KR100845515B1 - 골 충진 복합체 및 그 제조 방법 - Google Patents

골 충진 복합체 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

골 충진 복합체 및 그 제조 방법이 제공된다. 골 충진 복합체는 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스, 및 매트릭스에 충진되어 있는 골 재생 유도체를 포함한다. 골 충진 복합체는 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스와 이에 충진되어 있는 골 대체제에 의해 유착을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 골 재생 능력을 갖추어 예를 들어 손상된 치조골 결손 부위에 이러한 골 충진 복합체를 이용함으로써 치조골 재생을 유도할 수 있다.
골 충진 복합체, 히알루론산, 하이드로젤

Description

골 충진 복합체 및 그 제조 방법{Bone Filling complex and method for fabricating the same}
도 1은 히알루론산 중의 히드라지드기 도입율을 핵자기 공명법으로 정량한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 링커가 도입된 히알루론산을 투석한 후 그 결과물을 가지고 HPLC로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 히알루로디나아제로 처리한 히알루론산 및 링커가 도입된 히알루론산의 분해 산물을 GPC로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4a 및 도 4b는 히알루로디나아제로 처리한 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체의 분해 산물을 각각 카르바졸 어세이와 GPC로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 골 충진 복합체 및 그 제조 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히알루론산 유도체를 포함하는 골 충진 복합체 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
일반적으로 외상이나 골다공증과 같은 질환으로 인해 골 손상부가 발생할 경 우 그 부위에 골을 채워서 골 유합시킨다. 골 유합에 가장 보편적인 방법은 다른 부위의 자신의 골을 일부 채취해서 이식하는 자가골 이식법과 동물의 뼈를 화학 처리하여 이식하는 이종골 이식법이 있다.
자가골 이식법의 경우에는 많은 양을 채취하기 어렵고 공여 부위에 합병증이 발생할 수 있다. 또한, 이종골 이식법의 경우에는 면역 반응과 함께 골 유합이 지연될 수 있으며, 예를 들어 우골 유래 이종골 이식재를 사용시 광우병의 전염 가능성도 있다.
최근 자가골과 이종골을 대체할 만한 성능을 가진 골 충진재가 많이 개발되고 있다. 골 충진재로는 뼈, 치아 등의 구성 성분인 인산 칼슘계 화합물이 사용될 수 있는데, 이러한 골 충진재를 이용하여 골 손상부를 치유하는 과정에서 섬유조직(fibrous tissue)이 과도하게 발생하여 주변의 조직과 비정상적 접합이 일어나는 유착(adhesion) 현상이 발생될 수 있다. 이중 일부는 자발적으로 분해 되지만 대부분의 경우는 상처 치유 후에도 유착이 존재하여 각종 후유증을 유발할 수 있다.
따라서, 골 손상 부위에서의 골 재생 능력 및 유착 방지 능력이 우수한 골 충진재에 대한 개발이 요구된다.
이에 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 골 재생 능력 및 유착 방지 능력이 우수한 골 충진 복합체를 제공하고자 하는 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 다른 기술적 과제는 골 재생 능력 및 유착 방지 능력이 우수한 골 중진 복합체의 제조 방법을 제공하고자 하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체는 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스, 및 상기 매트릭스에 충진되어 있는 골 재생 유도체를 포함한다.
상기 매트릭스에 포함되는 상기 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체는 히알루론산에 수버레이트를 반응시켜 수득될 수 있고, 상기 수버레이트는 예를 들어 비스(설포숙신이미딜)수버레이트일 수 있다.
상기 수버레이트는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르보닐기에 결합할 수 있다.
상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 수버레이트의 카르보닐기와 결합할 수 있다.
이러한 상기 매트릭스는 하기 화학식 1로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함할 수 있다.
화학식 1
Figure 112006063044940-pat00001
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
또한, 상기 매트릭스에 포함되는 상기 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체는 히알루론산에 무수 메타크릴산을 도입하고, 이를 디티올계 가교제에 반응시켜 수득될 수 있다.
상기 무수 메타크릴산은 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르보닐기에 결합할 수 있다.
상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 무수 메타크릴산의 카르보닐기와 결합할 수 있다.
상기 디티올계 가교제는 예를 들어 양단에 각각 시스테인을 포함하고, 이들 사이에 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산의 배열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
이러한 상기 매트릭스는 하기 화학식 2로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함할 수 있다.
화학식 2
Figure 112006063044940-pat00002
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, C는 시스테인, R은 아르기닌, G는 글리신, D는 아스파르트산이고, (-S-)는 시스테인에 포함된 메르캅토기 유래의 황을 나타낸다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
또한, 상기 매트릭스는 망상 구조를 가질 수 있다.
또한, 상기 골 재생 유도체는 인산 칼슘계 화합물일 수 있다.
또한, 상기한 바와 같은 골 충진 복합체는 블록형, 과립형 또는 주사형의 제형을 가질 수 있다.
상기 다른 기술적 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체의 제조 방법은 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스를 형성하는 단계, 및 상기 매트릭스에 골 재생 유도체를 충진하는 단계를 포함한다.
