KR20010044624A - 연골조직공학을 위한 연골지지체의 제조방법 및 이연골지지체를 사용하여 제조한 인공연골 - Google Patents

Abstract

본 발명은 연골지지체의 제조방법 및 이 연골지지체를 사용하여 제조한 조직공학적 인공연골에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 비분해성(non-degradable) 또는 저분해성(very slow degrading) 생체재료로 원하는 형태의 내부 지지체를 제조한 후, 여기에 생분해성 고분자재료를 피복 또는 결합시켜 제조된 복합재료 지지체 및 이 복합재료 지지체에 연골세포를 파종하고 배양하여 얻은 지지체-연골세포 복합체를 생체내의 원하는 부위에 이식하여 형성된 조직공학적 인공연골에 관한 것으로, 본 발명의 복합재료 지지체를 사용하여 연골조직을 형성시킴으로써, 연골조직의 형성이 완료되기 전에 생분해성 고분자 지지체가 분해되어 신생연골이 변형되는 것을 방지할 수 있으며, 연약한 신생 연골조직이 외부로부터 가해지는 물리적 힘을 충분히 견딜 수 있어 원하는 모양으로 연골조직이 형상화될 수 있도록 할 뿐 아니라, 내부 지지체의 재료에 따라 신생연골조직의 물리적 특성을 다양화할 수 있어 궁극적으로 원하는 형태 및 다양한 특성을 가진 인공연골조직을 생산할 수 있다.

또한, 이 기술을 응용할 경우 여러 조직공학분야와 인공장기의 개발분야에도 적용 가능할 것이므로, 신체조직의 일부를 복원하거나 인공장기를 개발하는 등의 의학적 용도로 다양하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

연골조직공학을 위한 연골지지체의 제조방법 및 이 연골지지체를 사용하여 제조한 인공연골{A process for preparing the scaffold and tissue engineered cartilage made from the scaffold}

본 발명은 연골지지체의 제조방법 및 이 방법에 의해 제조된 연골지지체를 사용하여 제조한 조직공학적 인공연골에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는 생체적합성이 검증된 다양한 비분해성(non-degradable) 또는 저분해성(very slow degrading) 생체재료로 원하는 형태의 내부 지지체를 제조한 후, 여기에 현재 흔히 사용하는 생분해성 고분자재료를 피복 또는 결합시킴으로써 결국 새로운 개념의 복합재료 지지체를 만들고, 이를 이용하여 연골조직을 생산함으로써 변형없이 원하는 모양의 신생연골을 만들 수 있고, 아울러 다양한 물리적 특성을 가진 연골의 생산도 가능해지게 하는 연골지지체의 제조방법 및 이 연골지지체를 사용하여 제조한 조직공학적 인공연골에 관한 것이다.

일반적으로 연골은 한번 손상되면 자연적으로 재생되지 않는 조직이다. 그 동안 이를 치료하기 위하여 비흡수성 생체재료 등의 연골 대체물을 사용하는 방법이 사용되었다. 그러나, 지금까지 사용된 비흡수성 연골 대체물들은 생체 내에서 피부괴사, 염증반응 등의 각종 부작용 및 합병증이 있어 문제가 되어, 결국에는 자가연골이식이 가장 좋은 것으로 인정되고 있다.

하지만, 최근에 생명공학 분야 중에서도 결여되거나 손상된 생체의 조직일부를 실험실에서 만들어 생체조직을 재건하는 데 사용하려는 조직공학 분야가 발달함에 따라 연골조직을 만드는 연골조직공학 또한 활발한 연구가 진행되고 있다.

이러한 방법들 중 대표적인 방법이 생분해성 고분자재료로 원하는 형태의 지지체를 제조한 후, 여기에 연골세포를 파종하고 배양하여 지지체-연골세포 복합체를 얻은 다음, 이를 생체 내의 원하는 부위에 이식하면 지지체는 서서히 분해되어 완전히 흡수되고, 연골세포는 계속 증식하여 원하는 형태의 연골조직이 생성되도록 하는 것이다.

