KR102108552B1

KR102108552B1 - 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법 및 상기 히알루론산 마이크로비드의 용도

Info

Publication number: KR102108552B1
Application number: KR1020180055584A
Authority: KR
Inventors: 최원일
Original assignee: 한국세라믹기술원
Priority date: 2018-05-15
Filing date: 2018-05-15
Publication date: 2020-05-08
Anticipated expiration: 2038-05-15
Also published as: WO2019221432A1; KR20190130887A

Abstract

본 발명은 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법 및 상기 히알루론산 마이크로비드의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 히알루론산을 알렌드로네이트(ALD), 아데노신 디포스페이트(ADP) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 리간드와 가교반응시키는 것을 포함하는 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드는 우수한 생체적합성, 생분해성, 물리적 안정성을 가지고 있어 치과용 충전제, 정형외과용 보조제, 성형외과용 필러, 유착방지제, 세포지지체 또는 약물 전달체 등 다양한 용도로 사용될 수 있다.

Description

히알루론산 마이크로비드의 제조 방법 및 상기 히알루론산 마이크로비드의 용도{METHOD FOR PREPARING HYALURONIC ACID MICROBEAD AND USE OF THE HYALURONIC ACID MICROBEAD}

히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 N-아세틸-D-글루코사민과 D-글루쿠론산으로 구성되어 있고 상기 반복단위가 선형으로 연결되어 있는 생체고분자 물질로서, 안구의 유리액, 관절의 활액 및 닭벼슬 등에 많이 존재한다. 히알루론산은 우수한 생체적합성과 점탄성으로 인해 안과용 수술 보조제, 관절기능 개선제, 약물전달 물질 및 점안제 등의 의료 및 의료 용구나, 화장품 용도 등으로 널리 사용되고 있다. 그러나, 그 자체만으로는 생체내(in vivo, 히알루론산 분해효소 등 포함) 또는 산, 알칼리 등의 조건에서 쉽게 분해되어 사용이 제한적이다. 따라서, 구조적으로 안정한 히알루론산 유도체를 개발하기 위한 노력이 널리 진행되고 있다(Laurent, T.C. "The chemistry, biology and medical applications of hyaluronan and its derivatives" Portland Press Ltd., London, 1998).

히알루론산 유도체는 수술 후의 유착 방지제, 주름살 개선제, 성형 보조물, 관절기능 개선제, 약물 전달체 및 세포배양 지지체(Scaffold) 등 다양한 용도로 개발되고 있으며, 특히 주름살 개선제와 성형 보조제 등은 상업적 용도로 활발한 연구가 행해지고 있다(F. Manna, M. Dentini, P. Desider, O. De Pita, E. Mortilla, B. Maras, Journal of European Academy of Dermatology and Venereology, 13(1999) 183-192).

히알루론산 유도체의 하나로서, 가교제를 사용하여 히알루론산들을 상호 공유결합시킨 히알루론산 가교물은 우수한 생체적합성, 물리적 안정성 및 생분해성을 가지고 있으며, 미국특허 제4,716,224호, 제4,963,666호, 제5,017,229호, 제5,356,883호 등에는 그것의 제조방법들이 개시되어 있다. 그러나, 이들 특허에서의 방법으로 제조된 히알루론산 가교물(히알루론산 유도체)은 히알루론산 분해효소 및 열에 대한 안정성이 상대적으로 낮으며 미반응 화학물질의 제거가 어려워 고순도의 생체적합성 물질로 활용하기에는 한계가 있다. 특히, 가교제로서 디비닐술폰, 할로메틸옥시란, 알데히드를 사용하는 경우 미 반응한 잔류 가교제에 의한 세포독성이 나타나므로 미 반응 가교제를 낮추기 위해 복잡한 공정을 수행해야하며 카보디이미드 또는 숙신이미딜활성에스테르 등은 독성은 약하지만 과량으로 사용해야 가교 효과를 볼 수 있으며 가격이 높다는 단점이 있다. 또한 히알루론산 마이크로입자의 경우에는 spray-drying 방법을 통해서 초고압 및 저온에서 한번에 분사시켜 제조할 수 있지만, 입자간의 균일성이 떨어지고 고가의 장비를 사용해야 하는 문제점이 존재한다.

이에, 본 발명자들은 상기 문제점을 해결하기 위하여 화학 가교제를 사용하지 않고 쉽고 간단히 제조할 수 있는 히알루론산 마이크로비드를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 칼슘 용액상에서 히알루론산을 알렌드로네이트(ALD), 아데노신 디포스페이트(ADP) 또는 아데노신 트리포스페이트(ATP)와 반응시키는 경우 우수한 생체적합성, 생분해성 및 물리적 안정성을 갖는 히알루론산 마이크로비드가 제조될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명에 따른 히알루론산과 ALD, ADP 또는 ATP의 가교반응에 의한 히알루론산 유도체의 반응식을 도 1에 나타내었다.