상기 매트릭스 형성 단계는 히알루론산에 수버레이트를 반응시키는 단계를 포함할 수 있고, 상기 수버레이트는 예를 들어 비스(설포숙신이미딜)수버레이트일 수 있다.
상기 수버레이트는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르보닐기에 결합할 수 있다.
상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 수버레이트의 카르보닐기와 결합할 수 있다.
이러한 상기 매트릭스는 하기 화학식 1로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함할 수 있다.
화학식 1
Figure 112006063044940-pat00003
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
상기 링커는 적어도 하나의 유기 용매를 0 내지 60부피% 포함하는 용액 상에서 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합할 수 있으며, 상기 유기 용매는 예를 들어 에탄올일 수 있다.
또한, 상기 매트릭스 형성 단계는 히알루론산에 무수 메타크릴산을 도입하는 단계, 및 상기 무수 메타크릴산이 도입된 히알루론산과 디티올계 가교제를 반응시키는 단계를 포함한다.
상기 무수 메타크릴산은 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합할 수 있다.
상기 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 무수 메타크릴산의 카르보닐기와 결합할 수 있다.
상기 디티올계 가교제는 예를 들어 양단에 각각 시스테인을 포함하고, 이들 사이에 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산의 배열을 포함하는 펩타이드일 수 있다.
이러한 상기 매트릭스는 하기 화학식 2로 표시되는 유니트를 적어도 하나 포함할 수 있다.
화학식 2
Figure 112006063044940-pat00004
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, C는 시스테인, R은 아르기닌, G는 글리신, D는 아스파르트산이고, (-S-)는 시스테인에 포함된 메르캅토기 유래의 황을 나타낸다. 이때, 바람직하게는 상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
상기 링커는 적어도 하나의 유기 용매를 0 내지 60부피% 포함하는 용액 상에서 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합할 수 있고, 상기 유기 용매는 예를 들어 에탄올일 수 있다.
또한, 상기 골 재생 유도체는 인산 칼슘계 화합물일 수 있다.
또한, 상기 매트릭스 형성과 상기 골 재생 유도체 충진은 실질적으로 인시츄로 수행될 수 있다.
기타 실시예들의 구체적인 사항들은 상세한 설명 및 도면들에 포함되어 있 다. 따라서, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체는 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스와 매트릭스에 충진되어 있는 골 재생 유도체를 포함한다.
우선, 골 충진 복합체의 매트릭스(matrix)에 대해 설명한다.
매트릭스는 골 충진 복합체가 생체 내에 투입되어 골 조직을 재생시키는 동안 조직들을 서로 분리시키기 위한 물리적 장벽으로 작용하여, 유착의 우려가 있는 환부 또는 손상을 덮어주거나 감싸주고, 소정 시간 경과되면 생체 내에서 분해되어 재생 골 조직으로 치환되는 것으로, 이러한 매트릭스는 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함한다. 매트릭스는 예를 들어 그물 모양의 망상 구조를 가질 수 있다.
이를 보다 상세하게 설명하면, 매트릭스는 히알루론산에 수버레이트(suberate)를 반응시켜 수득된 물질로 이루어진다. 히알루론산과 반응되는 수버 레이트는 예를 들어 비스(설포숙신이미딜)수버레이트(Bis[sulfosuccinimmidyl]suberate)일 수 있다.
히알루론산은 하기 화학식 3에 도시한 바와 같이, D-글루쿠론산과 N-아세틸글로코사민이 β(1→3) 글리코시드 결합에 의해 연결된 이당 유니트로 이루어지는 글루코사미드글리칸의 일종이다. 히알루론산은 그 화학적, 물리적 구조에 종차이가 없고, 인간도 대사계를 가지고 있으며, 면역성, 독성의 면에서도 가장 안전한 생체 재료이다. 히알루론산은 예를 들어 미생물을 발효하여 대량으로 생산할 수 있고, 이 경우 바이러스 오염, 알레르기 반응을 일으킬 위험이 없으며, 일정 수준의 품질을 유지할 수 있다.
화학식 3
Figure 112006063044940-pat00005
본 발명에서의 "히알루론산"이라 함은 히알루론산 그 자체뿐만 아니라 그것의 염을 모두 포함하는 개념이다. 즉, 본 발명에서의 "히알루론산"은 히알루론산, 히알루론산 염 또는 히알루론산과 히알루론산의 혼합물을 포함한다. 히알루론산 염에는 예를 들어 히알루론산 나트륨, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등과 같은 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등과 같은 유기염을 모두 포함한다. 경우에 따라서는 이들의 적어도 2개의 조합이 사용될 수도 있 다. 본 발명에서의 히알루론산의 분자량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 100,000 내지 10,000,000 일 수 있다.
매트릭스에 포함되는 히알루론산과 수버레이트는 화학적으로 공유 결합되어 있다. 따라서, 히알루론산과 수버레이트가 결합되어 있는 히알루론산 유도체는 생체 내에 투여 된 후에도 염 농도의 변화, pH 변화 등의 환경 변화에 의해서 이들이 서로 분리되지 않는다.
