KR100823627B1 - 히알루론산 유도체를 포함하는 다층막 - Google Patents

히알루론산 유도체를 포함하는 다층막 Download PDF

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Abstract

히알루론산 유도체를 포함하는 다층막이 제공된다. 다층막은 히알루론산에 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체 중에서 적어도 하나 선택되는 폴리머를 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함하는 조직 접착층, 및 조직 접착층 상에 위치하고 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 다공성 지지층을 포함한다. 또한, 다층막은 히알루론산에 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체 중에서 적어도 하나 선택되는 폴리머와 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함하는 조직 접착층, 및 조직 접착층 상에 위치하고 히알루론산에 무수 메타크릴을 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함하는 다공성 지지층을 포함한다.
히알루론산, 유도체, 다층막

Description

히알루론산 유도체를 포함하는 다층막{Multilayer film comprising hyaluronic acid derivatives}
도 1은 히알루론산 중의 히드라지드기 도입율을 핵자기 공명법으로 정량한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 히알루론산 유도체를 투석한 후 그 결과물을 가지고 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 히알루로디나아제로 처리한 히알루론산 및 히알루론산 유도체의 분해 산물을 GPC로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 및 4b는 히알루로디나아제로 처리한 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체의 분해 산물을 각각 카르바졸 어세이와 GPC로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 히알루론산 유도체를 포함하는 다층막에 관한 것으로, 보다 상세하게는 체내 분해 속도가 조절되어진 히알루론산 유도체를 포함하는 다층막에 관한 것이다.
치주 질환에 의해 손상된 치조골을 치료하기 위해 최근 인공막을 손상된 치주 조직 내에 도입하여 치유를 증진시키고 완전한 치주 조직의 복원을 유도하는 동시에 골이식 결과를 개선시켜 새로운 치조골의 생성을 유도하려는 시도가 이루어지고 있다.
이러한 시도의 일환으로, 천연 고분자인 콜라겐 차폐막이 유도 조직 재생술이나 피부 또는 점막 조직의 드레싱 소재로 적용되고 있다. 그러나 콜라겐은 단백질로서 항원성을 완전히 제거하지 않은 경우 염증과 알레르기 반응을 일으킬 수 있고, 생체 내에서의 분해 속도가 일정하지 않다는 단점이 있다. 또한, 콜라겐이 동물에서 유래한 것일 경우 광우병 등의 질병을 유발할 위험도 다수 존재한다.
이에 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 생체 내에서 안전하며, 분해 속도가 조절된 히알루론산 유도체를 포함하는 다층막을 제공하고자 하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 다층막은 히알루론산에 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체 중에서 적어도 하나 선택되는 폴리머를 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함하는 조직 접착층, 및 상기 조직 접착층 상에 위치하고 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 다공성 지지층을 포함한다.
이때, 상기 조직 접착층의 폴리머는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합할 수 있다.
상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 폴리머의 카르복실기와 결합할 수 있다.
이러한 조직 접착층은 하기 화학식 1로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함할 수 있다.
화학식 1
Figure 112006063044805-pat00001
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, R4는 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체에서 적어도 하나 선택되는 폴리머이다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
또한, 상기 다공성 지지층의 하이드로젤 형태의 히알루로산 유도체는 히알루론산에 수버레이트를 반응시켜 수득할 수 있다.
상기 수버레이트는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합할 수 있고, 상기 수버레이트는 바람직하게는 비스(설포숙신이미딜)수버레이트일 수 있다.
상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 수버레이트의 카르보닐기와 결합할 수 있다.
이러한 다공성 지지층은 하기 화학식 2로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함할 수 있다.
화학식 2
Figure 112006063044805-pat00002
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
또한, 상기 조직 접착층은 예를 들어 용매 추출법으로 형성될 수 있고, 상기 다공성 지지층은 상기 조직 접착층 상에 동결 건조하여 형성될 수 있다.
상기한 바와 같은 조직 접착층과 다공성 지지층을 포함하는 다층막은 예를 들어 치주조직 재생용 차폐막에 적용될 수 있다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 다른 실시예에 따른 다층막은 히알루론산에 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체 중에서 적어도 하나 선택되는 폴리머와 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함하는 조직 접착층, 및 상기 조직 접착층 상에 위치하고, 히알루론산에 무수 메타크릴을 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함하는 다공성 지지층을 포함한다.
상기 조직 접착층의 폴리머는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합할 수 있다.
또한, 상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 폴리머의 카르복실기와 결합할 수 있다.
이러한 조직 접착층은 하기 화학식 1로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함할 수 있다.
화학식 1
Figure 112006063044805-pat00003
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, R4는 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체에서 적어도 하나 선택되는 폴리머이다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
또한, 상기 다공성 지지층의 상기 무수 메타크릴은 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합할 수 있다.
상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 무수 메타크릴의 카르보닐기와 결합할 수 있다.
이러한 다공성 지지층은 하기 화학식 3으로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함할 수 있다.
화학식 3
Figure 112006063044805-pat00004
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
상기 링커는 적어도 하나의 유기 용매를 0 내지 60부피% 포함하는 용액 상에서 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합할 수 있고, 이러한 유기 용매로는 예를 들어 에탄올을 사용할 수 있다.
