KR20030032420A

KR20030032420A - 손상된 안구 조직의 재생을 위한 생분해성 고분자로제조된 다공성 지지체

Info

Publication number: KR20030032420A
Application number: KR1020010064182A
Authority: KR
Inventors: 김영하; 김수현; 이상영; 김재찬; 오정환
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2001-10-18
Filing date: 2001-10-18
Publication date: 2003-04-26
Also published as: JP2003126236A

Abstract

본 발명은 손상된 안구 부위에 매입함으로써 손상된 안구 부위에 안구 조직을 재생시켜 손상된 안구 조직을 치유하기 위한, 생분해성 고분자로 제조된 다공성 지지체에 관한 것이다.

본 발명의 생분해성 고분자 지지체는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리트리메틸렌카보네이트 및 이들의 공중합체와 같은 합성 고분자, 또는 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등의 천연 고분자 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 중합체로 제조될 수 있다.

본 발명에 따르면, 손상된 안구 부위 즉 각막, 결막 및 공막에 생분해성 고분자로 제조된 다공성 지지체를 매입하여 부작용이 없이 안구 조직을 재생/치유할 수 있다.

Description

손상된 안구 조직의 재생을 위한 생분해성 고분자로 제조된 다공성 지지체 {Porous Scaffold Made of Biodegradable Polymer for Reconstructing Damaged Ocular Tissue}

보다 구체적으로, 본 발명은 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리트리메틸렌카보네이트 및 이들의 공중합체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 생분해성 고분자로 제조된, 공극의 크기가 10-800 um이고, 공극율이 50-99%인 손상된 안구 조직 재생용 다공성 지지체를 제공한다.

안구는 전체적으로 공막(sclera)에 의하여 둘러싸여 있고, 앞의 눈동자 부분은 빛이 통과되는 각막(cornea), 각막과 공막을 연결하며 눈섭 내부의 검결막까지 연결된 주머니 형태의 결막(conjunctiva)으로 구성되어 있다.

각막은 두께가 1-1.2 mm이고, 신경은 분포되어 있으나 혈관이 없는 투명한 막으로서 빛을 굴절 투과시킨다. 각막은 조직학적으로 상피, 보우만막, 간질, 데스메막, 내피의 5층으로 구성되어 있으며, 상피는 손상시 1-2일 내에 빠르게 재생되나 내피는 재생되기 어렵다. 결막 및 공막은 혈관이 있고 대부분 섬유세포로 구성된 막으로서 쉽게 재생된다. 각막과 결막은 안구의 전반에 노출되어 있으므로 외상, 화상, 화학약품에 의하여 손상될 수 있고 또한 여러가지 병변 및 감염에 의한 조직괴사가 발생할 수 있다. 공막은 내부에 위치하고 있으나 역시 병변 및 감염에 의하여 손상될 수 있다. 손상된 각막 상피, 결막 및 공막이 쉽게 회복되지만 회복 속도가 너무 빠르면 반흔(scar)이 생성되기 쉽다.

손상된 각막은 일반적으로 시신에서 띄어낸 각막을 이식하는 방법이 매우 성공적으로 시술되고 있으나, 생체 각막의 공급이 부족하고 스티븐스-존슨(Stevens-Johnson) 질병 (눈물이 부족한 병) 등의 질병이 있으면 실패하기 쉽다. 인공 물질로 제조된 인공 각막은 오랜 연구에도 불구하고 아직 임상적으로 성공율이 매우 낮다 (T.V.Chirila 등 J. Biomed. Mater. Res., 28, 745, 1994 등 참조). 즉, 이식된 인공 각막이 떨어져 나가거나, 공막이 괴사되며 주위 조직이 썩어 들어가는 등의 합병증으로 인해 실패율이 높다. 이는 인공 각막으로 쓰이는 재료의 생체적합성 (biocompatibility)이 우수하지 못하여 생체 각막과의 접합력이 약하기 때문이다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 미국 특허 (제 5,836,313호, E.Perez 등)에는 각막조직(콜라겐)과 하이드로젤(hydrogel, 폴리에틸렌옥사이드 등 친수성 고분자의 가교체)이 복합 결합된 인공 각막이 기술되어 있으나 실제 임상에 적용한 결과는 없다. 각막의 손상이 그다지 크지 않거나 레이저 시술 후의 부작용, 염증, 감염된 각막을 치료하기 위하여 양막(amniotic membrane, 태반의 가장 안쪽 막으로 태아를 둘러싸고 있는 얇은 반투명막)을 그 부위에 덮어주면 염증이 감소하고 세포 성장을 촉진시켜 효과적으로 치유되는 방법이 시술되고 있다 (미국 특허 제 6,143,315호, M.X.Wang 등 참조). 그러나 이러한 방법은 손상 부위가 크거나 정도가 심한 경우에는 적용할 수 없는 한계가 있다.

