KR101141547B1

KR101141547B1 - 구조틀 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체

Info

Publication number: KR101141547B1
Application number: KR1020090133756A
Authority: KR
Inventors: 이수홍; 강선웅; 김진수; 한인보; 신동아
Original assignee: 차의과학대학교 산학협력단
Priority date: 2009-12-30
Filing date: 2009-12-30
Publication date: 2012-05-03
Also published as: KR20110077244A

Abstract

본 발명은 공극을 갖는 고분자 지지체(polymer support)의 구조틀(frame) 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체(construct for tissue-reconstruction)로서, (i) 상기 코팅층이 세포; 세포성장인자; 또는 세포 및 세포성장인자를 포함하고, (ii) 상기 코팅층이 트롬빈에 의해 가교화되어 있으며, 또한 (iii) 상기 구조체가 10 ㎛～ 1,000 ㎛의 공극을 갖는, 조직재생용 구조체를 제공한다.

조직재생용 구조체, 히알루론산, 피브리노오겐, 세포성장인자, 줄기세포

Description

구조틀 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체{Construct for tissue-reconstruction comprising coating layer formed by coating hyaluronic acid or its salt and fibrinogen on surface of support frame}

본 발명은 공극을 갖는 고분자 지지체(polymer support)의 구조틀(frame) 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체로서, 얻어지는 구조체가 공극을 그대로 유지함으로써, 공극을 통한 체액(body fluid)의 원활한 접근이 가능하고 산소 및 영양분의 공급이 원활할 뿐만 아니라, 상기 공극을 통하여 구조체로부터의 세포성장인자의 지속적이고 안정적인 방출이 가능한 조직재생용 구조체에 관한 것이다.

조직공학(tissue engineering)은 세포학, 생명과학, 공학, 의학 등의 기존의 과학 영역을 응용하는 다학제간 학문으로 생체조직의 구조와 기능 사이의 상관관계를 이해하고, 손상된 조직이나 장기를 정상적인 조직으로 대체, 재생시키기 위한 새로운 융합 학문분야이다. 즉, 체내에 이식가능한 인공생체조직을 만들어 우리 몸의 기능을 유지, 향상 또는 복원하는 것을 목적으로 한다. 이를 위해 우선적으로, 환자의 몸에서 필요한 조직을 채취하여 세포를 분리한 후, 분리된 세포를 배양을 통해 필요한 양만큼 증식시킨다. 증식된 세포를 다공성 생분해 고분자 지지체(support)에 심어 일정기간 동안 체외 배양하여 얻어지는 세포/지지체 복합물을 다시 체내에 이식한다. 이식된 세포/지지체 복합물은 신생 혈관이 형성될 때까지는 체액의 확산에 의해 산소와 영양분을 공급받으며, 체내에 혈관이 자라서 들어와 혈액의 공급이 이루어지면 증식하여 새로운 조직 및 장기를 형성하게 된다.

조직재생용 지지체는 조직재생의 목적에 따라 세포를 포함하지 않고 그 자체를 사용하는 경우와 세포를 포함하는 경우로 나눌 수 있다. 세포를 포함하지 않는 경우에는 세포성장인자(cell growth factors) 또는 분화인자(differentiation-inducing factors)를 도입하여 이식시 주변조직으로부터 세포이동을 유도하여 조직을 재생시킨다. 한편, 세포를 포함하는 경우에는 자가 혹은 동종의 세포를 이용하며, 최근에는 줄기세포를 이용해 조직재생을 보다 원할하게 유도하려는 노력이 진행 중이다. 이와 같이, 세포의 사용 유무와 관계없이 조직공학용 지지체는 조직재생을 효과적으로 유도하는데 필수적인 요소의 하나이다.

조직공학용 지지체로는 폴리글리콜산(PGA), 폴리락틱산(PLA), 폴리카프로락톤(PCL)을 기반으로 하는 고분자와 이들의 공중합체로부터 공극을 갖는 구조의 형태로 제조된다. 제조된 지지체는 이들 재료의 특성으로 인해 모두 소수성의 성질을 가지고 있다. 따라서, 조직 공학적 응용에 있어서 고분자 지지체는 인체조직으로 이식시 혹은 조직세포를 배양하는 경우, 세포 및 조직 적합성이 낮다는 점이 문제이다. 또한, 지지체의 제조시 유기용매 사용 또는 열처리 때문에 성장 혹은 분화인 자를 직접적으로 담체하기가 어렵거나 담체 효율이 낮은 경우가 많다. 이러한 문제점을 개선하기 위하여 최근 여러 가지 방법으로 지지체의 표면을 개질하려는 노력이 진행되고 있다.

친수성 및 생체적합성을 향상시키기 위한 고분자 지지체 표면 개질 방법으로서 산성 및 염기성 용액을 사용해 표면 부식을 통한 표면적 증가와 하이록실기와 카르복실기를 유도하는 방법이 보고된 바 있다(Gao J, Niklason L, Langer R., Surface hydrolysis of poly(glycolic acid) meshes increases the seeding density of vascular smooth muscle cells, J Biomed Mater Res. (1998) 5;42(3), 417-24 ; I. K. Kwon, K. D. Park, S. W. Choi, S-H. Lee, E. B. Lee, J. S. Na, S. H. Kim, and Y. H. Kim, Fibroblast Culture on Surface-modified Poly(glycolide-co-caprolactone) Scaffold for Soft Tissue Regeneration, J. Biomaterials Sci., Polymer Ed, (2001) 12(10), 1147-1160 ; Perego G, Preda P, Pasquinelli G, Curti T, Freyrie A, Cenni E., Functionalization of poly-(L-lactic-co-epsilon-caprolactone): effects of surface modification on endothelial cell proliferation and hemocompatibility. J Biomater Sci Polym Ed. (2003) 14(10), 1057-75). 또한, 세포외기질의 성분 중 하나인 교원질을 PGA, PLA 또는 PLGA와 혼합하여 하이브리드 형태로 지지체를 제조하는 방법 등이 보고된 바 있다 (Chen G, Ushida T, Tateishi T., Poly(DL-lactic-co-glycolic acid) sponge hybridized with collagen microsponges and deposited apatite particulates, J Biomed Mater Res. (2001) 57(1), 8-14 ; Chen G, Sato T, Ushida T, Hirochika R, Tateishi T., Redifferentiation of dedifferentiated bovine chondrocytes when cultured in vitro in a PLGA-collagen hybrid mesh, FEBS Lett. (2003) 8;542(1-3), 95-9). 그러나, 상기와 같은 종래의 방법은 산성 또는 알칼리 용액에 의하여 고분자의 주쇄사슬이 분해되어 분자량이 감소하고, 결국 지지체의 기계적 물성이 크게 저하된다는 단점이 있다. 더욱이, 교원질을 사용하는 경우는 이종의 것을 사용하게 되므로 면역반응의 문제가 발생할 수 있다는 단점이 있다. 이밖에, 플라즈마 처리 및 친수성 중합 단량체로 다공성 고분자 지지체의 표면을 개질을 하려는 연구가 진행되었으나(Yang J, Bei J, Wang S. Enhanced cell affinity of poly (D,L-lactide) by combining plasma treatment with collagen anchorage, Biomaterials (2002) 23(12), 2607-1 ; Shen H, Hu X, Yang F, Bei J, Wang S., Combining oxygen plasma treatment with anchorage of cationized gelatin for enhancing cell affinity of poly(lactide-co-glycolide). Biomaterials (2007) 28(29), 4219-30; Kuo YC, Ku IN., Application of polyethyleneimine-modified scaffolds to the regeneration of cartilaginous tissue. Biotechnol Prog. (2009) 25(5), 1459-67), 화학적 작용기 및 친수성 물질에 의한 세포친화력 증대는 한계가 있는 것으로 평가되고있다.