본 명세서에서 사용된 용어 "히알루론산"은 히알루론산 자체와 히알루론산 염을 모두 포함하는 의미로 사용된다. 따라서, 이하에서 사용된 용어 "히알루론산 수용액"은 히알루론산의 수용액, 히알루론산 염의 수용액, 및 히알루론산 과 히알루론산 염의 혼합 수용액을 모두 포함하는 개념이다. 상기 히알루론산 염은 히알루론산 나트륨, 히알루론산 칼륨, 히알루론산 칼슘, 히알루론산 마그네슘, 히알루론산 아연, 히알루론산 코발트 등의 무기염과, 히알루론산 테트라부틸암모늄 등의 유기염이 모두 포함된다. 경우에 따라서는, 그들의 둘 또는 그 이상이 조합되어 사용될 수도 있다.

본 발명은

(a) 히알루론산 또는 그의 염을 수용액에 용해시키는 단계;

(b) 상기 히알루론산 또는 그의 염 용액에 알렌드로네이트(ALD), 아데노신 디포스페이트(ADP) 및 아데노신 트리포스페이트(ATP)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 리간드 첨가하여 가교반응시키는 단계; 및

(c) 상기 가교반응된 히알루론산 또는 그의 염의 유도체를 분리 건조하여 회수하는 단계를 포함하는 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법을 제공하고자 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 모식도를 도 2에 나타내었다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법에 있어서, 상기 방법은 (d) 상기 회수된 히알루론산 또는 그의 염의 유도체를 0.1~2.0M 농도의 다가 양이온 용액에 적하하여 비드형태로 제조하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 다가 양이온은 CaCl₂, SrCl₂, BaCl₂ 또는 AlCl₃ 인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법에 있어서, 상기 히알루론산의 분자량은 100,000 내지 5,000,000 Da인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법에 있어서, 상기 히알루론산의 농도는 1 ~ 10wt%인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법에 있어서, 상기 수용액은 탈이온수(deionized water: DIW), 증류수(distilled water: DW), 생리식염수(saline solution), 또는 인산염완충용액(PBS)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 15℃ 내지 60℃의 온도에서 1 시간 내지 48 시간 동안 100 rpm 내지 2,000 rpm의 교반 속도로 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 (b)는 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에 수행되는 것을 특징으로 한다. 상기 카르복실기 활성화제는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카르보디이미드(EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide), 1-에틸-3-(3-(트리메틸암모니오)프로필) 카르보디이미드(ETC, 1-ethyl-3-(3-(trimethylammonio)propyl) carbodiimide) 및 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리노에틸) 카르보디이미드(CMC, 1-cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl) carbodiimide)로 이루어진 군으로부터 1조 잉상 선택될 수 있다. 상기 펩티드 결합 촉진제는 1-히드록시벤조트리아졸(HOBt, 1-hydroxybenzotriazole), 3,4-디히드로-3-히드록시-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HOOBt, 3,4-dihydro-3-hydroxy-4-oxo-1,2,3-benzotriazine), 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt, 1-hydroxy-7-azabenzotriazole), 설포-N-히드록시설포숙신이미드 (Sulfo-NHS, Sulfo-N-hydroxysulfosuccinimide) 및 O-(1H-벤조트리아졸-1-y)-N,N,N',N'-테트라메틸유로니움테트라플루오로보레이트(TBTU, O-(1H-benzotriazole-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborate)로부터 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법에 있어서, 상기 단계 (c)의 분리 및 정제는 증류, 재결정, 칼럼 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출, 투석 또는 세척에 의해 수행되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법에 있어서, 상기 히알루론산 마이크로비드는 치과용 충전제, 정형외과용 보조제, 성형외과용 필러, 유착방지제, 세포지지체 또는 약물 전달체로 사용되는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조방법은 칼슘 용액상에서 쉽고 간단히 제조할 수 있으며, 상기 제조방법을 통해 제조된 히알루론산 마이크로비드(HA microbead)는 다양한 생리활성물질을 로딩할 수 있어 의용재료 분야(주름제거용 필러(filler), 성형보조물 implant), 약물전달체(drug delivery matrix), 세포전달체(cell carrier), 세포지지체(scaffold), 관절기능 개선제) 및 화장품 분야에 널리 사용될 수 있을 것을 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 히알루론산과 ALD, ADP 또는 ATP의 가교반응에 의한 히알루론산 유도체의 반응식을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따른 히알루론산 마이크로비드의 제조 모식도를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 1에 따른 칼슘이온 반응성이 높은 리간드의 선별 결과를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 실시예 2에 따른 HA-ALD의 1H NMR 분석 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 실시예 3에 따른 HA microbead의 특성 평가 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 실시예 4에 따른 HA microbead의 세포독성 평가 결과를 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 >

실시예 1. 칼슘이온 반응성이 높은 리간드의 선별

칼슘반응성이 있는 리간드 ALD, ADP 및 ATP를 각각 금나노입자에 결합시킨 뒤, 다양한 농도 (0 ~ 1.6 mM)의 염화칼슘과 교반한 후, 금나노입자의 흡광도를 UV/Vis 장비를 이용하여 분석하였다.

