CN114466869B - 水凝胶组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包括透明质酸聚合物和多聚体交联剂的交联聚合物(例如，水凝胶)，所述交联聚合物用于治疗疾患(例如，视网膜脱离或骨关节炎)、用于筛选模型(例如，体外细胞培养系统)中、或用于细胞移植(例如，体内细胞递送)。

Description

水凝胶组合物及其用途
序列表
本申请含有序列表，该序列表已经以ASCII格式通过电子方式提交并且据此以全文引用的方式并入本文。所述ASCII副本创建于2020年7月2日，命名为51408-002WO2_SEQUENCE_LISTING_07.02.20_ST25，大小为6,115字节。
背景技术
透明质酸(hyaluronan或hyaluronic acid(HA))是一种非硫酸化的糖胺聚糖，由D-葡糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖的重复单体单元组成。透明质酸在许多组织中含量丰富，并且是可生物降解的。因此，透明质酸已用于体内医学应用和体外细胞培养应用。然而，当在体内注射或在体外使用时，透明质酸会被清除。因此，需要具有延长的体内寿命和体外寿命的透明质酸组合物。
发明内容
本公开的特征在于化学改性和交联的透明质酸衍生物，其具有延长的体内寿命和体外寿命。此类透明质酸衍生物可用于治疗疾患(例如，视网膜脱离或骨关节炎)，用于筛选模型(例如，药物筛选，例如体外细胞培养系统)，或用于细胞移植(例如，体内细胞递送)。
透明质酸包括D-葡糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖的重复单元。如本文所用，透明质酸的D-葡糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖的糖主链的碳原子编号如图表1所示。
图表1
本公开的特征在于透明质酸的衍生物(例如，携带酮基团或氧胺基团的透明质酸)及其在合成可用于治疗疾病(例如，视网膜脱离)或用于筛选模型(例如，3D细胞培养系统)中的交联聚合物(例如，水凝胶)中的用途。
在第一方面，本发明的特征在于一种式(I)化合物：
HAP-K
(I)，
其中HAP为透明质酸聚合物；并且K为与透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Ia)或式(Ib)的结构：
其中RX为C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基、C1-20亚杂烷基、C2-20亚杂烯基或C2-20亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；并且R1为C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C2-6杂烯基、C2-6杂炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、C2-9杂环基或C2-9杂芳基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代，或其盐。
在一些实施例中，K具有式(Ia)的结构：
在一些实施例中，K具有式(Ib)的结构：
在一些实施例中，K通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C1上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，K通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C2上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，K通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C3上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，K通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C4上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，K通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C6上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，K通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C7上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，K通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C8上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，K通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C9上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，K通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C10上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，K通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C12上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。
在一些实施例中，透明质酸聚合物包含式(II)的结构：
其中RK1、RK2、RK3、RK4、RK5和RK6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基，或连接至K的键；RK7为RK8为或连接至K的键；并且RK9、RK10和RK11中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基，其中RK1、RK2、RK3、RK4、RK5、RK6和RK8中的至少一者为连接至K的键。
在一些实施例中，RK1为H。在其他实施例中，RK2为H。在又一些实施例中，RK3为H。在一些实施例中，RK4为在一些实施例中，RK5为H。在一些实施例中，RK6为H。在特定实施例中，RK8为连接至K的键。在一些实施例中，RK8为在一些实施例中，RK8为在一些实施例中，RK9为H。在一些实施例中，RK10为H。在一些实施例中，RK11为H。
在一些实施例中，化合物进一步以式(III)描述：
[A]m[B]n[C]1-(m+n)
(III)，
其中
[A]具有式(IIIa)的结构：
其中RA1、RA2、RA3、RA4、RA5和RA6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；并且K为与透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Ia)或式(Ib)的结构：
其中RX为C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基、C1-20亚杂烷基、C2-20亚杂烯基或C2-20亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；并且R1为C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C2-6杂烯基、C2-6杂炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、C2-9杂环基或C2-9杂芳基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；
[B]具有式(IIIb)的结构：
其中RB1、RB3、RB4、RB5和RB6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；RB2为H、C1-12酰基、C1-12烷基或C1-12杂烷基，其中的每一个任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；RB7为H或C1-6烷基；Y1为NRB8、O或S；Z1为NRB9、O或S；并且RB8和RB9中的每一个独立地为H或C1-6烷基；
[C]具有式(IIIc)的结构：
其中RC1、RC2、RC3、RC4、RC5和RC6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；并且Ma为阳离子(例如，碱金属阳离子例如钠，或碱土金属阳离子)；
并且
m和n中的每一个独立地为大于零且小于1的分数，其中(m+n)<1。
在特定实施例中，R1为C1-6烷基、C2-6烯烃、C2-6炔烃或C1-6杂烷基。例如，R1可以为C1-6烷基(例如，–CH3或–CH2CH3)。
在一些实施例中，RA1为H。在其他实施例中，RA2为H。在又一些实施例中，RA3为H。在一些实施例中，RA4为在一些实施例中，RA5为H。在一些实施例中，RA6为H。
在一些实施例中，K具有式(Ia)的结构：
在一些实施例中，K具有式(Ib)的结构：
在特定实施例中，K具有的结构。
在特定实施例中，RB1为H。在一些实施例中，RB2为H或C1-6酰基。在特定实施例中，RB2为H。在又一些实施例中，RB3为H。在一些实施例中，RB4为在一些实施例中，RB5为H。在一些实施例中，RB6为H。在一些实施例中，RB7为H。在又一些实施例中，Y1为O。在一些实施例中，Y1为NRB8。在某些实施例中，Z1为O。在一些实施例中，RB8为H。
在特定实施例中，RC1为H。在一些实施例中，RC2为H。在又一些实施例中，RC3为H。在一些实施例中，RC4为在一些实施例中，RC5为H。在一些实施例中，RC6为H。
在特定实施例中，m和n介于0.35到0.65之间。在其他实施例中，m和n介于0.45到0.55之间。
在一些实施例中，RX为C1-20亚烷基或C2-20亚杂烯基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。在特定实施例中，RX为C2-20亚杂烯基，其任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
在一些实施例中，[A]具有式(A1)的结构：
其中p为1、2、3、4、5或6。在特定实施例中，p为3。
在一些实施例中，[A]具有式(A2)的结构：
其中p为1、2、3、4、5或6。在特定实施例中，p为1。
在一些实施例中，[B]具有式(B1)的结构：
在一些实施例中，[B]具有式(B2)的结构：
其中RB2为C1-12酰基、C1-12烷基或C1-12杂烷基，其中的每一个任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
在一些实施例中，[C]具有式(C1)的结构：
在一些实施例中，[C]具有式(C2)的结构：
其中RC2为C1-12烷基，其任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
在相关方面，本发明的特征在于(i)透明质酸聚合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物)或包含式(II)的结构的透明质酸聚合物)与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(IV-i)或式(IV-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物：
其中R1为C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C2-6杂烯基、C2-6杂炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、C2-9杂环基或C2-9杂芳基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；RX为与透明质酸聚合物共价连接的部分；RX为C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基、C1-20亚杂烷基、C2-20亚杂烯基或C2-20亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；并且RY为从多聚体聚合性交联剂形成的片段，或其盐。
在特定实施例中，多聚体聚合性交联剂为能够与式(IV-i)的两个连接基团共价连接的二聚体、能够与式(IV-i)的三个连接基团共价连接的三聚体、能够与式(IV-i)的四个连接基团共价连接的四聚体、能够与式(IV-i)的五个连接基团共价连接的五聚体、能够与式(IV-i)的六个连接基团共价连接的六聚体、能够与式(IV-i)的七个连接基团共价连接的七聚体、或能够与式(IV-i)的八个连接基团共价连接的八聚体。
在特定实施例中，多聚体聚合性交联剂为能够与式(IV-ii)的两个连接基团共价连接的二聚体、能够与式(IV-ii)的三个连接基团共价连接的三聚体、能够与式(IV-ii)的四个连接基团共价连接的四聚体、能够与式(IV-ii)的五个连接基团共价连接的五聚体、能够与式(IV-ii)的六个连接基团共价连接的六聚体、能够与式(IV-ii)的七个连接基团共价连接的七聚体、或能够与式(IV-ii)的八个连接基团共价连接的八聚体。
在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有小于100MDa、75MDa、50MDa、30MDa、20MDa、15MDa、10MDa、6MDa、5MDa、1MDa、500kDa、250kDa、100kDa、50kDa、30kDa、20kDa、15kDa、10kDa、6kDa、5kDa或1kDa的平均分子量。在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有小于100MDa、75MDa、50MDa、30MDa、20MDa、15MDa、10MDa、6MDa、5MDa或1MDa的平均分子量。在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有小于500kDa、250kDa、100kDa、50kDa、30kDa、20kDa、15kDa、10kDa、6kDa、5kDa或1kDa的平均分子量。
在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有100Da至1kDa、1kDa至30kDa、30kDa至50kDa、50kDa至100kDa、100kDa至250kDa、250kDa至500kDa、500kDa至1MDa、1MDa至5MDa、5MDa至15MDa、15MDa至30MDa、30MDa至50MDa、或50MDa至100MDa的平均分子量。在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有100Da至1kDa、1kDa至30kDa、30kDa至50kDa、50kDa至100kDa、100kDa至250kDa、或250kDa至500kDa的平均分子量。在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有500kDa至1MDa、1MDa至5MDa、5MDa至15MDa、15MDa至30MDa、30MDa至50MDa、或50MDa至100MDa的平均分子量。
在一些实施例中，RY包括C1-200亚烷基、C2-200亚烯基、C2-200亚炔基、C1-200亚杂烷基、C2-200亚杂烯基或C2-200亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。在一些实施例中，RY包括任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-200亚杂烷基。在一些实施例中，RY包括任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-100亚杂烷基。在特定实施例中，RY为C1-200亚杂烷基，其任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
在特定实施例中，用于形成式(IV-i)或式(IV-ii)的交联聚合物的多聚体聚合性交联剂具有式(IVa)的结构：