최근 펩타이드 혹은 세포외기질(extracellular matrix, ECM) 물질을 하이드로겔 형태로 지지체 표면에 도입함으로써 세포 점착성을 증가시키는 다양한 방법들이 시도되고 있다 (Mann BK, West JL. Cell adhesion peptides alter smooth muscle cell adhesion, proliferation, migration, and matrix protein synthesis on modified surfaces and in polymer scaffolds. J Biomed Mater Res. (2002) 60(1) 86-93 ; Zhu Y, Gao C, He T, Shen J. Endothelium regeneration on luminal surface of polyurethane vascular scaffold modified with diamine and covalently grafted with gelatin. Biomaterials (2004) 25(3), 423-30). 이중 대표적으로는 파이브로넥틴(fibronectin)으로 고분자 표면을 도포하는 방법(Harding SI, Afoke A, Brown RA, MacLeod A, Shamlou PA, Dunnill P., Engineering and cell attachment properties of human fibronectin-fibrinogen scaffolds for use in tissue engineered blood vessels. Bioprocess Biosyst Eng. (2002) 25(1), 53-9), 하이드록시아파타이트 결정과 콜라겐을 혼합하여 복합체를 제조하는 방법(Itoh S, Kikuchi M, Takakuda K, Koyama Y, Matsumoto HN, Ichinose S, Tanaka J, Kawauchi T, Shinomiya K., The biocompatibility and osteoconductive activity of a novel hydroxyapatite/collagen composite biomaterial, and its function as a carrier of rhBMP-2. J Biomed Mater Res. (2001) 5;54(3), 445-53; Zhang R, Ma PX, Biomimetic polymer/apatite composite scaffolds for mineralized tissue engineering, Macromol Biosci. (2004) 20;4(2), 100-11) 등을 예로 들 수 있다. 실제로, 세포외기질 물질 (extracellular matrix)이나 특정 조직성장인자들은 생체내에서 손상된 조직재생에 탁월한 효능이 있는 것으로 보고되고 있으며(Schleicher I, Parker A, Leavesley D, Crawford R, Upton Z, Xiao Y., Surface modification by complexes of vitronectin and growth factors for serum-free culture of human osteoblasts. Tissue Eng. (2005) 11(11-12), 1688-98; Ma Z, Gao C, Gong Y, Shen J., Cartilage tissue engineering PLLA scaffold with surface immobilized collagen and basic fibroblast growth factor, Biomaterials (2005) 26(11), 1253-9; Hosseinkhani H, Hosseinkhani M, Khademhosseini A, Kobayashi H., Bone regeneration through controlled release of bone morphogenetic protein-2 from 3-D tissue engineered nano-scaffold. J Control Release. (2007) 26;117(3), 380-6)), 실제 임상에서도 이들의 우수한 조직재생력이 다수의 결과에서 보고된 바 있다. 그러나, 상기 방법들로 이루어진 지지체는 수화된 하이드로겔로 인해 지지체 표면 공극이 막히는 현상과 하이드로젤내에 세포성장물질 도입 효율이 매우 낮은 단점이 있다.

일반적으로 대부분의 세포외기질 및 세포성장인자들은 상대적으로 고가이고, 분자량이 수십 kDa에 이르는 고분자량의 단백질로서 생체 내에서는 불안정하여 활성이 떨어진다. 체내에서 이식될 경우에도 수 분 이내로 방출, 소실되므로 원하는 위치에서 치료효과를 얻기 위해서는 고가의 세포성장인자를 대용량으로 투여해야 하는 점과 다량의 투여로 인한 부작용 유발의 가능성도 제기되고 있다. 최근 고분자 지지체에 골성장인자들을 함유시켜 서방출함으로써 단순 적용에 따른 단점을 경감하고자 하는 시도가 이루어져 왔으며 어느 정도 그 효과도 입증 되었다. 그러나 이들 골이식재나 지지체 자체에 의해서는 조직성장인자가 물리적으로 혼합되어 있는 상태로서 초기 적용시 초기방출 (burst release)이 일어나 치료기간동안 유효농도의 유지가 어렵다는 단점이 있다. 따라서, 지지체 표면에 생체활성이 뛰어난 세포외기질물질을 안정적으로 도포하고, 세포성장인자를 효율적으로 도입하여 안정적 으로 방출되도록 유도하는 방법의 개발은 조직재생 분야에서 매우 중요하다.

본 발명자들은 소수성을 나타내는 조직공학용 지지체에서 세포점착이 효율적으로 이루어지지 못하는 단점과 세포 성장인자들의 도입이 용이하지 않은 단점을 해결하기 위해, 세포친화성을 증진시키는 하이드로겔 표면처리 방법에 대한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 공극을 갖는 고분자 지지체(polymer support)의 구조틀(frame) 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐을 동결건조 등의 방법으로 코팅하여 코팅층을 형성시킴으로써, 세포친화력을 크게 증진시켜 세포점착력을 크게 향상시킬 수 있을 뿐 아니라, 세포성장인자의 도입도 매우 효율적으로 이루어질 수 있다는 것을 발견하였다. 즉, 표면이 건조된 하이드로겔 코팅층에 세포 및/또는 세포성장인자 등을 파종할 경우, 빠른 속도로 세포와 세포성장인자를 지지체 표면에 점착하도록 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 더욱이, 트롬빈을 통하여 가교화를 유도하고, 얻어지는 구조체가 공극을 그대로 유지하도록 함으로써, 공극을 통한 체액(body fluid)의 원활한 접근이 가능하고 산소 및 영양분의 공급이 원활할 뿐만 아니라, 상기 공극을 통하여 구조체로부터의 세포성장인자의 지속적이고 안정적인 방출이 가능하므로, 조직세포들이 균일하게 효율적으로 점착, 증식될 수 있다는 것을 발견하였다.