이러한 히알루론산은 수버레이트와 결합시, 링커를 개재하여 결합될 수 있다. 링커는 수버레이트의 카르보닐기와 결합하여 히알루론산에 도입될 수 있으며, 히알루론산 유도체의 생체 내 분해 속도를 조절하는 역할을 한다. 히알루론산 유도체는 체내에 존재하는 히알루론산 분해 효소인 히알루로디나아제(hyaluronidase)가 히알루론산의 카르복실기에 의해 히알루론산을 인식함으로써 분해된다. 따라서, 링커를 히알루론산의 카르복실기에 결합시켜 카르복실기가 노출되는 수를 조절함으로써, 히알루로디나아제에 의한 히알루론산 유도체의 분해 속도를 조절할 수 있다. 예를 들어 히알루론산에 도입되어진 링커의 비율이 높을수록 생체 내에서의 히알루론산 유도체의 분해 속도가 낮아지게 된다. 따라서, 히알루론산에 도입되는 링커의 도입율을 조절함으로써, 히알루론산 유도체의 체내에서의 분해 속도를 목적하는 바대로 조절하는 것이 가능하다.
이러한 링커는 적어도 2개의 아미노기를 포함할 수 있다. 링커는 예를 들어 복수의 아미노기를 포함하는 디히드라지드 화합물, 디아민 화합물, 히드라진 화합 물일 수 있다. 링커는 예를 들어 H2N-(CH2)x-NH2(식 중 x는 0 내지 10의 정수이다), H2NNHCO-(CH2)-CH2-(O-CH2-CH2)x-NH2(식 중, x는 0 내지 10의 정수이다)로 표시되는 디아민 화합물, H2NNHCO-(CH2)x-CONHNH2(식 중, x는 1 내지 10의 정수이다)로 표시되는 디히드라지드 화합물, 또는 NH(R1)-NH(R2)(식 중, R1 및 R2는 각각 수소 원자 또는 C1 -6 알킬기이다)로 표시되는 히드라진 화합물일 수 있다.
수버레이트 또는 링커가 히알루론산에 도입되는 위치는 예를 들어 히알루론산의 카르복실기일 수 있다. 카르복실기에 도입되는 경우, 아미드기, 히드라지드기, 디아실히드라지드기, 카르복실산에스테르기를 형성함으로써, 수버레이트 또는 링커 부분이 히알루론산에 도입될 수 있다. 수버레이트 또는 링커가 히알루론산과 카르복실산에스테르를 형성하여 히알루론산에 도입되어 형성되는 히알루론산 유도체는 투여액 내, 생체 내에서 가수분해에 의해 수버레이트의 탈리가 비교적 단시간에 발생할 수 있다. 따라서, 가수분해 속도가 느린 아미드기, 히드라지드기 등을 포함하는 링커를 개재하여 수버레이트를 히알루론산에 도입하는 것이 바람직하다.
상술한 바와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체의 매트릭스는 하기 화학식 1으로 표시되는 유니트의 반복 구조를 분자 내에 포함할 수 있다.
화학식 1
Figure 112006063044940-pat00006
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다. 이때, 바람직하게는 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
이러한 매트릭스에는 골 재생 유도체가 충진되어 있다. 매트릭스는 예를 들어 그물 모양의 망상 구조를 가질 수 있으며, 망상 구조의 내부, 망상의 사이사이에 골 재생 유도체가 충진되어 있다. 골 재생 유도체는 골 손상 부위에서 골 조직의 재생을 유도하는 것으로, 예를 들어 인산 칼슘계 화합물일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체에 포함되는 골 재생 유도체는 천연에서 유래한 인산 칼슘계 화합물일 수도 있고, 인공적으로 합성한 인산 칼슘계 화합물일 수도 있으며, 골 조직의 재생을 유도하는 것이라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있음은 물론이다.
계속해서, 상술한 바와 같은 골 충진 복합체의 제조 방법을 설명한다.
우선 히알루론산의 카르복실기를 활성화한다. 예를 들어 N,N'-카르보닐디이 미다졸(CDI), N,N'-디시클로헥실카르보닐이미드(DCC), N-에톡시카르보닐-2-에톡시-1,2-디히드록시놀린(EEDQ), 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진)-4-메틸모르폴륨(DMT-MM), 2-벤조트리아졸-1,1,3,3-테트라메틸우로늄사불화붕산염(TBTU), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HODhbt), 벤조트리아졸-1-옥시-트리스-피롤리디노-포스포늄육불화인산염(PyBOP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스(디메틸아미노)포스포늄헥사플루오로포스페이트(BOP) 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC) 또는 N-하이드록시숙신이미드(NHS) 등의 축합제를 단독 또는 적절하게 조합하여 히알루론산의 카르복실기를 활성 에스테르화한다.
여기에 히드라지드기, 아미노기 등의 활성 에스테르와 반응성을 갖는 작용기를 포함하는 상술한 바와 같은 링커를 도입한다. 이때, 링커는 증류수 또는 적어도 하나의 유기 용매를 포함하는 용액 상에서 히알루론산의 카르복실기에 도입될 수 있다. 유기 용매는 예를 들어 에탄올일 수 있으며, 전체 용액 중 유기 용매의 비율은 약 60부피% 이하일 수 있고, 바람직하게는 약 50부피%일 수 있다.