한편, 손상된 결막을 치료하는 방법도 완전하지 못하다. 현재 병변이 있는 결막을 제거한 후 밑에 노출된 공막을 덮기 위해 주변 결막을 당겨 봉합시키는 결막표면 재건술이 시행되고 있으나, 이는 미용상, 기능상 장애를 초래하며 병변이 너무 광범위한 경우는 수술이 불가능하다.

근래에 생분해성 고분자 지지체(scaffold)를 이용하여 손상된 생체조직이나 장기를 재생하는 조직공학(tissue engineering)이 활발히 연구되고 있다. 이때에 생분해성 고분자 지지체는 다공성(porous)으로서 내외부에 세포가 부착 성장하면서지지체가 서서히 분해 소멸된다. 현재 지지체의 화학적 성질/표면 물성과 세포의 부착/성장의 상관 관계, 지지체의 공극(pore) 크기의 효과, 세포의 부착 및 양육 조건 등에 관하여 많은 연구가 진행되고 있다. 현재 이러한 조직공학기술을 이용하여 인공 피부와 인공 간이 성공하고 있고 연골과 인공 뼈, 인공 혈관, 인공 방광, 인공 심장판막, 신경 재생에 대한 연구가 활발히 전개되고 있다 (R.C.Thomason 등 Adv. Polym. Sci., 122, 245, 1995 등 참조). 각막도 조직공학 연구의 대상의 하나이나 아직 실험 단계로서 실용화에는 장시일이 요구되고 있다 (L.Germain 등 Pathobiology, 67, 140, 1999 등 참조).

따라서, 본 발명의 목적은 손상된 안구 부위에 매입함으로써 부작용이 없이 손상된 안구 부위에 안구 조직을 재생시켜 손상된 안구 조직을 치유하기 위한, 생분해성 고분자로 제조된 다공성 지지체를 제공하는 것이다.

도 1은 표면개질 PLGA 지지체에 7일간 배양한 안구 상피세포 단면의 전자현미경 사진.

도 2은 표면개질 PLGA 지지체에 7일간 배양한 안구 상피세포 단면의 H&E 염색 사진.

도 3는 결막 재생 동물 실험의 개략도.

도 4는 PLGA/콜라겐/히알루론산/양막 지지체 이식 2주 후 세극등 검사 및 플루레신 염색으로 결막이 재생된 것을 보여주는 사진.

도 5은 PLGA/콜라겐/히알루론산/양막 지지체 이식 2주 후 H & E 염색 사진.

이와 같이, 본 발명은 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리트리메틸렌카보네이트 및 이들의 공중합체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 생분해성 고분자로 제조된, 공극의 크기가 10-800 um이고, 공극율이 50-99%인 손상된 안구 조직 재생용 다공성 지지체를 제공한다.

상기 생분해성 고분자는 폴리글리콜산, 폴리락트산 등의 합성 고분자 및 이들의 공중합체, 또는 히알루론산, 키토산 등의 천연 고분자 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군 중에서 선택된다.

이러한 다공성 지지체는 고분자 섬유 부직포 (fiber mesh), 염 침출법, 유화 동결건조법, 상분리법, 고압기체 팽창법, 염 발포법 등에 의하여 제조될 수 있으며, 상기 지지체의 공극 크기는 10-800 um이다.

보다 구체적으로, 본 발명의 생분해성 고분자 지지체는 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리트리메틸렌카보네이트 및 이들의 공중합체와 같은 합성 고분자, 또는 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등의 천연 고분자 및 이들의 혼합물로 이루어진 군 중에서 선택된 중합체로 제조될 수 있다.