따라서, 본 발명은 높은 친수성 및 세포친화성을 가짐으로써, 세포 및/또는 세포성장인자가 높은 점착효율(introduction rate or loading rate)로 고분자 지지체 상에 도입된 조직재생용 구조체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 태양에 따라, 공극을 갖는 고분자 지지체(polymer support)의 구조틀(frame) 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체(construct for tissue-reconstruction)로서, (i) 상기 코팅층이 세포; 세포성장인자; 또는 세포 및 세포성장인자를 포함하고, (ii) 상기 코팅층이 트롬빈에 의해 가교화되어 있으며, 또한 (iii) 상기 구조체가 10 ㎛～ 1,000 ㎛의 공극을 갖는, 조직재생용 구조체가 제공된다.

상기 고분자 지지체는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체, 락타이드와 카프로락톤과의 공중합체, 및 글리콜라이드와 카프로락톤과의 공중합체으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 생분해성 고분자로부터 바람직하게 형성될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 D,L-락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체 및 폴리카프로락톤의 혼합물로부터 형성될 수 있다. 상기 고분자 지지체는 10 ㎛～ 1,000 ㎛ 범위의 공극을 가질 수 있다.

상기 히아루론산 또는 그의 염의 중량평균분자량은 1,000 ～ 4,000,000 달톤의 범위일 수 있으며, 상기 코팅층 중의 히아루론산 또는 그의 염의 함량은 10 ～ 90 중량%의 범위일 수 있다. 또한, 상기 코팅층 중의 피브리노오겐의 함량은 10 ～ 90 중량%의 범위일 수 있다. 상기 코팅은 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐을 함유하는 수용액 중에 상기 지지체를 침지한 다음, 상기 지지체를 상기 수용액으로부터 꺼내어 동결건조하는 과정을 적어도 1회 이상, 바람직하게는 2회 내지 20회 반복 수행될 수 있으며, 상기 침지는 4～50 ℃에서 수행될 수 있다. 또한, 상 기 침지 후 동결건조 전에, 상기 수용액으로부터 꺼낸 지지체를 약 25 ℃에서 건조하는 것을 추가로 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐을 함유하는 수용액에 세포성장인자를 추가로 함유시킴으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포성장인자를 함유하는 수성 용액(aqueous solution)을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가한 후, 트롬빈 및 칼슘염을 함유하는 용액을 가하여 건조시킴으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 또다른 구현예에서, 세포성장인자; 및 트롬빈과 칼슘염을 함유하는 수성 용액을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가하여 건조시킴으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 또다른 구현예에서, 트롬빈 및 칼슘염을 함유하는 용액을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가하여 건조시킨 다음, 세포성장인자를 함유하는 수성 용액을 가함으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 상기 구현예에 있어서, 상기 건조는 동결건조에 의해 바람직하게 수행될 수 있으며, 상기 수성 용액 중의 세포성장인자의 농도는 10 pg/mL ～ 100 mg/mL의 범위일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 구현예들로부터 얻어진 세포성장인자가 도입된 조직재생용 구조체의 코팅층 표면 상에, 세포를 함유하는 수성 분산액(aqueous dispersion)을 파종하는 단계를 추가로 포함으로써, 추가적으로 상기 세포가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 상기 수성 분산액 중의 세포의 농도는 10³ ～ 10¹⁰ cells/mL의 범위일 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 트롬빈 및 칼슘염을 함유하는 용액을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가하여 건조시킨 다음, 세포를 함유하는 수성 분산액(aqueous dispersion)을 가함으로써, 상기 세포가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 상기 건조는 동결건조에 의해 수행될 수 있으며, 상기 수성 분산액 중의 세포의 농도는 10³ ～ 10¹⁰ cells/mL의 범위일 수 잇다.

상기 세포는 조직세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)일 수 있으며, 상기 세포성장인자는 BMP-2(bone morphogenetic protein 2), VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor), IGF(insulin-like growth factor), NGF(nerve growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β), 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 조직재생용 구조체는 공극을 갖는 고분자 지지체(polymer support)의 구조틀(frame) 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하며, 따라서 얻어지는 구조체가 공극을 그대로 유 지함으로써, 공극을 통한 체액(body fluid)의 원활한 접근이 가능하고 산소 및 영양분의 공급이 원활할 뿐만 아니라, 상기 공극을 통하여 구조체로부터의 세포성장인자의 지속적이고 안정적인 방출이 가능하므로, 조직세포들이 균일하게 효율적으로 점착, 증식될 수 있다. 또한, 본 발명의 조직재생용 구조체는 화학적인 촉매의 사용 없이 균일한 코팅층 형성이 가능하므로, 우수한 안전성을 가질 뿐만 아니라 높은 친수성 및 세포친화성를 가짐으로써 세포, 세포성장인자가 높은 점착효율(introduction rate or loading rate)로 도입될 수 있다. 또한, 도입된 세포성장인자가 지속적인 방출 패턴을 나타내므로, 줄기세포의 분화를 안정적으로 유도할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 조직재생용 구조체는 생체에 이식되어 근골격재생, 혈관재생, 피부재생 등을 포함한 다양한 조직공학적 소재로 사용될 수 있다.

본 명세서에서, "조직재생용 구조체(construct for tissue-reconstruction)"라 함은 체내의 손상된 조직 또는 그 주변에 이식되어 손상된 조직을 재생시킨 후 다시 분리되거나, 혹은 완전히 분해되어 없어지게 되는 구조체를 말한다. 상기 조직재생용 구조체는 체외에서 분화를 유도하여 생체내에 이식되거나, 혹은 별도의 분화 유도 없이 생체내에 직접 이식되어 생체내에서 분화가 유도되도록 할 수 있다. 상기 조직재생용 구조체는 체내에 이식되어 신생 혈관이 형성될 때까지는 체액을 통하여 산소와 영양분을 공급받으며, 또한 혈관의 생성(angiogenesis)을 통하여 혈액의 공급이 이루어지면서 증식하여 새로운 조직이나 장기로 형성된다.

또한, "세포성장인자(cell growth factors)"라 함은 분화인 자(differentiation-inducing factors)라고도 칭해지며, 세포의 성장 및/또는 줄기세포의 분화에 관여되는 인자를 말한다. 상기 세포성장인자는 생체내에 이식되었을 때, 주변조직으로부터 세포이동을 유도하여 조직을 재생시키거나, 줄기세포의 분화를 촉진시켜 조직을 재생시키는 역할을 하는 모든 인자들을 포함한다. 예를 들어,BMP-2(bone morphogenetic protein 2), VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor), IGF(insulin-like growth factor), NGF(nerve growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β), bFGF(basic fibroblast growth factor) 등을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 공극을 갖는 고분자 지지체의 구조틀(frame) 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체(construct for tissue-reconstruction)로서, (i) 상기 코팅층이 세포; 세포성장인자; 또는 세포 및 세포성장인자를 포함하고, (ii) 상기 코팅층이 트롬빈에 의해 가교화되어 있으며, 또한 (iii) 상기 구조체가 10 ㎛～ 1,000 ㎛의 공극을 갖는, 조직재생용 구조체를 제공한다.