이어, 링커가 도입된 히알루론산 용액에 골 재생 유도체, 예를 들어 인산 칼슘 화합물을 분산시킨 다음, 비스(설포숙신이미딜)수버레이트를 첨가하여 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 망상 구조의 매트릭스에 골 재생 유도체가 충진되어 있는 골 충진 복합체를 완성할 수 있다. 상술한 바와 같이 매트릭스의 형성과 골 재생 유도체 충진은 실질적으로 인시츄(in-situ)로 수행될 수 있다.
이러한 골 충진 복합체를 냉동 건조시켜, 블록형, 과립형 또는 주사형 등으로 사용 목적에 적합하게 다양한 제형으로 만들 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체는 예를 들어 치과용 골 충진재로 사용될 수 있다. 즉, 손상된 치조골 결손 부위에 채워 넣어 치조골의 재생을 유도할 수 있다.
계속해서, 본 발명의 다른 실시예에 따른 골 충진 복합체에 대해 설명한다.
본 발명의 다른 실시예에 따른 골 충진 복합체는 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스와 매트릭스에 충진되어 있는 골 재생 유도체를 포함한다.
매트릭스에 포함되어 있는 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체는 히알루론산에 무수 메타크릴산을 도입하고, 이를 디티올계 가교제에 반응시켜 수득된 것이다.
히알루론산은 무수 메타크릴산과 화학적으로 공유 결합되어 있다. 따라서, 히알루론산과 무수 메타크릴산이 결합되어 있는 히알루론산 유도체는 생체 내에 투여 된 후에도 염 농도의 변화, pH 변화 등의 환경 변화에 의해서 이들이 서로 분리되지 않는다.
이러한 히알루론산은 무수 메타크릴산과 결합 시, 링커를 개재하여 결합될 수 있다. 링커는 무수 메타크릴산의 카르보닐기와 결합하여 히알루론산에 도입될 수 있으며, 히알루론산 유도체의 생체 내 분해 속도를 조절하는 역할을 한다. 이러한 링커의 기능과 종류는 본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체에서와 실질적으로 동일하므로, 여기에서는 중복되는 설명은 생략한다.
무수 메타크릴산 또는 링커가 히알루론산에 도입되는 위치는 예를 들어 히알루론산의 카르복실기일 수 있다. 카르복실기에 도입되는 경우, 아미드기, 히드라지드기, 디아실히드라지드기, 카르복실산에스테르기를 형성함으로써, 무수 메타크릴산 또는 링커 부분이 히알루론산에 도입될 수 있다. 무수 메타크릴산 또는 링커가 히알루론산과 카르복실산에스테르를 형성하여 히알루론산에 도입되어 형성되는 히알루론산 유도체는 투여액 내, 생체 내에서 가수분해에 의해 무수 메타크릴산의 탈리가 비교적 단시간에 발생할 수 있다. 따라서, 가수분해 속도가 느린 아미드기, 히드라지드기 등을 포함하는 링커를 개재하여 무수 메타크릴산을 히알루론산에 도입하는 것이 바람직하다.
링커를 개재하여 무수 메타크릴산이 도입되어 있는 히알루론산과 반응하는 디티올계 가교제로는 예를 들어 메르캅토기(-SH)를 포함하는 시스테인이 양단에 위치하고 이들 사이에 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산의 배열을 포함하는 펩타이드일 수 있다. 이러한 가교제의 양단은 각각 히알루론산 유도체의 무수 메타크릴산 유래의 α,β-불포화 카르보닐기와 결합하여 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 형성한다.
아르기닌, 글리신 및 아스파르트산 배열을 포함하는 펩타이드 도입을 통해 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체는 세포부착 능력이 향상될 수 있다. 생체 내의 세포 표면에 존재하는 수용체(receptor)인 인테그린(integrin)과 ECM에 존재하는 접착 단백질(adhesion protein)에 의해 세포 접착이 일어나게 되는데, 접착 단백질에 직접적으로 세포를 부착시키는 역할을 하는 펩타이드 배열이 아르기닌, 글리신, 아스파르트산의 배열이다. 따라서, 아르기닌, 글리신, 아스파르트산의 배열을 포함하는 디티올계 가교제를 히알루론산 유도체에 도입함으로써 세포 접착을 효 과적으로 유도할 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 골 충진 복합체의 매트릭스는 하기 화학식 2와 같은 유니트의 반복 구조를 분자 내에 포함할 수 있다.
화학식 2
Figure 112006063044940-pat00007
여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1 -6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, C는 시스테인, R은 아르기닌, G는 글리신, D는 아스파르트산이고, (-S-)는 시스테인에 포함된 메르캅토기 유래의 황을 나타낸다. 이때, 바람직하게는 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-일 수 있다.
이러한 매트릭스에는 골 재생 유도체가 충진되어 있다, 매트릭스는 예를 들어 그물 모양의 망상 구조를 가질 수 있으며, 망상 구조의 내부, 망상의 사이사이에 골 재생 유도체가 충진되어 있다. 골 재생 유도체는 본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체의 골 재생 유도체와 실질적으로 동일하므로, 여기에서는 중복되는 설명은 생략한다.
계속해서, 상술한 바와 같은 골 충진 복합체의 제조 방법을 설명한다.