其中a为介于1到90之间的整数(例如，6到40之间、10到40之间、15到40之间、6到60之间、或20到60之间)或其盐。在一些实施例中，a为约29。在其他实施例中，a为约54。
在特定实施例中，用于形成式(IV-i)或式(IV-ii)的交联聚合物的多聚体聚合性交联剂具有式(IVb)的结构：
其中b为介于1到90之间的整数(例如，6到40之间、10到40之间、15到40之间、6到60之间)或其盐。在一些实施例中，b为约75。
在一些实施例中，RY包括聚氨酯、聚脲、聚酰胺、聚环氧烷、聚碳酸酯、聚酯、聚内酯、有机硅聚合物、聚醚砜、聚烯烃、多肽、多糖、聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯-丁烯、聚异丁烯、聚丁二烯或聚乙烯丁烯链段。例如，多聚体聚合性交联剂可包括选自聚环氧丙烷、聚环氧乙烷和聚环氧丁烷的聚环氧烷链段。
在一些实施例中，RY进一步包括多肽。在一些实施例中，多肽包括细胞粘附肽(例如，RGD肽(例如，包括SEQ ID NO:1GRGDSPASSKKG的序列的肽))。在一些实施例中，多肽包括可降解肽(例如，MMP肽(例如，包括SEQ ID NO:2SKAGAGPQGIWGQGAGAKSKS的序列的肽))。
本发明的特征在于包括任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物)或包含式(II)的结构的透明质酸聚合物)与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(IV-i)或式(IV-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的水凝胶。在特定实施例中，水凝胶为玻璃体替代物。
本发明的特征进一步在于一种治疗疾患(例如，眼部疾患例如视网膜脱离)的方法，该方法包括将玻璃体替代物玻璃体内注射至有此需要的受试者(例如人受试者)的例如眼睛内。
本发明的特征还在于一种治疗疾患(例如，眼部疾患例如视网膜脱离)的方法，该方法包括将玻璃体替代物关节内注射至有此需要的受试者(例如人受试者)。
本发明的特征进一步在于一种治疗疾患(例如，眼部疾患例如视网膜脱离)的方法，该方法包括将玻璃体替代物注射至有此需要的受试者(例如人受试者)的滑液腔内。
本发明的特征在于一种水凝胶细胞培养物，其包括任何前述交联聚合物(例如，式(IV-i)或式(IV-ii)的交联聚合物)和至少一个细胞。在特定实施例中，水凝胶细胞培养物进一步包括促进生理相关组织的生长的至少一种药剂和/或细胞外基质蛋白(例如，胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白)。水凝胶细胞培养物可以为癌症(例如，乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤癌、肺癌、脑癌、卵巢癌或前列腺癌)的筛选模型。
另一方面，本发明的特征在于一种制备任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物)或包含式(II)的结构的透明质酸聚合物)与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(IV-i)或式(IV-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的方法，所述方法包括：(i)提供第一组合物，其包含任何前述化合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物))；(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及(iii)将第一组合物与第二组合物合并以形成混合物。
另一方面，本发明的特征在于一种制备包括任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物)或包含式(II)的结构的透明质酸聚合物)与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(IV-i)或式(IV-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的水凝胶的方法，所述方法包括：(i)提供第一组合物，其包含任何前述化合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物))；(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及(iii)将第一组合物与第二组合物合并以形成混合物。
本发明的特征还在于一种形成包括任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物)或包含式(II)的结构的透明质酸聚合物)与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(IV-i)或式(IV-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的玻璃体替代物的方法，所述方法包括：(i)提供第一组合物，其包含任何前述化合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物))；(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及(iii)将第一组合物与第二组合物合并以形成混合物，其中该混合物被注射至受试者(例如，罹患视网膜脱离或处于视网膜脱离风险下的受试者，例如人受试者)的眼睛内。在一些实施例中，步骤(iii)获得了替代受试者眼睛的玻璃体液的混合物
本发明的特征在于一种形成包括任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物)或包含式(II)的结构的透明质酸聚合物)与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(IV-i)或式(IV-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的三维水凝胶的方法，所述方法包括：(i)提供第一组合物，其包含任何前述化合物(例如，式(I)化合物(例如，式(III)化合物))；(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及(iii)在存在至少一个细胞的情况下将第一组合物与第二组合物合并以形成混合物，其中当将至少一个细胞在三维水凝胶中培养时，该三维水凝胶支持生理相关组织的生长。混合可以在存在促进生理相关组织的生长的至少一种药剂的情况下进行。在特定实施例中，混合在存在细胞外基质蛋白的情况下进行。细胞外基质蛋白为例如胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白或层粘连蛋白。在特定实施例中，细胞为癌细胞(例如，乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞或淋巴瘤癌细胞)。
在一些实施例中，混合物的浓度为至少0.1wt％(例如，至少0.5wt％、至少1wt％、至少10wt％或至少20wt％)的交联聚合物。在一些实施例中，步骤(iii)在约37℃的温度进行。在一些实施例中，混合物的pH水平小于9.0。在特定实施例中，混合物的pH水平为约6.0至约8.5。在又一些实施例中，混合物的pH水平为约7.0至约8.0。在一些实施例中，混合物的pH水平为约7.4。在一些实施例中，步骤(iii)包括形成包含摩尔比为约5:1至约1:1(例如，约4:1、约3:1或约2:1)的第一组合物和第二组合物的混合物。
在特定实施例中，多聚体聚合性交联剂携带两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个末端氧胺基团。在一些实施例中，任何前述化合物(例如式(I)化合物(例如式(III)化合物))与硒代两个或更多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂的交联度介于0.01％到1％之间、0.01％到5％之间、0.1％到1％之间、0.01％到5％之间、0.1％到10％之间、0.01％到80％之间、1％到5％之间、10％到50％之间、20％到40％之间、20％到99％之间、50％到99％之间、70％到90％之间、80％到95％之间、90％到99％之间、95％到99％之间、98％到99.5％或99％到99.9％之间。
在一些实施例中，该方法进一步包括：(iv)提供第三组合物，其包含醛改性的透明质酸；以及(v)将混合物与第三组合物合并。
在特定实施例中，步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有在HBS中在约37℃介于1秒到48小时之间、1秒到24小时之间、1秒到30秒之间、10秒到1分钟之间、30秒到5分钟之间、1分钟到30分钟之间、1分钟到1小时之间、30分钟到1小时之间、1小时到24小时之间、1小时到2小时之间、2小时到3小时之间、3小时到5小时之间、5小时到10小时之间、10小时到15小时之间、10小时到24小时之间、15小时到24小时之间、或24小时到48小时之间的胶凝时间。在其他实施例中，交联聚合物在Hank平衡盐溶液(HBS)中在约37℃历经约28天失去至多10％(例如，至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、或至多0.1％)的质量。在其他实施例中，交联聚合物在HBS中在约37℃历经约28天失去至多25％(例如，至多20％、至多15％、至多10％、至多5％、或至多1％)的质量。
在一个相关方面，本发明的特征在于一种式(V)化合物：
HAP-OA
(V)，
其中HAP为透明质酸聚合物；并且OA为与透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Va)的结构：
其中RW为C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基、C1-20亚杂烷基、C2-20亚杂烯基或C2-20亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；并且R3为H、C1-6烷基或C1-6杂烷基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代，或其盐。
在一些实施例中，OA通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C1上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，OA通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C2上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，OA通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C3上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，OA通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C4上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，OA通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C6上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，OA通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C7上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，OA通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C8上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，OA通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C9上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，OA通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C10上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。在一些实施例中，OA通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C12上的取代基与透明质酸聚合物共价连接。
在一些实施例中，透明质酸聚合物包含式(VI)的结构：
其中RL1、RL2、RL3、RL4、RL5和RL6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基，或连接至OA的键；RL7为RL8为或连接至OA的键；并且RL9、RL10和RL11中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基，其中RL1、RL2、RL3、RL4、RL5、RL6和RL8中的至少一者为连接至OA的键。
在一些实施例中，RL1为H。在其他实施例中，RL2为H。在又一些实施例中，RL3为H。在一些实施例中，RL4为在一些实施例中，RL5为H。在一些实施例中，RL6为H。在特定实施例中，RL8为连接至K的键。在一些实施例中，RL8为在一些实施例中，RL8为在一些实施例中，RL9为H。在一些实施例中，RL10为H。在一些实施例中，RL11为H。
在一些实施例中，化合物进一步以式(VII)描述：
[D]q[E]r[F]1-(q+r)
(VII)，
其中
[D]具有式(VIIa)的结构：
其中RD1、RD2、RD3、RD4、RD5和RD6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；并且OA为与透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Va)的结构：
其中RW为多肽、C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基、C1-20亚杂烷基、C2-20亚杂烯基或C2-20亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；并且R3为H、C1-6烷基或C1-6杂烷基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代，或其盐；
[E]具有式(VIIb)的结构：
其中RE1、RE3、RE4、RE5和RE6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；RE2为H、C1-12酰基、C1-12烷基或C1-12杂烷基，其中的每一个任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；RE7为H或C1-6烷基；Y2为NRE8、O或S；Z3为NRE9、O或S；并且RE8和RE9中的每一个独立地为H或C1-6烷基；
[F]具有式(VIIc)的结构：
其中RF1、RF2、RF3、RF4、RF5和RF6中的每一个独立地为H或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基；并且Mb为阳离子(例如，碱金属阳离子例如钠，或碱土金属阳离子)；并且
q和r中的每一个独立地为大于零且小于1的分数，其中(q+r)<1。
在一些实施例中，RD1为H。在其他实施例中，RD2为H。在又一些实施例中，RD3为H。在一些实施例中，RD4为在一些实施例中，RD5为H。在一些实施例中，RD6为H。
在特定实施例中，R3为H。在一些实施例中，R3为C1-6烷基(例如，-CH3或–CH2CH3)。
在特定实施例中，RE1为H。在一些实施例中，RE2为H或C1-6酰基。在特定实施例中，RE2为H。在又一些实施例中，RE3为H。在一些实施例中，RE4为在一些实施例中，RE5为H。在一些实施例中，RE6为H。在一些实施例中，RE7为H。在又一些实施例中，Y2为O。在一些实施例中，Y1为NRE8。在某些实施例中，Z2为O。在一些实施例中，RE8为H。
在特定实施例中，RF1为H。在一些实施例中，RF2为H。在又一些实施例中，RF3为H。在一些实施例中，RF4为在一些实施例中，RF5为H。在一些实施例中，RF6为H。