또한, 상기 다공성 지지층에 포함되는 히알루론산 유도체는 디티올계 가교제에 의해 가교되어 있는 하이드로젤 형태일 수 있다. 이때, 상기 디티올계 가교제는 예를 들어 양단에 각각 시스테인을 포함하고, 이들 사이에 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산의 배열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
상기 다공성 지지층은 하기 화학식 4로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함할 수 있다.
화학식 4
Figure 112006063044805-pat00005
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, C는 시스테인, R은 아르기닌, G는 글리신, D는 아스파르트산이고, (-S-)는 시스테인에 포함된 메르캅토기 유래의 황을 나타낸다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
또한, 상기 조직 접착층은 예를 들어 용매 추출법으로 형성될 수 있고, 상기 다공성 지지층은 상기 조직 접착층 상에 동결 건조하여 형성될 수 있다.
상기한 바와 같은 조직 접착층과 다공성 지지층을 포함하는 다층막은 예를 들어 치주조직 재생용 차폐막에 적용될 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있다. 따라서, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 다층막에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 다층막은 조직 접착층과, 이러한 조직 접착층 상에 위치하는 다공성 지지층을 포함한다.
우선, 다층막 중 조직 접착층에 대해 설명한다.
조직 접착층은 손상 조직과 마주하는 면으로 조직 재생 유도 기능을 갖는다. 이러한 조직 접착층은 히알루론산(hyaluronic acid)에 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)에서 적어도 하나 선택되는 폴리머를 반응시켜 수득된 히알루론산 유도체를 포함한다.
히알루론산은 하기 화학식 5에 도시한 바와 같이, D-글루쿠론산과 N-아세틸글로코사민이 β(1→3) 글리코시드 결합에 의해 연결된 이당 유니트로 이루어지는 글루코사미드글리칸의 일종이다. 히알루론산은 그 화학적, 물리적 구조에 종차이가 없고, 인간도 대사계를 가지고 있으며, 면역성, 독성의 면에서도 가장 안전한 생체 재료이다. 히알루론산은 예를 들어 미생물을 발효하여 대량으로 생산할 수 있고, 이 경우 바이러스 오염, 알레르기 반응을 일으킬 위험이 없으며, 일정 수준의 품질을 유지할 수 있다.
화학식 5
Figure 112006063044805-pat00006
본 발명에서의 "히알루론산"이라 함은 히알루론산 그 자체뿐만 아니라 그것 의 염을 모두 포함하는 개념이다. 즉, 본 발명에서의 "히알루론산"은 히알루론산, 히알루론산 염 또는 히알루론산과 히알루론산의 혼합물을 포함한다. 히알루론산 염에는 예를 들어 히알루론산 나트륨, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등과 같은 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등과 같은 유기염을 모두 포함한다. 경우에 따라서는 이들의 적어도 2개의 조합이 사용될 수도 있다. 본 발명에서의 히알루론산의 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 100,000 내지 10,000,000 일 수 있다.
조직 접착층에 포함되는 히알루론산과 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 또는 글리콜산 공중합체(PLGA)는 화학적으로 공유 결합되어 있다. 따라서, 조직 접착층 중의 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 락트산-글리콜산(PLGA)과 결합한 히알루론산은 생체 내에 투여한 후에도 염 농도의 변화, pH 변화 등의 환경 변화에 의해서 이들이 서로 분리되지 않는다.
폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)에서 선택되는 폴리머의 분자량은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 히알루론산과의 반응 효율면에서, 통상 점도평균분자량 10만 달톤이하의 것, 예를 들어 1,000 내지 5만 달톤의 것을 사용할 수 있다.
이러한 히알루론산은 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 또는 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA) 결합 시, 링커를 개재하여 결합될 수 있다. 링커는 히알루론산에 도입되어 히알루론산 유도체의 생체 내 분해 속도를 조절한다.
히알루론산 유도체는 체내에 존재하는 히알루론산 분해 효소인 히알루로디나 아제(hyaluronidase)가 히알루론산의 카르복실기에 의해 히알루론산을 인식함으로써 분해된다. 따라서, 링커를 히알루론산의 카르복실기에 결합시켜 카르복실기가 노출되는 수를 조절함으로써, 히알루로디나아제에 의한 히알루론산 유도체의 분해 속도를 조절할 수 있다. 예를 들어 히알루론산에 도입되어진 링커의 비율이 높을수록 생체 내에서의 히알루론산 유도체의 분해 속도가 낮아지게 된다. 따라서, 히알루론산에 도입되는 링커의 도입율을 조절함으로써, 히알루론산 유도체의 체내에서의 분해 속도를 목적하는 바대로 조절하는 것이 가능하다.
이러한 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함할 수 있다. 링커는 예를 들어 복수의 아미노기를 포함하는 디히드라지드 화합물, 디아민 화합물, 히드라진 화합물일 수 있다. 링커는 예를 들어 H2N-(CH2)x-NH2(식 중 x는 0 내지 10의 정수이다), H2NNHCO-(CH2)-CH2-(O-CH2-CH2)x-NH2(식 중, x는 0 내지 10의 정수이다)로 표시되는 디아민 화합물, H2NNHCO-(CH2)x-CONHNH2(식 중, x는 1 내지 10의 정수이다)로 표시되는 디히드라지드 화합물, 또는 NH(R1)-NH(R2)(식 중, R1 및 R2는 각각 수소 원자 또는 C1 -6 알킬기이다)로 표시되는 히드라진 화합물일 수 있다.
폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 또는 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 또는 링커가 히알루론산에 도입되는 위치는 예를 들어 히알루론산의 카르복실기일 수 있다. 카르복실기에 도입되는 경우, 아미드기, 히드라지드기, 디아실히드라지드기, 카르복실산에스테르기를 형성함으로써, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 또는 링커 부분이 히알루론산에 도입될 수 있다. 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA), 또는 링커가 히알루론산과 카르복실산에스테르를 형성하여 히알루론산에 도입되어 형성되는 히알루론산 유도체는 투여액 내, 생체 내에서 가수분해에 의해 폴리머의 탈리가 비교적 단시간에 발생할 수 있다. 따라서, 가수분해 속도가 느린 아미드기, 히드라지드기 등을 포함하는 링커를 개재하여 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 또는 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)를 히알루론산에 도입하는 것이 바람직하다.
히알루론산에 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 또는 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)를 화학적으로 그래프트 결합시키는 방법으로는, 우선 히알루론산의 카르복실기를 활성화한다. 예를 들어 N,N'-카르보닐디이미다졸(CDI), N,N'-디시클로헥실카르보닐이미드(DCC), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드록시놀린(EEDQ), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진)-4-메틸모르폴륨(DMT-MM), 2-벤조트리아졸-1,1,3,3-테트라메틸우로늄사불화붕산염(TBTU), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HODhbt), 벤조트리아졸-1-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄육불화인산염(PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(BOP) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 등의 축합제를 단독 또는 적절하게 조합하여 히알루론산의 카르복실기를 활성 에스테르화한다.
여기에 히드라지드기, 아미노기 등의 활성 에스테르와 반응성을 갖는 작용기를 포함하는 링커를 도입한 후, 테트라부틸암모늄(TBA) 염에 이온 교환하고, 디메 틸술폭사이드(DMSO) 중에서, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)/N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 카르복실기를 활성화한 폴리머와 반응시키는 방법을 이용할 수 있다. 이때, 링커는 증류수 또는 적어도 하나의 유기 용매를 포함하는 용액 상에서 히알루론산의 카르복실기에 도입될 수 있다. 유기 용매는 예를 들어 에탄올일 수 있으며, 전체 용액 중 유기 용매의 비율은 용액약 60부피% 이하일 수 있고, 바람직하게는 약 50부피%일 수 있다.
또한, 히알루론산에 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA) 또는 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)를 화학적으로 그래프트 결합시키는 다른 방법으로는 먼저 폴리머의 말단 카르복실기를 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)/N-하이드록시숙신이미드(NHS)로 활성화하고, 이것과 디아민 또는 디히드라지드 말단을 가질 수 있도록 링커와 반응시켜, 히알루론산의 카르복실기에 1-에틸-3-(3-메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)/N-하이드록시숙신이미드 등의 축합제로 결합시키는 방법을 이용할 수 있다. 이때, 링커는 증류수 또는 적어도 하나의 유기 용매를 포함하는 용액 상에서 히알루론산의 카르복실기에 도입될 수 있다. 유기 용매는 예를 들어 에탄올일 수 있으며, 전체 용액 중 유기 용매의 비율은 용액약 60부피% 이하일 수 있고, 바람직하게는 약 50부피%일 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 다층막의 조직 접착층은 하기 화학식 1으로 표시되는 유니트의 반복 구조를 분자 내에 포함할 수 있다.
화학식 1
Figure 112006063044805-pat00007
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, R4는 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체 중에서 적어도 하나 선택되는 폴리머이다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
이러한 조직 접착층은 예를 들어 용매 추출법을 이용하여 필름 형태로 가공될 수 있다.
조직 접착층 상에 위치하는 다공성 지지층은 뼈 조직과 맞닿는 면으로 다공성 지지층쪽으로 뼈세포들이 융합(integration)되도록 한다. 이러한 다공성 지지층은 하이드로겔 형태의 히알루론산을 포함한다. 이를 보다 상세하게 설명하면, 히알루론산에 수버레이트(suberate)를 반응시켜 수득한 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함한다. 히알루론산과 반응되는 수버레이트는 예를 들어 비스(설포숙신이미딜)수버레이트(Bis[sulfosuccinimmidyl]suberate)일 수 있다.
히알루론산은 수버레이트와 화학적으로 공유 결합되어 있다. 따라서, 히알루론산과 수버레이트가 결합되어 있는 히알루론산 유도체는 생체 내에 투여 된 후에도 염 농도의 변화, pH 변화 등의 환경 변화에 의해서 이들이 서로 분리되지 않는다.
이러한 히알루론산은 수버레이트와 결합시, 링커를 개재하여 결합될 수 있다. 링커는 수버레이트의 카르보닐기와 결합하여 히알루론산에 도입될 수 있으며, 다공성 지지층의 생체 내 분해 속도를 조절하는 역할을 한다. 즉, 히알루론산에 도입되어진 링커의 비율에 의해 생체 내에 투여 된 다공성 지지층의 분해 속도가 달라질 수 있다. 이러한 링커는 조직 접착층에 포함되는 링커와 실질적으로 동일한 것이므로, 여기에서 중복되는 설명은 생략하도록 한다.