우선 본 발명의 일 실시예에 따른 골 충진 복합체의 제조 방법에서와 마찬가지로 히알루론산의 카르복실기를 활성화하여 활성 에스테르화하고, 여기에 히드라지드기, 아미노기 등의 활성 에스테르와 반응성을 갖는 작용기를 포함하는 링커를 도입한다. 이때, 링커는 증류수 또는 적어도 하나의 유기 용매를 포함하는 용액 상에서 히알루론산의 카르복실기에 도입될 수 있다. 유기 용매는 예를 들어 에탄올일 수 있으며, 전체 용액 중 유기 용매의 비율은 약 60부피% 이하일 수 있고, 바람직하게는 약 50부피%일 수 있다.
이어, 링커가 도입된 히알루론산 용액에 무수 메타크릴산을 반응시켜, 링커를 개재하여 무수 메타크릴산을 히알루론산에 도입한다.
다음, 무수 메타크릴산이 도입된 히알루론산 용액에 골 재생 유도체, 예를 들어 인산 칼슘 화합물을 분산시킨 다음, 디티올계 가교제, 예를 들어 양단에 시스테인이 위치하고 이들 사이에 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산의 배열을 포함하는 펩타이드를 첨가하여 마이클 첨가 반응에 의해 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스에 골 재생 유도체가 충진되어 있는 골 충진 복합체를 완성할 수 있다. 상술한 바와 같이 매트릭스의 형성과 골 재생 유도체 충진은 실질적으로 인시츄로 수행될 수 있다.
이러한 골 충진 복합체를 냉동 건조시켜, 블록형, 과립형 또는 주사형 등으로 사용 목적에 적합하게 다양한 제형으로 만들 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 다른 실시예에 따른 골 충진 복합체는 예를 들어 치과용 골 충진재로 사용될 수 있다. 즉, 손상된 치조골 결손 부위에 채워 넣어 치조골의 재생을 유도할 수 있다.
이하, 실험예들을 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단, 실험예들은 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명이 하기 실험예들에 의하여 한정되는 것은 아님이 이해되어야 한다.
[ 실험예 1] 골 충진 복합체의 제조
[ 실험예 1-1] 히드라지드기가 도입된 히알루론산의 제조
증류수에 대한 히알루론산(Denkikagaku Kogyo Co.(Tokyo, Japan))의 농도가 각각 2㎎/㎖ 및 5㎎/㎖인 히알루론산 용액을 제조하였다. 이때, 히알루론산 용액은 증류수만을 포함하는 경우, 증류수에 대해 에탄올이 각각 25부피% 및 50부피% 비율로 포함하는 경우를 제조하였다.
여기에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드(EDC)(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)를 사용하여 히알루론산의 카르복실기를 활성화 시킨 다음, 아디프산디히드라지드(ADH)(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA))를 첨가하고, 1N 염산으로 pH를 약 4.8로 유지하면서 실온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 이때, EDC와 ADH의 첨가량은 히알루론산의 카르복실기에 대하여 각각 몰비로 4배 및 40배였다.
반응 결과물을 100mM 염화나트륨 용액, 25% 에탄올 용액, 증류수로 투석하고, 동결 건조하여 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)을 얻었다.
각 수득된 히알루론산 중의 히드라지드기 도입율을 1H-NMR(DPX300, Bruker, Germany)로 정량한 결과를 도 1에 도시하였다(히알루론산의 N-아세틸기(α)는 약 2.1ppm, 아디프산 부분의 메틸렌기(β, γ)는 약 1.7ppm, 1.8ppm, 2.4ppm, 2,5ppm).
도 1에 도시한 바와 같이, 히알루론산 용액 중 에탄올의 비율이 증가함에 따라 히드라지드기 도입율이 증가함을 알 수 있었다.
[ 실험예 1-2 ] 히드라지드가 도입된 히알루론산의 정량
실험예 1-1 중 히알루론산 농도를 5㎎/㎖로 하고 에탄올의 비율을 50부피%로 하여 수득된 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)을 HPLC로 정량하여 그 결과를 도 2에 도시하였다.
이때, HPLC 조건은 용출액은 34mM 인산염 완충액(pH 6.6)/메탄올 =80:20(v/v))이였고, 워터스 1525 바이너리 HPLC 펌프, 워터스 2487 듀얼 λ 어브저번스 검출기, 워터스 717 플러스 오토 샘플러(Milford, MA, USA))를 사용하였으며, 칼럼은 울트라하이드로젤 250과 1000 컬럼(7.8㎜ i.d. ×30㎝)을 사용하였고, 유속은 0.5㎖/min이었으며, 샘플 주입량은 10㎕이었고, 샘플 농도는 5㎎/㎖ 이었다. 검출 파장(detection wavelength)은 210㎚였다.
[ 실험예 1-3 ] 히드라지드기가 도입된 히알루론산의 효소 내성 평가
히알루론산, 증류수 상에서 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH), 에탄올이 약 50부피% 포함된 용액 상에서 히드라지드기가 도입된 히알루론산(stealth HA-ADH)을 각각 약 4.57㎎/㎖의 농도로 각각 0.2M 인산 나트륨 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.2) 1.8㎖에 용해하였다. 이 용액들에 각각 1500U/㎖ 농도 의 히알루로디나아제(bovine testicular hyaluronidase) 용액 200㎕를 첨가하여, 약 37℃에서 48시간 인큐베이트하였다.
