EP2167109A2 - Materialzusammensetzungen, welche aus exokrinem drüsengewebe erhaltene adulte stammzellen enthalten, insbesondere zur verwendung in der regenerationsmedizin, z. b. zur wiederherstellung von verletztem oder geschädigtem myokardgewebe - Google Patents

Materialzusammensetzungen, welche aus exokrinem drüsengewebe erhaltene adulte stammzellen enthalten, insbesondere zur verwendung in der regenerationsmedizin, z. b. zur wiederherstellung von verletztem oder geschädigtem myokardgewebe

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EP2167109A2
EP2167109A2 EP08784719A EP08784719A EP2167109A2 EP 2167109 A2 EP2167109 A2 EP 2167109A2 EP 08784719 A EP08784719 A EP 08784719A EP 08784719 A EP08784719 A EP 08784719A EP 2167109 A2 EP2167109 A2 EP 2167109A2
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EP
European Patent Office
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stem cells
cells
tissue
material composition
stem
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08784719A
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English (en)
French (fr)
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Charli Kruse
Jennifer Kajahn
Norbert W. Guldner
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Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
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Publication date
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    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers

Definitions

  • compositions containing adult stem cells obtained from exocrine glandular tissue especially for use in regenerative medicine, e.g. to restore injured or damaged myocardial tissue
  • Heart failure is a major cause of death in industrialized countries and is due to the inability of mature myocardial cells (cardiomyocytes) to divide and repair damaged heart muscle. Since the therapeutic use of embryonic cardiomyocytes is banned in most countries, adult human stem cells could be an alternative to regenerative medicine.
  • Adult stem cells of various origins have already been injected intramyocardially to be transferred to cardiomyocytes. However, only in animal experiments did such cell-cell contact induce mesenchymal stem cells for differentiation into cardiomyocytes.
  • the use of human cardiomyocytes from human adult stem cells to restore injured or damaged myocardium has been an objective for many years, but not yet optimally achieved.
  • this object is fundamentally solved by providing a method for producing autonomously contracting cardiomyocytes by differentiation from adult stem cells isolated from exocrine glandular tissue and by the provision of special material compositions containing these stem cells.
  • these compositions which include, for example, injectable cell compositions, may have the disadvantage that, while the cells either reach the desired site of application but do not remain there (eg, possible in the case of injection), or the material composition is relatively bulky, the desired absorption extended in the body and a larger footprint in the body with it (eg when using conventional solid substrates).
  • the present invention is based on the finding that these disadvantages can be avoided by providing new material compositions according to claim 1 or claim 12, in which the stem cells are present on carrier matrices in the form of, preferably resorbable, thread structures or nets on which the stem cells for Differentiation, eg can be brought to autonomously contracting heart muscle cells.
  • exocrine glandular tissue thus provides a very effective source for widely differentiable stem cells, from which the desired heart muscle cells can be obtained successfully in good yields in bulk.
  • exocrine glandular tissue used according to the invention may be derived from an adult organism, juvenile organism or non-human fetal organism, preferably a post-mortem. native organism.
  • adult as used in the present application thus refers to the developmental stage of the parent tissue and not to that of the donor organism from which the tissue is derived.
  • Adult stem cells are non-embryonic stem cells.
  • the exocrine glandular tissue is isolated from a salivary gland, lacrimal gland, sebaceous gland, sweat gland, genital glands, including the prostate, or from gastrointestinal tissue, including pancreas, or secretory tissue of the liver.
  • this is acinar tissue.
  • the acinar tissue is from the pancreas, parotid gland, or submandibular gland.
  • the stem cells isolated primarily from the organism are used as a source for the further cultivation and differentiation towards heart muscle cells.
  • This variant has the advantage of a particularly simple process control.
  • the desired differentiated cells can be obtained directly from a primary culture.
  • an aggregation of the stem cells isolated from the organism into so-called organoid bodies takes place.
  • This variant has the advantage that with the organoid bodies an effective reservoir for larger amounts of differentiated cells is created.
  • the inventors have found that the stem cells isolated from the exocrine glandular tissue form organoid bodies which, when supplied with nutrients, show a strong growth to tissue bodies with diameters of up to a few millimeters or more.
  • this method can be carried out by identifying, if necessary, selecting and further multiplying myocardial cells, which have formed spontaneously from the primary or secondary (from the organoid bodies) isolated stem cells.
  • a stimulation of the cell culture is provided in the differentiation of the heart muscle cells.
  • the stimulation has the advantage of increased efficiency and speed of formation of the desired heart muscle cells.
  • a first variant after the differentiation of the stem cells to the heart muscle cells, their stimulated propagation in a culture medium is provided.
  • the stimulation already happens at an earlier stage and concerns the still undifferentiated stem cells whose development / differentiation is induced to the desired heart muscle cells.
  • the stimulation may include one or more of the following stimulation treatments, which may be performed simultaneously or sequentially. Co-culture with differentiated myocardial cells or with cell lines derived therefrom, treatment (imprinting) with immobilized or dissolved molecular differentiation factors provided in the liquid phase, or gene activation in the stem cell may be provided. Furthermore, a stimulation, the addition of other substances, for For example, hormones (eg, insulin), or cell types that affect differentiation.
  • hormones eg, insulin
  • the carrier is, for example, a synthetic substrate which has advantages for a targeted design with the differentiation factors, or a biological cell on whose cell membrane the differentiation factors are arranged.
  • Some exemplary, non-limiting growth and differentiation factors that can be used are 5 ⁇ -Azazytidin, bFGF, Cardiogenol, transferrin and PDGF.
  • the stimulation treatment is carried out by cultivating the stem cells under normal conditions (eg as described in Example 1) in the presence of biological "nanostructured surfaces.”
  • This term refers here to cells, for example cardiomyocytes or other cardiac cells, which are treated by a fixation treatment,
  • the cell membrane was made opaque while retaining the surface structure of the cells, including the surface proteins and other molecules exposed there, thus affecting substances from within excluded from these cells and the stimulation is done specifically by the influence of the surface structure of the fixed cells.
  • an identification and selection of the differentiated cells from the cell culture is provided, there may be advantages for the further use of the heart muscle cells formed.
  • a cell composition can be provided which consists entirely or for the most part of heart muscle cells. If the selection is done with sorting, which are known per se, such. For example, with a preparative cell sorter method or a sorting in a fluidic microsystem, there may be advantages for compatibility with conventional cell biological procedures.
  • a further advantage of identification and selection is that cells which are not identified as heart muscle cells and are not selected accordingly from the processed culture can be subjected to further cultivation and differentiation.
  • the yield of the method can be increased.
  • Sorts of sorting of cardiomyocytes and their progenitor cells would be e.g. by transfecting reporter gene constructs with cardiac-specific promoters, which give rise to fluorescent products when switched on, or fluorescently labeled antibodies to cardiac-specific proteins.
  • stem cells are obtained from tissue of secretory glands or glands of the gastrointestinal tract of the organism to form the heart muscle cells.
  • the stem cells are in particular isolated from tissue which consists of acinar tissue or contains acinar tissue.
  • Preferred donor organisms are vertebrates, especially mammals. Especially preferred is the human.
  • the isolation of the stem cells takes place from non-embryonic states, ie from differentiated tissue in the juvenile phase or the adult phase.
  • differentiated tissue in the fetal state can in principle also be resorted to.
  • the heart muscle cells produced are preferably used therapeutically.
  • a particular advantage is that human heart muscle cells can be produced from non-embryonic stem cells and used for the treatment of humans.
  • a particularly attractive option is the autologous treatment of a person with cardiomyocytes derived from their own stem cells. In this way, effective rejection reactions can be avoided.
  • the treatment will involve the recovery of injured or damaged myocardium.
  • the treatment may involve either the administration of the undifferentiated stem cells and their induced differentiation into myocardial cells in the body, or the administration of the already differentiated myocardial cells, e.g. in a transplant.
  • an object of the invention are cell compositions which contain adult stem cells from differentiated exocrine glandular tissue and / or heart muscle cells resulting therefrom.
  • the cell composition may contain other cells or materials which form eg a matrix.