在特定实施例中，q和r介于0.35到0.65之间。在其他实施例中，q和r介于0.45到0.55之间。
在一些实施例中，[D]具有式(D1)的结构：
其中s为1、2、3、4、5或6。在一些实施例中，s为2。在一些实施例中，R3为
在一些实施例中，[E]具有式(E1)的结构：
在一些实施例中，[E]具有式(E2)的结构：
其中RE2为C1-12酰基、C1-12烷基或C1-12杂烷基，其中的每一个任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
在一些实施例中，[F]具有式(F1)的结构：
在一些实施例中，[F]具有式(F2)的结构：
其中RF2为C1-12烷基，其任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
在相关方面，本发明的特征在于一种(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物：
其中R4为C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C2-6杂烯基、C2-6杂炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、C2-9杂环基或C2-9杂芳基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；RW为与透明质酸聚合物共价连接的部分；RW为多肽、C1-20亚烷基、C2-20亚烯基、C2-20亚炔基、C1-20亚杂烷基、C2-20亚杂烯基或C2-20亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；并且RZ为从多聚体聚合性交联剂形成的片段，或其盐。
在特定实施例中，R4为C1-6烷基、C2-6烯烃、C2-6炔烃或C1-6杂烷基。例如，R4可以为C1-6烷基(例如，–CH3或–CH2CH3)。
在特定实施例中，多聚体聚合性交联剂为能够与式(VIII-i)的两个连接基团共价连接的二聚体、能够与式(VIII-i)的三个连接基团共价连接的三聚体、能够与式(VIII-i)的四个连接基团共价连接的四聚体、能够与式(VIII-i)的五个连接基团共价连接的五聚体、能够与式(VIII-i)的六个连接基团共价连接的六聚体、能够与式(VIII-i)的七个连接基团共价连接的七聚体、或能够与式(VIII-i)的八个连接基团共价连接的八聚体。
在特定实施例中，多聚体聚合性交联剂为能够与式(VIII-ii)的两个连接基团共价连接的二聚体、能够与式(VIII-ii)的三个连接基团共价连接的三聚体、能够与式(VIII-ii)的四个连接基团共价连接的四聚体、能够与式(VIII-ii)的五个连接基团共价连接的五聚体、能够与式(VIII-ii)的六个连接基团共价连接的六聚体、能够与式(VIII-ii)的七个连接基团共价连接的七聚体、或能够与式(VIII-ii)的八个连接基团共价连接的八聚体。
在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有小于100MDa、75MDa、50MDa、30MDa、20MDa、15MDa、10MDa、6MDa、5MDa、1MDa、500kDa、250kDa、100kDa、50kDa、30kDa、20kDa、15kDa、10kDa、6kDa、5kDa或1kDa的平均分子量。在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有小于100MDa、75MDa、50MDa、30MDa、20MDa、15MDa、10MDa、6MDa、5MDa或1MDa的平均分子量。在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有小于500kDa、250kDa、100kDa、50kDa、30kDa、20kDa、15kDa、10kDa、6kDa、5kDa或1kDa的平均分子量。
在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有100Da至1kDa、1kDa至30kDa、30kDa至50kDa、50kDa至100kDa、100kDa至250kDa、250kDa至500kDa、500kDa至1MDa、1MDa至5MDa、5MDa至15MDa、15MDa至30MDa、30MDa至50MDa、或50MDa至100MDa的平均分子量。在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有100Da至1kDa、1kDa至30kDa、30kDa至50kDa、50kDa至100kDa、100kDa至250kDa、或250kDa至500kDa的平均分子量。在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有500kDa至1MDa、1MDa至5MDa、5MDa至15MDa、15MDa至30MDa、30MDa至50MDa、或50MDa至100MDa的平均分子量。
在一些实施例中，RZ包括C1-200亚烷基、C2-200亚烯基、C2-200亚炔基、C1-200亚杂烷基、C2-200亚杂烯基或C2-200亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。在一些实施例中，RZ包括任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-200亚杂烷基。在一些实施例中，RZ包括任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-100亚杂烷基。在特定实施例中，RZ为C1-200亚杂烷基，其任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
在一些实施例中，RZ包括聚氨酯、聚脲、聚酰胺、聚环氧烷、聚碳酸酯、聚酯、聚内酯、有机硅聚合物、聚醚砜、聚烯烃、多肽、多糖、聚硅氧烷、聚二甲基硅氧烷、聚乙烯-丁烯、聚异丁烯、聚丁二烯或聚乙烯丁烯链段。例如，多聚体聚合性交联剂可包括选自聚环氧丙烷、聚环氧乙烷和聚环氧丁烷的聚环氧烷链段。
在一些实施例中，RZ进一步包括多肽。在一些实施例中，多肽包括细胞粘附肽(例如，RGD肽(例如，包括SEQ ID NO:1GRGDSPASSKKG的序列的肽))。在一些实施例中，多肽包括可降解肽(例如，MMP肽(例如，包括SEQ ID NO:2SKAGAGPQGIWGQGAGAKSKS的序列的肽))。
本发明的特征在于一种包括任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的水凝胶。在特定实施例中，水凝胶为玻璃体替代物。
本发明的特征进一步在于一种治疗疾患(例如，眼部疾患例如视网膜脱离)的方法，该方法包括将玻璃体替代物玻璃体内注射至有此需要的受试者(例如人受试者)的例如眼睛内。
本发明的特征还在于一种治疗疾患(例如，眼部疾患例如视网膜脱离)的方法，该方法包括将玻璃体替代物关节内注射至有此需要的受试者(例如人受试者)。
本发明的特征进一步在于一种治疗疾患(例如，眼部疾患例如视网膜脱离)的方法，该方法包括将玻璃体替代物注射至有此需要的受试者(例如人受试者)的滑液腔内。
本发明的特征在于一种包括任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)和至少一个细胞的水凝胶细胞培养物。在特定实施例中，水凝胶细胞培养物进一步包括促进生理相关组织的生长的至少一种药剂和/或细胞外基质蛋白(例如，胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白)。水凝胶细胞培养物可以为癌症(例如，乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤癌、肺癌、脑癌、卵巢癌或前列腺癌)的筛选模型。
另一方面，本发明的特征在于一种制备任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的方法，所述方法包括：(i)提供第一组合物，其包含任何前述化合物(例如，式(V)化合物(例如，式(VII)化合物))；(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及(iii)将第一组合物与第二组合物合并以形成混合物。
另一方面，本发明的特征在于一种制备包括任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的水凝胶的方法，所述方法包括：(i)提供第一组合物，其包含任何前述化合物(例如，式(V)化合物(例如，式(VII)化合物))；(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及(iii)将第一组合物与第二组合物合并以形成混合物。
本发明的特征还在于一种形成包括任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的玻璃体替代物的方法，所述方法包括：(i)提供第一组合物，其包含任何前述化合物(例如，式(V)化合物(例如，式(VII)化合物))；(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及(iii)将第一组合物与第二组合物合并以形成混合物，其中该混合物被注射至受试者(例如，罹患视网膜脱离或处于视网膜脱离风险下的受试者，例如人受试者)的眼睛内。
本发明的特征在于一种形成包括任何前述交联聚合物(例如(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)的三维水凝胶的方法，所述方法包括：(i)提供第一组合物，其包含任何前述化合物(例如，式(V)化合物(例如，式(VII)化合物))；(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及(iii)在存在至少一个细胞的情况下将第一组合物与第二组合物合并以形成混合物，其中当将至少一个细胞在三维水凝胶中培养时，该三维水凝胶支持生理相关组织的生长。混合可以在存在促进生理相关组织的生长的至少一种药剂的情况下进行。在特定实施例中，混合在存在细胞外基质蛋白的情况下进行。细胞外基质蛋白为例如胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白或层粘连蛋白。在特定实施例中，细胞为癌细胞(例如，乳腺癌细胞、结肠癌细胞、胰腺癌细胞或淋巴瘤癌细胞)。
在一些实施例中，混合物的浓度为至少0.1wt％(例如，至少0.5wt％、至少1wt％、至少10wt％或至少20wt％)的交联聚合物。在一些实施例中，步骤(iii)在约37℃的温度进行。在一些实施例中，混合物的pH水平小于9.0。在特定实施例中，混合物的pH水平为约6.0至约8.5。在又一些实施例中，混合物的pH水平为约7.0至约8.0。在一些实施例中，混合物的pH水平为约7.4。在一些实施例中，步骤(iii)包括形成包含摩尔比为约5:1至约1:1(例如，约4:1、约3:1或约2:1)的第一组合物和第二组合物的混合物
在特定实施例中，多聚体聚合性交联剂携带两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个或更多个末端氧胺基团。在一些实施例中，任何前述化合物(例如式(V)化合物(例如式(VII)化合物))与硒代两个或更多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂的交联度介于0.01％到1％之间、0.01％到5％之间、0.1％到1％之间、0.01％到5％之间、0.1％到10％之间、0.01％到80％之间、1％到5％之间、10％到50％之间、20％到40％之间、20％到99％之间、50％到99％之间、70％到90％之间、80％到95％之间、90％到99％之间、95％到99％之间、98％到99.5％或99％到99.9％之间。
在一些实施例中，该方法进一步包括：(iv)提供第三组合物，其包含醛改性的透明质酸；以及(v)将混合物与第三组合物合并。
在特定实施例中，步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有在HBS中在约37℃介于1秒到48小时之间、1秒到24小时之间、1秒到30秒之间、10秒到1分钟之间、30秒到5分钟之间、1分钟到30分钟之间、1分钟到1小时之间、30分钟到1小时之间、1小时到24小时之间、1小时到2小时之间、2小时到3小时之间、3小时到5小时之间、5小时到10小时之间、10小时到15小时之间、10小时到24小时之间、15小时到24小时之间、或24小时到48小时之间的胶凝时间。在其他实施例中，交联聚合物在Hank平衡盐溶液(HBS)中在约37℃历经约28天失去至多10％(例如，至多9％、至多8％、至多7％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、或至多0.1％)的质量。在其他实施例中，交联聚合物在HBS中在约37℃历经约28天失去至多25％(例如，至多20％、至多15％、至多10％、至多5％、或至多1％)的质量。
化学术语
应当理解，本文所使用的术语是为了描述特定实施例的目的而不是限制性的。
对于以下任何化学定义，原子符号后面的数字表示存在于特定化学部分中的该元素的原子总数。如将理解的，如本文所述，若必要，可存在其他原子例如氢原子或取代基，以满足原子的化合价。例如，未取代的C2烷基基团具有式-CH2CH3。当与本文定义的基团一起使用时，提及的碳原子数包括缩醛和缩酮基团中的二价碳，但不包括酰基、酯、碳酸酯或氨基甲酸酯基团中的羰基碳。提及环状基团(例如，碳环基、芳基、杂环基或杂芳基)中的原子数，例如碳、氧、氮或硫，仅包括形成环结构的一部分的那些原子。
如本文所用，术语“酰基”表示如本文所定义的通过羰基与母体分子基团连接的氢或烷基基团，并且例如甲酰基(即，羧基醛基)、乙酰基、三氟乙酰基、丙酰基和丁酰基。示例性未取代的酰基包括1至6、1至11、或1至21个碳。
如本文所用，术语“烷基”是指具有1至20个碳原子(例如，1至16个碳原子、1至10个碳原子、或1至6个碳原子)的支链或直链单价饱和脂肪烃基团。亚烷基为二价烷基基团。
如本文所用，单独或与其他基团组合使用的术语“烯基”是指具有碳-碳双键并具有2至20个碳原子(例如，2至16个碳原子、2至10个碳原子、2至6个或2个碳原子)的直链或支链烃残基。亚烯基为二价烯基基团。
如本文所用，单独或与其他基团组合使用的术语“炔基”是指具有碳-碳三键并具有2至20个碳原子(例如，2至16个碳原子、2至10个碳原子、2至6个或2个碳原子)的直链或支链烃残基。亚炔基为二价炔基。
如本文所用，术语“氨基”表示-N(RN1)2，其中每个RN1独立地为H、烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳基、杂环基、–OH、–NO2、–N(RN2)2、–SO2ORN2、–SO2RN2、–SORN2或酰基(例如，乙酰基、三氟乙酰基或本文所述的其他酰基)；或者两个RN1组合以形成亚杂环基，并且其中每个RN2独立地为H、烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳基、杂环基。
如本文所用，术语“氧胺”表示RO1O-NH2，其中RO1为酰基、烷基、烯基、炔基、芳基、碳环基、杂烷基、杂烯基、杂炔基、杂芳基或杂环基。在一个实施例中，RO1为烷基或杂烷基，其中的每一个任选地经一个或多个取代基取代，该取代基包括氧代、卤素(例如，氟)、羟基、烷基、杂烷基(例如，取代的和未取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)或硫代烷氧基)、叠氮基、氰基、硝基、氨基、或巯基。
如本文所用，术语“芳基”是指具有至少一个芳香环的6至12个碳原子的芳族单环或多碳环基团。此类基团的示例包括但不限于苯基、萘基、1,2,3,4-四氢萘基、1,2-二氢萘基、茚满基和1H-茚基。
如本文所用，术语“叠氮基”表示-N3基团。
如本文所用，术语“氰基”表示CN基团。
如本文所用，术语“碳环基”是指具有3至12个碳原子的非-芳族C3-C12单环、双环或三环基团。碳环基结构包括环烷基和不饱和碳环基基团。
如本文所用，术语“环烷基”是指3至12个碳原子，优选3至6个碳原子的饱和、非-芳族、单价的单环或多碳环基团。该术语进一步举例为例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、降冰片基和金刚烷基的基团。
如本文所用，术语“卤素”是指氟(氟代)、氯(氯代)、溴(溴代)或碘(碘代)基团。