이러한 생분해성 고분자 지지체의 역할은 3차원적으로 조직이 부착 성장할 수 있고 세포 성장 및 새로운 조직 형성에 필요한 영양분과 특정 성장인자들을 전달하는 것이다. 궁극적으로는 세포의 증식, 성장과 더불어 세포외 기질이 분비되어 새로운 조직이 형성되고 고분자 지지체는 서서히 분해되어 완전히 소멸되므로 세포군과 세포외 기질만으로 구성된 새로운 조직 대체물이 완성된다. 따라서, 이러한 생분해성 고분자 지지체는 독성이 없고 조직에 대한 생체적합성(tissue compatibility)이 우수하여야 하며, 기계적 강도가 충분하여 세포가 부착 성장하는 동안에 형태를 유지하여야 하는 반면에 분해속도가 적당하여 세포 성장과 더불어 분해 소멸되어야 한다. 따라서, 조직공학의 대상에 따라 위의 합성 고분자들이 적당한 비율로 혼합된 조성의 공중합체가 많이 사용된다. 특히 글리콜산, 락트산 및 카프로락톤으로 구성된 공중합체는 구하기 쉽고 물성 및 분해속도에 관한 자료가 많아서 가장 많이 사용되고 있다.

다공성 생분해성 고분자 지지체에 세포가 부착 성장되는 공정은 매우 중요하다. 세포의 부착은 세포의 종류와 재료의 화학적 조성과 표면 물성 (특히 재료의 소수성/친수성), 공극의 크기 및 세포의 부착 방법에 따라 차이가 크다. 일반적으로 합성 고분자는 소수성이므로 세포 부착(또한 세포가 함유된 배양액의 젖음(wetting))이 적다.

반면에 콜라겐, 히알루론산, 키토산 등의 천연 고분자는 친수성이 커서 세포 부착이 많으나 기계적 강도가 약하고 분해 속도 조절이 어렵다. 따라서, 소수성 고분자 표면을 물리적 및 화학적 방법으로 친수화하는 방법 (J.Gao 등 J. Biomed. Mater. Res., 42, 417, 1998 등 참조) 또는 천연 고분자를 코팅 사용하는 방법 (M.D.M.Evans 등 J. Biomed. Mater. Res., 56, 461, 2001 등 참조) 등이 보고된 바 있다.

부착된 세포가 성장하는 속도와 세포의 생리학적 활성도도 위에서 이야기한 요소에 따라 차이가 크지만, 세포 부착과 성장 속도가 반드시 비례하지는 않는다. 그 중에서도 공극의 크기와 분포가 세포 성장을 결정하는 매우 중요한 요소이며, 공극이 서로 연결된 (inter-connecting) 구조이어야 영양액이 지지체 내부까지 고르게 침투하여 세포가 잘 성장한다. 적당한 공극의 크기는 세포의 종류 및 실험 방법에 따라 다르나, 10-800 um, 바람직하게는 50-600 um이다.

위와 같은 생분해성 고분자를 사용하여 다공성 지지체를 제조하는 방법은 여러 가지가 있다. 섬유 부직포 (nonwoven mesh)는 공극이 많고 표면적이 넓어서 자주 사용되고 있다. 보다 쉬운 방법은 염 침출법 (solvent-casting/particulate-leaching method)으로서, 생분해성 고분자의 유기용매 용액에 녹지 않는 소금 등의입자를 혼합하여 주물을 제조한 후에 용매를 제거하고 물로서 소금 입자를 용출 제거하는 방법으로, 염 입자의 크기와 혼합 비율을 조절함으로써 다양한 공극의 크기와 공극율(porosity)을 갖는 다공성 구조를 얻을 수 있다.

이외에도, 생분해성 고분자 용액에 암모늄 바이카보네이트 (산성 수용액이나 고온의 물과 반응하여 이산화탄소와 암모니아 가스로 분해됨) 입자를 혼합하여 매트릭스를 만들고 유기용매를 일부 제거한 후 고온의 증류수에 침지하여 염을 발포시켜 제거하는 염 발포법 (gas foaming/salt leaching), 고분자의 유기용매 용액/물의 유화액 (emulsion)을 동결건조하여 유기용매와 물을 제거하는 유화 동결건조법 (emulsion freeze-drying), 고분자의 유기용매 용액에 승화성 물질 또는 용해도가 다른 용매를 추가하고 승화 또는 온도 변화에 따른 상분리 (phase separation)에 의하여 다공성 지지체를 제조하는 상분리법, 유기 용매를 사용하지 않는 방법으로서 생분해성 고분자를 주형에 넣어 압력을 가해 펠렛을 만들고 적당한 온도에서 고압의 탄산가스를 생분해성 고분자에 주입한 후 서서히 압력을 낮추어서 매트릭스 내의 탄산가스가 방출되어 공극을 형성하는 고압 기체 팽창법 (high pressure gas expansion) 등이 보고되고 있다.