  • the cell composition may also comprise an envelope or a 3-dimensional matrix in which the heart muscle cells and optionally other cell types are arranged.
  • the cladding or 3-dimensional matrix consists, for example, of alginate, collagen, implantable materials, polymers (biopolymers or synthetic polymers), in particular materials degradable in the body.
  • the matrix may have a thread structure or network structure.
  • a principal aspect of the present invention relates to a composition of matter wherein the glandular stem cells obtained from exocrine glandular tissue are on a support matrix having the form of sutures or nets.
  • This carrier matrix is preferably biocompatible and degradable in the body. Typically, this is a resorbable plastic material, for example the commercially available Vicryl (ex Ethicon) or the above-mentioned polymeric materials.
  • the glandular stem cells attach to both the outer surface and the microstructures of the threads and nets and can be differentiated there. With the help of this carrier matrix, the stem cells or the resulting differentiated cells can be conveniently and specifically brought to desired application sites in the body.
  • a specific embodiment of the present invention relates to a Biodegradable Strain Cell Patch (BTS) for myocardial regeneration.
  • BTS Biodegradable Strain Cell Patch
  • Such a patch comprises adult stem cells from exocrine glandular tissue, preferably pancreatic stem cells, and a porous, optionally subdivided, matrix for receiving the cells, has a large contact area for the myocardial wound surface to which it is to be applied after removal of the epicardium, is usually multi-layered, for example composed of several sponge-like membranes, but relatively thin (low diffusion distance) and easy to fix.
  • the porous matrix is e.g. a collagen matrix or consists of another physiologically acceptable material (e.g., as described above).
  • the carrier matrix can be in the form of a thread structure or a network as defined above. In one embodiment, all materials of the patch are degradable in the body.
  • the patch may further contain all or part of myocardial cells differentiated cells or other differentiated cells occurring in the heart.
  • the patch may further contain substances that promote differentiation of the stem cells into cardiomyocytes, and / or pharmaceutical agents, e.g. to suppress a rejection reaction.
  • the term "bidirectionally transformable" as used herein means that the patch is designed so that the cells contained in this patch, in particular stem cells, can come into contact with cells of the adjacent tissue or cells released on both sides, and thereby inducing or stimulating transformation / differentiation of the stem cells to the desired cell type.
  • the patch is placed between the broad back muscle (latissimus dorsi muscle) and the epicardial myocardium (see FIG. 3). Then, the cells of the myocardium or substances released therefrom can induce a differentiation of the heart cells arranged in the patch stem cells to cardiac cells, especially heart muscle cells.
  • the tissue of the back muscle can on the one hand provide the cells of the patch with nutrients and on the other hand induce a transformation of the backside arranged stem cells to vascular cells, eg endothelial cells, etc., or allow an immigration of corresponding cells into the patch, so that A new formation of capillaries in the patch or the adjacent tissue can take place.
  • hypercapillarization of the dorsal muscle sheath with an intact muscle fascia is additionally induced in the patient by intermittent transcutaneous electrostimulation (eg by glued-on stimulation electrodes).
  • the stem cells are injected into the (preferably hypercapillarized) muscle tissue (M. latissimus dorsi) itself, which wraps around the heart. They develop there and are transformed by substances of the adjacent injured myocardial surface (and / or supplied exogenous differentiation factors) into myocardial cells.
  • the vascular system of the skeletal muscle then becomes the vascular system of the contracting myocardial patch.
  • An implanted muscle pacemaker that electrostimulates the patch could also induce fiber transformation of the muscle fibers of skeletal muscle into pure oxygen-dependent type I fibers.
  • type I fibers do not survive long-term stimulation and would eventually eliminate them Skeletal muscle fibers lead.
  • a myocardial patch with its own vascular supply would be the result.
  • the adult stem cells used are human stem cells which have been isolated from pancreatic tissue.
  • pancreatic stem cells were cocultivated with small pieces of human heart muscle obtained from heart valve surgery. After a contact time of 48 hours, the myocardium was removed and stem cells were maintained in culture for a further 2 to 4 days and 2 weeks, respectively, to examine the influence of the myocardium on cardiomyocyte differentiation. Thereafter, the various methods, including immunocytochemistry of sarcomeres and cardiac-specific troponin I, semiquantitative RT-PCR analysis for alpha-actin and troponin T2 and electron microscopic examination were used to detect cardiomyocytes.
  • Myocardium for cocultivation can be obtained by biopsies from the cardiac septum, which are already routinely used to detect tissue rejection after heart transplantation.
  • the method according to the invention which can easily and conveniently prepare a large number of contractible cardiomyocytes, could be of importance for general myocardial regeneration and, in particular, for contractile myocardial patches.
  • FIGS 1 and 2 show the results of various detection methods for cardiomyocytes.
  • Fig. Ib Immunocytochemical visualization of sarcomeres (red) in transformed adult pancreatic stem cells (blue nuclei) in contact with human myocardium (M) for 2 days. A decreasing gradient from M to the periphery can be observed.
  • Fig. Ic Gene expression analysis with the cardiac-specific PCR primers for the target genes ⁇ -actin and troponin T2 isoform-1 demonstrates a greater increase of muscle cell-specific molecules in co-cultured cells (CEpan 3b, human pancreatic stem cells; P14, passage 14, HEp -2, human carcinogenic cell line, h-heart cDNA, human heart cDNA).
  • Fig. 2a, b Human pancreatic adult stem cells with immunocytochemical staining for cardiac-specific troponin I without contact with human myocardium (a) and after a two-day contact with human myocardium (b). A clear example of the Exis- Dementia of heart-specific troponin I in transformed cells is demonstrated.
  • Fig. 2c, d Various stages of cardiomyocytes transformed from adult pancreatic stem cells are shown in the electron micrographs four days after 48 hours of contact with biopsies of human myocardium. Myofilaments and structures of partial (c) and complete (d) development of the glossy stripes are shown. Vesicles organized in lines ( Figure 2c, arrows) are considered as cross-sections of a premature status of the sarcoplasmic reticulum.
  • FIG. 3 shows the placement of a biodirectionally transformable stem cell patch (BTS) between the myocardium and the broad dorsal muscle (latissimus dorsi muscle) for myocardial regeneration.
  • BTS biodirectionally transformable stem cell patch
  • FIG. 4 shows the growth of glandular stem cell thread structures.
  • pancreatic tissue The source of human pancreatic tissue was healthy tissue removed for pancreatic surgery for cancer or inflammatory disease for safety reasons. The tissue was obtained in physiological saline. From this, pancreatic acini were isolated as already described (DE 10328280, Orlic et al., Nature 410: 701-705).
  • the acini were centrifuged and further purified by washing in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Gibco, Germany) supplemented with 20% fetal calf serum (FCS) equilibrated with carbogen and adjusted to pH 7.4. The washing procedure (centrifugation, aspiration, resuspension) was repeated 5 times.
  • the acini were resuspended in DMEM and cultured at 37 ° C in a humidified atmosphere with 5% CO 2 . After 1 to 2 days of culture, spindle-shaped cells were observed surrounding the outer margins of the pancreatic acini. Differentiated acinar cells were removed with each medium exchange.
  • pancreatic stem cells were cultured by trypsin treatment, counted and reseeded at a density of 2.4 x 10 5 cells / cm 2 . This procedure was repeated until sufficient cells were available. As already shown, no changes of the stem cells take place during the passages (checked by staining). Therefore, we used passages 14 and 4 for further differentiation.
  • the stimulation of differentiation into cardiomyocytes was achieved by cocultivation of the primary cells with 5 pieces of myocardium (4 x 4 x 4 mm) for 2 days.
  • the tissue (mitral papillary muscle or auriculum) was obtained in heart valve replacement surgery and transported in physiological saline.
  • the heart muscle pieces were placed at the bottom of the culture vessels for 3 hours until the primary cells (1 x 10 6 ) were applied. After 48 hours were removed the heart muscle pieces and further cultured the stem cells as described above. The cells were then subjected to passage each time confluency was reached. Immunocytochemical analyzes were performed directly 48 hours after treatment. To study the long-term effects of differentiation, cells were harvested 17 days after treatment for PCR analysis.