상기 고분자 지지체(polymer support)는 고분자로 이루어진 매트릭스로서 공극을 갖는 매트릭스를 말한다. 상기 고분자 지지체는 생분해성 고분자로부터 바람직하게 형성될 수 있으며, 상기 생분해성 고분자는 의약 또는 약학 분야에서 통상적으로 사용되는 생분해성 고분자일 수 있다. 바람직하게는, 상기 고분자 지지체는 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체, 락타이드와 카프로락톤과의 공중합체, 및 글리콜라이드와 카프로락톤과의 공중합체으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 생분해성 고분자로부터 형성될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 D,L-락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체[예를 들어, 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(D,L-lactic acid-co-glycolic acid, PLGA)] 및 폴리카프로락톤(poly(ε-caprolactone), PCL)의 혼합물로부터 형성될 수 있다. 상기 공극을 갖는 고분자 지지체는 예를 들어 상기한 생분해성 고분자로부터 통상의 방법, 예를 들어 염추출법, 발포법, 유화동결법, 열접착법, 3차원 프린팅, CAD-CAM 등의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, Kim 등의 방법(Biofabrication 2009; 1: 1-7)에 따라 자유 임의 형상 제작 방법(solid free-form fabrication method)에 따라 공극을 갖는 고분자 지지체를 형성시킬 수 있다. 상기 공극의 형상은 원형, 사각형 등의 다양한 형태일 수 있다. 상기 공극의 크기는 약 10 ㎛～ 1,000 ㎛ 범위일 수 있으며, 이때 상기 공극의 크기는 예를 들어 원형일 경우 직경, 사각형일 경우 가로 또는 세로의 길이를 의미한다.

상기 히아루론산은 인체 내에 존재하는 친수성 다당체로서, D-글루코론산(D-glucoronic acid)과 N-글루고스아민(N-glucosamine)의 이당체(Disaccharide, 분자량 379)의 기본 단위(Unit)가 긴 사슬처럼 연결된 고분자(High molecular weight hetero-polysaccharide)의 형태로 존재하며, 세포의 성장, 분화, 및 이동(migration) 등 세포외 간질(extracelluar matrix) 내에서 다양한 기능을 담당한다. 히아루론산의 염은 다양한 염 형태일 수 있으며, 예를 들어, 히아루론산 코발트, 히아루론산 마그네슘, 히아루론산 아연, 히아루론산 칼슘, 히아루론산 칼륨, 히아루론산 나트륨 등의 무기염 및 히아루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염 형태일 수 있다. 바람직하게는 히아루론산 나트륨을 사용할 수 있다. 본 발명의 조직재생용 구조체는 상기 히아루론산 또는 히아루론산의 염을 각각 포함하거나, 히아루론산과 히아루론산의 염을 혼합하여 포함할 수 있다. 상기 히아루론산 또는 그의 염의 중량평균분자량은 특별히 제한된 것은 아니며, 예를 들어, 상기 히아루론산 또는 그의 염의 평균분자량은 1,000 ～ 4,000,000 달톤일 수 있고, 바람직하게는 1,000 ～ 1,500,000 달톤일 수 있다.

본 발명의 조직재생용 구조체에 있어서, 상기 코팅층 중의 히아루론산 또는 그의 염의 함량은 10 ～ 90 중량%의 범위일 수 있으며, 또한 상기 코팅층 중의 피브리노오겐의 함량은 10 ～ 90 중량%의 범위일 수 있다. 상기 코팅층 중의 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐의 중량비는 크게 제한되는 것은 아니며, 세포성장인자의 방출속도 등을 감안하여 조절될 수 있다.

고분자 지지체의 구조틀(frame) 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐의 코팅은 히아루론산 및 피브리노오겐을 함유하는 수용액 중에 상기 지지체를 침지한 다음, 상기 지지체를 상기 수용액으로부터 꺼내어 동결건조하는 과정을 적어도 1회 이상 수행함으로써 수행될 수 있다. 상기 동결건조는 반복하여 수행될 수 있으며, 예를 들어 2회 내지 20회 반복하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 침지는 4 ～ 50 ℃, 바람직하게는 4 ～ 20 ℃에서 수행될 수 있다. 상기 침지 시간은 특별히 제한되는 것은 아니며, 약 30초의 단시간 동안 수행되거나 필요에 따라 그 보다 장시간 예를 들어 12 ～ 48 시간 동안 수행될 수 있 다. 또한, 필요할 경우, 상기 침지 후 동결건조 전에, 상기 수용액으로부터 꺼낸 지지체를 상온(약 25 ℃)에서 건조하는 것을 추가로 포함함으로써 제조과정에서 공극이 막히는 것을 방지할 수 있다.

상기와 같이 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 구조틀(frame) 표면 상에 코팅되어 있는 고분자 지지체는 높은 친수성 및 세포친화성을 가짐으로써, 세포 및/또는 세포성장인자를 높은 점착효율(introduction rate or loading rate)로 고분자 지지체 상에 도입시킬 수 있다.

예를 들어 세포성장인자의 도입은 수성 용액, 예를 들어 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline) 중에 세포성장인자를 용해시켜 상기 코팅층에 가하고 건조(바람직하게는 동결건조)시킴으로써 수행될 수 있다. 상기와 같이 건조된 코팅층에는 세포성장인자가 코팅층 전체에 균일하게 분산되어 있거나 코팅층 표면에 골고루 박혀있는 형태로 존재하게 된다. 또한, 세포성장인자의 도입은 상기 코팅층을 가교화시키 전, 가교화와 동시에, 혹은 가교화시킨 후에 도입할 수 있다.

구체적으로는, 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐을 함유하는 수용액에 세포성장인자를 추가로 함유시켜, 상기한 바와 동일한 방법으로 코팅층을 형성시킴으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 또한, 세포성장인자를 함유하는 수성 용액(aqueous solution)을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가한 후(필요할 경우 추가로 건조, 바람직하게는 동결건조 한 후), 트롬빈 및 칼슘염을 함유하는 용액을 가하여 건조시킴으로써 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 또한, 세포성 장인자; 및 트롬빈과 칼슘염을 함유하는 수성 용액을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가하여 건조시킴으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 또한, 트롬빈 및 칼슘염을 함유하는 용액을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가하여 건조시킨 다음, 세포성장인자를 함유하는 수성 용액을 가함으로써(필요할 경우 추가로 건조, 바람직하게는 동결건조함으로써), 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 상기 구현예에 있어서, 상기 건조는 동결건조에 의해 바람직하게 수행될 수 있으며, 상기 수성 용액 중의 세포성장인자의 농도는 10 pg/mL ～ 100 mg/mL의 범위일 수 있다.

또한, 세포의 도입은 줄기세포 등의 세포를 수성 매질(예를 들어, 인산완충식염수, DMEM 등과 같은 통상의 세포배양용 배지 등)에 분산시켜 얻어진 분산액을 상기 코팅층 또는 세포성장인자가 도입된 코팅층에 가함으로써 수행될 수 있다. 상기와 같이 세포를 코팅층에 도입하면, 세포가 높은 점착효율로 상기 코팅층에 점착되게 된다.