수버레이트 또는 링커가 히알루론산에 도입되는 위치는 예를 들어 히알루론산의 카르복실기일 수 있다. 카르복실기에 도입되는 경우, 아미드기, 히드라지드기, 디아실히드라지드기, 카르복실산에스테르기를 형성함으로써, 수버레이트 또는 링커 부분이 히알루론산에 도입될 수 있다. 수버레이트 또는 링커가 히알루론산과 카르복실산에스테르를 형성하여 히알루론산에 도입되어 형성되는 히알루론산 유도체는 투여액 내, 생체 내에서 가수분해에 의해 수버레이트의 탈리가 비교적 단시간에 발생할 수 있다. 따라서, 가수분해 속도가 느린 아미드기, 히드라지드기 등을 포함하는 링커를 개재하여 수버레이트를 히알루론산에 도입하는 것이 바람직하다.
히알루론산에 수버레이트를 화학적으로 그래프트 결합시키는 방법으로는, 우선 히알루론산의 카르복실기를 활성화한다. 예를 들어 N,N'-카르보닐디이미다 졸(CDI), N,N'-디시클로헥실카르보닐이미드(DCC), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드록시놀린(EEDQ), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진)-4-메틸모르폴륨(DMT-MM), 2-벤조트리아졸-1,1,3,3-테트라메틸우로늄사불화붕산염(TBTU), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HODhbt), 벤조트리아졸-1-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄육불화인산염(PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(BOP) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 등의 축합제를 단독 또는 적절하게 조합하여 히알루론산의 카르복실기를 활성 에스테르화한다.
여기에 히드라지드기, 아미노기 등의 활성 에스테르와 반응성을 갖는 작용기를 포함하는 링커를 도입한 후, 수버레이트를 링커의 말단과 반응시켜, 수버레이트의 카르보닐기와 링커의 말단을 반응시키는 방법을 이용할 수 있다. 이때, 링커는 증류수 또는 적어도 하나의 유기 용매를 포함하는 용액 상에서 히알루론산의 카르복실기에 도입될 수 있으며, 유기 용매는 예를 들어 에탄올일 수 있고, 전체 용액 중 유기 용매의 비율은 약 60부피% 이하일 수 있고, 바람직하게는 약 50부피%일 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 다층막의 다공성 지지층은 하기 화학식 2로 표시되는 유니트의 반복 구조를 분자 내에 포함할 수 있다.
화학식 2
Figure 112006063044805-pat00008
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
이러한 다공성 지지층은 예를 들어 조직 접착층 상에 히알루론산 유도체의 전구체 용액을 부은 다음 가교 반응을 시킨 후, 이를 냉동 냉장고(deep freezer)에 넣어 약 -70℃에서 급속 냉각 시킨 다음, 동결 건조기(freeze dryer)에 넣어 건조시킴으로서 완성될 수 있다.
상술한 바와 같은 조직 접착층과 다공성 지지층을 포함하는 다층막은 예를 들어 조직 재생 유도 차폐막의 용도로 사용될 수 있다. 즉, 손상된 치조골 주위 치근막 또는 이식물이 적용된 악골 부위에 삽입하거나 덧씌운 후 수술용 생분해성 봉합사로 치근에 고정시키거나 생체적합성 접착제를 이용하여 골 조직에 단단히 부착시키면, 차폐막의 내면, 즉 다공성 지지층 측에는 유도 재생이 요구되는 골 조직이 위치하게 되며, 외부면, 즉 조직 접착층 측에는 결체 조직이나 상피조직이 바로 접하여 덮히게 된다.
계속해서, 본 발명의 다른 실시예에 따른 다층막을 설명한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 다층막은 조직 접착층과, 이러한 조직 접착층 상에 위치하는 다공성 지지층을 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 다층막의 조직 접착층은 본 발명의 일 실시예에 따른 다층막에 포함되어 있는 조직 접착층과 실질적으로 동일하므로 중복되는 설명은 생략한다. 따라서, 여기에서는 다공성 지지층을 중심으로 본 발명의 다른 실시예에 따른 다층막을 설명한다.
조직 접착층 상에 위치하는 다공성 지지층은 히알루론산에 무수 메타크릴(methacrylic anhydride)을 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함한다.
히알루론산은 무수 메타크릴과 화학적으로 공유 결합되어 있다. 따라서, 히알루론산과 무수 메타크릴이 결합되어 있는 히알루론산 유도체는 생체 내에 투여 된 후에도 염 농도의 변화, pH 변화 등의 환경 변화에 의해서 이들이 서로 분리되지 않는다.
이러한 히알루론산은 무수 메타크릴과 결합 시, 링커를 개재하여 결합될 수 있다. 링커는 무수 메타크릴의 카르보닐기와 결합하여 히알루론산에 도입될 수 있으며, 다공성 지지층의 생체 내 분해 속도를 조절한다. 이러한 링커의 기능과 종류, 링커의 도입 위치, 링커의 도입 방법 등은 본 발명의 일 실시예에 따른 다층막에서와 실질적으로 동일하므로, 여기에서는 중복되는 설명은 생략한다.
상술한 바와 같은 본 발명의 다른 실시예에 따른 다층막의 다공성 지지층은 하기 화학식 3과 같은 유니트의 반복 구조를 분자 내에 포함할 수 있다.
화학식 3
Figure 112006063044805-pat00009
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자일 수 있고, R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
이러한 다공성 지지층은 예를 들어 조직 접착층 상에 히알루론산 유도체의 전구체 용액을 부은 다음 가교 반응을 시킨 후, 이를 냉동 냉장고에 넣어 약 -70℃에서 급속 냉각 시킨 다음, 동결 건조기에 넣어 건조시킴으로서 완성될 수 있다.