  • Fig. Ia The cell layer was washed with the less nutritious phosphate buffered saline (PBS) and mechanically partially lifted off the bottom of the culture with a scraper. Contracting regions were then documented on a video.
  • PBS phosphate buffered saline
  • biopsies were cultured as described above, but without pancreatic stem cells. After 2 days no growing cells could be detected.
  • Myocardium (M) performed by four different patients.
  • Stem cells were co-cultured with myocardial biopsies for 48 hours and cultured for 2 to 4 days after myocardial removal. Thereafter, the samples were rinsed twice with PBS and dried in air at room temperature for 24 hours and then fixed by pure acetone for 10 minutes at -20 ° C, rinsed again with TBS buffer for 2 x 5 minutes and with 10% RPMI 1640 AB-serium preincubated. Monoclonal antitroponin I antibodies (Cone 2d5, Biozal 1:25) were used as primary antibodies for 60 minutes.
  • Total cell RNA was synthesized using a nucleo-spin RNA
  • RNA samples (Macherey-Nagel, Düren, Germany) isolated. 0.5 ⁇ g of total RNA was reverse transcribed into cDNA using reverse transcriptase Superscript II RNase H ⁇ (RT, Invitrogen) and oligo dT primers (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. The PCR reactions were performed in 50 ⁇ l reaction volume using Taq DNA polymerase (MBI Fermentas). The reactions were carried out for 38 cycles. A control run of RNA without reverse transcription was performed to check for contamination with genomic DNA and gave no bands. To normalize the cDNA concentration in different RT samples we measured the relative expression of GAPDH as a representative control of an internal housekeeping gene.
  • FIG. 2 cd The electron microscopic examination (FIG. 2 cd) shows cells with a number of contractile fibrils after 48 hours of contact of adult pancreatic stem cells with human myocardium and another 4 days differentiation. Furthermore, various stages of glossy stripes were observed. currency 2c, the glossy strip is well differentiated in FIG. 2d as in mature tissue. After a gloss stripe is found only in heart muscle, these findings also prove a differentiation of adult human stem cells into cardiomyocytes.
  • the stem cells are seeded in petri dishes at a density of 1 ⁇ 10 3 and cultured for 24 hours in DMEM (containing 10% FCS and 1% penicillin / streptomycin) until they adherently adhere to the bottom of the culture dishes. The cells are then cultured for 24 hours in a differentiation medium containing:
  • the cells are seeded in petri dishes at a density of 1 x 10 3 and cultured directly for 48 h with a differentiation medium containing:
  • cardiogenol solution 5 mg cardiogenol are dissolved in 4.75 ml DMSO.
  • the cells are incubated for 7 days in the following differentiation medium: DMEM medium
  • Cardiomyocytes are sown on a culture bottle so that they completely overgrow the bottom of the bottle. Then, stem cells (labeled, for example, with ⁇ -galactosidase) are added to the cells at a density of 1 ⁇ 10 3 and cocultured for 14 days. Based on the labeled stem cells, the number of cells differentiated in cardiomyocytes can be determined, for example, by FACS analysis.
  • Cardiomyocytes are placed in a cell culture cage for 14 days to freshly seeded pancreatic stem cells.
  • the cardiomyocytes will release various substances that promote the differentiation of stem cells into cardiomyocytes.
  • a fusion with co-cultured cells can be ruled out and the cells need not be marked beforehand.
  • Stem cells from exocrine glands of humans and goats are sown in different passages on resorbable threads and nets. These threads and nets are for example made of Vicryl (sterile packaged by Ethicon) and are previously coated with 1% gelatin. This is followed by sowing of the stem cells in DMEM supplemented with 10% FCS. The stem cells accumulate on and in the microstructures of the threads and nets after only a few hours, and can then be stained with various stains, e.g. Nuclear staining, represent.
  • various stains e.g. Nuclear staining

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Abstract

Die Erfindung betrifft Materialzusammensetzungen, umfassend aus exokrinem Drüsengewebe erhaltene adulte Stammzellen und eine Trägermatrix in Form einer Fadenstruktur und/oder eines Netzes. Die Trägermatrix besteht vorzugsweise aus einem körperverträglichen und im Körper abbaubaren Kunststoffmaterial. Die erfindungsgemäßen Materialzusammensetzungen sind besonders geeignet zur Verwendung in der Regenerationsmedizin, z.B. zur Wiederherstellung von verletztem oder geschädigtem Myokardgewebe.

Description

Materialzusammensetzungen, welche aus exokrinem Drüsengewebe erhaltene adulte Stammzellen enthalten, insbesondere zur Ver- wendung in der Regenerationsmedizin, z.B. zur Wiederherstellung von verletztem oder geschädigtem Myokardgβwebθ
Hintergrund
Herzversagen ist eine Haupttodesursache in Industrieländern und beruht auf der Unfähigkeit von ausgewachsenen Herzmuskel- zellen (Kardiomyozyten) zur Teilung und Wiederherstellung von geschädigtem Herzmuskel. Nachdem die therapeutische Verwendung von embryonalen Kardiomyozyten in den meisten Ländern verboten ist, könnten adulte humane Stammzellen eine alterna- tive Möglichkeit für die regenerative Medizin darstellen. Adulte Stammzellen verschiedenen Ursprungs wurden bereits intramyokardial injiziert, um in Kardiomyozyten überführt zu werden. Jedoch induzierte ein solcher Zell-Zell-Kontakt lediglich in Tierexperimenten mesenchymale Stammzellen zur Dif- ferenzierung in Kardiomyozyten. Somit ist insbesondere die Verwendung von humanen Kardiomyozyten aus humanen adulten Stammzellen zur Wiederherstellung von verletztem oder geschädigtem Myokard ein schon seit vielen Jahren angestrebtes, aber noch nicht optimal verwirklichtes Ziel.
In der DE 2006 03 996.3 wird diese Aufgabe grundsätzlich gelöst durch die Bereitstellung eines Verfahren zur Herstellung von autonom kontrahierenden Herzmuskelzellen durch Differenzierung aus adulten Stammzellen, die aus exokrinem Drüsenge- webe isoliert wurden, und durch die Bereitstellung von speziellen Materialzusammensetzungen, welche diese Stammzellen enthalten . Diese Zusammensetzungen, welche beispielsweise injektionsfähige Zellzusammensetzungen umfassen, haben jedoch unter Umständen den Nachteil, dass die Zellen zwar entweder den gewünschten Applikationsort erreichen, jedoch dort nicht verbleiben (z.B. im Falle der Injektion möglich), oder die Materialzusammensetzung relativ voluminös ist, was die erwünschte Resorption im Körper verlängert und einen größeren Platzbedarf im Körper mit sich bringt (z.B. bei Verwendung herkömmlicher fester Trägermaterialien) .
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem Befund, dass diese Nachteile vermieden werden können, indem neue Materialzusammensetzungen nach Anspruch 1 oder Anspruch 12 bereitgestellt werden, bei denen die Stammzellen auf Trägermatrices in Form von, vorzugsweise resorbierbaren, Fadenstrukturen oder Netzen vorliegen, auf denen die Stammzellen zur Differenzierung, z.B. zu autonom kontrahierenden Herzmuskelzellen, gebracht werden können.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder haben festgestellt, dass die aus exokrinem Drüsengewebe isolierten adulten Stammzellen pluripotent sind und sowohl das Potential zur spontanen Differenzierung zu Herzmuskelzellen aufweisen als auch in der Lage sind, sich unter geeigneten stimulierenden Bedingungen überwiegend oder fast ausschließlich zu Herzmuskelzellen zu entwickeln. Exokrines Drüsengewebe stellt somit eine sehr effektive Quelle für breit differenzierungsfähige Stammzellen dar, aus denen die gewünschten Herzmuskelzellen erfolgreich mit guten Ausbeuten massenhaft erhalten werden können.