본 발명자들은 글리콜산, 락트산, 카프로락톤, 디옥사논 또는 트리메틸렌카보네이트로 제조된 생분해성 고분자 공중합체를 사용하여 위에서 설명한 제조 방법에 의해서 공극이 10-800 um, 보다 바람직하게는 50-600 um이고, 공극율이 50-99%인 다공성 지지체를 제조하였다.

위에서 설명한 바와 같이, 조직공학에 사용되는 생분해성 다공성 고분자 지지체는 독성이 없고 조직에 대한 생체적합성이 우수하여야 하며, 기계적 강도가 충분하여 세포가 부착 성장하는 동안에 형태를 유지하여야 하는 반면에 분해속도가 적당하여 세포 성장과 더불어 분해 소멸되어야 한다. 본 연구에 적합한 고분자들은 글리콜산, 락트산, 카프로락톤, 디옥사논, 또는 트리메틸렌카보네이트로 조성된 고분자 및 이들의 공중합체이다. 폴리글리콜산은 강도가 크지만 분해가 매우 빨라서 3개월 내에 완전히 분해된다. 폴리락트산도 강도가 크지만 분해가 너무 느려서 완전히 분해되는데 6개월 내지 1년이 걸린다. 폴리카프로락톤은 강도가 약하고 분해속도가 폴리락트산보다 더 느리다.

따라서, 본 연구에는 적절한 강도 및 분해속도를 갖는 위의 합성 고분자들의 2성분 이상의 공중합체가 보다 효과적이었다. 이러한 공중합체는 글리콜산, 락트산, 카프로락톤, 디옥사논, 및 트리메틸렌카보네이트의 2성분 공중합체; 폴리(글리콜산/락트산), 폴리(글리콜산/카프로락톤), 폴리(글리콜산/디옥사논), 폴리(글리콜산/트리메틸렌카보네이트), 폴리(락트산/카프로락톤), 폴리(락트산/디옥사논), 폴리(락트산/트리메틸렌카보네이트), 폴리(카프로락톤/디옥사논), 폴리(카프로락톤/트리메틸렌카보네이트) 또는 글리콜산, 락트산, 카프로락톤, 디옥사논, 및 트리메틸렌카보네이트의 3성분 이상의 공중합체 중에서 선택될 수 있다. 특히 폴리(글리콜산/락트산) 및 폴리(락트산/카프로락톤)은 기계적 강도가 우수하고 체내에서 8-12주 내에 분해되므로 본 연구에 매우 적합하였다.

이러한 합성 고분자를 사용하여 다공성 지지체를 제조하는 방법은 위에 설명한 바와 같이 섬유 부직포, 염 침출법, 염 발포법, 유화 동결건조법, 상분리법, 또는 고압 기체 팽창법 중에서 선택할 수 있다. 이 중에서 가장 쉬운 방법은 염 침출법으로서, 생분해성 고분자를 유기용매에 녹이고 그 유기용매에 녹지 않는 소금 등의 입자를 혼합하여 주물을 제조한 후에 용매를 제거하고 물을 사용하여 소금 입자를 용출 제거하는 방법이다. 첨가되는 소금 입자의 크기와 혼합 비율을 조절하면 다양한 공극의 크기와 공극율을 갖는 다공성 구조를 얻을 수 있다. 위의 합성 고분자들은 벤젠, 톨루엔, 클로로포름, 테트라히드로퓨란 등 및 이들의 혼합 용매에 쉽게 녹으며 통상 사용되는 농도는 0.3-20 중량/부피%이다.

소금 이외에 유기용매에 녹지 않는 염의 입자들도 사용할 수 있으나 소금이 제일 구하기 쉽고 여러 가지 크기의 입자로 쉽게 만들 수 있으므로 편리하다. 본 발명에서 연구된 소금의 입자 크기 및 혼합율은 20-600 um 및 50-99 중량/부피%이었다.

이러한 합성 고분자 다공성 지지체들은 기계적 강도가 우수하고 분해속도를 조절할 수 있는 장점이 있는 반면에, 표면이 소수성이므로 초기 세포 점착 및 성장이 낮았다. 따라서, 본 연구에서는 이러한 합성 고분자 지지체들 표면에 콜라겐, 히알루론산, 키토산 및 양막 추출물 또는 이들의 조합물을 코팅함으로써 표면의 친수성을 증가시키고 세포들의 초기 부착 및 성장을 촉진시켰다. 콜라겐, 히알루론산, 키토산 및 양막 추출물 또는 이들 조합물의 0.01-5 중량/부피% 수용액에 다공성 지지체를 담그어 코팅한 후 동결건조하거나 50℃ 이하에서 진공건조하였다. 또는, 코팅된 천연 고분자가 쉽게 씻겨나가는 것을 방지하기 위하여 코팅 후에 글루타르알데히드 또는 수용성 카르보디이미드 용액에 6시간 이상 반응시켜 가교화하였다.

