begünstigen, Arzneimittel und Kombinationen hiervon.

3. Matrix nach Anspruch 1, die derart ausgestaltet ist, daß zum Haftenbleiben für Zellen unterschiedlicher Herkunft getrennte Bereiche zur Verfügung gestellt werden.

4. Matrix nach Anspruch 1, wobei es sich bei den Mitteln zum Einführen (von Zellen) um in der Matrix ausgeformte Kanäle handelt.

5. Matrix nach Anspruch 1, wobei die Mittel zum Einführen (von Zellen) aus einem Katheter bestehen.

6. Matrix nach Anspruch 1, wobei die Porengröße der Matrix zwischen etwa 100 und 300 µm liegt und ohne Schädigung der Zellen oder des Patienten ein Gefäßeinwachsen und das Einführen von Zellen in die Matrix gestattet.

7. Matrix nach Anspruch 1, welche aus einem biologisch abbaubaren Polymer, ausgewählt aus der Gruppe Polyanhydrid, Polyorthoester, Polyglykolsäure, Polymilchsäure, Copolymere und Mischungen derselben und Collagen als Matrixwerkstoff, gebildet ist.

8. Matrix nach Anspruch 1, die aus einem nicht-abbaubaren Polymer, ausgewählt aus der Gruppe Ethylenvinylacetat, Derivate von Polyvinylalkohol, Polytetrafluorethylen, Nylon und Silicon, gebildet ist.

9. Matrix nach Anspruch 1, welche zusätzlich Zellen, ausgewählt aus der Gruppe Gallengangzellen, Nebenschilddrüsenzellen, Schilddrüsenzellen, Zellen der Nebennieren- Hypothalamus-Hypophyse-Achse, Herzmuskelzellen, Nierenepithelzellen, Nierenröhrenzellen, Nierenbasalmembranzellen, Nervenzellen, Blutgefäßzellen, Darmzellen und Zellen zur Bildung von Knochen und Knorpel, glatter Muskeln und Skelettmuskeln, umfaßt.

10. Matrix nach Anspruch 1, die zusätzlich dissoziierte Leberzellen enthält.

11. Matrix nach Anspruch 1, gebildet aus einem Polyvinylalkoholderivat.

12. Verwendung einer Matrix nach einem der Ansprüche 1 bis 11 bei der Herstellung einer Vorrichtung zur gesteuerten Zellenimplantation zur Verwendung im Rahmen eines chirurgischen Verfahrens, umfassend die Implantation der Matrix und Abwarten, bis in 10-90% der Matrix eine Gefäßbildung stattgefunden hat, und anschließendes Einführen lebensfähiger Zellen in die Matrix, in der die Gefäßbildung stattgefunden hat.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Implantationsstelle aus der Gruppe Mesenterium, subkutanes Gewebe, Subfascia und supraperitoneal ausgewählt ist.

14. Verwendung nach Anspruch 12, wobei im Rahmen des chirurgischen Verfahrens zusätzlich am Patienten ein portacavaler Shunt gesetzt wird.

15. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Matrix Mittel zum Einführen von Zellen in die Matrix zum Zeitpunkt der Implantation enthält.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Matrix Verteilungskanäle zum Einführen der Zellen enthält.

17. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Matrix Katheter zum Einführen von Zellen enthält.

18. Verwendung nach Anspruch 12, wobei es sich bei den Zellen um Hepatozyten handelt.

19. Verwendung nach Anspruch 12, wobei zusätzlich die Zellen aus der Gruppe Nebenschilddrüsenzellen, Schilddrüsenzellen, Zellen der Nebennieren-Hypothalamus- Hypophyse-Achse, Nervenzellen und Zellen zur Bildung von Knochen und Knorpel, glatter Muskeln und Skelettmuskeln ausgewählt werden.