일 구현예에서, 상기한 바와 같이 얻어진 세포성장인자가 도입된 조직재생용 구조체의 코팅층 표면 상에, 세포를 함유하는 수성 분산액(aqueous dispersion)을 파종하는 단계를 추가로 포함으로써, 추가적으로 상기 세포가 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 상기 수성 분산액 중의 세포의 농도는 10³ ～ 10¹⁰ cells/mL의 범위일 수 있다.

또다른 구현에에서, 트롬빈 및 칼슘염을 함유하는 용액을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가하여 건조시킨 다음, 세포를 함유하는 수성 분산액(aqueous dispersion)을 가함으로써, 세포성장인자의 도입없이 세포가 단독으로 상기 코팅층에 도입될 수 있다. 상기 건조는 동결건조에 의해 수행될 수 있으며, 상기 수성 분산액 중의 세포의 농도는 10³ ～ 10¹⁰ cells/mL의 범위일 수 잇다.

본 발명의 조직재생용 구조체에 있어서, 상기 트롬빈 및 칼슘염은 피브리노오겐의 가교화 기능을 수행하며, 그 사용량은 원하는 가교화의 정도(예를 들어 세포성장인자의 원하는 방출속도를 달성하기 위하여 필요한 정도)에 따라 적절한 범위로 선택하여 사용될 수 있다. 바람직하게는 상기 트롬빈 및 칼슘염의 농도는 10 ～ 90 중량%의 범위일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 세포는 조직재생의 목적에 따라 사용되는 세포를 제한 없이 사용될 수 있으며, 전형적으로는 조직세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)일 수 있다. 본 발명의 조직재생용 구조체에 있어서, 상기 세포의 로딩(loading) 양은 필요에 따라 적절히 선택될 수 있으며, 전형적으로는 조직재생용 구조체 당 약 1×10⁵ 내지 5×10⁷ cells의 조직세포 또는 줄기세포를 함유할 수 있다. 상기 조직세포는 환자유래의 세포를 분리한 후, 이를 체외에서 배양/증식하여 얻어진 세포 즉, 환자유래의 체외 증식된 세포를 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 성체줄기세포는 다양한 조직 또는 세포로부터 유래 될 수 있으며, 예를 들어 골유유래 줄기세포, 제대혈유래 줄기세포, 태반유래 줄기세포, 근육유래 줄기세포, 지방유래 줄기세포 등을 모두 포함한다. 예를 들어, 통상적으로 흔히 시행되는 지방흡입 과정에서 폐기되는 지방조직을 사용하여 얻을 수 있는 지방유래 줄기세포(Adipose-derived stem cells, ASCs)가 바람직하게 사용될 수 있다. 상기 지방유래 줄기세포는 환자 자신 또는 표현형이 일치하는 타인의 지방으로부터 공지의 방법에 따라 얻어진 것을 사용할 수 있다. 상기 지방은 피하지방조직, 골수지방조직, 장간막 지방조직, 위장 지방조직 및 후복막 지방조직 등을 제한없이 포함한다.

상기 세포성장인자(cell growth factors) 또한, 조직재생의 목적에 따라 사용되는 세포성장인자를 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들어 BMP-2(bone morphogenetic protein 2), VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor), IGF(insulin-like growth factor), NGF(nerve growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β), bFGF(basic fibroblast growth factor) 등을 1 종 이상 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 조직재생용 구조체에 있어서, 상기 세포성장인자의 로딩(loading) 양은 목적에 따라 적절히 선택될 수 있다. 예를 들어 인산완충식염수 등의 수성 매질 중 약 10 pg/mL ～ 100 mg/mL 농도의 세포성장인자의 용액을 단위 형태의(unit-form) 조직재생용 구조체에 가하여 건조시킴으로써 세포성장인자를 로딩할 수 있다.

본 발명의 조직재생용 구조체는 상기한 바와 같이 세포(예를 들어, 조직세 포, 줄기세포 등), 세포성장인자를 별도의 조직재생용 구조체에 함유할 수 있으며, 필요에 따라 이들을 조합하여 하나의 조직재생용 구조체에 함유할 수도 있다. 예를 들어, 세포성장인자로서 BMP-2 및 세포로서 지방유래 줄기세포를 하나의 조직재생용 구조체에 함유할 수 있으며, 이로부터 얻어진 조직재생용 구조체는 골조직 재생에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, BMP-2 및 지방유래 줄기세포를 함유하는 조직재생용 구조체는 체외에서 골분화를 유도하여 생체내에 이식될 수 있거나, 혹은 별도의 분화 유도 없이 생체내에 이식함으로써 생체내에서 골분화를 유도할 수도 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 골성장인자가 도입된 조직재생용 지지체의 제작

(1) 고분자 지지체의 구조틀(frame) 표면 상에 히아루론산 및 피브리노오겐의 코팅층 형성

폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA) 및 폴리카프로락톤(PCL)로부터 형성된 고분자 지지체를 Kim 등의 방법(Biofabrication 2009; 1: 1-7)에 따라, 자유 임의 형상 제작 방식(solid free-form fabrication method)을 사용하여 제작하였다. 얻어진 고분자 지지체의 4mm x 4mm x 2mm이고, 공극의 크기는 약 250 μm 이었으며, 공극률은 약 65～70% 이었다. 1 mL 아프로니틴에 용해된 피브리노겐 용액(녹십자사, 그 린플라스트 1 mL 키트 사용)과 삼차 증류수 10 mL에 히아루론산(분자량 1,500,000, LG생명과학제조) 200 mg을 용해시킨 수용액을 볼륨기준으로 동일 비율로 혼합하였다. 얻어진 피브리노겐/히아루론산 용액에 상기에서 제조한 고분자 지지체를 침지하여 4℃에서 24시간 동안 교반하였다. 상기 고분자 지지체를 꺼내어 공극이 1시간 동안 실온에서 건조한 후, 24 시간 동안 동결건조하였다. 상기 침지 및 동결건조 과정을 3회 반복하여 구조틀 표면 상에 히아루론산 및 피브리노오겐의 코팅층이 형성된 고분자 지지체를 얻었다.

(2) 골성장인자가 도입된 조직재생용 지지체의 제작

골성장인자(BMP-2)(Chinese hamster ovary cell-derived recombinant human BMP-2, R&D Systems, Minneapolis, MN)를 인산완충식염수에 50 μg/mL의 농도로 녹인 후, 얻어진 BMP-2 용액 20 ㎕를 실시예 1에서 얻어진 코팅층이 형성된 고분자 지지체에 가하여 흡수시킨 다음, 즉시 동결건조하였다. 동결건조된 지지체에 트롬빈(녹십자사, 그린플라스트 1 mL 키트 사용)을 용해시킨 염화칼슘 수용액 32 ㎕를 가하여 가교화를 유도한 후, 다시 동결건조하여 조직재생용 지지체를 제작하였다.