Das erfindungsgemäß verwendete exokrine Drüsengewebe kann von einem erwachsenen Organismus, juvenilen Organismus oder nicht-humanen fötalen Organismus, vorzugsweise einem post- natalen Organismus, stammen. Der Begriff "adult", wie in der vorliegenden Anmeldung verwendet, bezieht sich somit auf das Entwicklungsstadium des Ausgangsgewebes und nicht auf dasjenige des Donororganismus, aus dem das Gewebe stammt. "Adulte" Stammzellen sind nicht-embryonale Stammzellen.
Vorzugsweise wird das exokrine Drüsengewebe aus einer Speicheldrüse, Tränendrüse, Talgdrüse, Schweißdrüse, aus Drüsen des Genitaltrakts, einschließlich Prostata, oder aus gastro- intestinalem Gewebe, einschließlich Pankreas, oder sekretorischem Gewebe der Leber isoliert. In einer stark bevorzugten Ausführungsform handelt es sich dabei um acinäres Gewebe. Ganz besonders bevorzugt stammt das acinäre Gewebe aus dem Pankreas, der Ohrspeicheldrüse oder Unterkieferspeicheldrüse. Ein Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass die Stammzellen effektiv aus lebenden Donororganismen, z. B. aus humanen Speicheldrüsen oder durch einen minimal-invasiven retro- peritonealen Eingriff aus dem Pankreas, gewonnen werden können, ohne dass der Donororganismus entscheidend beeinträch- tigt wird. Dies ist sowohl unter ethischen Gesichtspunkten als auch mit Blick auf die Möglichkeit der weiteren Beobachtung des Donororganismus hinsichtlich eventueller Krankheiten von besonderem Vorteil.
Gemäß einer ersten Ausführungsform dieses Verfahrens werden die primär aus dem Organismus isolierten Stammzellen als Quelle für die weitere Kultivierung und Differenzierung hin zu Herzmuskelzellen verwendet. Diese Variante besitzt den Vorteil einer besonders einfachen Verfahrensführung. Die ge- wünschten differenzierten Zellen können direkt aus einer Primärkultur gewonnen werden. Alternativ ist gemäß einer abgewandelten Ausführungsform vorgesehen, dass zunächst eine Aggregation der aus dem Organismus isolierten Stammzellen zu so genannten organoiden Körpern erfolgt. Diese Variante besitzt den Vorteil, dass mit den organoiden Körpern ein effektives Reservoir für größere Mengen differenzierter Zellen geschaffen wird. Die Erfinder haben festgestellt, dass die aus dem exokrinen Drüsengewebe isolierten Stammzellen organoide Kör- per bilden, die bei Nährstoffversorgung ein starkes Wachstum zu Gewebekörpern mit Durchmessern bis zu einigen Millimetern oder darüber zeigen.
Grundsätzlich kann dieses Verfahren ausgeführt werden, indem Herzmuskelzellen, die sich spontan aus den primär oder sekundär (aus den organoiden Körpern) isolierten Stammzellen gebildet haben, identifiziert, erforderlichenfalls selektiert und weiter vermehrt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist bei der Differenzierung der Herzmuskelzellen eine Stimulation der Zellkultur vorgesehen. Die Stimulation besitzt den Vorteil einer erhöhten Effektivität und Geschwindigkeit der Bildung der gewünschten Herzmuskelzellen. Gemäß einer ersten Variante ist nach der Differenzierung der Stammzellen zu den Herzmuskelzellen deren stimulierte Vermehrung in einem Kultivierungsmedium vorgesehen. Gemäß einer zweiten Variante geschieht die Stimulation bereits in einem früheren Stadium und betrifft die noch undifferenzierten Stammzellen, deren Entwicklung/Differenzierung zu den gewünschten Herzmuskelzellen veranlasst wird.
Die Stimulation kann eine oder mehrere der folgenden Stimulationsbehandlungen umfassen, die gleichzeitig oder aufeinander folgend durchgeführt werden können. Es kann eine Co- Kultivierung mit differenzierten Herzmuskelzellen oder mit davon abgeleiteten Zelllinien, eine Behandlung (Prägung) mit immobilisierten oder gelösten, in der flüssigen Phase bereitgestellten molekularen Differenzierungsfaktoren oder eine Genaktivierung in der Stammzelle vorgesehen sein. Des weiteren kann eine Stimulation den Zusatz von anderen Substanzen, zum Beispiel Hormone (z.B. Insulin), oder Zelltypen, welche die Differenzierung beeinflussen, beinhalten.
Wenn die Prägung mit immobilisierten Wachstumsfaktoren er- folgt, so werden vorzugsweise Differenzierungsfaktoren verwendet, die auf einem beweglichen, relativ zu den Stammzellen positionierbaren Träger fixiert sind. Vorteilhafterweise kann damit eine gezielte Differenzierung einzelner Stammzellen oder bestimmter Stammzellgruppen erreicht werden. Der Träger ist beispielsweise ein synthetisches Substrat, das Vorteile für eine gezielte Gestaltung mit den Differenzierungsfaktoren besitzt, oder eine biologische Zelle, auf deren Zellmembran die Differenzierungsfaktoren angeordnet sind.
Einige beispielhafte, nicht-beschränkende Wachstums- bzw. Differenzierungsfaktoren, die verwendet werden können, sind 5^-Azazytidin, bFGF, Cardiogenol, Transferrin und PDGF.
In einer speziellen Ausführungsform geschieht die Stimulati- onsbehandlung durch Kultivierung der Stammzellen unter normalen Bedingungen (z.B. wie in Beispiel 1 beschrieben) in Gegenwart von biologischen „nanostrukturierten Oberflächen". Dieser Begriff bezeichnet hier Zellen, z.B. Kardiomyozyten oder andere Herzzellen, die durch eine Fixierungsbehandlung, z.B. mit Formaldehyd oder einem anderen geeigneten Fixierungsmittel, abgetötet wurden und deren Zellmembran dabei undurchlässig gemacht wurde, während die Oberflächenstruktur der Zellen, einschließlich der Oberflächenproteine und anderer dort exponierter Moleküle, erhalten blieb. Auf diese Wei- se ist ein Einfluss von Substanzen aus dem Inneren dieser Zellen ausgeschlossen und die Stimulation erfolgt spezifisch durch den Einfluss der Oberflächenstruktur der fixierten Zellen . Wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens eine Identifizierung und Selektion der differenzierten Zellen aus der Zellkultur vorgesehen ist, können sich Vorteile für die weitere Verwendung der gebildeten Herzmus- kelzellen ergeben. Es kann insbesondere eine Zellzusammensetzung bereitgestellt werden, die vollständig oder zum größten Teil aus Herzmuskelzellen besteht. Wenn die Selektion mit Sortierverfahren erfolgt, die an sich bekannt sind, wie z. B. mit einem präparativen Zellsorter-Verfahren oder eine Sortie- rung in einem fluidischen Mikrosystem, können sich Vorteile für die Kompatibilität mit herkömmlichen zellbiologischen Prozeduren ergeben.
Ein weiterer Vorteil der Identifizierung und Selektion be- steht darin, dass Zellen, die nicht als Herzmuskelzellen identifiziert sind und entsprechend nicht aus der bearbeiteten Kultur selektiert werden, einer weiteren Kultivierung und Differenzierung unterzogen werden können. Damit kann vorteilhafterweise die Ausbeute des Verfahrens gesteigert werden.
Möglichkeiten zur Sortierung von Kardiomyzyten und ihren Vorläuferzellen wären z.B. mittels Transfektion von Reportergen- konstrukten mit herzspezifischen Promotoren, welche zu fluoreszierenden Produkten führen, wenn sie eingeschaltet werden, oder fluoreszenzmarkierte Antikörper gegen herzspezifische Proteine .
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden zur Bildung der Herzmuskelzellen Stammzellen aus Gewebe von sekretori- sehen Drüsen oder Drüsen des gastro-intestinalen Traktes des Organismus gewonnen. Die Stammzellen werden insbesondere aus Gewebe isoliert, das aus acinärem Gewebe besteht oder acinä- res Gewebe enthält. Bei der Gewinnung aus der Pankreas können sich Vorteile für die Verwendung weiterer Gewebeteile des Pankreas für die genannte Stimulation ergeben. Bei der Gewinnung aus der Speicheldrüse können sich Vorteile für die schonende Behandlung des Donororganismus ergeben.