히알루론산 또는 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH, stealth HA-ADH)은 하기 반응식에 도시한 바와 같이 히알루로디나아제에 의해 N-아세탈헥소사미니드(N-acetalhexosaminide) 결합이 분해된다.
반응식
Figure 112006063044940-pat00008
히알루로디나아제로 히알루론산과 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH, stealth HA-ADH)을 처리한 후, 그 분해 산물 중의 이중 결합을 자외선 분광법으로 정량하여 분해 속도를 분석한 결과를 도 3에 도시하였다. 분해 산물을 분석하기 위해 GPC 분석을 사용하였다.
도 3의 (a)는 히알루론산에 대하여 히알루로디나제의 처리 전후를 나타낸 GPC 분석 결과이고, (b)는 증류수 상에서 히드라자드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH)에 대하여 히알루로디나제의 처리 전후를 나타낸 GPC 분석 결과이며, (c)는 에탄올이 약 50부피% 포함된 수용액 상에서 히드라지드기가 도입된 히알루론산(stealth HA-ADH)에 대하여 히알루로디나제의 처리 전후를 나타낸 GPC 분석 결과이다.
GPC에서는 분자량이 큰 물질의 피크가 먼저 나오고, 분자량이 작은 물질의 피크가 나중에 나오게 되는데, 효소에 의해 분해된 분해 산물은 분자량이 감소하기 때문에 피크가 뒤쪽으로 이동하게 되고, 효소 처리 후 동일 시간이 지났을 때 피크의 위치 변화 정도가 클수록 분해가 많이 되었음을 의미한다. (a), (b) 및 (c) 모두에서 히알루론산의 농도는 약 5㎎/㎖이었고, (b)와 (c)에서의 히드라지드기 도입율은 각각 70.47% 및 82.82% 이었다.
도 3에 도시한 바와 같이, 히알루론산에 히드라지드기의 도입율이 높을수록 히알루론산의 효소에 의한 분해 정도가 낮아짐을 확인할 수 있었다.
[ 실험예 1-4] 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체의 효소 내성 평가
히드라지드기 도입율이 각각 69.39몰%, 79.61몰% 및 84.98몰%인 히알루론산 각 12mg을 PBS(0.01M, pH7.4, 25℃) 270㎕에 용해시켰다. 완전히 용해된 후, 각 용액 180㎍을 앞부분이 잘려진 주사기에 넣었다.
비스(설포숙신이미딜)수버레이트를 20㎕의 PBS에 용해시켜 주사기에 담긴 히알루론산 용액에 첨가해 균일하게 혼합하였다. 첨가한 비스(설포숙신이미딜)수버레이트의 양은 히알루론산에 도입된 ADH의 20몰%이었다.
이 전구체 용액을 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이트 하여 가교 반응을 완결시켰다.
완성된 각 하이드로젤 형태의 히알루론산(약 200㎕)을 4㎖ 바이알(vial)에 넣었다. 0.2M 인산 나트륨 완충액(pH 6.2) 0.9㎖을 각 바이알에 첨가하였다. 각 바이알에 히알루로네이트 리아제(hyaluronate lyase) 180U을 포함한 0.2M 인산 나트 륨 완충액(pH 6.2) 0.9㎖을 첨가하였다. 이를 37℃에서 96 시간 동안 인큐베이트하였다.
정해진 샘플링 시간(sampling time)이 되면 각 바이알에서 상층액 200㎕를 뽑아내고, 0.2M 인산 나트륨 완충액(pH 6.2) 200㎕을 다시 넣어주었다. 각 샘플링 시간마다 발생하는 상층액의 희석은 후보정하였다. 뽑아낸 각 상층액 200㎕은 끓는 물이 담겨진 수조에 약 3분 동안 담그어 효소 활성을 중지시켰다.
히알루로디나아제에 의한 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체의 분해는 상층액으로 분해되어 나온 글루쿠론산의 양을 카르바졸 어세이(carbazole assay와 GPC를 통해 측정하여 분석하여 그 결과를 각각 도 4a 및 도 4b에 도시하였다. 카르바졸 어세이에서는 발색 반응이 일어난 시료의 흡광도를 자외선 분광광도계(UV spectrophotometer)를 이용하여 측정함으로써 히알루론산 분해 정도를 정량적으로 분석할 수 있다.