또는, 합성 고분자 대신에 콜라겐, 히알루론산, 및 키토산과 같은 천연 고분자를 이용하여 다공성 지지체를 제조하였다. 이들 고분자의 수용액 또는 약산성 용액 (경우에 따라서는 양막 추출물을 함유)을 -20℃에서 얼린 후에 동결건조하여 다공성 지지체를 제조하고 글루타르알데히드 또는 수용성 카르보디이미드 용액에서 6시간 이상 반응시켜 가교화하였다.

제조한 이들 다공성 지지체에 시험관 내에서 (in vitro) 안구 상피세포 (corneal epithelial cell) 및 기질 섬유아세포 (stromal fibroblast)를 부착시키고 1일, 4일, 및 7일 동안 배양시킨 결과, 이들 세포들이 많이 성장된 것을 발견하였다. 세포 점착 및 성장은 전자현미경과 H & E (헤마톡실린(hematoxylin) & 에오신(eosin)) 염색으로 측정/분석하였고, 세포로부터 분비된 단백질의 양을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법으로 정량하여 세포의 생리적 활성을 평가하였다. 또한, 천연 고분자로 제조된 지지체 및 천연 고분자들이 코팅된 합성 고분자 지지체가 코팅되지 않은 합성 고분자 지지체보다 세포들이 우월하게 많이 성장시킨 것을 확인하였다.

토끼 안구 표면, 즉 결막, 각막 또는 공막 표면 일부를 의도적으로 손상시킨 부위에 이러한 다공성 지지체를 매입하여 관찰한 결과, 심한 염증이나 커다란 반흔이 없이 새로운 안구 조직이 재생되어 결손된 부위를 대체함으로써 손상 부위를 치유한 사실을 확인하였다.

하기 실시예로서 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

[생분해성 고분자 다공성 지지체의 제조 및 코팅 방법]

<방법 1> 폴리(락트산/글리콜산) 공중합체 (PLGA)-소금 염 침출법

PLGA (락트산/글리콜산 = 50/50, 분자량: 40,000∼75,000)를 용매(클로로포름)에 3 중량/부피%로 용해시킨 후, 소금을 갈아서 채를 사용하여 여러 크기 (0-50 um, 50-100 um, 100-400 um, 400-800 um)로 분별한 염을 염:PLGA 용액의 중량 비율이 각각 50:50, 70:30, 90:10 95:5가 되도록 혼합하여 10 ㎝ 페트리 접시에 부어 냉동실에서 용매를 증발시켰다. 얻어진 얇은 막(두께: 0.5-1.5 mm)을 48 시간 동안 증류수에서 염을 용출시켜 도 1와 같이 공극이 서로 연결된 다공성 지지체를 제조하였다. 지지체의 평균 공극의 크기는 50-800 um이고, 공극율은 45-98%이었다.

<방법 2> 폴리(글리콜산/카프로락톤) 공중합체 (PGCL) 유화동결건조법

PGCL (글리콜산/카프로락톤 = 50/50, 분자량: 130,000)을 톨루엔에 5 중량/부피%로 용해시킨 후, 물을 첨가하여 초음파기기(sonicator)로 완전히 혼합하여 유화시킨다. 이 유화용액을 액체질소에서 동결시킨 후, 진공하에서 건조시켜 평균 공극의 크기가 50-800 um이며, 공극율이 45-98%인 다공성 지지체를 제조하였다. 얻어진 다공성 지지체는 두께 0.5-1.5 mm로서 도 1와 같이 공극이 서로 연결된 구조를 보유하였다.