Bevorzugte Donororganismen sind Wirbeltiere, insbesondere Säuger. Ganz besonders bevorzugt ist der Mensch. Bei der Verwendung humaner Stammzellen erfolgt die Isolation der Stammzellen aus nicht-embryonalen Zuständen, also aus differenziertem Gewebe in der juvenilen Phase oder der adulten Phase. Bei nicht-menschlichen Donororganismen kann grundsätzlich auch auf differenziertes Gewebe im fötalen Zustand zurückgegriffen werden.
Die hergestellten Herzmuskelzellen werden vorzugsweise thera- peutisch verwendet. Ein besonderer Vorteil liegt darin, dass humane Herzmuskelzellen aus nicht-embryonalen Stammzellen hergestellt und für die Behandlung von Menschen eingesetzt werden können. Eine besonders attraktive Möglichkeit ist die autologe Behandlung eines Menschen mit Herzmuskelzellen, die von eigenen Stammzellen gewonnen wurden. Auf diese Weise können wirksam Abstoßungsreaktionen vermieden werden. Typischerweise wird die Behandlung die Wiederherstellung von verletztem oder geschädigtem Myokard beinhalten. Die Behandlung kann entweder die Verabreichung der undifferenzierten Stammzellen und deren induzierte Differenzierung zu Herzmuskelzellen im Körper beinhalten oder die Verabreichung der bereits differenzierten Herzmuskelzellen, z.B. in einem Transplantat.
Ein Gegenstand der Erfindung sind Zellzusammensetzungen, die adulte Stammzellen aus differenziertem exokrinen Drüsengewebe und/oder daraus entstandene Herzmuskelzellen enthalten. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Zellzusammensetzung weitere Zellen oder Materialien enthalten, die z.B. eine Matrix bilden. Die Zellzusammensetzung kann auch eine Umhüllung oder eine 3-dimensionale Matrix umfassen, in der die Herzmuskelzellen und gegebenenfalls weitere Zelltypen angeordnet sind. Die Umhüllung oder 3- dimensionale Matrix besteht zum Beispiel aus Alginat, Kolla- gen, implantierbaren Materialien, Polymeren (Biopolymere oder synthetische Polymere) , insbesondere im Körper abbaubaren Materialien. Die Matrix kann eine Fadenstruktur oder Netzstruktur aufweisen.
Ein Hauptaspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Materialzusammensetzung, bei der sich die aus exokrinem Drüsengewebe erhaltenen glandulären Stammzellen auf einer Trägermatrix befinden, welche die Form von Fäden oder Netzen aufweist. Diese Trägermatrix ist vorzugsweise körperverträglich und im Körper abbaubar. Typischerweise handelt es sich dabei um ein resorbierbares Kunststoffmaterial, z.B. das im Handel erhältliche Vicryl (von Ethicon) oder die obengenannten poly- meren Materialien. Die glandulären Stammzellen lagern sich sowohl auf der äußeren Oberfläche als auch in den Mikrostruk- turen der Fäden und Netze an und können dort zur Differenzierung gebracht werden. Mit Hilfe dieser Trägermatrix können die Stammzellen bzw. die daraus entstandenen differenzierten Zellen bequem und gezielt an gewünschte Applikationsorte im Körper gebracht werden. Darüber hinaus kann die Applikation einer solchen Trägermatrix möglicherweise die bei einer intramyokardialen Injektion von Stammzellen öfter zu beobachtenden Herzrhythmusstörungen verhindern. Mit dem Einsatz einer solchen Trägermatrix kann man auch einen Zellverlust (z.B. durch Abwanderung von Stammzellen nach Injektion) hin- auszögern oder ganz unterbinden, da die applizierten Zellen fest an den Mikrostrukturen der Fäden und Netze haften und erst durch bzw. nach Teilung das defekte Gewebe regenerieren. Eine spezielle Ausfϋhrungsform der vorliegenden Erfindung betrifft einen biodirektional transformierbaren Stammzellenpatch (BTS) für die Myokardregeneration. Ein solcher Patch umfasst adulte Stammzellen aus exokrinem Drüsengewebe, vor- zugsweise pankreatische Stammzellen, und eine poröse, gegege- benenfalls unterteilte, Matrix zur Aufnahme der Zellen, besitzt eine grosse Auflagefläche für die Myokardwundflache, auf die es nach Entfernung des Epikards aufgebracht werden soll, ist in der Regel mehrlagig, z.B. aus mehreren schwamm- artigen Membranen aufgebaut, aber relativ dünn (geringe Diffusionsstrecke) und gut fixierbar.
Die poröse Matrix ist z.B. eine Kollagenmatrix oder besteht aus einem anderen physiologisch annehmbaren Material (z.B. wie oben beschrieben) . Die Trägermatrix kann in Form einer Fadenstruktur oder eines Netzes wie oben definiert vorliegen. In einer Ausführungsform sind alle Materialien des Patches im Körper abbaubar.
Der Patch kann ferner ganz oder teilweise zu Herzmuskelzellen ausdifferenzierte Zellen oder andere im Herzen vorkommende differenzierte Zellen enthalten. Der Patch kann ferner Substanzen enthalten, welche die Differenzierung der Stammzellen zu Kardiomyozyten fördern, und/oder pharmazeutische Wirkstof- fe, z.B. zur Unterdrückung einer Abstoßungsreaktion.
Der Begriff „bidirektional transformierbar", wie hier verwendet, bedeutet, dass der Patch so gestaltet ist, dass die in diesem Patch enthaltenen Zellen, insbesondere Stammzellen, auf beiden Seiten mit Zellen des angrenzenden Gewebes oder von den Zellen abgegebenen Substanzen in Kontakt kommen können und dadurch eine Transformation/Differenzierung der Stammzellen zu dem gewünschten Zelltyp induziert oder stimuliert werden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Patch zwischen dem breiten Rückenmuskel (Musculus latissimus dorsi) und dem von Epikard befreiten Myokard platziert (siehe Fig. 3) . Dann können die Zellen des Myokards bzw. davon abgegebene Substan- zen eine Differenzierung der herzseitig im Patch angeordneten Stammzellen zu Herzzellen, insbesondere Herzmuskelzellen, induzieren. Auf der anderen Seite kann das Gewebe des Rückenmuskels die Zellen des Patches einerseits mit Nährstoffen versehen und andererseits eine Transformation der rückensei- tig angeordneten Stammzellen zu Gefäßzellen, z.B. Endothel- zellen etc., induzieren oder eine Einwanderung entsprechender Zellen in den Patch erlauben, so dass eine Neubildung von Kapillargefäßen im Patch oder dem angrenzenden Gewebe stattfinden kann. Gewünschtenfalls wird bei dem Patienten zusätzlich eine Hyperkapillarisierung des Rückenmuskelmantels mit intakter Muskelfaszie durch intermittierende transkutane Elektrostimulation (z.B. durch aufgeklebte Stimulationselektroden) induziert .
In einer anderen Ausführungsform werden die Stammzellen in das (vorzugsweise hyperkapillarisierte) Muskelgewebe (M. latissimus dorsi) selbst, welches das Herz umschlingt, injiziert. Sie entwickeln sich dort und werden durch Substanzen der benachbarten verletzten Myokardoberflache (und/oder zugeführte exogene Differenzierungsfaktoren) in Herzmuskelzellen transformiert. Das Gefäßsystem des Skelettmuskels wird danach zum Gefäßsystem des kontrahierenden Myokardpatches . Durch einen implantierten Muskelschrittmacher, der den Patch elektro- stimuliert, könnte man ferner eine Fasertransformation der Muskelfasern des Skelettmuskels in reine sauerstoffabhängige Typ I-Fasern induzieren. Nachdem Typ I-Fasern im Gegensatz zu den Herzmuskelfasern jedoch eine Dauerstimulation nicht überleben, würde dies langfristig zu einer Eliminierung dieser Skelettmuskelfasern führen. Ein Myokardpatch mit eigener Gefäßversorgung wäre die Folge.
Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfin- düng handelt es sich bei den verwendeten adulten Stammzellen um humane Stammzellen, die aus Pankreasgewebe isoliert wurden.
Adulte Stammzellen wurden aus pankreatischem Gewebe von Pati- enten, die sich einer Pankreasoperation unterzogen hatten, isoliert und kultiviert (hinsichtlich der Bedingungen siehe Beispiel 1). Die Zellen wurden selektiert, mit Medium (z.B. DMEM) mit fetalem Kalbserum kultiviert und bis zu mehr als 25 mal passagiert. Die Kulturen konnten zwischen einzelnen Pas- sagen auch eingefroren werden, ohne die Zellen zu beinträchtigen. Die Kulturen zeigten in verschiedenen Passagen spontan gebildete netzartige Zellcluster (Fig. Ia) und einige dieser Zellcluster zeigten zelluläre Kontraktionen an verschiedenen Stellen, was ein funktionelles kontraktiles System anzeigt.
In einem optimierten Verfahren, mit dem schneller größere Mengen an kontrahierenden Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) erhalten werden konnten, wurden pankreatische Stammzellen mit kleinen Stücken von humanem Herzmuskel, erhalten bei einer Herzklappenoperation, kokultiviert . Nach einer Kontaktzeit von 48 Stunden wurde das Myokard entfernt und Stammzellen wurden für weitere 2 bis 4 Tage bzw. 2 Wochen in Kultur gehalten, um den Einfluss des Myokards auf die Differenzierung zu Kardiomyozyten zu untersuchen. Danach wurden die ver- schiedene Verfahren, einschließlich Immunzytochemie von Sarkomeren und herz-spezifischem Troponin I, semiquantitativer RT-PCR-Analyse hinsichtlich Alpha-Actin und Troponin T2 und elektronenmikroskopische Untersuchung angewandt, um Kardiomyozyten nachzuweisen. Myokard für die Kokultivierung kann mittels Biopsien aus dem Herz-Septum, die bereits routinemäßig zum Nachweis von Gewe- beabstoßung nach einer Herztransplantation verwendet werden, erhalten werden. Das erfindungsgemäße Verfahren, mit dem eine große Anzahl von kontraktionsfähigen Kardiomyozyten auf einfache und bequeme Weise hergestellt werden kann, könnte für die allgemeine Myokardregeneration von Bedeutung sein und insbesondere für kontraktionsfähige Myokard-Patches .
Figurenbeschreibung
Die Figuren 1 und 2 zeigen die Ergebnisse verschiedener Nachweisverfahren für Kardiomyozyten.
Fig. Ia Kulturen von pankreatischen Stammzellen mit netzartigen Zellclustern zeigen autonome Kontraktionen.
Fig. Ib Immunzytochemische Visualisierung von Sarkomeren (rot) in transformierten adulten pankreatischen Stammzellen (blaue Kerne) in Kontakt mit humanem Myokard (M) für 2 Tage. Ein abnehmender Gradient von M bis zur Peripherie ist zu beobachten.
Fig. Ic Eine Genexpressionsanalyse mit den herzspezifischen PCR-Primern für die Zielgene α-Aktin und Troponin T2- Isoform- 1 demonstriert eine stärkere Zunahme von muskelzell- spezifischen Molekülen in kokultivierten Zellen (CEpan 3b, humane pankreatische Stammzellen; P14, Passage 14; HEp-2, humane karzinogene Zelllinie; h-heart-cDNA, humane Herz-cDNA) .
Fig. 2a,b Humane pankreatische adulte Stammzellen mit immun- zytochemischer Anfärbung für herzspezifisches Troponin I ohne Kontakt mit humanem Myokard (a) und nach einem zweitägigen Kontakt mit humanem Myokard (b) . Ein klarer Beleg der Exis- tenz von herzspezifischem Troponin I in transformierten Zellen wird demonstriert.
Fig. 2c,d Verschiedene Stadien von Kardiomyozyten, transfor- miert aus adulten pankreatischen Stammzellen, sind in den e- lektronenmikroskopischen Aufnahmen vier Tage nach einem 48 stündigen Kontakt mit Biopsien von humanem Myokard gezeigt. Myofilamente und Strukturen von teilweiser (c) und vollständiger (d) Entwicklung der Glanzstreifen sind gezeigt. Vesi- kel, organisiert in Linien (Fig. 2c, Pfeile) , werden als Querschnitte eines prämaturen Status des sarkoplasmatischen Retikulums betrachtet.
Fig. 3 zeigt die Platzierung eines biodirektional transfor- mierbaren Stammzellenpatches (BTS) zwischen Myokard und dem breiten Rückenmuskel (Musculus latissimus dorsi) für die Myo- kardregeneration.
Fig. 4 zeigt die Bewachsung von Fadenstrukturen mit glandulären Stammzellen.
BEISPIEL 1
Isolierung, Kultivierung und Rekultivierung adulter pankrβa- tischer humaner Stammzellen
Die Quelle des humanen pankreatischen Gewebes war gesundes Gewebe, das bei Pankreasoperationen wegen Krebs oder Entzündungserkrankungen aus Sicherheitsgründen entfernt worden war. Das Gewebe wurde in physiologischer Salzlösung erhalten. Daraus wurden Pankreas-Acini wie bereits beschrieben (DE 10328280; Orlic et al., Nature 410:701-705) isoliert.
Speziell wurde das pankreatische Gewebe mit Verdauungsmedium, enthaltend HEPES-Eagle-Medium (pH 7,4), 0,1 mM HEPES-Puffer (pH 7,6), 70 % (Vol. /Vol.) modifiziertes Eagle-Medium, 0,5 % (Vol. /Vol.) Trasylol (Bayer AG, Leverkusen, Deutschland), 1 % (Gew. /Vol.) Rinderserumalbumin, 2,4 mM CaCl2 und Collagenase (0,63 PZ/mg, Serva, Heidelberg, Deutschland) behandelt. Nach dem Verdau wurden die Acini durch Aufsaugen und Ausstoßen durch verschiedene Glaspipetten mit engen Öffnungen dissoziiert und durch ein Nylonsieb filtriert. Die Acini wurden zentrifugiert und weiter gereinigt durch Waschen in Dulbec- co's modifiziertem Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Deutschland), ergänzt mit 20 % fetalem Kalbserum (FCS) , äquilibriert mit Carbogen und auf pH 7,4 eingestellt. Die Waschprozedur (Zentrifugation, Absaugen, Resuspension) wurde 5 mal wiederholt. Die Acini wurden in DMEM resuspendiert und bei 37° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2 kultiviert. Nach 1 - 2 Tagen Kultur wurden spindelförmige Zellen beobachtet, welche die äußeren Ränder der Pankreas-Acini umgaben. Differenzierte acinäre Zellen wurden bei jedem Mediumaustausch entfernt. Nach dem Erreichen von Konfluenz wurden pankreatische Stammzellen durch Trypsinbehandlung kultiviert, gezählt und mit einer Dichte von 2,4 x 105 Zellen/cm2 erneut ausgesät. Diese Prozedur wurde wiederholt, bis ausreichend Zellen zur Verfügung standen. Wie bereits gezeigt werden konnte, finden keine Veränderungen der Stammzellen während der Passagen statt (durch Anfärbung überprüft) . Deshalb verwendeten wir die Pas- sagen 14 und 4 für die weitere Differenzierung.
Die Stimulierung der Differenzierung in Kardiomyozyten wurde erzielt durch Kokultivierung der primären Zellen mit jeweils 5 Stücken Myokard (4 x 4 x 4 mm) für 2 Tage. Das Gewebe (mitraler Papillarmuskel oder Aurikulum) wurde bei einer Operation zum Herzklappenersatz erhalten und in physiologischer Salzlösung transportiert. Die Herzmuskelstücke wurden am Boden der Kulturgefäße für 3 Stunden platziert, bis die Primärzellen (1 x 106) aufgebracht wurden. Nach 48 Stunden wurden die Herzmuskelstücke entfernt und die Stammzellen weiter wie oben beschrieben kultiviert. Die Zellen wurden dann jedes Mal nach Erreichen von Konfluenz einer Passage unterworfen. Im- munzytochemische Analysen wurden direkt 48 Stunden nach der Behandlung durchgeführt. Zur Untersuchung der Langzeitwir- kungn der Differenzierung wurden die Zellen 17 Tage nach der Behandlung für PCR-Analysen gewonnen.