상술한 바와 같은 조직 접착층과 다공성 지지층을 포함하는 다층막은 예를 들어 조직 재생 유도 차폐막의 용도로 사용될 수 있다.
계속해서, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 다층막에 대해 설명한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 다층막은 조직 접착층과, 이러한 조직 접착층 상에 위치하는 다공성 지지층을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 다층막의 조직 접착층은 본 발명의 일 실시예에 따른 다층막에 포함되어 있는 조직 접착층과 실질적으로 동일하므로 중복되는 설명은 생략한다. 또한, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 다층막의 다공성 지지층은 본 발명의 다른 실시예에 따른 다층막의 다공성 지지층에 포함되는 히알루론산 유도체가 가교되어 하이드로젤 형태를 갖는다는 점에서 본 발명의 다른 실시예에 따른 다층막과 차이점이 있다. 따라서, 여기에서는 다공성 지지층을 중심으로 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 다층막을 설명한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따른 다층막의 다공성 지지층에 포함되는 히알루론산 유도체는 본 발명의 일 실시예에 따른 히알루론산 유도체가 디티올계 가교제에 의해 가교된 하이드로젤 형태를 갖는다.
디티올계 가교제로는 예를 들어 메르캅토기(-SH)를 포함하는 시스테인이 양단에 위치하고 이들 사이에 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산의 배열을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 이러한 가교제의 양단은 각각 히알루론산 유도체의 무수 메타크릴 유래의 α,β-불포화 카르보닐기와 결합하여 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 형성한다.
아르기닌, 글리신 및 아스파르트산 배열을 포함하는 펩타이드 도입을 통해 히알루론산 유도체는 세포부착 능력이 향상될 수 있다. 생체 내의 세포 표면에 존 재하는 수용체(receptor)인 인테그린(integrin)과 ECM에 존재하는 접착 단백질(adhesion protein)에 의해 세포 접착이 일어나게 되는데, 접착 단백질에 직접적으로 세포를 부착시키는 역할을 하는 펩타이드 배열이 아르기닌, 글리신, 아스파르트산의 배열이다. 따라서, 아르기닌, 글리신, 아스파르트산의 배열을 포함하는 디티올계 가교제를 히알루론산 유도체에 도입함으로써 세포 접착을 효과적으로 유도할 수 있다.
상술한 바와 같이 형성된 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 다층막의 다공성 지지층은 하기 화학식 4와 같은 유니트의 반복 구조를 분자 내에 포함할 수 있다.
화학식 4
Figure 112006063044805-pat00010
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, C는 시스테인, R은 아르기닌, G는 글리신, D는 아스파르트산이고, (-S-)는 시스테인에 포함된 메르캅토기 유래의 황을 나타낸다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
이러한 다공성 지지층은 예를 들어 조직 접착층 상에 히알루론산 유도체의 전구체 용액을 부은 다음 가교 반응을 시킨 후, 이를 냉동 냉장고에 넣어 약 -70℃에서 급속 냉각 시킨 다음, 동결 건조기에 넣어 건조시킴으로서 완성될 수 있다.
상술한 바와 같은 조직 접착층과 다공성 지지층을 포함하는 다층막은 예를 들어 조직 재생 유도 차폐막의 용도로 사용될 수 있다.
이하, 실험예들을 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실험예들은 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명이 하기 실험예들에 의하여 한정되는 것은 아님이 이해되어야 한다.
[ 실험예 1] 히알루론산 유도체의 제조
[ 실험예 1-1 ] 히드라지드기가 도입된 히알루론산의 제조
증류수에 대한 히알루론산(Denkikagaku Kogyo Co.(Tokyo, Japan))의 농도가 각각 2㎎/㎖ 및 5㎎/㎖인 히알루론산 용액을 제조하였다. 이때, 히알루론산 용액은 증류수만을 포함하는 경우, 증류수에 대해 에탄올이 각각 25부피% 및 50부피% 비율로 포함하는 경우를 제조하였다.
여기에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)를 사용하여 히알루론산의 카르복실기를 활성화 시킨 다음, 아디프산디히드라지드(ADH)(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA))를 첨가하고, 1N 염산으로 pH를 약 4.8로 유지하면서 실온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 이때, EDC와 ADH의 첨가량은 히알루론산의 카르복실기에 대하여 각각 몰비로 4배 및 40배였다.
반응 결과물을 100mM 염화나트륨 용액, 25% 에탄올 용액, 증류수로 투석하고, 동결 건조하여 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)을 얻었다.
각 수득된 히알루론산 중의 히드라지드기 도입율을 1H-NMR(DPX300, Bruker, Germany)로 정량한 결과를 도 1에 도시하였다(히알루론산의 N-아세틸기(α)는 약 2.1ppm, 아디프산 부분의 메틸렌기(β, γ)는 약 1.7ppm, 1.8ppm, 2.4ppm, 2.5ppm).
도 1에 도시한 바와 같이, 히알루론산 용액 중 에탄올의 비율이 증가함에 따라 히드라지드기 도입율이 증가함을 알 수 있었다.
[ 실험예 1-2 ] 히드라지드가 도입된 히알루론산의 정량
실험예 1-1 중 히알루론산 농도를 5㎎/㎖로 하고 에탄올의 비율을 50부피%로 하여 수득된 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)을 HPLC로 정량하여 그 결과를 도 2에 도시하였다.