그러나, 지금까지 사용되고 있는 이 방법은 생체 내에 삽입된 지지체-연골세포 복합체의 지지체가 시간이 지남에 따라 분해와 흡수가 비교적 빠르게 진행되어 연골조직이 완전히 생성되기 전에 분해와 흡수가 완료되기 때문에 새로 생산되는 연골조직의 변형을 일으킬 수 있고, 또한, 생산된 새로운 연골조직이 아직 외부로부터 가해지는 물리적 힘을 충분히 견디기에는 연약하므로 서서히 변형이 초래되어 아직까지 임상에서 이용되지 못하고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 신생연골조직의 변형을 방지할 수 있는 방법에 대하여 연구를 거듭한 결과, 비분해성 또는 저분해성 생체재료로 소정 형태의 내부 지지체(internal scaffold)를 만든 후, 이를 생분해성 고분자재료로 피복 또는 결합시킨 복합재료 지지체를 사용하여 인공연골을 제조한다면 상기한 변형 등의 문제점이 해결될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 신생연골의 변형을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 신생연골조직의 물리적 특성을 다양화할 수 있어 궁극적으로 원하는 형태 및 다양한 특성을 가진 연골조직을 생산할 수 있는 연골지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 이러한 새로운 개념의 연골지지체를 이용하여 생산된 조직공학적 인공연골을 제공하는 것이다.

도 1은 종래의 조직공학적 인공연골의 제조방법을 도식화한 그림이다.

도 2는 본 발명의 방법으로 인공연골 및 연골지지체를 제조하는 방법을 도식화한 그림이다.

도 3은 본 발명의 인공연골제조를 위한 연골지지체의 제조방법 중, 내부 지지체와 생분해성 고분자 재료를 결합시키는 방법의 일예를 도식화한 그림이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 연골지지체의 제조방법은 (1) 비분해성(non-degradable) 또는 저분해성(very slow degrading) 생체재료로 소정의 형태를 갖는 내부 지지체를 제조하는 단계; 및 (2) 상기 내부지지체에 생분해성 고분자재료를 피복 또는 결합시켜 복합재료 지지체를 얻는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명은 종래의 생분해성 고분자재료만으로 구성된 지지체를 이용한 인공연골이 일정기간이 경과하면 생체 내에서 생분해성 지지체가 분해 및 흡수되어 원하는 모양의 연골이 완벽하게 형상화되지 않고 연골의 변형이 일어나지만, 본 발명에 따른 복합재료 지지체를 이용한 조직공학적 인공연골은 인체 내에 삽입될 수 있도록 생체적합성이 검증된 비분해성 또는 저분해성 생체재료를 생분해성 고분자재료 내부에 도입한 복합재료 지지체를 사용하기 때문에, 변형 없이 완전한 연골을 형성시킬 수 있다.

본 발명에 따른 연골지지체의 제조방법을 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(1) 비분해성(non-degradable) 또는 저분해성(very slow degrading) 생체재료로 소정의 형태를 갖는 내부 지지체를 제조하는 단계.

본 발명에서 사용되는 비분해성 또는 저분해성 고분자는 인체 내에 삽입할 수 있도록 생체적합성이 검증된 의료용 재료로서, 그 종류가 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 폴리에틸렌(Medpor^ⓡ), 실리콘, 폴리테트라플루오르에틸렌(Gore-Tex^ⓡ), 형상기억합금, 세라믹 등 가능한 모든 생체재료를 사용할 수 있으며, 인체 내에서 신생 연골조직이 위치할 특성이나 기능적 요구에 따라 적합한 재료를 선정하여 사용한다.

상기에서 소정의 형태란 이식하고자 하는 생체연골부위의 형태를 의미한다.

(2) 상기 내부 지지체에 생분해성 고분자재료를 피복 또는 결합시켜 복합재료 지지체를 얻는 단계.

상기 (1)단계에서 제조한 내부 지지체의 표면을 생분해성 고분자재료로 피복 하거나, 내부 지지체에 여러 개의 구멍을 내어 이 구멍을 통하여 생분해성 고분자재료가 관통하여 내부 지지체와 생분해성 고분자가 한 덩어리로 맞물리도록 결합시키거나, 내부 지지체의 표면을 거칠게 요철 가공하여 내부 지지체와 생분해성 고분자를 결합시키는 등의 여러 가지 방법으로 내부 지지체와 생분해성 고분자재료를 결합시켜 복합재료 지지체를 얻는다.

본 발명에 사용된 생분해성 고분자는 인체에 무해하고, 인체 내에 이식되면 가수분해 및 인체내의 효소에 의해 일정기간 내에 생분해될 수 있는 특성을 갖는 것이면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적인 예를 들면, 젖산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 콜라겐, 젤라틴, 피브리노오겐, 카제인, 피브린, 키틴, 키토산, 하이알루로닉산, 헤파린, 콘드로이친, 알긴산, 케라틴, 폴리히드록시뷰티릭산(polyhydroxybutyric acid), 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드 및 폴리알킬시아노아크릴레이트 중에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.