(3) 조직재생용 지지체의 표면 형태 관찰

상기에서 코팅층을 형성하기 전의 고분자 지지체(도 1의 좌측) 및 얻어진 조직재생용 지지체(도 1의 우측)의 형태를 관찰한 결과는 도 1과 같다. 상단은 광학현미경으로 측정한 사진이고, 하단은 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM)을 통해 측정한 사진이다. 도 1로부터, 다공성 지지체의 구조틀(frame) 표면 상에 히아루론산/피브린 코팅층이 공극의 막힘 없이 고르게 형성되 어 있음을 알 수 있다.

실시예 2. 인간 지방유래 줄기세포가 도입된 조직재생용 지지체의 평가

(1) 인간 지방유래 줄기세포의 분리 및 배양

인간 지방조직은 차의과학대학 부속병원의 윤리위원회의 허가 아래 동의를 받고 지방흡입술에 의해 얻었다. 오염된 혈액을 제거하기 위해, 얻어진 지방 조직을 인산완충식염수(PBS)(Sigma, St. Louis, MO)를 이용하여 3회 세척하였다. 이어서 지방조직을 0.2 w/v% 소혈청알부민 함유 PBS와 2 mg/mL 타입 II 콜라게네이즈(Sigma)로 45분 동안 37℃로 소화시켰다. 70 μm 필터로 여과하고, 여액을 원심분리한 후 부유하는 지방세포를 제거하였다. 분리된 지방조직 유래 줄기세포 (ASCs)을 100 U/mL의 페니실린, 100 μg/mL의 스트렙토마이신, 그리고 10%의 우태아 혈청(Invitrogen, USA)이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM, Gibco BRL,Gaithersburg, MD)에서 배양하였다. 3회 또는 4회째 계대 배양된 세포를 하기 단계에서 사용하였다.

(2) 지방유래 줄기세포가 도입된 조직재생용 지지체의 세포점착능 평가

상기 (1)에서 인간 지방유래 줄기세포의 현탁액(1×10⁶ cells/mL)에 실시예 1의 (2)에서 얻어진 코팅층이 형성된 고분자 지지체를 침지하고, 4시간 동안 37℃ 인큐베이터에 배양한 다음, PBS로 3회 세척하여 지지체에 부착되지 않은 세포를 제거하여 조직재생용 지지체의 세포점착능을 평가하였다. 비교를 위하여, 코팅층 형 성되지 않은 고분자 지지체를 3일 동안 우혈청이 10% 포함된 세포 배양 배지에서 충분히 수화 시킨 후 상기 (1)에서 인간 지방유래 줄기세포의 현탁액(1×10⁶ cells/mL)에 침지하고, 4시간 동안 37℃ 인큐베이터에 배양한 다음, PBS로 3회 세척하여 지지체에 부착되지 않은 세포를 제거하였다(비교예).

본 발명에 따른 조직재생용 지지체 및 비교예의 지지체에 대하여 세포점착성을 다음과 같이 평가하였다. 즉, 각각의 지지체에 트립신을 가하여 지지체에 부착된 세포만을 수거한 다음, 수거된 세포의 개수를 세포측정기(Marienfeld GMbH & Co.KG, Germany)를 이용하여 계수하였다. 또한, 각각의 지지체를 FDA(fluorescein diacetate)로 염색한 후 공초점 형광현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM)을 이용하여 세포의 부착 모습을 관찰하였다. 그 결과는 도 2와 같다. 도 2로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 코팅층을 갖지 않은 고분자 지지체는 낮은 세포점착을 보인 반면, 본 발명에 따른 조직재생용 지지체는 높은 세포점착율을 나타냈다.

실시예 3. 조직재생용 지지체로부터의 BMP-2 방출

실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 BMP-2 (1 ㎍)가 도입된 조직재생용 지지체를 1.0 mL 37 ℃, PBS에서 BMP-2의 방출량을 5회에 걸쳐 면역효소측정법(ELISA)를 이용하여 측정하였다. ELISA 플레이트(NUNC, Polylabo, Strasbourg, France)는 포획 단원 항체(capture monoclonal antibody)로 도포시켰으며, 1 w/v % 소혈청알 부민 (bovine serum albumin)과 5 w/v % 수크로오스로 1시간 동안 차단시켰다. 희석된 샘플을 ELISA 플레이트에 첨가한 후 결합된 BMP-2를 항-인간 BMP-2 폴리클론 항체를 이용하여 측정하였다. 이어서 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 복합체(streptavidin-conjugated horseradish peroxidase)를 플레이트에 가한 다음, 퍼옥시다제와 테트라메틸벤지딘을 가하고 20분간 반응시켰다. 효소반응을 산 용액을 추가하여 중지시킨 후 샘플의 흡광도를 ELISA plate reader(PowerWave X340, Bio-Tek Instruments, Inc., Winooski, VT)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다. 그 결과는 도 3과 같다. 도 3의 결과로부터, 본 발명에 따른 조직재생용 지지체로부터 BMP-2가 3일 이상 지속적으로 방출됨을 알 수 있다.

실시예 4. 생체외 (in vitro) 지방줄기세포의 골분화도 평가

(1) BMP-2 및 지방유래 줄기세포가 도입된 조직재생용 지지체의 제작

실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 BMP-2 (1 ㎍)가 도입된 조직재생용 지지체 당 ASCs 약 5×10⁴ cells를 로딩하였다. 상기 로딩은 실시예 2의 (1)에서 얻은 ASCs 약 5×10⁴ cells을 DMEM 배지 32 μL에 분산시켜 얻어진 분산액을 상기 BMP-2 (1 ㎍)가 도입된 조직재생용 지지체에 뿌려주었다.

대조군으로 BMP-2가 로딩 안된 코팅층을 갖는 복합지지체(즉, 실시예 1의 (1)에서 제조된 코팅층을 갖는 지지체)(NO BMP-2)와 시험시작일에 BMP-2 1 ㎍를 배양 배지 안에 첨가한 코팅층을 갖는 지지체(즉, 실시예 1의 (1)에서 제조된 코팅층 을 갖는 지지체)(BMP-2 addition day 0)를 설정하여 ASCs를 배양하였다. 배양 배지로 10% v/v FBS, 100 units/mL 페니실린과 0.1 mg/mL 스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지를 사용하였고, 3일 마다 교환하였다.