<방법 3> PLGA 또는 PGCL 다공성 지지체의 표면개질

<방법 1>에서 얻어진 PLGA 다공성 지지체를 0.1 중량% 콜라겐 용액에 6시간 담그어 코팅한 후, 2 중량% 카보디이미드 수용액에 18 시간 동안 담그어 화학적 가교 처리하였으며 (PLGA/콜라겐 지지체), 동일한 방법으로 0.1 중량%의 히알루론산 용액을 코팅하여 PLGA/히알루론산 지지체를 제조하였다. 또한 콜라겐을 도포한 후 히알루론산 용액을 코팅하여 동결건조시킨 PLGA/콜라겐/히알루론산 지지체도 제조하였다. 0.1 중량%의 콜라겐 용액에 콜라겐의 1/10 중량의 양막 입자를 혼합하여 양막 성분이 함유된 현탁액을 제조하고, 이에 PLGA 지지체를 담그어 코팅을 실시한 PLGA/콜라겐/양막 지지체를 제조하였으며, 히알루론산을 도포한 후 양막 성분이 함유된 콜라겐 현탁액으로 처리한 PLGA/콜라겐/히알루론산/양막 지지체도 제조하였다.

<방법 2>에서 얻어진 PGCL 다공성 지지체도 상기와 동일한 방법으로 표면을 개질하여 각각 PGCL/콜라겐, PGCL/히알루론산, PGCL/콜라겐/히알루론산, 및 PGCL/콜라겐/양막 지지체를 제조하였다.

[다공성 지지체에 세포 부착 및 성장 실험]

콜라겐, 히알루론산, 및 양막으로 개질된 각각의 PLGA 및 PGCL 지지체를 이용하여 안구 상피세포와 기질 섬유아세포 배양을 실시하여 각각의 세포 점착율과 증식율을 전자현미경과 H & E 염색법으로 비교하였다.

안구 상피세포는 둘베코 개질 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 1% 페니실린, 10% 우태아 혈청, 1× MEM 아미노산, 1× MEM 비타민, 1× MEM 비필수 아미노산을 첨가하여 제조한 배지를, 기질 섬유아세포는 둘베코 개질 이글 배지 F12에 40 ㎍/㎖ 젠타마이신(gentamicin), 15% 우태아 혈청, 5 ㎍/㎖ 인슐린, 0.1 ㎍/㎖ 콜레라 독소 및 10 ng/㎖ 인간 EGF를 첨가하여 제조한 배지를 각각 사용하여 5% 탄산가스 농도 하에서 37℃ 포화 습도에서 배양하였다. 안구 상피세포 및 기질 섬유아세포를 이용한 증식 시간 (doubling time)의 측정은 약 8주에 걸쳐 실시하였으며, 안구 상피세포는 제1 아융합 상태 (subconfluent state)에 도달하기까지 약 4주가 소요되었다. 각각의 세포들은 계대배양에 들어가기 전에 세포 농도 1×10⁵개/ml의 현탁액 200 ㎕를 각각 5 ㎖의 배지가 채워진 6웰 플레이트에 접종한 후, 37 ℃ 5% 탄산가스 분위기의 세포 배양기에서 배양하였다. 이러한 플레이트를 20개씩 준비하였고, 각 플레이트에 준비된 세포들은 24 시간 간격으로 분리하여 단일세포 현탁액을 만든 후 쿨터 계수기(Coulter counter)로 5 번씩 계수하여, 세포수가 2 배 및 4 배가 도달하는 시간을 측정하였다.

지지체들을 UV 조사 5분, 70% EtOH에 1시간 동안 담그어 멸균시켰다. 세포배양기 내에서 제조된 지지체에 세포를 5시간 점착시킨 후, 1 ㎖의 배지를 첨가해주었고 배지는 2일마다 교환해 주면서 세포를 배양하였다. 세포의 초기 점착율을 높이기 위해 세포를 동적방법으로 점착시켰다. 즉, 37℃, 5% 탄산가스 세포배양기 내부에 100 rpm으로 고정된 진탕기(orbital shaker)를 설치하고, 다공성 지지체들을 4×10⁶cells/㎖의 세포 농도로 조절된 안구 상피세포와 기질 섬유아세포 현탁액에 넣어 동적 상태에서 세포를 부착시켰다. 표면 개질에 따른 안구 상피세포와 기질 섬유아세포의 점착과 증식을 비교 관찰하기 위해 각각 1 일, 4 일 및 7 일 동안 배양하여 전자현미경과 H & E 염색으로 관찰하였다. 전자현미경용 시편은 2.5% 글루타르알데히드 용액으로 4 시간 동안 고정시켰으며, H & E 염색용 시료는 70%, 80%,90% 및 100% 에탄올로 순차적으로 각각 20 분간 탈수시킨 후 완전히 진공건조하였다.