이때, HPLC 조건은 용출액은 34mM 인산염 완충액(pH 6.6)/메탄올 =80:20(v/v))이였고, 워터스 1525 바이너리 HPLC 펌프, 워터스 2487 듀얼 λ 어브저번스 검출기, 워터스 717 플러스 오토 샘플러(Milford, MA, USA))를 사용하였으며, 칼럼은 울트라하이드로젤 250과 1000 컬럼(7.8㎜ i.d. ×30㎝)을 사용하였고, 유속은 0.5㎖/min이었으며, 샘플 주입량은 10㎕이었고, 샘플 농도는 5㎎/㎖ 이었 다. 검출 파장(detection wavelength)은 210㎚였다.
[ 실험예 1-3 ] 히드라지드기가 도입된 히알루론산의 효소 내성 평가
히알루론산, 증류수 상에서 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH), 에탄올이 약 50부피% 포함된 용액 상에서 히드라지드기가 도입된 히알루론산(stealth HA-ADH)을 각각 약 4.57㎎/㎖의 농도로 각각 0.2M 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.2) 1.8㎖에 용해하였다. 이 용액들에 각각 1500U/㎖ 농도의 히알루로디나아제(bovine testicular hyaluronidase) 용액 200㎕를 첨가하여, 약 37℃에서 48시간 인큐베이트하였다.
히알루론산 또는 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)은 하기 반응식 1에 도시한 바와 같이 히알루로디나아제에 의해 N-아세탈헥소사미니드(N-acetalhexosaminide) 결합이 분해된다.
반응식 1
Figure 112006063044805-pat00011
히알루로디나아제로 히알루론산과 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)을 처리한 후, 그 분해 산물 중의 이중 결합을 자외선 분광법으로 정량하여 분해 속도를 분석한 결과를 도 3에 도시하였다. 분해 산물을 분석하기 위해 GPC 분석을 사용하였다.
도 3의 (a)는 히알루론산에 대하여 히알루로디나제의 처리 전후를 나타낸 GPC 분석 결과이고, (b)는 증류수 상에서 히드라자드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)에 대하여 히알루로디나제의 처리 전후를 나타낸 GPC 분석 결과이며, (c)는 에탄올이 약 50부피% 포함된 용액 상에서 히드라지드기가 도입된 히알루론산(stealth HA-ADH)에 대하여 히알루로디나제의 처리 전후를 나타낸 GPC 분석 결과이다.
GPC에서는 분자량이 큰 물질의 피크가 먼저 나오고, 분자량이 작은 물질의 피크가 나중에 나오게 되는데, 효소에 의해 분해된 분해 산물은 분자량이 감소하기 때문에 피크가 뒤쪽으로 이동하게 되고, 효소 처리 후 동일 시간이 지났을 때 피크의 위치 변화 정도가 클수록 분해가 많이 되었음을 의미한다. (a), (b) 및 (c) 모두에서 히알루론산의 농도는 약 5㎎/㎖이었고, (b)와 (c)에서의 히드라지드기 도입율은 각각 70.47% 및 82.82% 이었다.
도 3에 도시한 바와 같이, 히알루론산에 히드라지드기의 도입율이 높을수록 히알루론산의 효소에 의한 분해 정도가 낮아짐을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 1-4 ] 히드라지드기가 도입된 히알루론산에 수버레이트가 도입된 히알루론산 유도체의 효소 내성 평가
히드라지드기 도입율이 각각 69.39몰%, 79.61몰% 및 84.98몰%인 히알루론산 각 12mg을 PBS(0.01M, pH7.4, 25℃) 270㎕에 용해시켰다. 완전히 용해된 후, 각 용액 180㎍을 앞부분이 잘려진 주사기에 넣었다.
비스(설포숙신이미딜)수버레이트를 20㎕의 PBS에 용해시켜 주사기에 담긴 히알루론산 용액에 첨가해 균일하게 혼합하였다. 첨가한 비스(설포숙신이미딜)수버레 이트의 양은 히알루론산에 도입된 ADH의 20몰%이었다.
이 전구체 용액을 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이트 하여 가교 반응을 완결시켰다.
완성된 각 하이드로젤 형태의 히알루론산(약 200㎕)을 4㎖ 바이알(vial)에 넣었다. 0.2M 인산 나트륨 완충액(pH 6.2) 0.9㎖을 각 바이알에 첨가하였다. 각 바이알에 히알루로네이트 리아제(hyaluronate lyase) 180U을 포함한 0.2M 인산 나트륨 완충액(pH 6.2) 0.9㎖을 첨가하였다. 이를 37℃에서 96 시간 동안 인큐베이트하였다.
정해진 샘플링 시간(sampling time)이 되면 각 바이알에서 상층액 200㎕를 뽑아내고, 0.2M 인산 나트륨 완충액(pH 6.2) 200㎕을 다시 넣어주었다. 각 샘플링 시간마다 발생하는 상층액의 희석은 후보정하였다. 뽑아낸 각 상층액 200㎕은 끓는 물이 담겨진 수조에 약 3분 동안 담그어 효소 활성을 중지시켰다.