(2) 골분화도 평가

실험시작일, 3, 7과 10일에 알칼리 포스파타제 활성을 ELISA법으로 측정하였다. 각각의 지지체(3, 7과 10일에 수거한 모든 그룹의 지지체)를 50 ㎕ 라이시스 버퍼(lysis buffer, Cell Culture Lysis Reagent 5X, Promega)에 첨가하고, 세포 용해물(lysate)을 10분간 13000 rpm에서 초원심분리(Micro 17R, Hanil Science Industrial, Seoul, Korea)하여 제거하였다. 각각의 샘플은 150 ㎕ p-니트로페닐포스페이트(pNPP, Sigma)를 첨가한 다음, 37℃에서 15분간 배양하였다. 0.2 N NaOH를 첨가하여 반응을 중지시키고, 각 샘플의 흡광도를 ELISA plate reader를 사용하여 405 nm에서 측정하였다. 그 결과는 도 4와 같다. 도 4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, BMP-2가 존재하지 않는 경우(NO BMP-2), 전체 배양기간 동안 알칼리 포스파타제의 활성이 증가하지 않았다. BMP-2 addition on day 0의 경우, 배양시작 7일 동안 알칼리 포스파타제의 활성이 증가하였으나 그 후는 감소 하였다. 반면, BMP-2가 도입된 조직재생용 지지체의 경우에는 전체 배양기간 동안 알칼리 포스파타제의 활성이 지속적으로 증가하였다.

실시예 5. 생체내(in vivo) 골조직재생 평가

실시예 1과 동일한 방법으로 제조한 BMP-2 (1 ㎍)가 도입된 조직재생용 지지체 당 ASCs 약 1×10⁶ cells를 로딩하였다. 상기 로딩은 실시예 2의 (1)에서 얻은 ASCs 약 5×10⁴ cells을 DMEM 배지 32 μL에 분산시켜 얻어진 분산액을 상기 BMP-2 (1 ㎍)가 도입된 조직재생용 지지체에 뿌려준 다음 한 시간 후에 면역결핍쥐의 등에 이식하였다.

(2) 지지체의 이식

무흉선 암컷 마우스(BALB/c-nu, 7 weeks old, female, SLC, Tokyo, Japan)를 4개의 실험군으로 나누고(n=6), 실라진(xylazine) 1.15 mg/kg과 케타민 8 mg/kg으로 마취시켰다. 각각의 실험군은 다음과 같다: 제1군은 코팅층을 형성시키지 않은 고분자 지지체를 이식한 군이고(G1), 제2군은 히아루론산/피브린 코팅층(즉, 트롬빈을 가하여 가교화시킨 코팅층)을 형성시킨 고분자 지지체를 이식한 군이고(G2), 제3군은 히아루론산/피브린 코팅층(즉, 트롬빈을 가하여 가교화시킨 코팅층)을 형성시킨 고분자 지지체 및 외부에서 BMP-2를 별도로 이식한 군이고(G3), 제4군은 상기 (1)에서 제조한 조직재생용 지지체를 이식한 군이다(G4). 각각의 지지체는 무흉선쥐(BALB/c-nu)의 등쪽 피하에 이식하였다.

(3) 조직염색을 통한 골조직재생평가

이식 8주 후에 실험동물들을 치사시켜 이식된 조직을 적출하여 파라핀에 포매하고(embedding), 4 ㎛의 두께로 절단한 뒤 Weber, F. E., 등의 방법[Biochem. Biophys Res. Commun. 286 (2001) 554-558]에 따라, 골드너-트리크롬(Goldner- Trichrome) 염색을 실시하였다. 골 재생 면적은 광학 현미경과 연결된 image analysis system(KS400, Zeiss, Munich, Germany)를 이용하여 분석하였고, 전체 횡단면에 대한 골 형성 면적비[(골 면적/전체 면적)×100%]로 정량화하였다.

도 5는 적출된 조직의 단면을 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome) 염색 후 광학현미경으로 관찰한 사진이다. 여기서 녹색 부분과 B는 재생된 골 부위, 화살표는 지지체를 나타내며, 스케일 바는 100 ㎛이다. 도 5의 결과로부터, 제1군의 경우 거의 골이 재생되지 않았고, 제2군 및 제3군의 경우에는 어느 정도 골이 재생되었음을 알 수 있다. 이에 반해, 제4군의 경우 골 재생이 매우 우수하였다. 도 6은 제3군 및 제4군에서 지지체 이식 후 적출된 단면을 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome) 염색 후 광학현미경으로 관찰한 사진이다. 여기서 스케일 바는 30 ㎛이다. 도 6의 결과로부터, 제4군에서 분화된 조골세포(osteoblast, 검은 화살표) 와 골세포(osteocyte, 빨간 화살표)를 관찰할 수 있다. 도 7은 (골 면적/전체 면적)×100%에 의해 계산된 골 형성 면적비를 나타낸 그래프로, 별표(*)는 통계학적 유의성을 나타낸다(*p<0.05). 도 7의 결과로부터, 제1군의 경우 1.9±0.4%, 제2군 및 제3군의 경우 5.5±2.2와 7.8±1.7%의 골 형성 면적비를 각각 나타내었다. 이에 반해, 제4군의 경우 19.6±5.0%로, 본 발명에 따른 골 재생용 복합 지지체를 이식한 경우 골 재생이 매우 우수함을 알 수 있다.

(4) 미네랄화된 골 조직 형성 평가

미네랄화된 골 조직 형성을 확인하기 위해 이식된 지지체의 soft x-ray촬영과 칼슘의 양을 측정하였다. 침착된 칼슘의 양은 Jeon et al., Biomaterials 2007;28(17):2763-2771에 기술된 방법으로 측정하였다. 즉, 이식 8주 후 적출된 조직을 인산완충용액을 이용하여 부드럽게 세척한 후 0.6 N 염산을 첨가한 후 잘게 자르고 교반기에서 12시간 동안 교반하였다. 이후 이를 1,000 g에서 5분간 원심분리하였다. 상층액에 있는 칼슘의 양은 상용화 된 칼슘 정량 키트(Bioassays)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다. 도 8는 이식체에서의 칼슘의 양을 측정하여 나타낸 그래프로, 별표(*)는 통계학적 유의성을 나타낸다(*p<0.05). 도 8의 결과로부터, soft x-ray의 경우 Group 4에서 가장 밝은 빛을 나타내며, 이는 미네랄화된 골조직이 형성됐음을 알 수 있고, 칼슘 정량 결과도 제4군에서 23.7 ㎍/㎎ dry tissue로 가장 높게 나타났다.

도 1은 코팅층을 형성하기 전의 고분자 지지체(도 1의 좌측, A) 및 본 발명에 따라 얻어진 조직재생용 지지체(도 1의 우측, B)의 형태를 관찰한 결과이다. 상단은 광학현미경으로 측정한 사진이고, 하단은 주사전자현미경(Scanning electron microscope, SEM)을 통해 측정한 사진이다.

도 2는 인간 지방유래 줄기세포가 도입된 본 발명에 따른 조직재생용 지지체(우측); 및 코팅층 형성되지 않은 고분자 지지체를 3일 동안 우혈청이 10% 포함된 세포 배양 배지에서 충분히 수화 시킨 후 인간 지방유래 줄기세포를 동일한 방법으로 인큐베이션하여 제작한 비교예의 지지체(좌측)를 공초점 형광현미경(Confocal Laser Scanning Microscope, CLSM)을 이용하여 측정한 결과 및 지지체에 부착된 세포의 갯수를 측정한 결과이다.