如本文所用，术语“杂烷基”是指如本文所定义的烷基基团，其中一个或多个组成性碳原子已被氮、氧或硫替换。杂烷基的示例为“烷氧基”，如本文所用，其是指烷基-O-(例如，甲氧基和乙氧基)；“氨基甲酸酯”，如本文所用，其是指其中RN3为例如H或烷基；和“酰肼”，如本文所用，其是指其中RN4和RN5中的每一个独立地为例如H或烷基。经一个或多个氧代基团取代的杂烷基的示例包括
亚杂烷基为二价杂烷基。
如本文所用，术语“杂烯基”是指如本文所定义的烯基基团，其中一个或多个组成性碳原子已被氮、氧或硫替换。杂烯基的示例为“烯氧基”，如本文所用，其是指烯基-O-。亚杂烯基为二价杂烯基。
如本文所用，术语“杂炔基”是指如本文所定义的炔基，其中一个或多个组成性碳原子已被氮、氧或硫替换。在一些实施例中，杂炔基可进一步被1、2、3或4个如本文针对炔基所述的取代基取代。杂炔基的示例为“炔氧基”，如本文所用，其是指炔基-O-。亚杂炔基为二价杂炔基。
如本文所用，术语“杂芳基”是指具有至少一个芳香环的5至12个原子的芳族单环或多环基团，所述芳环包含一个、两个、三个或四个选自N、O和S的环杂原子，剩余的环原子为C。杂芳基的一个或两个环碳原子可以被羰基替换。杂芳基的示例包括吡啶基、吡唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、咪唑基、噁唑基和噻唑基。
如本文所用，术语“杂环基”表示具有至少一个环的3至12个原子的单环或多环基团，所述环包含一个、两个、三个或四个选自N、O或S的环杂原子，其中没有环是芳族的.杂环基的示例包括吗啉基、硫代吗啉基、呋喃基、哌嗪基、哌啶基、吡喃基、吡咯烷基、四氢吡喃基、四氢呋喃基和1,3-二氧杂环己烷基。亚杂环基为二价杂环基。
如本文所用，术语“羟基”表示-OH基团。
如本文所用，术语“硝基”表示NO2基团。
如本文所用，术语“巯基”表示-SH基团。
烷基、烯基、炔基、杂烷基、杂烯基和杂炔基可以为经取代或未取代的。除非另有说明，否则若为经取代的，通常将存在1至10个(例如，1至4、1至3或1至2个)取代基。取代基包括例如：氧代、卤素(例如氟)、羟基、烷基、杂烷基(例如取代和未取代的烷氧基(例如甲氧基或乙氧基)或硫代烷氧基)、叠氮基、氰基、硝基、氨基或巯基。
定义
在本申请中，除非上下文另有明确说明，否则(i)术语“一”可理解为“至少一个”；(ii)术语“或”可理解为“和/或”；(iii)术语“包含”和“包括”可以理解为包括逐项列出的组分或步骤，无论是单独呈现还是与一个或多个另外的组分或步骤一起呈现。
如本文所用，术语“约”和“大约”是指在所描述的值之上或之下10％以内的值。例如，术语“约5nM”表示4.5至5.5nM的范围。
如本文所用，术语“施用”是指向受试者或系统施用组合物(例如，如本文所述的化合物或包括化合物的制剂)。施用至动物受试者(例如，对人)可以通过任何合适的途径进行。例如，在一些实施例中，施用可以是支气管(包括通过支气管滴注)、颊、肠、皮间、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、瘤内、静脉内、心室内、粘膜、鼻、口腔、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括气管内滴注)、透皮、阴道和玻璃体(例如，作为玻璃体替代物)施用。
如本文所用，术语“交联或取代的程度”是指相对于最初存在于透明质酸聚合物和多聚体聚合性交联剂上的官能团对的总量，转化为交联或接枝键的官能团对的数量，以百分比表示。例如，20％、40％、60％或80％表示，相对于存在于透明质酸聚合物上的总官能团，交联基团的量。
如本文所用，术语“透明质酸聚合物”是指由D-葡糖醛酸或其衍生物和D-氨基葡萄糖(例如，D-N-乙酰氨基葡萄糖)或其衍生物组成的线性杂多糖，它们通过交替的β-1,4和β-1,3糖苷键连接一起，并且允许在一个或多个点共价连接到多聚体聚合性交联剂，及其盐(例如，生理学上可接受的盐)。根据本发明的合适的HA聚合物包括由最多12,500个二糖重复单元组成的多糖，并且取决于来源，大小范围为约500至5,000,000Da，特别是约500至3,000,000Da。每个重复单元在D-葡糖醛酸基序上携带化学基团(例如，甲酸或甲酸根)，其可以潜在地被束缚以形成根据本发明的交联聚合物。根据特定方面，这些化学基团(例如，甲酸或甲酸根)被本发明的多聚体聚合性交联剂取代的程度在约0.01％到1％之间、0.01％到5％之间、0.1％到1％之间、0.01％到5％之间、0.1％到10％之间、1％到5％之间、10％到50％之间、20％到40％之间、20％到99％之间、50％到99％之间、70％到90％之间、80％到95％之间、90％到99％之间、95％到99％之间、98％到99.5％之间、或99％到99.9％之间。-透明质酸聚合物衍生物包括但不限于：(i)与有机和/或无机碱的盐；(ii)透明质酸与脂肪族、芳香族、环状或杂环系列醇的酯，其酯化百分比可根据醇的类型和所用醇的长度而变化(例如和/或如 EP 0216453 B1中所述)；(iii)透明质酸与脂肪族、芳香族、环状或杂环系列胺的酰胺(例如，和/或如 EP 1095064 B1中所述)；(iv)透明质酸的O-硫酸化衍生物(例如，如EP 0702699 B1中所述)或N-硫酸化衍生物(例如，如EP0971961 A1中所述)；(v)透明质酸的内酯(例如和/或如EP 0341745 B1中所述)；(vi)HA的脱酰产物：N-乙酰-氨基葡萄糖级分被脱乙酰化(例如，如EP 1313772 B1中所述)；(vii)从N-乙酰基-氨基葡萄糖级分的伯羟基氧化获得的HA过羧化产物，过羧化程度在0.1％至100％范围内(例如，和/或如 EP 1339753 A1中所述)。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”是指两个或更多个天然或非天然氨基酸残基的任何链，而不管是否经翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。掺入本发明材料的多肽可包括3至50个天然或非天然氨基酸残基(例如，3至15、5至20、或15至50个天然或非天然氨基酸残基)。多肽可以为细胞粘附肽，例如RGD肽。
如本文所用，术语“X-改性的透明质酸”是指包含官能团X的透明质酸衍生物。例如，“酮-改性的透明质酸”是指包含酮取代基的透明质酸衍生物(例如，式(I)化合物)；“氧胺改性的透明质酸”是指含有氧胺取代基的透明质酸衍生物(例如，式(V)化合物)；“醛改性的透明质酸”是指含有醛取代基的透明质酸衍生物(例如，实例3中合成的化合物)。
本文所述的组合物可具有可电离基团，以能够制备为生理上可接受的盐。这些盐可以是涉及无机酸或有机酸的酸加成盐，或者是在本文所述化合物的酸性形式的情况下由无机或有机碱制备而成的盐。通常，化合物可作为制备为生理上可接受的酸或碱的加成产物的生理上可接受的盐来制备或使用。用于制备合适盐的合适的生理上可接受的酸和碱以及方法是本领域众所周知的。盐可以由生理上可接受的无毒酸和碱(包括无机和有机的酸和碱)制备。代表性的酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢溴酸盐、盐酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐和戊酸盐。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙和镁，以及无毒的铵、季铵和胺阳离子盐(包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺和乙胺)。
如本文所用，术语“受试者”是指可以向其施用根据本发明的组合物的任何生物体，例如用于实验、诊断、预防和/或治疗目的。典型的受试者包括任何动物(例如，哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人类)。受试者可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、将在未来接受治疗，或者是在特定疾病或病症的受过训练的专业人员的照料下的人或动物。
如本文所用，术语“治疗”(treat、treated或treating)是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其中目的为预防或减缓(减轻)不希望的生理状况、疾患或疾病(例如，眼部疾患例如视网膜脱离)，或获得有益的或期望的临床结果。有益的或期望的临床结果包括但不限于症状(例如视力下降、视力模糊或眩光)的缓解；病症、疾患或疾病程度的减轻；病症、疾患或疾病状态的稳定(即不恶化)；病症、疾患或疾病进展的延迟或减缓；病症、疾患或疾病状态的改善或缓解(无论是部分的还是总体的)，无论是可检测的还是不可检测的；至少一个可测量的物理参数的改善，患者不一定能够辨别；或病症、疾患或疾病的增强或改善。治疗包括在没有过多副作用的情况下引起临床上显著的应答。
如本文所用，术语“玻璃体液”是指位于晶状体后面眼球中的物质(例如，凝胶)。
本发明的一个或多个实施例的细节在以下描述中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从具体实施方式和权利要求中显而易见。
附图说明
图1说明了用于玻璃体凝胶的聚合物的合成和肟交联物的形成。描述了酮改性和醛改性的透明质酸(分别为HAK和HAA)和聚(乙二醇)四(氧胺)(PEGOA4)的合成方案。HA-酮的合成使用DMTMM进行，将HA与3-(2-甲基-1,3-氧杂环戊烷-2-基)丙烷-1-胺偶联，然后进行酸催化脱保护和中和。HA-醛的合成使用DMTMM进行，将HA与氨基乙醛二甲基乙缩醛偶联，然后进行酸催化脱保护和中和。当将HAK、HAA和PEGOA4混合在一起时，它们会反应形成肟键和水凝胶，一旦将该水凝胶注射至眼睛中，就会使视网膜变平。
图2为说明HAK、HAA和PEGOA4制剂的胶凝时间的图，胶凝时间随着通过流变学测量的HAA重量百分比的增加而缩短(n＝3，平均值+标准偏差，*p<0.05，**p<0.01，单因素方差分析Tukey事后检验)。
图3为说明HA-肟水凝胶在平衡盐水溶液中历经28天的溶胀稳定性的图，如通过相对于初始水凝胶质量的质量变化所测量，溶胀程度很低(对于1.15:0.10，n＝3；对于1.10:0.15，n＝5；对于1.05:0.20，n＝4，平均值±标准偏差)。
图4为说明HA-肟水凝胶(1.05:0.20HAK:HAA)在室温通过23Ga、25Ga和27Ga针的可注射性的图。凝胶可通过23Ga针历时经10分钟和通过25Ga针历时5分钟手动注射(n＝3，平均值±标准偏差)。
图5A和图5B说明了HA-肟水凝胶表面张力的表征。如图5A中所示，在室温用空气对HA-肟和硅油进行的表面张力和接触角测量的代表性图像。图5B为说明HA-肟水凝胶(1.05:0.20HAK:HAA)的表面张力显著高于硅油的图(n＝4，平均值±标准偏差，***p<0.001，学生t检验)。
图6A和图6B说明了酶促降解下的HA-肟水凝胶的透明度。图6A为说明历经10天的用透明质酸酶处理的HA-肟-AF647标记的水凝胶的酶促降解的图，通过在λex＝640nm和λem＝675nm处的荧光测量(n＝5，平均值±标准偏差)。图6B为说明历时10天的用透明质酸酶处理的HA-肟的透明度的图，透明度在λ＝380-740nm之间测量并减去第0天示出的磷酸盐缓冲盐水透明度(n＝3，平均值±标准偏差)。
图7A、图7B、图7C、图7D说明HA-肟水凝胶的体外细胞相容性。如图7A中所示，历经24小时的使用或不使用HA-肟培养，人源性RPE-CA1细胞的活力均得以维持，通过使用Imaris的活/死染色定量(n＝3个生物学重复，平均值±标准偏差，p＝0.23，学生t检验)。如图7B中所示，培养24小时后用钙黄绿素AM(活)和溴乙啡锭二聚体(死)染色的RPE-CA1细胞的活/死图像。比例尺表示50μm。如图7C中所示，为历经96小时的使用或不使用HA-肟培养的小鼠cod细胞的活力，通过使用Imaris的活/死染色定量(n＝3个生物学重复，平均值±标准偏差，p＝0.84，学生t检验)。如图7D中所示，培养4天后用钙黄绿素AM(活)、溴乙啡锭二聚体(死)和Hoechst 33342(细胞核)染色的cod细胞的活/死图像。比例尺表示200μm。
图8A和图8B示出了说明来自小鼠视网膜外植体的死亡视杆细胞(7-AAD)的百分比的图(图8A)和说明发生细胞凋亡的细胞(膜联蛋白V)的图(图8B)，在第7天通过流式细胞术定量(n>3，平均值+标准偏差，单因素方差分析Tukey事后检验)。
图9为说明来自HAK、HAA和PEGOA4聚合物的内毒素的定量的图。相对于未处理的聚合物，计算用γ相氧化铝处理的不同批次聚合物的内毒素浓度(n＝3-5，平均值±标准偏差)。
图10A和图10B说明了荧光标记的HA-肟凝胶的表征和在玻璃体腔内的存在。图10A说明了Alexa Fluor 647标记的HAK在环境光下历时28天的荧光稳定性，通过在λex＝640nm和λem＝675nm处的荧光测量(n＝3，平均值±标准偏差)。使用和不使用0.25wt％AlexaFluor 647标记的HA制备的HA-肟-AF647和HA-肟样品在紫外光下的图像。图10B说明了在玻璃体切除术并且注射荧光标记的HA-肟-AF647存在或以液体形式的硅油填充空腔之后冷冻切片的兔眼。
图11A、图11B和图11C说明了在兔眼中解剖的HA-肟水凝胶的稳定性。图11A为说明HA-肟水凝胶在体内的建模稳定性的图，使用非线性拟合单相衰减和最小二乘拟合从荧光数据计算的半衰期为43天。图11B说明了用透明质酸酶消化的从兔眼解剖的水凝胶在λex＝640nm和λem＝675nm处测量并相对于第1天归一化的荧光(对于第1天，n＝3；对于第14和28天，n＝5；对于第56天，n＝7；平均值±标准偏差，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001，单因素方差分析Tukey事后检验)。从眼睛中收集水凝胶以确定相对于第1天归一化的样品质量(对于第1天，n＝4；对于第14天和第28天，n＝5；对于第56天，n＝6；平均值±标准偏差，*p<0.05、**p<0.01和***p<0.001，单因素方差分析Tukey事后检验)(图11C)。
图12A、图12B和图12C说明了用H+E染色的兔的内核层和外核层的组织学分析。图12A说明了在注射HA-肟水凝胶后7天、28天和56天后或在注射硅油后7天和28天后以及在灌注平衡盐水进行假手术后7天后用苏木精和伊红(H&E)染色的视网膜的代表性切片(比例尺表示100μm)。图12B和图12C示出了说明通过在注射HA-肟、硅油或假手术后第7、28和56天的细胞核数对兔核内层(图12B)和外核层(图12C)视网膜厚度进行定量的图(对于HA-肟和假手术组第7天，n＝7；对于硅油组第7天，n＝4；对于HA-肟组第28天，n＝4；对于硅油组第28天，n＝6；对于HA-肟组第56天，n＝6，平均值±标准偏差，p＝0.855(INL)和p＝0.034，(ONL)单因素方差分析Tukey事后检验)。
图13为说明注射HA-肟的兔的眼压历时56天保持在针对新西兰白兔报告的正常范围内的图(n＝6，平均值±标准偏差，对于非零斜率的线性回归分析，p＝0.780)。
图14A和图14B示出了在兔眼中用HA-肟修复视网膜脱离。如图14A中所示，在诱导视网膜脱离和水凝胶注射后7天，来自用H&E染色的兔眼的组织学切片的重建。视网膜脱离后兔视网膜的放大组织学横截面，比例尺表示200μm。如图14B中所示，注射HA-肟水凝胶后7天时内核层和外核层(INL和ONL)厚度的定量。
图15A、图15B、图15C说明了用H+E染色的兔的内核层和外核层的组织学分析。图15A说明了在注射含有0.4M蔗糖的HA-肟水凝胶后7天和28天后用苏木精和伊红(H&E)染色的视网膜的代表性切片，如图15B和图15C中所示，通过在注射含有0.4M蔗糖的HA-肟后第7天和第28天的细胞核数对兔内核层(图15B)和外核层(图15C)视网膜厚度进行定量(对于含有0.4M蔗糖的HA-肟组第7天，n＝3；对于在诱导视网膜脱离后注射含有0.4M蔗糖的HA-肟组第7天，n＝2；对于含0.4M蔗糖的HA-肟组第28天，n＝4；平均值±标准偏差)。
图16为说明进行假手术、注射HA-肟或注射含有0.4M蔗糖的HA-肟的兔历时28天的眼压的图(n＝3，平均值±标准偏差)。