도 4a 및 도 4b에 도시한 바와 같이, 히드라지드기 도입율이 69.39몰%인 히알루론산 유도체(◆), 79.61몰%인 히알루론산 유도체(■), 84.98몰%인 히알루론산 유도체(▲)의 히알루로디나아제에 의한 분해 정도는 히드라지드기의 도입율이 높을수록 느리게 진행됨을 알 수 있었다. 즉, 히드라지드기의 도입율이 높을수록 분해 효소에 의한 분해가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
[실험예 1-5] 매트릭스와 매트릭스에 충진된 골 재생 유도체를 포함하는 골 충진 복합체의 제조
히드라지드기 도입율이 69.39몰%인 히알루론산 12mg을 PBS(0.01M, pH7.4, 25℃) 270㎕에 용해시켰다. 완전히 용해된 후, 용액 180㎍을 앞부분이 잘려진 주사기에 넣었다. 최종 하이드로젤 용량인 200㎕를 기준으로 100㎎/㎖이 되는 양의 하이드록시아파타이트(Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA))를 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH) 용액 에 넣어 균일하게 분포하도록 잘 혼합시켰다. 비스(설포숙신이미딜)수버레이트를 20㎕의 PBS에 용해시켜 주사기에 담긴 히알루론산 용액에 첨가해 균일하게 혼합하였다. 첨가한 비스(설포숙신이미딜)수버레이트의 양은 히알루론산에 도입된 ADH의 20몰%이었다. 이 전구체 용액(precursor solution)을 37℃에서 한 시간 동안 인큐베이트 하여 가교 반응을 완결시켜 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 망상 구조의 매트릭스와 매트릭스 내부와 망상 사이사이에 골 재생 유도체가 충진된 골 충진 복합체를 완성시켰다.
완성된 골 충진 복합체를 냉동냉장고에서 약 -70℃로 급속냉각시킨 뒤, 동결 건조기에 넣어 저온을 유지하면서 진공을 걸어주면 매트릭스에서 수분이 빠져나가게 한 후, 이를 프레스하여 블록형으로 만들었다.
[ 실험예 2] 골 충진 복합체의 제조
[실험예 2-1] 무수 메타크릴산이 도입된 히알루론산의 제조
히드라지드기 도입율이 72.89몰%인 히알루론산(HA-ADH) 50mg을 증류수 2.25㎖에 용해시킨 후, 인산염 완충액(200mM, pH 8.0) 0.25㎖을 첨가해 pH를 8로 맞추었다. 히드라지드기에 대해 20몰배 과량의 무수 메타크릴산(MW=154.17)을 히드라지드기가 도입된 히알루론산(HA-ADH) 용액에 첨가하였다.
4 시간 동안 상온에서 교반하여 반응시킨 후, 에탄올을 이용하여 침전시켜 히알루론산 유도체(HA-MA)를 얻었다. 3회의 에탄올 세척 과정을 거친 뒤, 상온에서 건조시켰다.
히알루론산에 대한 무수 메타크릴산의 도입율은 1H NMR 분석을 통해 구할 수 있다.
[ 실험예 2-2] 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체로 제조
실험예 2-1에서 얻어진 히알루론산(HA-MA) 11㎎을 16㎕/㎖의 TEA를 포함한 PBS(240ul, 10mM, pH7.4)에 2시간 동안 용해시켰다. PBS에 TEA를 첨가하면 pH가 9.5로 변화한다. 최종 하이드로젤 용량인 250㎕를 기준으로 100㎎/㎖이 되는 양의 하이드록시아파타이트 (Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA))를 무수메타크릴이 도입된 히알루론산(HA-MA) 용액에 넣어 균일하게 분포하도록 잘 혼합시켰다. 가교제로서 티올에 대한 무수 메타크릴산의 몰비가 1:2가 되는 양의 시스테인-아르기닌-글리신-아스파르트산-아르기닌-시스테인을 포함하는 펩타이드를 DMSO 10㎕에 용해시켜 히알루론산 유도체(HA-MA) 용액에 첨가한 뒤, 즉시 와류가 발생하도록 교반하여(vortexing) 균일하게 혼합하였다.
이 전구체 용액 250㎕을 앞부분이 잘린 주사기에 넣어 가교 반응이 완결될 때까지 37℃에서 인큐베이트하여 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 망상 구조의 매트릭스와, 매트릭스 내부와 망상 사이사이에 골 재생 유도체가 충진된 골 충진 복합체를 완성시켰다.
완성된 골 충진 복합체를 냉동냉장고에서 약 -70℃로 급속냉각시킨 뒤, 동결 건조기에 넣어 저온을 유지하면서 진공을 걸어주면 매트릭스에서 수분이 빠져나가게 한 후, 이를 프레스하여 블록형으로 만들었다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되지 않고 본 발명의 기술적 요지를 벗어나지 않는 범위 내에서 당업자에 의해 다양하게 변형 실시될 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 골 충진 복합체는 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스와 이에 충진되어 있는 골 대체제에 의해 유착을 방지할 수 있을 뿐만 아니라 우수한 골 재생 능력을 갖추어 예를 들어 손상된 치조골 결손 부위에 이러한 골 충진 복합체를 이용함으로써 치조골 재생을 유도할 수 있다.

Claims (35)

  1. 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스; 및
    상기 매트릭스에 충진되어 있는 골 재생 유도체를 포함하는 골 충진 복합체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체는 히알루론산에 수버레이트를 반응시켜 수득된 골 충진 복합체.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 수버레이트는 비스(설포숙신이미딜)수버레이트인 골 충진 복합체.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 수버레이트는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르보닐기에 결합한 골 충진 복합체.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 링커는 2개 이상의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 수버레이트의 카르보닐기와 결합한 골 충진 복합체.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 매트릭스는 하기 화학식 1로 표시되는 유니트를 하나 이상 포함하는 골 충진 복합체.