<실시예 1>

<방법 1>에서 얻어진 다양한 공극 크기의 PLGA 다공성 지지체를 0.5 ×0.5 ×0.7 mm³의 크기로 준비하였다. 37℃, 5% 탄산가스 세포배양기 내에 설치한 진탕기 (100 rpm으로 고정)를 사용하여 PLGA 지지체를 4×10⁶cells/㎖ 농도의 안구 상피세포 현탁액에 담그어 안구 상피세포를 동적배양법으로 지지체에 점착시켰다. 각각 1일, 4일, 및 7일 동안 체외 배양하여 전자현미경, H & E 염색 및 ELISA 방법으로 안구 상피세포의 점착과 증식을 비교 분석하였다.

PLGA 다공성 지지체의 공극의 크기 및 공극율에 따른 안구 상피세포의 점착 및 증식 결과는 각각 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같다. 표 1에서 공극의 크기가 작은 경우 세포 점착율이 낮았고 세포 증식도 느린 것으로 나타났으며, 100 um 이상의 공극 크기에서 높은 점착 및 증식을 보였다. 또한 표 2에서 공극율이 높을수록 대체로 세포의 점착이나 증식이 높게 나타났다.

PLGA 지지체의 공극의 크기에 따른 안구 상피세포의 점착 및 증식 결과
단백질 생성량(mg)	공극 크기
단백질 생성량(mg)	50 um 이하	50-100 um	100-400 um	400-800 um
1일 배양시	0.16	0.10	0.24	0.35
4일 배양시	0.15	0.12	0.45	0.25

PLGA 지지체의 공극율에 따른 안구 상피세포의 점착 및 증식 결과
단백질 생성량(mg)	공극율
단백질 생성량(mg)	50%	70%	90%	95%
1일 배양시	0.10	0.11	0.14	0.15
4일 배양시	0.20	0.27	0.45	0.35

<실시예 2〉

<방법 2>에서 얻어진 다양한 공극 크기와 공극율을 가진 PGCL 다공성 지지체를 <실시예 1>와 동일한 방법으로 기질 섬유아세포를 점착시키고 체외 배양하였다.

공극의 크기 및 공극율에 따른 기질 섬유아세포의 점착 및 증식 결과는 하기 표 3에 나타낸 바와 같이 <실시예 1>의 결과와 비슷하였다.

PGCL 지지체의 공극의 크기에 따른 기질 섬유아세포의 점착 및 증식 결과
단백질 생성량(mg)	공극 크기
단백질 생성량(mg)	50 um 이하	50-100 um	100-400 um	400-800 um
1일 배양시	0.18	0.12	0.27	0.40
4일 배양시	0.19	0.12	0.48	0.30

〈실시예 3〉안구 상피세포의 체외 배양

<방법 3>에서 얻어진 표면개질 PLGA/콜라겐, PLGA/히알루론산, PLGA/콜라겐/히알루론산, PLGA/콜라겐/양막, 및 PLGA/콜라겐/히알루론산/양막 지지체와 개질되지 않은 대조군 PLGA 지지체를 <실시예 1>에서 기술한 방법으로 안구 상피세포를 동적배양법으로 침착시키고 5시간 후에 점착된 세포의 수를 측정하였으며 (표 4), 1일, 4일, 및 7일간 체외 배양하여 안구 상피세포의 점착과 증식을 전자현미경과 H & E 염색법으로 비교 관찰하였다.

표 4에서 알 수 있는 바와 같이, 표면이 개질된 PLGA 다공성 지지체들이 미처리 대조군에 비해 높은 초기 세포 점착율을 나타내었으며, 특히 PLGA/콜라겐/히알루론산 및 PLGA/콜라겐/히알루론산/양막 지지체가 우수한 결과를 나타내었다. 도 1의 전자현미경 사진 및 도 2의 H & E 염색법으로 관찰한 바와 같이 다공성 지지체의 내부에도 안구 상피세포가 고르게 성장되었음을 확인할 수 있었고, PLGA/콜라겐/히알루론산 및 PLGA/콜라겐/히알루론산/양막 지지체에서 보다 많은 세포가 고르게 성장한 결과를 확인하였다.

표면개질 PLGA 지지체에 점착된 지 5시간 후의 안구 상피세포의 수
지지체	PLGA	PLGA/콜라겐	PLGA/히알루론산	PLGA/콜라겐/히알루론산	PLGA/콜라겐/양막	PLGA/콜라겐/히알루론산/양막
세포수(10⁴개/지지체)	11	14	30	35	14	40

<실시예 4〉

<방법 2>에서 얻어진 표면개질 PGCL/콜라겐, PGCL/히알루론산, PGCL/콜라겐/히알루론산, 및 PGCL/콜라겐/양막 지지체를 <실시예 1>에서 기술한 방법과 동일하게 기질 섬유아세포를 동적 배양법으로 점착시키고 각각 1일, 4일, 및 7일 동안 체외 배양하여 전자현미경과 H & E 염색법으로 분석하였다.