도 3은 골성장인자가 도입된 본 발명에 따른 조직재생용 지지체로부터의 BMP-2의 방출 거동을 ELISA를 통하여 측정한 결과이다.

도 4는 골성장인자가 도입된 본 발명에 따른 조직재생용 지지체 존재하에서 인간 지방유래 줄기세포를 배양하였을 때 점착된 지방줄기세포의 골분화 정도를 알카리 포스파타아제 활성(alkaline phosphatase activity)으로 정량분석한 결과이다. 대조군으로서 BMP-2가 로딩 안된 코팅된 지지체(NO BMP-2) 및 시험시작일에 BMP-2 1 ㎍를 배양 배지 안에 첨가한 코팅된 지지체(BMP-2 addition day 0)를 사용하였다.

도 5 내지 도 7은 각각 조직염색을 통한 골조직재생을 평가한 결과를 나타낸 다. 도 5 내지 도 7에서, 제1군은 코팅층을 형성시키지 않은 고분자 지지체(G1), 제2군은 히아루론산/피브린 코팅층을 형성시킨 고분자 지지체(G2), 제3군은 히아루론산/피브린 코팅층을 형성시킨 고분자 지지체 및 외부에서 BMP-2를 첨가한 군(G3), 제4군은 상기 (1)에서 제조한 조직재생용 지지체(G4)를 각각 이식하였을 때를 나타낸다. 도 5는 세포외기질이 도입된 지지체 표면에서 재생된 골조직의 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome) 염색 후 정성적 결과를 광학현미경을 통해 관찰한 사진이다. 도 6은 제3군과 제4군에서 골드너-트리크롬(Goldner-Trichrome) 염색 한 결과를 나타낸다. 도 7은 각각의 군에서 재생된 골조직 면적을 정량한 결과이다.

도 8은 세포외기질이 도입된 지지체 표면에서의 골재생 정도의 평가를 위한 동물실험 결과이다. 상단은 동물실험을 통한 soft X-ray 결과이며, 하단은 동물실험을 통해 재생된 골조직의 칼슘이온정량 결과이다.

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공극을 갖는 고분자 지지체의 구조틀 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체로서,

(i) 상기 코팅층이 세포성장인자를 포함하고, (ii) 상기 코팅층이 트롬빈에 의해 가교화되어 있으며, 또한 (iii) 상기 구조체가 10 ㎛～ 1,000 ㎛의 공극을 가지며,

히아루론산 또는 그의 염, 피브리노오겐, 및 세포성장인자를 함유하는 수성 용액 중에 상기 지지체를 침지한 다음, 상기 지지체를 상기 수성 용액으로부터 꺼내어 동결건조하는 과정을 적어도 1회 이상 수행함으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
공극을 갖는 고분자 지지체의 구조틀 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체로서,

(i) 상기 코팅층이 세포성장인자를 포함하고, (ii) 상기 코팅층이 트롬빈에 의해 가교화되어 있으며, 또한 (iii) 상기 구조체가 10 ㎛～ 1,000 ㎛의 공극을 가지며,

세포성장인자를 함유하는 수성 용액(aqueous solution)을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가한 후, 트롬빈 및 칼슘염을 함유하는 용액을 가하여 건조시킴으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
공극을 갖는 고분자 지지체의 구조틀 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체로서,

(i) 상기 코팅층이 세포성장인자를 포함하고, (ii) 상기 코팅층이 트롬빈에 의해 가교화되어 있으며, 또한 (iii) 상기 구조체가 10 ㎛～ 1,000 ㎛의 공극을 가지며,

세포성장인자; 및 트롬빈과 칼슘염을 함유하는 수성 용액을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가하여 건조시킴으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
공극을 갖는 고분자 지지체의 구조틀 표면 상에 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층을 포함하는 조직재생용 구조체로서,

(i) 상기 코팅층이 세포성장인자를 포함하고, (ii) 상기 코팅층이 트롬빈에 의해 가교화되어 있으며, 또한 (iii) 상기 구조체가 10 ㎛～ 1,000 ㎛의 공극을 가지며,

트롬빈 및 칼슘염을 함유하는 용액을 상기 히아루론산 또는 그의 염 및 피브리노오겐이 코팅되어 형성된 코팅층에 가하여 건조시킨 다음, 세포성장인자를 함유하는 수성 용액을 가함으로써, 상기 세포성장인자가 상기 코팅층에 도입되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조가 동결건조에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수성 용액 중의 세포성장인자의 농도가 10 pg/mL ～ 100 mg/mL의 범위인 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 얻어진 조직재생용 구조체의 코팅층 표면 상에, 세포를 함유하는 수성 분산액(aqueous dispersion)을 파종하는 단계를 추가로 포함으로써, 상기 세포가 상기 코팅층에 추가로 도입되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제18항에 있어서, 상기 수성 분산액 중의 세포의 농도가 10³ ～ 10¹⁰ cells/mL의 범위인 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
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제18항에 있어서, 상기 세포가 조직세포, 성체줄기세포, 배아줄기세포, 또는 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)인 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포성장인자가 BMP-2(bone morphogenetic protein 2), VEGF(vascular endothelial growth factor), EGF(epidermal growth factor), IGF(insulin-like growth factor), NGF(nerve growth factor), PDGF(platelet-derived growth factor), TGF-β(transforming growth factor-β), 및 bFGF(basic fibroblast growth factor)로 이루어진 군으로부터 1 종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자 지지체가 폴리락타이드, 폴리글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체, 락타이드와 카프로락톤과의 공중합체, 및 글리콜라이드와 카프로락톤과의 공중합체으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 생분해성 고분자로부터 형성된 것임을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제25항에 있어서, 상기 고분자 지지체가 D,L-락타이드와 글리콜라이드와의 공중합체 및 폴리카프로락톤의 혼합물로부터 형성된 것임을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 고분자 지지체가 10 ㎛～ 1,000 ㎛ 범위의 공극을 갖는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히아루론산 또는 그의 염의 중량평균분자량이 1,000 ～ 4,000,000 달톤의 범위인 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅층 중의 히아루론산 또는 그의 염의 함량이 10 ～ 90 중량%의 범위인 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅층 중의 피브리노오겐의 함량이 10 ～ 90 중량%의 범위인 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항에 있어서, 상기 히아루론산 또는 그의 염, 피브리노오겐, 및 세포성장인자를 함유하는 수성 용액 중에 상기 지지체를 침지한 다음, 상기 지지체를 상기 수성 용액으로부터 꺼내어 동결건조하는 과정을 2회 내지 20회 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항에 있어서, 상기 침지가 4～50 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.
제12항에 있어서, 상기 침지 후 동결건조 전에, 상기 수성 용액으로부터 꺼낸 지지체를 25 ℃에서 건조하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조직재생용 구조체.