그 결과, ALD, ADP 및 ATP는 모두 칼슘이온에 반응성을 보여주였다. 그 중에서, ALD가 칼슘이온과 결합력이 가장 좋은 것으로 확인되었다(도 3).

실시예 2. HA- ALD의 제조

히알루론산(650 kDa) 130mg을 9mL의 수용액에 30분 동안 용해시켰다. ALD (325 μM, 1mL)를 상기 히알루론산 용액에 첨가하고, 동시에 EDC(N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide, 650 μM)와 NHS(N-Hydroxysuccinimide, 650 μM)도 함께 첨가하여 18시간 동안 반응시켰다. 반응 용액을 dialysis membrane (15 kDa)에 옮겨서 48시간 동안 순도를 높여주는 투석반응을 진행하였다. ALD가 결합된 히알루론산 (HA-ALD)을 동결건조 후 1H NMR을 이용하여 치환률을 분석하였다. 또한, 히알루론산 (100 kDa)의 경우, 100mg을 사용하여 ALD (81mg), EDC (96mg) 및 NHS (58mg)의 함량을 달리하여 반응시킨 것을 제외하고는 상기 히알루론산(650 kDa)와 마찬가지로 HA-ALD을 제조하였다.

그 결과, HA의 카르복실그룹에 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 첨가후 아민그룹을 지닌 ALD을 효과적으로 치환시킨 것으로 확인되었다(도 4). 저분자량(100 kDa)과 고분자량(650 kDa)을 지닌 HA 모두 ALD가 안정적으로 치환되었으며, 분자량에 따른 NMR 분석결과는 큰 차이가 없는 것으로 나타났다.

실시예 3. HA microbead의 제조 및 특성평가

히알루론산 유도체(HA-ALD)를 수용액에 5wt%로 녹여준 뒤, 200mM 염화칼슘 용액에 떨어뜨려 히알루론산 나노/마이크로비드를 제조하였다. (100 rpm stirring 조건에서 시행). 히알루론산 마이크로비드의 크기 및 분산도를 DLS를 이용하여 분석하였고, 모형(morphology)은 FE-SEM을 이용하여 분석하였다.

그 결과, HA microbead는 저분자량(100 kDa)의 히알루론산을 이용하여 마이크로비드를 제조한 경우에는 평균적으로 약 0.35 μm 크기를 보여주었고, 고분자량(650 kDa)의 히알루론산을 이용한 경우에는 약 1.03 μm 크기로 나타났다. 이처럼 히알루론산 마이크로비드의 크기는 히알루론산 분자량 조절에 따라 가능하기 때문에 다양한 분자량별 히알루론산을 이용하여 마이크로비드를 제조하면 히알루론산의 물리적인 특성을 쉽게 조절할 수 있을 것으로 기대된다(도 5-6).

실시예 4. HA microbead의 제조 및 특성평가

히알루론산 마이크로비드의 세포독성 평가를 위해, NIH/3T3 Fibroblasts (1x104 cells/well)을 96 well cell culture plate에 도포 후, 12시간 정도 안정화시켰다(세포 배지: DMEM(FBS 10%, antibiotics 1% 포함)). 히알루론산 마이크로비드의 다양한 농도(1 ~ 1000 μg/mL)로 세포에 첨가하고 24시간 동안 배양한 뒤, 각각 세포 대사 작용에 미치는 영향에 대해서 WST-8 평가법을 사용하여 분석하였다.

그 결과, 히알루론산 마이크로비드는 히알루론산의 분자량에 상관없이 1 ~ 1000 μg/mL의 농도에서 세포독성을 일으키지 않는 것으로 확인되었다(도 7)

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

치과용 충전제, 정형외과용 보조제, 성형외과용 필러, 유착방지제, 세포지지체 또는 약물 전달체로 사용하기 위한 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법으로, 상기 방법은:
(a) 히알루론산 또는 그의 염을 수용액에 용해시키는 단계;
(b) 상기 히알루론산 또는 그의 염 용액에 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 첨가하여 가교반응시키는 단계;
(c) 상기 가교반응된 히알루론산 또는 그의 염의 유도체를 분리 건조하여 회수하는 단계; 및
(d) 상기 회수된 히알루론산 또는 그의 염의 유도체를 0.1~2.0M 농도의 다가 양이온 용액에 적하하여 비드형태로 제조하는 단계를 포함하고,
상기 단계 (b)는 카르복실기 활성화제와 펩티드 결합 촉진제의 존재하에 15℃ 내지 60℃의 온도에서 1 시간 내지 48 시간 동안 100 rpm 내지 2,000 rpm의 교반 속도로 수행되고,
상기 히알루론산의 농도는 1 ~ 10wt%인 것인, 히알루론산 마이크로비드의 제조 방법.
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제1항에 있어서,
상기 단계 (c)는 증류, 재결정, 칼럼 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 겔 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피, 상 분리, 용매 추출, 투석 또는 세척에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 것인, 방법.
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