하기 표 5에 나타낸 바와 같이, <실시예 3>의 결과와 비슷하게 표면이 개질된 PGCL 다공성 지지체들이 대조군에 비하여 기질 섬유아세포의 점착이 높았고 지지체 내부에 더 많은 세포들이 고르게 증식된 것을 확인할 수 있었다.

표면개질 PGCL 지지체에 점착된 지 5시간 후의 기질 섬유아세포의 수
지지체	PLGA	PLGA/콜라겐	PLGA/히알루론산	PLGA/콜라겐/히알루론산	PLGA/콜라겐/양막	PLGA/콜라겐/히알루론산/양막
세포수(10⁴개/지지체)	13	15	28	38	18	42

〈실시예 5〉토끼 동물 실험

체외 실험에서 우수한 세포적합성을 보인 표면개질 PLGA 및 PGCL 다공성 지지체의 치료 효과를 토끼 동물실험으로 평가하였다. 토끼의 각막, 결막, 또는 공막의 일부 조직을 7mm의 크기로 원형 절제기를 이용하여 제거하였다 (도 3). 같은 크기의 다공성 지지체를 UV 조사 및 70% 에탄올로 멸균한 후에, 손상시킨 부위에 이식하여 조직 재생을 면역 세포학적으로 평가하였고, 다공성 지지체를 사용하지 않은 경우와 비교하여 치유 효과 및 치유 후 결막의 수축을 분석하였다. 지지체의 이식 후 주위 조직으로부터 세포가 지지체 표면 및 내부로 성장하여 조직이 재생되는 것을 수주에서 수개월에 걸쳐 관찰하였으며, 시간의 변화에 따른 각막상피의 재생과 콜라겐의 침착 등 조직의 형성을 확인하였다. 각막의 경우는 환부 및 지지체 위에 추가로 신생 혈관 생성 억제 효과가 있는 양막을 덮어주었다.

도 4에 도시된 바와 같이, 손상된 결막 부위에 PLGA/콜라겐/히알루론산/양막 지지체를 이식한 2주 후에 결막이 재생되어 치유되었는지를 확인하였다. 재생된 조직 부위를 절단하여 H & E 염색법으로 분석한 결과, 세포들(도 5에서 진하게 나타난 부분)이 지지체 내부로 고르게 성장하고 있고, 일부 분해되지 않고 남아 있는다공성 지지체(흰 부분)도 관찰되었다 (도 5 참조). 각막 윤부에서 결막 원개까지의 길이를 측정하여 조직의 수축을 관찰한 결과, 고분자 지지체를 이식하지 않은 대조군의 경우 조직이 25% 수축한데 비하여 고분자 지지체를 이식한 경우 6%만 수축하였고 정상적인 안구 운동이 가능함을 관찰하였다. 3개월 후에 정상적인 결막 조직이 완전히 재생되었음을 확인하였다.

동일한 방법으로 손상시킨 각막 및 공막 결막 조직 부위에 여러 가지 표면개질 PLGA 및 PGCL 다공성 지지체를 이식한 결과, 손상된 조직이 성공적으로 재생된 것을 확인하였다.

본 발명에 따르면, 손상된 안구 부위 즉 각막, 결막 및 공막에 본 발명의 생분해성 고분자로 제조된 다공성 지지체를 매입하여 부작용이 없이 안구 조직을 재생/치유할 수 있다.

Claims

폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리디옥사논, 폴리트리메틸렌카보네이트 및 이들의 공중합체로 이루어지는 군 중에서 선택되는 생분해성 고분자로 제조된, 공극의 크기가 10-800 um이고, 공극율이 50-99%인 손상된 안구 조직 재생용 다공성 지지체.
제1항에 있어서, 안구 부위가 각막, 결막 및 공막으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 지지체.
제1항에 있어서, 생분해성 고분자가 폴리(락트산/글리콜산) 및 폴리(글리콜산/카프로락톤)으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 지지체.
제1항에 있어서, 그 표면에 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 양막 추출물 또는 이들의 조합물이 코팅된 지지체.
제1항에 있어서, 공극의 크기가 50-600 um인 지지체.