图17A、图17B、图17C、图17D、图17E和图17F说明了HA-肟水凝胶的合成以在体外对乳腺癌建模，以及HA-肟水凝胶在体外对乳腺癌建模的表征。图17A示出了总体目标为，以体内生长的那些细胞为基准，将在我们的新型HA-肟水凝胶中体外培养的细胞的基因表达谱相对于在基质胶(Matrigel)或2D组织培养聚苯乙烯(TCPS)中的常规培养物进行基准测试。这种方法使我们能够鉴定可以在药物筛选分析中作为靶标的途径。图17B中的说明示出了包含HA-酮(HAK)、HA-醛(HAA)和聚(乙二醇)-四氧胺(PEGOA4)并且在存在层粘连蛋白和乳腺癌细胞的情况下形成的HA-肟交联水凝胶，其导致细胞均匀分布。图17C示出了封装的MDA-MB-468细胞在24小时后在HA-肟水凝胶中的分布：在HAK交联凝胶中，由于凝胶缓慢，细胞聚集在孔底部；而在HAK:HAA(3:1质量比)中，细胞均匀分布。用钙黄绿素AM(活)和溴乙啡锭二聚体-1(死)染色细胞以进行活力分析；比例尺200μm(n＝3个独立实验，绘制了平均值+s.d.，***p<0.001，单因素方差分析，Tukey事后检验)。图17D示出了与PEGOA4交联的HA-肟水凝胶的胶凝时间(n＝3，平均值+s.d.，***p<0.001，单因素方差分析，Tukey事后检验)。图17E示出了与生长因子减少的基质胶相比，HA-肟水凝胶的压缩模量(n＝4，绘制了平均值+s.d.，*p<0.05；**p<0.01，单因素方差分析，Tukey事后检验)。阴影区域表示文献中报导的小鼠肿瘤的硬度范围(Paszek等人，Cancer cell,8:241(2005))。图17F示出了由3:1HA-酮(0.90wt％)和HA-醛(0.30wt％)与PEGOA4(1.04wt％)交联制备的HA-肟水凝胶在37℃在Hank平衡盐水溶液(HBSS)中并且在存在胶原酶的情况下历经28天稳定，但在存在透明质酸酶的情况下降解。剩余水凝胶的百分比由质量测量值确定(n＝3，绘制了平均值+s.d.)。
图18说明了增加DMTMM的当量对透明质酸的缩酮取代程度的影响(n＝3个独立样品，绘制了平均值+标准偏差，*p<0.05，单因素方差分析，Tukey事后检验)。
图19说明了醛取代的透明质酸(HAA)和4臂聚(乙二醇)四(氧胺)(PEGOA4)的合成。HAA的合成分两步进行：用氨基乙醛二甲基乙缩醛对HA进行酰胺化，然后用酸水溶液处理HA-缩醛48小时以生成HAA。PEGOA4的合成分两步进行：首先用N-Boc-氧胺乙酸对PEG四(胺)进行酰胺化，然后在酸水溶液中脱保护24小时以生成PEGOA4。
图20A、图20B和图20C说明l HA-肟水凝胶的溶胀稳定性。图20A示出了与80mol％PEGOA2交联的HAK/HAA或HA/HAA水凝胶历时28天的稳定性(n＝3个独立样品，数据表示平均值+标准偏差，溶胀斜率HAK/HAA的线性回归分析不显著偏离零斜率，p＝0.089；而HA/HAA显著偏离零斜率，p<0.0001)。图20B和图20C示出了由1.20wt％HAK、0.15wt％HAA和交联的2臂或4臂氧胺改性的PEG制备的HA-肟水凝胶的溶胀。特别地，图20B使用60mol％交联剂(即1.40wt％PEGOA2或1.09wt％PEGOA4)(n＝4个独立样品，绘制了平均值±标准偏差，在第0天之后的每一天**p<0.01，单因素方差分析，Tukey事后检验)。图20C使用80mol％交联剂(即1.86wt％PEGOA2或1.45wt％PEGOA4)(n＝4个独立样品，绘制了平均值±标准偏差，在第0天之后的每一天*p<0.05，单因素方差分析，Tukey事后检验)。
图21A、图21B、图21C、图21D、图21E和图21F说明了水凝胶的流变学。图21A、图21B和图21C说明了1.20wt％HA-肟水凝胶在37℃的流变学。图21A、图21B和图21C为1.20wt％HAK水凝胶与PEGOA4以0.60摩尔羟胺与酮的比率交联代表性图。图21A为时间扫描。图21B为频率扫描。图21C为应变扫描。图21D、图21E和图21F说明了1.20wt％HAK:HAA水凝胶与PEGOA4以0.60摩尔羟胺与酮+醛的比率交联代表性图。图21D、图21E和图21F为以下HAK:HAA比率的HA-肟水凝胶的时间扫描流变图的代表性图：7:1(图21D)、3:1(图21E)和1:1(图21F)。n＝3个独立样品，数据表示平均值+标准偏差。
图22A、图22B和图22C说明了在培养24小时后，随着HAA重量百分比的增加，MDA-MB-468细胞在HA-肟水凝胶中的分布和活力。图22A示出了封装在HA-肟水凝胶中的细胞沿z轴的分布。使用来自Bitplane的Imaris对分布进行定量(n＝3项独立研究；绘制了平均值+标准偏差，*p<0.05，单因素方差分析，Tukey事后检验)。图22B说明了封装在HA-肟水凝胶中24小时后细胞的活力，使用钙黄绿素AM和溴乙啡锭二聚体-1使用来自Bitplane的Imaris进行定量(n＝3个独立研究，绘制了平均值+标准偏差，*p<0.05，通过单因素方差分析Tukey事后检验确定无显著性(ns))。图22C示出了作为单细胞封装在HA-肟、基质胶和HyStem-C水凝胶中14天后，MDA-MB-468球状体沿z轴的分布，示出在HA-肟中的分布比在基质胶和HyStem-C中更为均匀。使用来自Bitplane的Imaris对分布进行高能量(n＝3项独立研究，绘制了平均值+标准偏差，*p<0.05，单因素方差分析，Tukey事后检验)。
图23说明了用HAK、HAA和PEGOA4制备的HA-肟水凝胶的压缩模量(n＝3-4个独立样品，数据表示平均值+标准偏差，*p<0.05；***p<0.001，单因素方差分析，Tukey事后检验)。
图24为说明与PEGOA4交联的HAK/HAA水凝胶的氧胺定量的方案，其中氧胺与醛和酮的比率为0.60。胶凝后，水凝胶用新戊醛淬灭并降解用于1H NMR分析。使用新戊醛通过1HNMR计算HA-肟水凝胶的交联效率(n＝3个独立样品，绘制了平均值+标准偏差，单因素方差分析Tukey事后检验确定无显著性(ns))。
图25A和图25B说明了层粘连蛋白在HA-肟水凝胶中的影响。图25A示出了7天后通过ELISA定量的与PEGOA4交联的HA-肟水凝胶中保留的Ln的量，在向HA-肟-Ln水凝胶添加PBS后24小时未从上清液中检测到Ln(nd)(n＝3个独立样品；绘制了平均值+标准偏差，无显著差异(ns)，**p<0.01，单因素方差分析，Tukey事后检验)。图25B显示了与含有Ln的与PEGOA4交联的HA-肟凝胶上的乳腺癌细胞数量与基质胶上的那些相比的倍数变化(n＝3项独立研究；绘制了平均值+标准偏差，*p<0.05；单因素方差分析，Tukey事后检验)。
图26A、图26B、图26C、图26D、图26E、图26F、图26G和图26H示出了封装在HA-肟水凝胶中的MDA-MB-468细胞在21天后的代表性免疫细胞化学图像(50μm比例尺)，对细胞核(用Hoechst)和肌动蛋白(用鬼笔环肽与F-肌动蛋白结合)染色(图26A和图26B)；对E-钙粘素染色(图26C和图26D)；对CD44染色(图26E和图26F)；以及对β1整联蛋白和HIF-1α染色(图26G和图26H)。
图27A、图27B、图27C、图27D、图27E、图27F和图27G说明了层粘连蛋白-1(Ln)掺入HA-肟水凝胶中的表征以及对细胞分布和球状体生长的影响。图27A示出了具有和不具有75μg·mL-1Ln的HA-肟水凝胶的压缩模量(对于HA-肟独立研究，n＝4；对于HA-肟-Ln独立研究，n＝3；绘制了平均值+标准偏差，学生t检验确定没有显著性(ns))。图27B和图27C表示24小时后封装并分布在生长因子减少的基质胶和HA-肟-Ln中的MDA-MB-468细胞。细胞用钙黄绿素AM(活)、溴乙啡锭二聚体-1(死)染色，使用来自Bitplane的Imaris对z堆栈图像进行3D重建。比例尺表示200μm。图27D示出了封装在基质胶或HA-肟-Ln水凝胶中的MDA-MB-468细胞沿z轴的分布。使用来自Bitplane的Imaris对分布进行定量(n＝3项独立研究；绘制了平均值+标准偏差，*p<0.05，单因素方差分析，Tukey事后检验)。图27E示出了封装在HA-肟+/-Ln和基质胶中的BT474球体的代表性明场图像。使用96孔板格式的GelCount仪器在细胞培养10天后捕获图像。图27F和图27G示出了在封装在HA-肟+/-Ln和基质胶中培养10天后，每孔中BT474球体的平均直径和数量。n＝3项独立研究；绘制了平均值+标准偏差，通过单因素方差分析Tukey事后检验确定无显著性(ns)。
图28A、图28B、图28C和图28D为在HA-肟水凝胶中培养21天的MDA-MB-468细胞的代表性免疫细胞化学共聚焦图像(50μm比例尺)。图28A示出了针对CD44、细胞核和F-肌动蛋白染色的癌球体。图28B示出了针对E-钙粘素、细胞核和F-肌动蛋白染色的癌球体。图28C示出了针对β1整联蛋白、细胞核和F-肌动蛋白染色的癌球体。图28D示出了针对HIF-1α、细胞核和F-肌动蛋白染色的癌球体。比例尺表50μm，图像用40x物镜采集。
图29详述在HA-肟+/-Ln中、在基质胶中和在TCPS上培养21天后，乳腺癌细胞表型的代表性图像。图像(a)-(d)为MCF7细胞。图像(e)-(h)为T47D细胞。图像(i)-(l)为BT474细胞。图像(m)-(p)为MDA-MB-468细胞。图像(q)-(t)为用DAPI和鬼笔环肽(F-肌动蛋白)染色的MDA-MB-231-H2N细胞。使用来自Olympus的Fluoview拍摄压缩的z堆栈图像。比例尺表示100μm。
图30A和图30B说明了在培养24小时后用MitoTracker和Sytox可视化的在2D TCPS上生长或包埋在基质胶、HA-肟或HA-肟-Ln水凝胶中的原代管腔乳腺癌细胞的活力(图30A)。使用来自Bitplane的Imaris对活力进行定量(n＝3个独立实验；绘制了平均值+标准偏差，单因素方差分析Tukey事后检验确认没有显著差异(ns))。图30B示出了在2D TCPS上、在基质胶、HA-肟和HA-肟-Ln中培养的管腔癌细胞的细胞生长，用RealTime-Glo MT测量(n＝3次技术重复；绘制了平均值+标准偏差，*p<0.05，单因素方差分析，Tukey事后检验)。
图31A、图31B、图31C、图31D和图31E说明了注射至NOD scidγ小鼠的乳腺脂肪垫中的乳腺癌细胞系的肿瘤生长曲线(n＝6只动物，绘制了平均值+标准偏差)。图31A示出了MCF7；图31B示出了T47D；图31C示出了BT474；图31D示出了MDA-MB-231H2N；并且图31E示出了MDA-MB-468。
图32A、图32B、图32C、图32D和图32E说明了相对于小鼠异种移植物，在2D TCPS上、在基质胶、HA-肟+/-Ln中培养21天后的乳腺癌细胞的基因表达。该图说明了MCF7、T47D、BT474、MDA-MB-231-H2N和MDA-MB-468的qPCR。n＝生物学重复；绘制了平均值+标准偏差，*p<0.05，**p<0.01单因素方差分析，Tukey事后检验。图32A说明了MCF7的qPCR；图32B说明了T47D的qPCR；图32C说明了BT474的qPCR；图32D说明了MDA-MB-231-H2N的qPCR；并且图32E说明了MDA-MB-468的qPCR。
图33A和图33B说明了患者来源的和5种不同的乳腺癌细胞系在HA-肟+/-Ln与基质胶和2D TCPS中的评价。图33A示出了第7天相对于第1天的细胞生长(n＝3；绘制了平均值+s.d.，*p<0.05，单因素方差分析，Tukey事后检验)。图33B示出了包埋在HA-肟、HA-肟-Ln或基质胶中的细胞再培养21天后的肿瘤球体直径(n＝3；绘制了平均值+sd，*p<0.05，单因素方差分析，Tukey事后检验)。在2D TCPS上没有形成球体。
图34说明了在用Maritoclax(Mcl-1)治疗7天后，在2D TCPS上或在3D中用Matrigel或HA-肟培养超过72小时的肿瘤来源的乳腺管腔上皮细胞的剂量应答曲线。所有筛选均通过RealTime-Glo MT细胞活力测定法进行定量(n＝3项独立研究；平均值+标准偏差，以最佳拟合曲线绘制)。
图35A和图35B说明了MDA-MB-468细胞对厄洛替尼(EGFR抑制剂)敏感性的比较。图35A为剂量应答曲线，且图35B示出了当在2D TCPS上或在3D中用基质胶、HA-肟+/-Ln培养时，在用厄洛替尼治疗7天后的MDA-MB-468细胞的IC50值，通过PrestoBlue细胞活力试剂定量。计算了IC50值，并显示在2D培养物和3D培养物之间存在显著差异(n＝3项独立研究；绘制了平均值±标准差，**p<0.01，单因素方差分析，Tukey事后检验)。
图36A和图36B说明了MDA-MB-468细胞对RGDOA肽的粘附和对固定的RGDOA肽的定量。图36A示出了粘附到含有RGDOA的与PEGOA4交联的HA-肟凝胶的MDA-MB-468细胞数量的倍数变化。n＝3项独立研究；绘制了平均值+标准偏差，*p<0.05；**p<0.01，单因素方差分析，Tukey事后检验。图36B示出了在缀合1小时或24小时后固定到与PEGOA4交联的HA-肟水凝胶的RGDOA的量。RGDOA浓度通过氨基酸分析使用精氨酸和丙氨酸峰来定量。N＝3个独立样品，数据表示平均值+标准差，**p<0.01，单因素方差分析，Tukey事后检验。
图37说明了由0.90wt％HA-酮和0.30wt％HA-醛与60mol％MMPOA2交联制备的HA-肟水凝胶在37℃在含有透明质酸酶或胶原酶的Hank平衡盐溶液中历经28天的溶胀和降解。
图38说明了通过在D2O中进行的1H NMR表征HAKA。
图39说明了通过在D2O中进行的1H NMR表征HANK。
图40A、图40B说明了通过33号针将3滑液腔μL水凝胶注射至膝关节中，将具有Alexa Fluor-647的HA-肟凝胶注射至12周雄性C57BL6/J小鼠的中。图40B示出了来自IVISSpectrum体内成像系统的定量荧光(n＝2，平均值±标准偏差)。
图41为说明封装在HA Soft中的A549肺癌细胞在通过27号针头注射后的存活率比在基质胶中更高的图，两者都类似于从活图像和死图像定量的未注射细胞(n＝3-6次重复，平均±标准偏差，不显著(ns)，*p<0.05单因素方差分析，Tukey事后检验)。
图42说明了HA-肟作为可注射水凝胶用于细胞移植的用途。用水凝胶植入NODscid小鼠体内的DCBXTO.58细胞的肿瘤生长曲线(n＝5，平均值+标准偏差)。
图43说明了通过在D2O中进行的1H NMR表征HAC。
具体实施方式
本公开的特征在于携带酮基团的透明质酸聚合物衍生物及其在合成可用于治疗疾病(例如，视网膜脱离)或用于筛选模型(例如，3D细胞培养系统)中的交联聚合物(例如，水凝胶)中的用途。本发明的特征在于水凝胶前体组合物(例如，式(I)或(III)化合物的溶液或式(V)或(VII)化合物的溶液)和携带一个、两个、三个、四个或更多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂，将它们合并以形成交联聚合物(例如，(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(IV-i)或式(IV-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物；或(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物)，所述交联聚合物可用作玻璃体替代物或用于形成三维水凝胶，当在该三维水凝胶中或上培养至少一个细胞时，该三维水凝胶支持生理相关组织的生长。透明质酸(Hyaluronan)或透明质酸(Hyaluronic Acid(HA))
透明质酸(hyaluronan或hyaluronic acid(HA))是一种非硫酸化的糖胺聚糖，由D-葡糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖组成。如上所述，本文所用的透明质酸的D-葡糖醛酸和D-N-乙酰氨基葡萄糖的糖主链的碳原子编号如图表1所述。
图表1
酮改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有酮的部分(例如，如上所述的K)通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C6上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
酮改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有酮部分(例如，如上所述的K)通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C3上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
酮改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有酮部分(例如，如上所述的K)通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C2上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
酮改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有酮部分(例如，如上所述的K)通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C8上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