Als die Zellen in den Kulturschalen konfluent wurden, konnten netzartige Cluster beobachtet werden (Fig. Ia). Die Zellschicht wurde mit der weniger nährstoffreichen phosphatgepufferten Salzlösung (PBS) gewaschen und mechanisch teilweise vom Boden der Kultur mit einem Schaber abgehoben. Kontrahierende Regionen wurden dann auf einem Video dokumentiert.
Zur Überprüfung, ob Kardiomyozyten aus Biopsien von Herzgeweben auswachsen, wurden die Biopsien wie oben beschrieben, jedoch ohne pankreatische Stammzellen, kultiviert. Nach 2 Tagen konnten keine auswachsenden Zellen nachgewiesen werden.
BEISPIEL 2
Nachweis von Herzmuskelzellen
1. Immunzytochβmiβ von Sarkomeren Sowohl die stimulierten als auch die nichtstimulierten Stammzellen wurden auf Kammer-Objektträgern ausgesät und mindestens 2 Tage lang kultiviert, bevor sie mit Methanol : Aceton (7:3), enthaltend 1 g/ml DAPI (Roche, Schweiz), fixiert und 3 x in PBS gewaschen wurden. Nach Inkubation in 10 %igem norma- len Ziegenserum bei Raumtemperatur für 15 Minuten wurden die Proben mit dem primären Antikörper über Nacht bei 4° C in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert. Primärer monoklonaler Antikörper wurde gegen das Sarkomer-Myosin MF 20 (DSHB, USA) gerichtet. Nach dreimaligem Spülen mit PBS wurden die Träger 45 Minuten lang bei 37° C mit Cy3-markiertem Antimaus-IgG, 1:200 verdünnt, inkubiert. Die Objektträger wurden 3 x in PBS gewaschen, mit Vectashield-Montagemedium (Vector, USA) be- deckt und mit einem Fluoreszenzmikroskop (Axioskop Zeiss, Deutschland) analysiert. Um auszuschließen, dass nachgewiesene Sarkomere aus der Biopsie freigesetzt worden waren und an den Stammzellen hafteten, wurden Kontrollen mit Myofibroblasten und Endothelzellen mit Myokard kokultiviert . Bei diesen Kontrollen waren die getesteten Zellen gemäß Immunzy- tochemie negativ bezüglich Sarkomeren.
Dagegen wurde ein immunzytochemischer Nachweis von Sarkomeren erfolgreich bei transformierten adulten humanen pankreati- sehen Stammzellen in vier Ansätzen nach Kontakt mit humanem
Myokard (M) von vier verschiedenen Patienten durchgeführt.
Ein abnehmender Gradient von entwickelten Sarkomeren von "M"
(Platzierung des Myokards) bis zur Peripherie wurde nach zwei
Tagen Myokardial-Kontakt gezeigt (Fig. Ib).
2. Immunzytochβmiθ von herz-spezifischβxα Troponin I
Stammzellen wurden mit Myokard-Biopsien für 48 Stunden kokultiviert und weitere 2 bis 4 Tage nach Entfernung des Myokards gezüchtet. Danach wurden die Proben 2 mal mit PBS gespült und 24 Stunden an Luft bei Raumtemperatur getrocknet und dann durch reines Aceton für 10 Minuten bei -20° C fixiert, erneut 2 x 5 Minuten mit TBS-Puffer gespült und mit RPMI 1640 mit 10 %igem AB-Serium vorinkubiert . Monoklonale Antitroponin I- Antikörper (Cone 2d5, Biozal 1:25) wurden als primäre Anti- körper für 60 Minuten lang eingesetzt. Eine Verabreichung von sekundärem Antikörper (Antimaus-Kaninchen-Antikörper; DAKO; 1:25, für 30 Minuten) gefolgt von Inkubation mit einem Komplex mit alkalischer Phosphatase bzw. ohne alkalische Phosphatase (DAKO; 1:50, 30 Minuten) wurde mehrmals wieder- holt. Schließlich wurde eine Substrat-Inkubation (Naphthol/- Neofuchsin) und Kontrastfärbung mit Hämalaun vor einer mikroskopischen Untersuchung vorgenommen. Zusätzlich erfolgte eine Isotopenkontrolle mit Maus-IgG 1 (DAKO) und für eine weitere negative Kontrolle wurde Skelettmuskel angefärbt. Myokard wurde als positive Kontrolle verwendet. Eine Isotypen- Kontrolle mit Maus IgG 1 (DAKO) war ebenfalls negativ. Zusätzliche Kontrollen, die mit Skelettmuskeln durchgeführt wurden, waren ebenfalls negativ. Wie erwartet, zeigte eine Kontrolle mit humanem Myokard ein positives Ergebnis (Daten nicht gezeigt) .
Die Immunzytochemie von Herz-spezifischem Troponin I war bereits 2 Tage nach einer 48-stündigen Kokultur mit einer huma- nen myokardialen Biopsie stark positiv, wie in Fig. 2b gezeigt. Stammzellen, die nicht in Kontakt mit myokardialen Biopsien waren, ergaben bei einem immunzytochemischen Nachweis für Troponin I hauptsächlich negative Ergebnisse und dienten als weitere Kontrolle (Fig. 2a) .
3. Serniquantitativβ RT-PCR-Analyse
®
Gesamt-Zell-RNA wurde unter Verwendung eines Nucleo-Spin RNA
II-Kits (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) isoliert. 0,5 μg Gesamt-RNA wurden unter Verwendung von reverser Transkriptase Superscript II RNase H~ (RT, Invitrogen) und oligo dT-Primern (Invitrogen) nach den Instruktionen des Herstellers revers in cDNA transkribiert. Die PCR-Reaktionen wurden in 50 μl Reaktionsvolumen unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (MBI Fermentas) durchgeführt. Die Reaktionen wurden für 38 Zyklen durchgeführt. Ein Kontrolllauf von RNA ohne reverse Transkription erfolgte, um eine Kontaminierung mit genomischer DNA zu prüfen und ergab keine Banden. Zur Normalisierung der cDNA-Konzentration in verschiedenen RT-Proben maßen wir die relative Expression von GAPDH als repräsentative Kontrolle für ein internes Haushaltungsgen. Die erwarteten Fragmentgrößen und die optimalen PCR-Verschmelzungstemperaturen waren wie folgt: GAPDH, 5 ' : gagtcaacggatttggtcgt , 3' :ggaagatggtgatgggattt (213 bp, 58,8°C), Troponin T2, 5 ' : gattctggctgagaggagga, 3 ' : tggagactttctggttatcgttg (197 bp, 62,6°C), Alpha-Aktin, 5 ' : gtgtgacgacgaggagacca, 3 ' : cttctgacccatacccacca (154 bp, 62,60C). Gereinigte humane Herz-RNA (Ambion) und eine karzinogene Zelllinie (HEp2) dien- ten als funktionelle Kontrollen für den PCR-Primer.
Eine semiquantitative RT-PCR-Analyse (Fig. Ic) für α-Aktin und Troponin T2 zeigte zwei Wochen nach Kontakt eine stärker ausgeprägte Erhöhung dieser muskelzell-spezifischen Moleküle als bei unbehandelten spontan differenzierten Stammzellen. Die Erhöhung von α-Aktin und Troponin T2 nach zwei Wochen war reproduzierbar und signifikant.
4. Elθktronenmikroskopischθ Untersuchung Zellen, die auf Deckgläsern gezüchtet worden waren, wurden mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Cacodylat-Puffer 1 h lang fixiert. Eine Nachfixierung wurde durchgeführt mit 1 % OsO4 in 0,1 M Cacodylat-Puffer für 2 h; Proben wurden mit Ethanol entwässert und in Araldit (Fluka, Buchs, Schweiz) eingebet- tet. Ultradünne Schnitte wurden mit Uranylacetat und Bleicit- rat (Ultrostainer Carlsberg System, LKB, Bromma, Schweden) angefärbt und mit einem Philips Elektronenmikroskop EM 400 bei 60 kV (Philips, Eindhoven, Niederlande) untersucht.