히알루로디나아제에 의한 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체의 분해는 상층액으로 분해되어 나온 글루쿠론산의 양을 카르바졸 어세이(carbazole assay와 GPC를 통해 측정하여 분석하여 그 결과를 각각 도 4a 및 도 4b에 도시하였다. 카르바졸 어세이에서는 발색 반응이 일어난 시료의 흡광도를 자외선 분광광도계(UV spectrophotometer)를 이용하여 측정함으로써 히알루론산 분해 정도를 정량적으로 분석할 수 있다.
도 4a 및 도 4b에 도시한 바와 같이, 히드라지드기 도입율이 69.39몰%인 히알루론산 유도체(◆), 79.61몰%인 히알루론산 유도체(■), 84.98몰%인 히알루론산 유도체(▲)의 히알루로디나아제에 의한 분해 정도는 히드라지드기의 도입율이 높을수록 느리게 진행됨을 알 수 있었다. 즉, 히드라지드기의 도입율이 높을수록 분해 효소에 의한 분해가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 1-5] 히드라지드기가 도입된 히알루론산에 무수 메타크릴이 도입된 히알루론산 유도체의 제조
히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)을 증류수 2.25㎖에 용해시킨 후, 인산염 완충액(200mM, pH 8.0) 0.25㎖을 첨가해 pH를 8로 맞추었다. 히드라지드기에 대해 20몰배 과량의 무수 메타크릴(MW=154.17)을 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH) 용액에 첨가하였다. 4 시간 동안 상온에서 교반하여 반응시킨 후, 에탄올을 이용하여 침전시켜 히알루론산 유도체(HA-MA)를 얻었다. 3회의 에탄올 세척 과정을 거친 뒤, 상온에서 건조시켰다. 히알루론산에 대한 무수 메타크릴의 도입율은 1H NMR 분석을 통해 구할 수 있다.
[ 실험예 1-6] 무수 메타크릴이 도입된 히알루론산 유도체를 하이드로젤 형태로 제조
실험예 1-5에서 얻어진 히알루론산 유도체(HA-MA) 11㎎을 16㎕/㎖l의 TEA를 포함한 PBS(240㎕, 10mM, pH7.4)에 2시간 동안 용해시켰다. PBS에 TEA를 첨가하면 pH가 9.5로 변화한다. 가교제로서 티올에 대한 무수 메타크릴의 몰비가 1:2가 되는 양의 시스테인-아르기닌-글리신-아스파르트산-아르기닌-시스테인을 포함하는 펩타이드를 DMSO 10㎕에 용해시켜 히알루론산 유도체(HA-MA) 용액에 첨가한 뒤, 즉시 와류가 발생하도록 교반하여(vortexing) 균일하게 혼합하였다. 이 전구체 용액(precursor solution) 250㎕을 앞부분이 잘린 주사기에 넣어 가교 반응이 완결될 때까지 37℃에서 인큐베이트하였다.
[ 실험예 2] 다공성 지지층 및 조직 접착층을 포함하는 다층막의 제조
[ 실험예 2-1 ] 조직 접착층의 제조
히알루론산에 락트산-글리콜산 공중합체를 도입하기 위해, 먼저 DCC를 사용하여 락트산-글리콜산 공중합체에 NHS를 결합시켜 락트산-글로콜산 공중합체-NHS(PLGA-NHS)를 합성하였다(반응식 2).
다음, 히드라지드기 도입율이 80몰% 이상인 히알루론산(HA-ADH)을 DMSO에 녹인 다음, 위의 락트산-글로콜산 공중합체-NHS(PLGA-NHS) 용액과 40℃에서 24시간 동안 반응시켰다(반응식 3).
반응을 통하여 얻은 히알루론산 유도체(HA-PLGA-NHS)는 히알루론산에 결합된 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)의 도입율 정도에 따라 용액 상에서 거동이 달라지게 된다. 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)의 치환 정도가 낮은(1.5몰퍼센트 이하) 히알루론산 유도체(HA-PLGA-NHS)는 히알루론산 보다 콤팩트한 코일 형태로 거동하는데, 이것은 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)의 강력한 소수성 상호작용에 의한 것이다. 이와는 달리 락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)의 치환 정도가 높은 (7.8몰퍼센트) 히알루론산 유도체(HA-PLGA-NHS)는 물에 대한 친화력이 급격하게 떨어진다. 즉, 강력한 이온성 결합을 가짐으로써 물에 대한 용해도가 떨어지고, 용액에서 젤과 같이 분산되는 것을 볼 수 있으며 DMSO에 결과적으로 잘 녹게 된다.
락트산-글리콜산 공중합체(PLGA)의 치환 정도가 높은 히알루론산 유도체(HA-PLGA-NHS)를 휘발성이 있는 유기 용매에 녹이고 락트산-글리콜산을 적당량 섞어서 작은 샬레에 옮긴 후에 용매를 서서히 증발 시켜, 필름 형태의 조직 접착층이 얻어졌다.
반응식 2
Figure 112006063044805-pat00012
반응식 3
Figure 112006063044805-pat00013
[ 실험예 2-2 ] 조직 접착층 상에 다공성 지지층의 제조
히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)을 PBS(0.01M, pH 7.4, 25℃)에 용해시켰다. 이어, 40㎎/㎖의 ADH에 대한 비스(설포숙신이미딜)수버레이트의 몰비가 20%가 되는 양의 비스(설포숙신이미딜)수버레이트를 소량의 PBS(0.01M, pH 7.4, 25℃)에 용해시켰다.