상기한 방법으로 제조된 연골지지체를 사용하여 인공연골을 제조하는 방법은 통상적인 조직공학적 인공연골의 제조방법에 따른다. 즉, 복합재료 지지체에 연골세포(chondrocyte)를 파종한 후, 이를 수일 내지 수주간 배양하여 지지체-연골세포 복합체(polymer-cell complex)를 얻고, 이를 생체내의 소정의 부위에 이식하여 조직공학적 인공연골을 제조한다. 배양방법은 연골조직공학에서 이용되는 모든 방법이 가능하며, 통상 연골배양액 내에 담구어 CO₂배양기에서 배양한다.

지지체-연골세포 복합체를 생체내의 소정의 부위에 이식하게 되면 생분해성 고분자 지지체는 서서히 분해되기 시작하고, 연골세포는 계속 증식하여 연골기질(cartilage matrix)을 생산하며, 결과적으로 생분해성 고분자 지지체는 분해되어 완전히 흡수되어 없어지고, 영구적 또는 반영구적인 내부 지지체의 둘레에는 일정두께의 연골조직이 형상화되는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 시험예에 의거하여 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

〈비교예 1〉

젖산과 글리콜산을 75:25중량%의 비율로 혼합한 후, 170℃, 100rpm에서 4시간 동안 촉매(150ppm, stanous octoate) 존재 하에 열중합하여 공중합체(co-polymer)를 제조하였다. 제조된 공중합체(이하, PLGA 75:25라함)를 클로로포름(chloroform) 등의 용매에 녹인 다음, 원하는 입자크기의 소금을 섞어서 말린다. 반쯤 말라서 용액이 젤리처럼 되면 원하는 귀모양의 형틀에 부어 넣고 충분히 마르도록 하였다. 귀모양으로 굳어진 다음에 이를 물에 넣어 하룻동안 소금을 녹여 내면 균일한 기공을 가진 다공성 연골지지체가 완성된다. 여기에 연골세포를 파종하고 3주 동안 배양하여 지지체-연골세포 복합체를 형성한 다음, 이를 쥐의 등(back of a rat)의 피부 밑에 이식하였다. 그 결과, 쥐의 피부 밑에 새로운 연골조직이 생성되었다(도 1 참조).

〈실시예 1〉

실리콘을 귀모양의 형틀에 부어서 귀모양의 내부 지지체를 제조하였다. 그 다음, 상기 비교예 1에서와 같이, PLGA 75:25를 클로로포름에 녹이고 소금을 섞은 후, 반쯤 굳어 젤리처럼 되었을 때 사람 귀모양의 형틀의 바닥에 부어 얇게 깔고 그 위에 미리 제작한 내부 지지체를 얹은 다음, 그 위에 다시 젤리상태의 공중합체를 덮으면 내부 지지체가 완전히 매몰된 도 2와 같은 사람 귀형태의 구조물이 만들어졌다. 이 구조물이 완전히 굳으면, 이를 물에 넣어 소금을 녹여내면 복합재료 지지체가 완성된다. 여기에 토끼의 귀에서 채취한 연골세포를 파종하고 3주 동안 배양하여 지지체-연골세포 복합체를 형성한 다음, 이를 토끼의 피부 밑에 자가이식하였다. 그 결과, 토끼의 피부 밑에 사람 귀모양의 새로운 연골조직이 생성되었다.

〈시험예 1〉

젖산과 글리콜산 공중합체(PLGA co-polymer 75:25)를 사용하여 비교예 1과 동일한 방법으로 한 변의 길이가 10mm이고 두께가 5mm인 사각형의 생분해성 연골지지체(이하에서는 '공지의 지지체'라 함) 6개와 이와 동일한 크기와 모양의 공중합체(PLGA co-polymer 75:25) 재료의 내부에 한 변의 길이가 7mm이고 두께가 1mm인 폴리에틸렌(Medpor^ⓡ)을 내부 지지체로 삽입한 연골지지체(이하에서는 '본 발명의 복합 지지체'라 함)를 6개 만들어 멸균시킨 후 인간의 이개탄성연골세포를 파종한 다음, 3주간 배양하여 지지체-연골세포 복합체를 형성하였다. 이렇게 만들어진 지지체-연골세포 복합체를 면역기능이 저하된 무모쥐(nude mouse)의 등(back)에 각각 피하이식(subcutaneous implantation)하여 연골생성을 유도하였다. 약 8주가 경과한 후에 쥐의 등에서 생성된 연골을 확인하였고, 생성된 연골조직을 채취하여 두 가지 지지체에서 각각 형성된 사각형의 신생연골의 크기와 두께를 측정하여 비교하여 보았다. 그 결과는 표 1과 같다.