酮改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有酮的部分(例如，如上所述的K)通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C12上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
酮改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有酮的部分(例如，如上所述的K)通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C10上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
类似地，氧胺改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有氧胺的部分(例如，如上所述的OA)通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C6上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
氧胺改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有氧胺的部分(例如，如上所述的OA)通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C3上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
氧胺改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有氧胺的部分(例如，如上所述的OA)通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C2上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
氧胺改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有氧胺的部分(例如，如上所述的OA)通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C8上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
氧胺改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有氧胺的部分(例如，如上所述的OA)通过D-N-乙酰氨基葡萄糖或其衍生物的C12上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
氧胺改性的透明质酸聚合物的示例如下所示，其中含有氧胺的部分(例如，如上所述的OA)通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C10上的取代基与透明质酸聚合物共价连接：
透明质酸衍生物包括但不限于，与有机和/或无机碱的盐；外酯衍生物(例如，与HA和醇形成)；内酯衍生物；酰胺衍生物(例如，与HA和胺形成)；O-硫酸化衍生物；N-硫酸化衍生物；脱乙酰衍生物(例如，包括D-氨基葡萄糖的HA)、过羧基化衍生物；还原型衍生品；和/或醚衍生物。例如，透明质酸的醚衍生物可以通过威廉姆森醚合成法合成。
酮改性的透明质酸(HA-酮或HAK)
本发明的水凝胶由含有式(I)的酮改性的透明质酸聚合物的前体溶液形成：
HAP-K
(I)，
其中HAP为透明质酸聚合物；并且K为与透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Ia)或式(Ib)的结构：
其中RX和R1如上文所定义。酮改性的透明质酸聚合物可以如实例1中所述制备。
透明质酸聚合物的任何合适的形式或衍生物均可用于形成酮改性的透明质酸聚合物。在一些实施例中，酮改性的透明质酸聚合物由可溶形式的分离的透明质酸形成。在一些实施例中，透明质酸聚合物具有约20kDa至400kDa、20kDa至100kDa、20kDa至200kDa、50kDa至200kDa、50kDa至400kDa、100kDa至150kDa、100kDa至400kDa、150kDa至300kDa、150kDa至400kDa、250kDa至1000kDa、500kDa至1500kDa、1000kDa至2000kDa、1000kDa至3000kDa、或2000kDa至3000kDa的分子量。在优选的实施例中，透明质酸聚合物具有约100至150kDa或150kDa至300kDa的分子量。
酮改性的透明质酸聚合物的示例包括式(III)化合物：
[A]m[B]n[C]1-(m+n)
(III)，
其中[A]具有式(IIIa)的结构：
其中RA1、RA2、RA3、RA4、RA5和RA6如上文所定义；并且K为与透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Ia)或式(Ib)的结构：
其中RX和R1如上文所定义；
[B]具有式(IIIb)的结构：
其中BB1、RB3、RB4、RB5、RB6、RB2、RB7、Y1和Z1如上文所述；
[C]具有式(IIIc)的结构：
其中RC1、RC2、RC3、RC4、RC5、RC6和Ma如上文所述；并且
m和n中的每一个独立地为大于零且小于1的分数，其中(m+n)<1。
[A]的示例包括式(A1)的结构：
[B]的示例包括式(B1)的结构和式(B2)的结构：
其中RB2如上文所定义。
[C]的示例包括式(C1)的结构和式(C2)的结构：
其中RC2如上文所述。
氧胺改性的透明质酸(HA-氧胺或HA-OA)
本发明的水凝胶还可以由含有式(V)的氧胺改性的透明质酸聚合物的前体溶液形成：
HAP-OA
(V)，
其中HAP为透明质酸聚合物；并且OA为与透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Va)的结构：
其中RW和R3如上文所定义。氧胺改性的透明质酸聚合物可以如实例10中所述制备。
透明质酸聚合物的任何合适的形式或衍生物均可用于形成氧胺改性的透明质酸聚合物。在一些实施例中，氧胺改性的透明质酸聚合物由可溶形式的分离的透明质酸形成。在一些实施例中，透明质酸聚合物具有约20kDa至400kDa、20kDa至100kDa、20kDa至200kDa、50kDa至200kDa、50kDa至400kDa、100kDa至150kDa、100kDa至400kDa、150kDa至300kDa、150kDa至400kDa、250kDa至1000kDa、500kDa至1500kDa、1000kDa至2000kDa、1000kDa至3000kDa、或2000kDa至3000kDa的分子量。在优选的实施例中，透明质酸聚合物具有约100至150kDa或150kDa至300kDa的分子量。
氧胺改性的透明质酸聚合物的示例包括式(VII)化合物：
[D]q[E]r[F]1-(q+r)
(VII)，
其中[D]具有式(VIIa)的结构：
其中RD1、RD2、RD3、RD4、RD5和RD6如上文所述；并且OA为与透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Va)的结构：
其中RW和R3如上文所述；
[E]具有式(VIIb)的结构：
其中RE1、RE2、RE3、RE4、RE5、RE2、RE7、Y2和Z2如上文所述；
[F]具有式(VIIc)的结构：
其中RF1、RF2、RF3、RF4、RF5、RF6和Mb如上文所述；并且q和r中的每一个独立地为大于零且小于1的分数，其中(q+r)<1。
[D]的示例包括式(D1)的结构：
其中s和R3如上文所定义。
[E]的示例包括式(E1)的结构和式(E2)的结构：
其中RE2如上文所述。
[F]的示例包括式(F1)的结构和式(F2)的结构：
其中RF2如上文所述。
多聚体聚合性交联剂
本发明的水凝胶也由含有携带两个或更多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂的前体溶液形成。这种多聚体交联剂可以使用实例4中描述的方案由聚胺制备。在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂具有小于30kDa、20kDa、15kDa或10kDa的平均分子量。
在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂通过式(IV-i)或式(IV-ii)的至少一个连接基团与透明质酸聚合物缀合：
其中RX、R1和RY如上文所定义。
用于形成本发明的交联聚合物的多聚体聚合性交联剂可具有通式：
其中为与部分RY-T共价连接的多聚体或聚合性核心；RY如上文所述；T为末端基团-ONH2；并且t为1至8的整数。在特定实施例中，为C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C2-6杂烯基、C2-6杂炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、C2-9杂环基或C2-9杂芳基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
可以为具有例如以下结构的多聚体或聚合性核心：
Q的示例包括但不限于C1-6烷基、 其中u为1至12的整数。
在特定实施例中，用于形成式(IV-i)或式(IV-ii)的交联聚合物的多聚体聚合性交联剂具有式(IVa)的结构：
其中a为介于1到90之间的整数(例如，6到40之间、10到40之间、15到40之间、6到60之间、或20到60之间)。在一些实施例中，a为约29。在其他实施例中，a为约54。
在又一些实施例中，用于形成式(IV-i)或式(IV-ii)的交联聚合物的多聚体聚合性交联剂具有式(IVb)的结构：
其中b为介于1到90之间的整数(例如，6到40之间、10到40之间、15到40之间、6到60之间)。在一些实施例中，b为约75。
在一些实施例中，多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团与透明质酸聚合物缀合：
其中RZ、R4和RW如上文所定义。
水凝胶形成
本发明的交联聚合物可以通过将式(I)或(II)化合物(例如，酮改性的透明质酸聚合物)与携带两个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂混合来制备。如实例6和7中所述，所得水凝胶可具有所需的生物物理特性(例如，密度)，该特性允许将前体组合物混合以用作(i)玻璃体替代物(例如，玻璃体水凝胶)，或(ii)三维水凝胶，其在将至少一个细胞在该三维水凝胶中培养时支持生理相关组织的生长。水凝胶前体溶液包括至少两种水凝胶前体组分，该组分溶解在水性介质中以形成水凝胶前体溶液，该水凝胶前体溶液用作玻璃体替代物或用于形成支持生理相关组织的生长的三维水凝胶，其中该水凝胶至少包括：(i)包含酮改性的透明质酸(HAK)的水凝胶前体；和(ii)与多聚体聚合性交联剂的肟键。任选地，前体溶液中的一者或两者包括另外的试剂、添加剂、缓冲液或盐(例如，以支持细胞生长或改善生物相容性(例如，用于细胞生长的营养物))以产生具有所需特性和/或功能的水凝胶。在一些实施例中，水凝胶进一步包括细胞外基质蛋白(例如，胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白和层粘连蛋白)。在特定实施例中，细胞外基质蛋白被可逆或不可逆地化学固定(例如，通过(例如，在蛋白质上的胺与HAK上的酮取代基之间)形成席夫碱)。
任何合适的水性介质均可用作水凝胶前体溶液的溶剂。在一些实施例中，水性介质包含水。在一些实施例中，水性介质包含盐水(例如，磷酸盐缓冲盐水(PBS)或Hank平衡盐(HBS)溶液)。在一些实施例中，水性培养基包含细胞培养基。应当理解，本文所述的任何培养基都可以用作细胞培养基。其他合适的介质对技术人员来说是显而易见的。在一些实施例中，水性介质包含糖溶液。在一些实施例中，水性介质包含溶剂(例如，DMSO)。
水凝胶前体组合物(例如，溶液)可以用不同浓度的组分(例如，酮改性的透明质酸、醛改性的透明质酸或聚合物交联剂(例如，聚(乙二醇)四(氧胺)))配制。在优选的实施例中，透明质酸聚合物(例如，酮改性的透明质酸、醛改性的透明质酸或其混合物)与交联剂的比率为40％至60％。水凝胶前体组合物(例如，溶液)可以进一步包括添加细胞外基质蛋白(例如，胶原蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、层粘连蛋白或其混合物)的溶液。
玻璃体替代物
玻璃体液是一种透明的凝胶状物质，由胶原蛋白(II、V/XI和IX型)和透明质酸组成，占据晶状体和视网膜之间的空间。随着眼睛年龄的增长，玻璃体经历了从凝胶状物质到流体状物质的转变。因此，需要更好的水凝胶组合物用作玻璃体替代物，例如，用于治疗视网膜脱离以改善受此类病症折磨的人的生活质量。本公开涉及水凝胶组合物及其用途，例如作为玻璃体替代物用于治疗疾患，例如视网膜脱离。
视网膜脱离是一种眼睛中的视网膜从其底层支持组织剥离的疾患。视网膜脱离是视力丧失的一个重要原因，在美国的发病率约为每100,000人中12人，每年约进行38,000次手术。在视网膜脱离的严重病例中，患者必须接受平坦部玻璃体切除术以去除眼内的玻璃体并用眼内填塞物代替以重新贴附视网膜。最常见的填塞物为气体和油。气体填塞物需要在下方脱离的情况下面朝下放置，并被吸收。相比之下，油替代品(例如硅油)不降解，必须通过另外的手术去除。天然生物材料例如透明质酸和胶原蛋白已被探索作为玻璃体替代品，但据我们所知，由于生物材料缺乏稳定性，迄今为止的所有研究都显示其适用性有限。
最初的脱离可能是局部的或广泛的，但如果不迅速治疗，整个视网膜可能会脱离，导致视力受损和失明。在严重的情况下，要重新贴附视网膜，患者必须先进行平坦部玻璃体切除术，然后进行激光光凝术或冷凝术以重新贴附视网膜，最后用填塞物填充玻璃体腔。目前使用的最常见的填塞物为气体、全氟化碳液体和硅油。
目前使用的最常见的填塞物为只能暂时使用的气体、全氟化碳液体和硅油，并且它们具有明显的缺点。气体填塞物可能限制患者的空中旅行，并且在下方脱离的情况下需要面朝下放置，但具有被自发吸收的优点。这导致了它们的开发程度比液体替代品更高，液体替代品不降解，可能导致高眼压，并且通常需要通过另外的手术去除。理想的玻璃体替代物将能够长时间留在眼睛中，经历降解以避免手术切除，并且将具有生物相容性。
合成聚合物例如聚(甲基丙烯酰胺)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(乙二醇)或聚(乙烯醇)都已被配制成水凝胶来治疗视网膜脱离。(Hayashi等人，Fast-forming hydrogel withultralow polymeric content as an artificial vitreous body.Nature BiomedicalEngineering,1:0044(2017)；Liang等人，Synthesis and characterization of in situforming anionic hydrogel as vitreous substitutes.Journal of biomedicalmaterials research Part B,Applied biomaterials,105:977-88(2017))。通常，这些玻璃体替代物使用小分子来交联聚合物，需要潜在有害的紫外线或使用在存在空气的情况下不稳定的官能团。然而，这些可能太稳定，已经导致8.5％的用MIRAgel(共聚(丙烯酸甲酯-丙烯酸2-羟基乙酯))治疗的患者在7-11年后出现归因于引起水凝胶变形溶胀的水解的并发症，必须去除。在聚(烷基酰亚胺)水凝胶的情况下，发现会引起严重的视网膜损伤。
天然生物材料例如透明质酸(HA)和胶原蛋白具有被降解的能力并已经被探索作为替代性的视网膜填塞物，但通常需要化学交联以避免清除。迄今为止的参考文献显示，天然生物材料的稳定性有限并且密度通常低于水，如表1中所总结(Su等人，Biomacromolecules,16:3093-102(2015)；Schnichels等人，PloS one.12:e0172895(2017)；Schramm等人，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.53:613-21(2012)；Pruett等人，Archives of Opthalmology,88:540-3(1972))。
表1.在兔模型中用作玻璃体替代物的水凝胶组合物。
*透明质酸(HA)、胶原蛋白(COL)。
1报告的稳定性为半衰期。
2研究持续时间为28天。
3研究持续时间为21天。
4研究持续时间为84天.