페트리디쉬 내의 실험예 2-1에서 제조된 조직 접착층 위에 비스(설포숙신이미딜)수버레이트 용액을 뿌린 후, 스핀 코팅법 등을 이용하여 비스(설포숙신이미딜)수버레이트 용액을 균일하게 분포시킨다. 비스(설포숙신이미딜)수버레이트 용액으로 코팅된 조직 접착층 위에 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH) 용액을 부어 넣으면 이 용액층으로 비스(설포숙신이미딜)수버레이트 용액이 자연스레 확산되면서 가교 반응이 일어난다. 가교 반응이 완결되도록 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이트 하였다.
조직 접착층 상에 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체가 만들어진 페트리디쉬를 냉동 냉장고에 약 -70℃에서 급속냉각시킨 뒤, 동결 건조기에 넣어 저온을 유지하면서 진공을 걸어주면 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체로부터 수분이 빠져나가 조직 접착층 상에 다공성 지지층이 완성되었다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되지 않고 본 발명의 기술적 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 당업자에 의해 다양하게 변형 실시될 수 있다.
상술한 바와 같이 미생물 유래의 히알루론산을 이용하고, 소정의 아미노기를 포함하는 링커를 도입하여 형성된 히알루론산 유도체를 포함하는 다층막은 생체 내에서 안전하고, 생체 적합성이 우수한 할 뿐만 아니라 분해 속도의 조절이 가능하여, 예를 들어 치주조직 재생용 차폐막 등으로 적용될 수 있다.

Claims (34)

  1. 히알루론산에 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체 중에서 적어도 하나 선택되는 폴리머를 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함하는 조직 접착층; 및
    상기 조직 접착층 상에 위치하고, 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 다공성 지지층을 포함하는 다층막.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 폴리머는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합한 다층막.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 폴리머의 카르복실기와 결합한 다층막.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 조직 접착층은 하기 화학식 1로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함하는 다층막.
    화학식 1
    Figure 112006063044805-pat00014
    (여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, R4는 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체에서 적어도 하나 선택되는 폴리머이다)
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-인 다층막.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체는 히알루론산에 수버레이트를 반응시켜 수득한 다층막.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 수버레이트는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합한 다층막.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 수버레이트는 비스(설포숙신이미딜)수버레이트인 다층막.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 수버레이트의 카르보닐기와 결합한 다층막.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 다공성 지지층은 하기 화학식 2로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함하는 다층막.
    화학식 2
    Figure 112006063044805-pat00015
    (여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다)
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-인 다층막.
  12. 제 7 항에 있어서,
    상기 링커는 적어도 하나의 유기 용매를 0부피% 초과 60부피% 이하로 포함하는 용액 상에서 상기 하일루론산의 카르복실기와 결합한 다층막.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 에탄올인 다층막.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 조직 접착층은 용매 추출법으로 형성된 다층막.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 다공성 지지층은 상기 조직 접착층 상에 동결 건조하여 형성된 다층막.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 다층막은 치주조직 재생용 차폐막인 다층막.
  17. 히알루론산에 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체 중에서 적어도 하나 선택되는 폴리머와 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함하는 조직 접착층; 및
    상기 조직 접착층 상에 위치하고, 히알루론산에 무수 메타크릴을 반응시켜 수득한 히알루론산 유도체를 포함하는 다공성 지지층을 포함하는 다층막.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 폴리머는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합한 다층막.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 폴리머의 카르복실기와 결합한 다층막.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 조직 접착층은 하기 화학식 1로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함하는 다층막.
    화학식 1
    Figure 112006063044805-pat00016
    (여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, R4는 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 락트산-글리콜산 공중합체에서 적어도 하나 선택되는 폴리머이다)
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-인 다층막.
  22. 제 17 항에 있어서,
    무수 메타크릴은 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합한 다층막.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 무수 메타크릴의 카르보닐기와 결합한 다층막.
  24. 제 23 항에 있어서,
    상기 다공성 지지층은 하기 화학식 3으로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함하는 다층막.
    화학식 3
    Figure 112006063044805-pat00017
    (여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다)
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-인 다층막.
  26. 제 22 항에 있어서,
    상기 링커는 적어도 하나의 유기 용매를 0부피% 초과 60부피% 이하로 포함하는 용액 상에서 상기 하일루론산의 카르복실기와 결합한 다층막.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 에탄올인 다층막.
  28. 제 17 항에 있어서,
    상기 다공성 지지층은 디티올계 가교제에 의해 가교되어 있는 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 다층막.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 디티올계 가교제는 양단에 각각 시스테인을 포함하고, 이들 사이에 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산의 배열을 포함하는 펩타이드인 다층막.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 히알루론산 유도체는 하기 화학식 4로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함하는 다층막.
    화학식 4
    Figure 112006063044805-pat00018
    (여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, C는 시스테인, R은 아르기닌, G는 글리신, D는 아스파르트산이고, (-S-)는 시스테인에 포함된 메르캅토기 유래의 황을 나타낸다)
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-인 다층막.
  32. 제 17 항에 있어서,
    상기 조직 접착층은 용매 추출법으로 형성된 다층막.
  33. 제 17 항에 있어서,
    상기 다공성 지지층은 상기 조직 접착층 상에 동결 건조하여 형성된 다층막.
  34. 제 17 항에 있어서,
    상기 다층막은 치주조직 재생용 차폐막인 다층막.
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