지지체의 종류	공지의 지지체(PLGA 75:25)	본 발명의 복합지지체(PLGA 75:25 + Medporⓡ)
한변의 길이(평균±표준편차, ㎜)	9.0 ±0.16	9.6 ±0.12
두께(평균±표준편차, ㎜)	4.3 ±0.08	4.6 ±0.05

표 1로부터, 양쪽 모두에서 원래의 지지체의 크기나 두께보다 약간씩 작아졌지만, 본 발명의 복합지지체로부터 생성된 연골조직의 한 변의 길이와 두께가 원래의 지지체의 크기에 가깝다는 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 복합지지체를 사용하여 생성된 연골이 변형이 적음을 알 수 있다.

한편, 연골조직의 물리적 강도를 과학적인 장비로 측정은 않았지만, 생성된 연골의 물리적 특성을 비교하기 위하여 손으로 구부려본 결과, 생분해성 재료만으로 제작된 공지의 지지체로부터 생성된 연골은 쉽게 구부러진데 반해서, 본 발명의 복합지지체로부터 생성된 연골조직은 연골조직 내의 Medpor^ⓡ내부 지지체의 강도로 인하여 쉽게 구부러지지 않았다. 따라서, 본 발명의 복합지지체로부터 생성된 연골은 내부지지체 재료의 특성에 따라서 물리적 특성을 현저히 바꿀 수 있다는 것을 알 수 있다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 인공연골은 연골내부에 영구적 또는 반영구적으로 유지되는 내부지지체를 함유하고 있기 때문에, 생분해성 고분자 지지체가 완전히 분해되어도 외부에서 가해지는 물리적 힘 등에 의해 변형됨이 없이 원하는 모양에 가깝게 형상화될 수 있어, 이 기술을 이용하면 선천성 기형, 고령화 또는 사고로 인하여 결손되거나 손상된 신체 일부를 효과적으로 복원할 수 있다. 또한, 내부지지체 재료의 특성에 따라서 생성되는 연골조직의 물리적 특성을 현저히 바꿀 수 있어 다양한 특성을 가진 연골의 생산이 가능해 진다.

아울러, 이 기술을 응용할 경우 여러 조직공학분야와 인공장기의 개발분야에도 적용 가능할 것이므로, 신체조직의 일부를 복원하거나 인공장기를 개발하는 등의 의학적 용도로 다양하게 이용될 수 있을 것이다.

Claims (6)

1. (1) 비분해성(non-degradable) 또는 저분해성(very slow degrading) 생체재료로 소정의 형태를 갖는 내부 지지체를 제조하는 단계;

   (2) 상기 내부 지지체에 생분해성 고분자재료를 피복 또는 결합시켜 복합재료 지지체를 얻는 단계;

   를 포함함을 특징으로 하는 복합재료 지지체의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 (1)단계의 비분해성 또는 저분해성 생체재료는 폴리에틸렌, 실리콘, 폴리테트라플루오르에틸렌, 형상기억합금 및 세라믹으로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기 (2)단계의 생분해성 고분자는 젖산-글리콜산 공중합체(PLGA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산(PLA), 콜라겐, 젤라틴, 피브리노오겐, 카제인, 피브린, 키틴, 키토산, 하이알루로닉산, 헤파린, 콘드로이친, 알긴산, 케라틴, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드 및 폴리알킬시아노아크릴레이트 중에서 선택된 1종 이상임을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 (2)단계의 내부지지체에 생분해성 고분자를 결합시키는 방법은 내부 지지체에 여러 개의 구멍을 내어 이 구멍을 통하여 생분해성 고분자재료가 관통하는 것에 의해 내부 지지체와 생분해성 고분자재료가 결합되도록 하거나, 내부지지체의 표면을 요철가공하여 생분해성 고분자가 내부 지지체와 맞물리도록 하여 결합되도록 하는 것임을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1항의 제조방법에 의해 제조된 것임을 특징으로 하는 복합재료 지지체.
6. 제 5항의 복합재료 지지체를 사용하여 형성된 조직공학적 인공연골.