如实例6中所述，肟点击化学用于产生pH值7-7.4的具有临床相关胶凝时间(小于1小时)的玻璃体凝胶，其中稳定的醛和酮取代的HA与聚(乙二醇)(PEG)上的氧胺官能团交联。肟水凝胶使用包括HA-醛、HA-酮和PEG-氧胺的点击交联系统进行工程化。胶凝由官能团的浓度控制，在混合后和注射至眼睛之前从几分钟到几小时内调整(图1)。这种水凝胶的物理特性通过用原代感光细胞在体外评估和用新西兰白兔在体内评估进行表征，以表征历经56天的过程中的稳定性和生物相容性。总之，这些研究确立了肟交联的HA作为潜在的玻璃体替代物用于治疗视网膜脱离(例如，将玻璃体替代物注射至有需要的受试者的眼睛中，将玻璃体替代物注射至有需要的受试者的滑液腔中，或关节内地注射玻璃体替代物)。
3D细胞培养
已经证明，三维(3D)培养物对于扩展人体组织以进行研究或临床应用是非常宝贵的。对于这两种应用，当3D培养物(1)支持尚未通过广泛培养或病毒感染永生化的原代人类细胞组织的生长，以及(2)包括定义的生理相关成分时，3D培养物最有用。
如实例7中所述，在存在细胞的情况下合成HA-肟凝胶以产生3D细胞培养物。
任选地，前体溶液中的一者或两者包括另外的试剂、添加剂、缓冲液或盐(例如，以支持细胞生长或改善生物相容性)以产生具有所需特性和/或功能的水凝胶。在特定实施例中，混合在存在细胞外基质蛋白的情况下进行。通常，细胞外基质蛋白是基于在体内存在于感兴趣的组织中的细胞外基质蛋白的组成进行选择的。示例性的细胞外基质蛋白包括但不限于胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白及其片段和亚基。在一些实施例中，细胞外基质蛋白为层粘连蛋白。任何合适形式的层粘连蛋白都可以用作第一水凝胶前体组分。在一些实施例中，所使用的层粘连蛋白的类型基于体内存在的用于感兴趣的生理学相关组织类型的层粘连蛋白。在一些实施例中，层粘连蛋白包括可溶形式的层粘连蛋白。在一些实施例中，层粘连蛋白包括分离的层粘连蛋白。在一些实施例中，层粘连蛋白包括重组层粘连蛋白。在一些实施例中，层粘连蛋白包括人层粘连蛋白。在一些实施例中，层粘连蛋白包括小鼠层粘连蛋白。在一些实施例中，层粘连蛋白包含任何上述形式的层粘连蛋白的片段或变体。在一些实施例中，层粘连蛋白未经官能化。在一些实施例中，层粘连蛋白没有经过化学改性以通过连接基与水凝胶缀合。在进一步的实施例中，层粘连蛋白可以形成可逆键(例如，通过(例如，在蛋白质上的胺与HAK上的酮取代基之间)形成席夫碱)。
关节修复
透明质酸已被用于治疗骨关节炎，但在未经化学改性或交联的情况下被迅速清除。如实例13中所述，制备HA-肟凝胶以将其注射至滑液腔中以保护关节。
体内细胞递送
在不使用基质来支持细胞的情况下，确保细胞存活和局部递送对于体内应用具有挑战性。如实例14中所述，制备HA-肟凝胶以与细胞一起注射以促进体内存活和生长。
实例
实例1–酮改性的透明质酸(HA-酮或HAK)的合成
本实例描述了酮改性的透明质酸(HAK)的合成。
背景：合成具有醛官能团的透明质酸的传统途径通常使用强氧化剂进行。该策略不产生酮官能团，因此需要不同的方法。此外，具有醛基的透明质酸的合成通常需要透明质酸包括稳定的保护基团，并且该保护基团需要持续的浓酸以在后续步骤中去除，这导致透明质酸的分子量降低。
方法：酮改性的透明质酸(HAK)按照以下方案中的描述合成。
首先，根据以下方案合成化合物1-c：
然后将化合物1-c与透明质酸反应以制备酮改性的透明质酸，如下述方案所示：
上述方案中描述的合成步骤的程序详述如下。
化合物1-c的合成
步骤1：5-氯-2-戊酮在使用前在135℃减压蒸馏得到无色油状物。
向邻苯二甲酰亚胺钾(41.3g，0.223mol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)(130mL)中的溶液中添加5-氯-2-戊酮(26.9g，0.223mol)。将反应在80℃加热24小时，然后冷却至室温。将反应混合物添加到冰水(750mL)中并搅拌1小时。通过过滤收集沉淀物并用冷水(500mL)洗涤。用甲苯(600mL)萃取粗制物质，加热至溶解，并用氢氧化钠溶液(1M，3x200mL)和盐水洗涤。产物用硫酸镁干燥，得到邻苯二甲酰亚胺改性的戊酮(化合物1-a)，为白色固体(27.2g，53％收率)。
1H NMR(CD3OD,400MHz)1.89-1.96(m,2H),2.14(s,3H),2.59(t,J＝8Hz,2H),3.69(t,J＝8Hz,2H),7.83(m,4H)。
13C NMR(CD3OD,100MHz)23.5,29.83,38.1,41.2,124.1,133.3,135.3,169.9,210.6。
(HRMS ESI)：[M]+计算值对于C13H13NO3：232.0968；实测值232.0974。
步骤2：将邻苯二甲酰亚胺改性的戊酮(化合物1-a)(27.2g，118mmol)悬浮在甲苯(600mL)中，并与乙二醇(37g，59mmol)和对甲苯磺酸一水合物(1.12g，5.9mmol)混合并加热至110℃，持续6小时。用Dean-Stark装置收集水性部分并添加新鲜的乙二醇(37g，59mmol)。有机部分用饱和碳酸氢钠(3x200mL)洗涤。有机部分用盐水洗涤并用硫酸镁干燥。将溶液浓缩，悬浮在乙醇中并蒸发以去除乙二醇邻苯二甲酰亚胺戊酮。获得白色固体(29.9g，定量收率)。
1H NMR(CD2Cl2,400MHz)1.26(s,3H),1.65-1.67(m,2H),1.71-1.77(m,2H),3.67(t,J＝8Hz,2H),3.89(m,4H),7.73(m,2H),7.83(m,2H)。
13C NMR(CD2Cl2,100MHz)23.8,24.3,36.9,38.5,65.26,123.5,123.9,134.4,134.8,168.0。
(HRMS ESI)：[M+H]+计算值对于C15H18NO4：276.1237；实测值276.1236。
步骤3：将水合肼的水溶液(50重量％)(15.2g，152mmol)和乙二醇邻苯二甲酰亚胺戊酮(化合物1-b)(29.9g，109mmol)溶解在乙醇(300mL)中并加热至65℃，持续2小时。将溶液冷却并添加在乙醇(40mL)中的氢氧化钾(7.38g，131mmol)，放置过夜，产生白色沉淀物，通过硅藻土垫抽滤收集。真空浓缩滤液，再次过滤粗品并用氯仿洗涤。将滤液再次浓缩并通过过滤，然后通过在15毫巴和87℃真空蒸馏纯化，得到氨基缩酮(化合物1-c)，为无色油状物(9.19g，61％收率)。
1H NMR(CD2Cl2,400MHz)1.28(s,3H),1.44-1.51(m,2H),1.60-1.64(m,2H),2.64(t,J＝8Hz,2H),3.87-3.89(m,2H),3.90-3.91(m,2H),5.33(s,1H)。
13C NMR(CD2Cl2,100MHz)24.1,28.9,37.0,42.9,61.2,110.4。
(HRMS ESI)：[M+H]+计算值对于C7H16NO2：146.1178；实测值146.1176。
HA-酮的合成
步骤1和2：将透明质酸钠(1.00g，242kDa)溶解在2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(100mL，0.1M水溶液，pH 6.6)中，并与DMTMM(4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基-吗啉正离子氯化物)(1.2g，4.36mmol)一起搅拌。30分钟后，滴加3-(2-甲基-1,3-二氧杂环戊烷-2-基)丙-1-胺(化合物1-c；0.36g，2.5mmol)，并搅拌48小时。使用甲基纤维素透析膜(12-14kDa截留分子量)将溶液在0.1M NaCl中透析48小时，然后在蒸馏水中透析24小时。将纯化的溶液冻干并通过1H NMR在氧化氘中进行分析以确定缩酮取代度(42％)。
步骤3和4：将缩酮取代的透明质酸(HA-缩酮)溶解在蒸馏水(1.0％w/v，HA-缩酮)中并用0.2M HCl透析2小时。将溶液用碳酸氢钠溶液(0.1M)改变至pH 4.0，放置过夜，然后用蒸馏水透析48小时。将透析液无菌过滤(0.22μm，Millipore)并冻干，得到0.88g白色蓬松固体。取代度通过1H NMR在氧化氘中分析，为42％酮改性。
实例2–Alexa Fluor 647/酮改性的透明质酸(HAK-647)的合成
本实例描述了Alexa Fluor 647/酮改性的透明质酸的合成。Alexa647是一种有用的荧光染料，可与分子或抗体缀合。
方法：Alexa647/酮改性的透明质酸是通过下述合成：将透明质酸钠(1.00g，242kDa)溶解在2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液(100mL，0.1M水溶液，pH 6.6)中，并与DMTMM(1.21g，4.36mmol)一起搅拌。30分钟后，滴加3-(2-甲基-1,3-二氧杂环戊烷-2-基)丙烷-1-胺(0.36g，2.5mmol)，并搅拌48小时。使用甲基纤维素透析膜(12-14kDa截留分子量)将溶液在0.1M NaCl中透析48小时，然后在蒸馏水中透析24小时。将纯化的溶液冻干并通过1H NMR在氧化氘中进行分析以确定缩酮取代度(40％至45％)。将缩酮取代的透明质酸(HA-缩酮)(500mg)溶解在pH 6.6的0.1M MES缓冲液(50mL)中，并与DMTMM(0.346g，1.25mmol)一起搅拌。30分钟后，添加Alexa Fluor 647酰肼(3mg，溶于DMSO中)。
将Alexa Fluor 647/缩酮取代的透明质酸(HA-缩酮)溶解在蒸馏水中(1.0％w/v，HA-缩酮)，并且用k 0.2M HCl透析2小时。将溶液用碳酸氢钠溶液(0.1M)改变至pH 5.0，放置过夜，然后在冻干前用pH 5.0的磷酸钠缓冲液透析三次。取代度通过1H NMR在氧化氘中分析，为40％至45％酮改性；并通过使用NanoDrop仪器测量650nm处的吸光度，通过生成具有10mg·mL-1HA的Alexa Fluor 647酰肼的标准曲线来确定荧光团浓度并与HAK-647比较。
实例3–醛取代的透明质酸(HA-醛或HAA)的合成
本实例描述了醛取代的透明质酸(HAA)的合成。
方法：醛改性的透明质酸(HAA)如下述方案所述合成。
上述合成步骤的程序详述如下。
步骤1和2：将透明质酸钠(1.00g，242kDa)溶解在MES缓冲液(120mL，0.1M水溶液，pH 5.5)中，并与DMTMM(0.69g，2.5mmol)一起搅拌。15分钟后，滴加氨基乙醛二甲基乙缩醛(105mg，1.0mmol)并在60℃搅拌。24小时后，使用甲基纤维素透析膜(12-14kDa截留分子量)将溶液在0.1M NaCl中透析48小时，然后在蒸馏水中透析24小时。将纯化的溶液冻干以确定缩醛取代度(43％缩醛改性)。
步骤3和4：将缩醛取代的透明质酸(HA-缩醛)溶解在蒸馏水中并用0.2M HCl透析48小时。将溶液用碳酸氢钠溶液(0.1M)改变至pH 4.0，放置过夜，然后用蒸馏水透析48小时。将透析液无菌过滤(0.22μm，Millipore)并冻干，得到白色蓬松固体。
实例4–合成星形-PEG-四(氧胺)(PEGOA4)交联剂
本实例描述了酮改性的透明质酸(HAK)的合成。
方法：星形-PEG-四(氧胺)(PEGOA4)按以下方案所述合成。
上述合成步骤的程序详述如下。
步骤1和2：在0℃在氮气下将(Boc-氨基氧基)乙酸(0.43g，2.3mmol)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(DIC)(0.57mL，4.6mmol)溶解在25mL二氯甲烷(DCM)中。1小时后，添加PEG-四胺(1.0g，5250Da)，随后添加N,N-二异丙基乙胺(1.18mL，9.14mmol)，并将反应在室温搅拌48小时。真空除去DCM，将粗产物与蒸馏水一起搅拌，并通过0.22μm过滤器过滤以去除N,N'-二异丙基脲副产物。然后使用甲基纤维素透析膜(1,000Da截留分子量)将滤液在氯化钠(0.1M)中透析24小时，然后在蒸馏水中透析48小时，然后冻干。获得白色固体形式的Boc保护的星形-PEG-四(氧胺)，并通过1H NMR表征取代度。
步骤3和4：通过在盐酸(0.2M)中透析48小时，然后在蒸馏水中透析48小时，将Boc保护的星形-PEG-四(氧胺)脱保护。将透析液冻干以得到星形-PEG-四(氧胺)(PEGOA4)，为白色结晶固体(0.95g，46.1％收率)。在CDCl3中进行1H NMR以确定脱保护的完成。将溶液用碳酸氢钠溶液(0.1M)改变至pH 4.0，放置过夜，然后用蒸馏水透析48小时。将PEGOA4溶解在PBS中并无菌过滤(0.22μm，Millipore)用于细胞培养。