Die elektronenmikroskopische Untersuchung (Fig. 2cd) zeigt nach 48 Stunden Kontakt von adulten pankreatischen Stammzellen mit humanem Myokard und weiteren 4 Tagen Differenzierung Zellen mit einer Anzahl kontraktiler Fibrillen. Ferner waren verschiedene Stadien von Glanzstreifen zu beobachten. Wäh- rend der Glanzstreifen in Fig. 2c nur schwach aber klar erkennbar ist, ist in Fig. 2d der Glanzstreifen gut differenziert wie in reifem Gewebe. Nachdem ein Glanzstreifen nur in Herzmuskel gefunden wird, belegen diese Befunde ebenfalls ei- ne Differenzierung von adulten humanen Stammzellen in Kardio- myozyten .
Nach 14 - 40 Tagen Wachstum in Kultur und nach 48 Stunden in Kontakt mit humanem Myokard wurden die Zellen partial mecha- nisch von dem Kulturgefäß abgehoben und mit einem weniger nährstoffreichen Kulturmedium behandelt. Die Zellkomplexe zeigten Kontraktionen in verschiedenen Bereichen. Diese Kontraktionen waren autonom und in mehreren Kulturen reproduzierbar, was ein funktionales kontraktiles System demonst- riert. Dies ist die erste Beobachtung von humanen autonom kontrahierenden Myokardzellen, welche aus humanen adulten Stammzellen erzeugt wurden.
BEISPIEL 3 Differenzierung mit 5-Azazytidin
Die Stammzellen werden in einer Dichte von 1 x 103 in Petrischalen ausgesät und 24 h lang in DMEM (mit 10 % FKS und 1 % Penicillin/Streptomycin) kultiviert, bis sie adhärent am Bo- den der Kulturschalen haften. Daraufhin werden die Zellen 24 h lang in einem Differenzierungsmedium kultiviert, welches enthält:
DMEM-Medium
10 μg/1 bFGF 10 μmol/1 5-Azacytidin
0,25 mg/1 Amphotericin. Ein Vergleich mit Kontrollansätzen ohne 5-Azazytidin zeigt, dass bei Stimulierung mit 5-Azazytidin deutlich mehr Stammzellen zu Kardiomyozyten differenzieren.
BEISPIEL 4
Differenzierung mit Cardiogenol
Die Zellen werden in einer Dichte von 1 x 103 in Petrischalen ausgesät und direkt für 48 h mit einem Differenzierungsmedium kultiviert, welches enthält:
DMEM-Medium
500 μl Cardiogenol-Lösung.
Für die Cardiogenol-Löung werden 5 mg Cardiogenol in 4,75 ml DMSO gelöst.
Auch hier entwickeln sich mehr Kardiomyozyten als in Kontrollen ohne Cardiogenol .
BEISPIEL 5
Differenzierung mit Insulin, Transferrin und PD6F
Die Zellen werden für 7 Tage in folgendem Differenzierungsmedium inkubiert: DMEM-Medium
820 μg/ml BSA
5 μg/ml Transferrin
5 μg/ml Insulin
50 ng/ml PDGF
Auch hier entwickeln sich mehr Kardiomyozyten als in Kontrollen ohne Wachstumsfaktoren. BEISPIEL 6
Differenzierung in Gegenwart von kokultivierten Kardiomyozyten
1. Variante: Kardiomyozyten werden so auf eine Kulturflasche ausgesät, dass sie den Boden der Flasche komplett bewachsen. Dann werden Stammzellen (z.B. mit ß-Galaktosidase markiert) in einer Dichte von 1 x 103 auf die Zellen gegeben und für 14 Tage ko- kultiviert. Anhand der markierten Stammzellen kann die Anzahl der in Kardiomyozyten differenzierten Zellen z.B. durch FACS- Analyse bestimmt werden.
2. Variante:
Kardiomyzyten werden in einem Zellkultur-Käfig für 14 Tage zu frisch ausgesäten pankreatischen Stammzellen gegeben. Die Kardiomyozyten werden verschiedene Substanzen abgeben, welche die Differenzierung der Stammzellen zu Kardiomyozyten fördern. Eine Fusion mit kokultivierten Zellen kann ausgeschlo- sen werden und die Zellen müssen vorher nicht markiert wer- den.
BEI SPIEL 7
Bewachsung von glandulären Stammzellen auf Fäden und Netzen
Stammzellen aus exokrinen Drüsen des Menschen und der Ziege werden in unterschiedlichen Passagen auf resorbierbaren Fäden und Netzen ausgesät. Diese Fäden und Netze bestehen zum Beispiel aus Vicryl (steril verpackt von Ethicon) und werden zuvor mit 1 % Gelatine beschichtet. Darauf folgt dann die Aus- saat der Stammzellen in DMEM mit 10 % FKS supplimentiert . Die Stammzellen lagern sich bereits nach wenigen Stunden auf und in den Mikrostrukturen der Fäden und Netze an und lassen sich dann mittels verschiedener Färbungen, z.B. Kernfärbungen, darstellen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Materialzusammensetzung, umfassend a) adulte Stammzellen, die aus exokrinem Drüsengewebe eines Organismus isoliert wurden, b) eine Trägermatrix, welche die Form von Fäden und/oder Netzen aufweist.
2. Materialzusammensetzung nach Anspruch 1, bei der Stammzellen verwendet werden, die aus sekretorischen Drüsen oder Drüsen des gastro-intestinalen Traktes des Organismus gewonnen wurden.
3. Materialzusammensetzung nach Anspruch 2, bei der Stammzellen verwendet werden, die aus dem Pankreas oder der Speicheldrüse des Organismus gewonnen wurden.
4. Materialzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der Stammzellen aus Drüsengewebe verwendet werden, das acinäres Gewebe ist.
5. Materialzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei der Stammzellen von einem Wirbeltier, vorzugsweise einem Säuger verwendet werden.
6. Materialzusammensetzung nach Anspruch 5, bei der humane Stammzellen verwendet werden.
7. Materialzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei der die Trägermatrix aus einem körperverträglichen und im Körper abbaubaren Kunststoffmaterial besteht.
8. Materialzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Materialzusammensetzung ferner differenzierte Zellen, insbesondere Herzmuskelzellen, umfasst, welche aus den Stammzellen gebildet wurden, die aus differenziertem exokrinen Drüsengewebe des Patienten stammen.
9. Verwendung der Materialzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 in medizinischen Anwendungen, insbesondere in der Regenerationsmedizin.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, das die Anwendung die Wiederherstellung von verletztem oder geschädigtem Myokard ist.
11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10 zur Transplantation oder in einer medizinischen Vorrichtung.
12. Bidirektional transformierbarer Stammzellenpatch (BTS), umfassend a) adulte Stammzellen, die aus exokrinem Drüsengewebe eines Organismus isoliert wurden, b) eine poröse Matrix in Form einer Fadenstruktur oder eines Netzes zur Aufnahme der Zellen, c) eine breite Auflagefläche des BTS zur Auflage auf einer breite Myokardwundflache .
13. Stammzellenpatch nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Stammzellen humane Stammzellen sind.
14. Stammzellenpatch nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass alle Bestandteile im Körper abbaubar sind.
15. Stammzellenpatch nach einem der Ansprüche 12-14, dadurch gekennzeichnet, dass er ferner ganz oder teilweise zu Herzmuskelzellen ausdifferenzierte Zellen enthält.
16. Stammzellenpatch nach einem der Ansprüche 12-15, dadurch gekennzeichnet, dass er ferner andere im Herzen vorkommende differenzierte Zellen enthält.
17. Stammzellenpatch nach einem der Ansprüche 12-16, da- durch gekennzeichnet, dass er ferner Substanzen, welche die Differenzierung der Stammzellen zu Kardiomyozyten fördern, und/oder pharmazeutische Wirkstoffe, z.B. zur Unterdrückung einer Abstoßungsreaktion, enthält.
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