    화학식 1
    Figure 112008009493041-pat00009
    (여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1-6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다)
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-인 골 충진 복합체.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체는 히알루론산에 무수 메타크릴산을 도입하고, 이를 디티올계 가교제에 반응시켜 수득된 골 충진 복합체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 무수 메타크릴산은 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합한 골 충진 복합체.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 링커는 2개 이상의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 무수 메타크릴산의 카르보닐기와 결합한 골 충진 복합체.
  11. 제 8 항에 있어서,
    상기 디티올계 가교제는 양단에 각각 시스테인을 포함하고, 이들 사이에 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산의 배열을 포함하는 펩타이드인 골 충진 복합체.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 매트릭스는 하기 화학식 2로 표시되는 유니트를 하나 이상 포함하는 골 충진 복합체.
    화학식 2
    Figure 112008009493041-pat00010
    (여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1-6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, C는 시스테인, R은 아르기닌, G는 글리신, D는 아스파르트산이고, (-S-)는 시스테인에 포함된 메르캅토기 유래의 황을 나타낸다)
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-인 골 충진 복합체.
  14. 제 1 항에 있어서,
    상기 매트릭스는 망상 구조를 갖는 골 충진 복합체.
  15. 제 1 항에 있어서,
    상기 골 재생 유도체는 인산 칼슘계 화합물인 골 충진 복합체.
  16. 제 1 항에 있어서,
    상기 골 충진 복합체는 블럭형, 과립형 또는 주사형의 제형을 갖는 골 충진 복합체.
  17. 하이드로젤 형태의 히알루론산 유도체를 포함하는 매트릭스를 형성하는 단계; 및
    상기 매트릭스에 골 재생 유도체를 충진하는 단계를 포함하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 매트릭스 형성 단계는 히알루론산에 수버레이트를 반응시키는 단계를 포함하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 수버레이트는 비스(설포숙신이미딜)수버레이트인 골 충진 복합체의 제조 방법.
  20. 제 18항에 있어서,
    상기 수버레이트는 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르보닐기에 결합하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 링커는 2개 이상의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 수버레이트의 카르보닐기와 결합하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 매트릭스는 하기 화학식 1로 표시되는 유니트를 하나 이상 포함하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
    화학식 1
    Figure 112008009493041-pat00011
    (여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1-6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이다)
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-인 골 충진 복합체의 제조 방법.
  24. 제 20 항에 있어서,
    상기 링커는 하나 이상의 유기 용매를 0 내지 60부피% 포함하는 용액 상에서 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 에탄올인 골 충진 복합체의 제조 방법.
  26. 제 17 항에 있어서,
    상기 매트릭스 형성 단계는
    히알루론산에 무수 메타크릴산을 도입하는 단계; 및
    상기 무수 메타크릴산이 도입된 히알루론산과 디티올계 가교제를 반응시키는 단계를 포함하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 무수 메타크릴산은 링커를 개재하여 상기 히알루론산의 카르복실기에 결합하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
  28. 제 27 항에 있어서,
    상기 링커는 2개 이상의 아미노기를 포함하며, 상기 아미노기 중 하나는 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하고, 상기 아미노기 중 다른 하나는 상기 무수 메타크릴산의 카르보닐기와 결합한 골 충진 복합체의 제조 방법.
  29. 제 26 항에 있어서,
    상기 디티올계 가교제는 양단에 각각 시스테인을 포함하고, 이들 사이에 아르기닌, 글리신 및 아스파르트산의 배열을 포함하는 펩타이드인 골 충진 복합체의 제조 방법.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    상기 매트릭스는 하기 화학식 2로 표시되는 유니트를 하나 이상 포함하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
    화학식 2
    Figure 112008009493041-pat00012
    (여기서, R1 및 R2는 각각 수소 원자, C1-6 알킬기에서 선택되고, R3는 단일 결합, -(CH2)x-, -CH2-CH2-(O-CH2-CH2)x- 또는 -NHCO-(CH2)y-CONH-이고, x는 1 내지 10의 정수이고, y는 0 내지 10의 정수이며, C는 시스테인, R은 아르기닌, G는 글리신, D는 아스파르트산이고, (-S-)는 시스테인에 포함된 메르캅토기 유래의 황을 나타낸다)
  31. 제 30 항에 있어서,
    상기 R1 및 R2는 각각 수소 원자이고, 상기 R3는 -NHCO-(CH2)y-CONH-인 골충진재의 제조 방법.
  32. 제 27 항에 있어서,
    상기 링커는 하나 이상의 유기 용매를 0 내지 60부피% 포함하는 용액 상에서 상기 히알루론산의 카르복실기와 결합하는 골 충진 복합체의 제조 방법.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 유기 용매는 에탄올인 골 충진 복합체의 제조 방법.
  34. 제 17 항에 있어서,
    상기 골 재생 유도체는 인산 칼슘계 화합물인 골 충진 복합체의 제조 방법.
  35. 제 17 항에 있어서,
    상기 매트릭스 형성과 상기 골 재생 유도체 충진은 인시츄로 수행되는 골 충진 복합체의 제조 방법.
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