实例5–玻璃体替代物水凝胶的合成、配制和表征
本实例描述了包括HAK、HAA和PEGOA4的玻璃体水凝胶的合成。
方法：玻璃体水凝胶的合成、配制和表征方法如下所述。
内毒素去除和检测：所用的HA由细菌和兔眼产生，对内毒素敏感(Buchen等人，“Rabbit ocular reactivity to bacterial endotoxin contained in aqueoussolution and ophthalmic viscosurgical devices,”Ophthalmology,119:e4(2012))。因此，HA-肟水凝胶的各个组分用γ相氧化铝处理并且实现0.4±0.1EU·mL-1的内毒素浓度，该浓度在新西兰白兔的眼睛可接受的0.08-0.60EU·mL-1范围内(Buchen等人，“Rabbitocular reactivity to bacterial endotoxin contained in aqueous solution andophthalmic viscosurgical devices,”Ophthalmology,119:e4(2012))。通过离心将氧化铝与聚合物分离，然后无菌过滤上清液以提供无菌聚合物。为了去除内毒素，将HAK和HAA中的每一者以25mg·mL-1并且将PEGOA4以109.5mg·mL-1溶解在ddH2O中。添加2wt％的γ相氧化铝，并将样品在室温振摇24小时。样品以2000rpm离心以迫使氧化铝沉降。在ddH2O中稀释后，通过0.22μM过滤器对上清液进行无菌过滤。然后将样品冻干。使用Genscript显色试剂盒通过将未处理和氧化铝处理的HAK和HAA以25mg·mL-1并将PEGOA4以109.5mg·mL-1溶解在PBS中来测定内毒素浓度。按照试剂盒方案制备标准内毒素溶液，并使用NanoDrop仪器通过测量545nm处的吸光度进行定量。计算线性回归以确定内毒素浓度，在HAK中为0.022±0.009EU·mg-1，在HAA中为0.01±0.01EU·mg-1，并且在PEGOA4中为0.003±0.002EU·mg-1。
肟凝胶玻璃体替代物：将内毒素减少的HAK和HAA聚合物以25mg·mL-1溶解在PBS中，并在37℃孵育2小时以溶解。将内毒素减少的PEGOA4以109.5mg·mL-1溶解在pH 7.4的0.1M磷酸盐缓冲液中并无菌过滤。将HAK与HAA合并，以在与9.48mg·mL-1的PEGOA4混合时分别给出10.0mg·mL-1和2.5mg·mL-1的最终聚合物浓度。对于体内研究，将聚合物装载到注射器内并以4:1(HAK+HAA):PEGOA4的体积比合并，在注射前，该聚合物通过注射器与注射器连接器混合九次。
结果：玻璃体替代物水凝胶的配制结果描述如下。HA-肟玻璃体替代物水凝胶的制剂：HA-肟系统的胶凝胶凝(图1)通过在恒定聚合物含量(1.25wt％)以及0.85wt％PEGOA4和0.5的氧胺与(醛+酮)摩尔比的情况下改变HAK与HAA的比率来评估。从储存和损失模量的交叉点推测，随着HAA的增加，胶凝更快，从15±3分钟到0.4±0.2分钟(图2)。具有0.10-0.20wt％HAA的水凝胶在以用于玻璃体切除术程序的平衡盐水溶液(BSS)进行的体外溶胀实验中是稳定的，并且历经28天保持在初始质量的94％和108％之间(图3)。这些1.25wt％HA和0.95wt％PEG HA-肟水凝胶比聚合物含量更高的5wt％PEG腙水凝胶更稳定，后者在体外6天后降解(Boehnke等人，“Imine Hydrogels with Tunable Degradability forTissue Engineering,”Biomacromolecules,16:2101(2015))。水凝胶质量的变化可归因于HA主链或肟键的水解(Kalia等人，“Hydrolytic stability of hydrazones and oximes,”Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,47:7523(2008))，并且在第一个月内最小。为了测试HA-肟凝胶的可注射性，在注射前使用注射器耦合器将HAK和HAA与PEGOA4混合。1.05:0.20HAK:HAA(wt％/wt％)的溶液很容易通过手术中常用的23和25号针头手动注射(图4)。重要的是，混合和注射过程都很快，结合受控的胶凝，能够注射至玻璃体腔中。
HA-肟玻璃体替代物的物理特性：HA-肟水凝胶被设计成匹配天然玻璃体的特性，并将其与硅油在密度、折射率、透明度和表面张力方面进行比较。HA-肟水凝胶的密度为1.01±0.05g·mL-1，与天然玻璃体的密度(1.01g·mL-1)相似，高于硅油的密度(0.97g·mL-1)。因此，我们的HA-肟水凝胶应该填充玻璃体，而硅油会漂浮。虽然后者可以通过使用大密度的术中全氟化碳液体来克服，但如果放置超过2周，这些液体会因为视网膜毒性而受到限制(Li等人，“Effects of perfluorooctane on the retina as a short-term and smallamounts remnant in rabbits,”International Journal of Ophthalmology,12:381(2019)；Stolba等人，“The effect of specific gravity of perfluorocarbon liquidon the retina after experimental vitreous substitution,”Graefes Arch Clin ExpOphthalmol,242:931(2004))。HA-肟水凝胶的折射率为1.356±0.002，由于HA-肟水凝胶和玻璃体两者中的高含水量，这与天然玻璃体(1.334)相似，而硅油具有更高的折射率(1.404)。众所周知，硅油会迁移到玻璃体腔外并随着时间的推移乳化，从而降低透明度，导致视力模糊。表征了HA-肟凝胶的表面张力并将其与硅油的表面张力比较(图5A)。HA-肟的表面张力(45±5mN·m-1)明显高于硅油(13±3mN·m-1)，这表明HA-肟水凝胶既不会通过视网膜裂孔迁移也不会迁移到前房(图5B)。使用HA水凝胶的一个优势为它被玻璃体内的透明质酸酶自然生物降解(Schwartz等人，“Human vitreous hyaluronidase:isolation andcharacterization,”Curr.Eye Res.15:1156(1996)。为了模拟水凝胶的生物降解，用透明质酸酶处理样品并测量了历经10天的透明度(图6A)。水凝胶的透明度在降解过程中得以保持，表明在降解过程中视力不会在体内受到影响(图6B)。
实例6–玻璃体替代物水凝胶的稳定性和相容性
本实例描述了体外细胞培养实验，使用在兔中执行的视网膜色素上皮细胞、感光细胞和视网膜外植体与前一个实例中描述的玻璃体替代物水凝胶制剂的相容性研究。
方法：体外实验和体内兔手术方法如下所述。
视网膜色素上皮细胞相容性：RPE细胞按照既定程序从CA1人胚胎干细胞系分化而来(Parker,J.；Mitrousis,N.；Shoichet,M.S.,“Hydrogel for Simultaneous TunableGrowth Factor Delivery and Enhanced Viability of Encapsulated Cells inVitro,”Biomacromolecules,17:476(2016))。将RPE细胞用胰蛋白酶解离并以每孔5,000个细胞接种于MEM/F-12、含有10％胎牛血清的DMEM/F-12中，在0.4μm透明转移孔(transwell)(Corning Life Sciences；目录号：C353095)上接种，其中300μL培养基位于24孔板格式的转移孔下方。去除转移孔中的细胞上方的培养基，将120μL HA-肟水凝胶直接添加RPE细胞上。将板在37℃保持1小时，然后将另外的100μL培养基添加到水凝胶上方。24小时后，去除水凝胶上方的培养基，替换为含有来自在dH2O中的25mg·mL-1溶液的1/250Hoechst 33342(细胞核)(Cell Signaling Technology；目录号：4082S)、来自DMSO中的4mM溶液的1/500钙黄绿素AM(活细胞)(Biotium Inc.，目录号：80011-1)和来自DMSO中的2mM溶液的1/250溴乙啡锭二聚体(死细胞)(Biotium Inc.，目录号：40014)的培养基，并孵育45分钟。使用Olympus FV1000共聚焦显微镜观察细胞，并使用Bitplane的Imaris 8软件进行分析。从三个生物学重复获得平均活力。
Nrl-/-感光细胞相容性：从出生后第3-5天的小鼠视网膜中收获感光细胞，放置在CO2独立培养基(Fisher Scientific)中，并按照制造商的方案用木瓜蛋白酶(WorthingtonBiochemical,UK)解离。将细胞在PBS(无Ca2+/Mg2+)中洗涤并使用0.4％台盼蓝(SigmaAldrich；目录号：G5516-500ML)作为活力计数器染色，然后重新悬浮在培养基中。将细胞在冰上保持不到1小时，然后以每孔104个细胞接种于MEM/F-12、含有10％胎牛血清的DMEM/F-12中，在0.4μm透明转移孔(transwell)(Corning Life Sciences；目录号：C353095)上接种，其中500μL培养基位于24孔板格式的每个转移孔下方。一旦去除转移孔上方的介质，就将每孔100μL HA-肟水凝胶添加到感光细胞上。将板在37℃保持1小时，然后将另外的100μL培养基添加到水凝胶上方。24小时后，去除水凝胶上方的培养基，并通过活/死染色分析细胞。使用Olympus FV1000共聚焦显微镜观察细胞，并使用Bitplane的Imaris 8软件进行分析。从三个生物学重复获得平均活力。
视网膜外植体兼容性：从P4 GFP白化小鼠Actin.gfp(具有表达GFP的感光细胞的转基因小鼠品系)解剖视网膜。将它们平装在转移孔上(6孔格式)并且用外植体上方的1.5mL和每个转移孔下方的2mL无血清培养基培养。通过去除尽可能多的在外植体上方的培养基，在培养1天后，将500μL HA-肟水凝胶添加到每个外植体。1小时后，将1mL培养基添加到外植体的顶部，将该外植体保持24小时，然后小心地取出含有位于视网膜上的水凝胶的孔，并用木瓜蛋白酶解离组织。根据制造商的说明，通过流式细胞术选择GFP标记的细胞、膜联蛋白V和7-氨基放线菌素D(用于流式细胞术的ThermoFisher Scientific PacificBlueTMAnnexin V/SYTOXTMAADvancedTM凋亡检测试剂盒；目录号：A35136)对活的感光细胞进行定量。平均活力从3个针对HA-肟的视网膜外植体和8个针对培养基对照的视网膜外植体获得。
兔视网膜手术：实验程序按照《实验动物护理和使用指南》进行，并由多伦多大学动物护理委员会遵循加拿大动物护理委员会的指导方针批准。新西兰白兔(3-4个月)购自Charles River。手术在全身麻醉下进行，所述全身麻醉用乙酰丙嗪1mg·kg-1进行，然后用异氟烷诱导并肌肉注射氯胺酮35mg·kg-1和甲苯噻嗪5mg·kg-1。施用皮下注射的美洛昔康0.2mg·kg-1进行疼痛控制，并提供头孢菌素20mg·kg-1来最小化术中感染风险，并且用酒精湿巾和碘对眼部周围的毛皮消毒。使用0.5％托吡卡胺和0.5％去氧肾上腺素散瞳，并使用阿尔卡因滴剂进行局部麻醉。手术显微镜(Moller Hi-R 900C)用于观察使用Constellation仪器(Alcon)进行的手术，使用23GAVitrectomy Pak去除玻璃体，同时使用平衡盐水溶液保持眼压，小心地放置套针以避免接触镜头。用气体替换生理盐水后，将大约1mL玻璃体凝胶(HAK、HAA和PEGOA4)或硅油(1000厘沲)注射至玻璃体腔内。手术后，移除套针并用8-0vicryl缝线缝合该区域。在手术后，动物用Tobradex治疗并每天一次接受皮下注射的美洛昔康0.2mg·kg-1，持续至少2-3天，用于术后镇痛。它们还接受了每日应用眼科maxidex以预防结膜炎至少2天，然后根据需要使用。假手术通过放置套针和输注生理盐水进行，没有进行玻璃体切除术。在手术后-1天、0天和每3天，使用Tono-Pen眼压计测量眼压(IOP)。在1、14、28或60天后牺牲兔，从这些动物身上收获左右两只眼睛。眼睛要么用戴维森固定液(Davidson’sfix)固定过夜，然后用70％乙醇+0.9％NaCl冲洗，要么用70％乙醇+0.9％NaCl覆盖每只眼睛。然后将眼睛包埋在石蜡中并用苏木精和伊红染色(H&E染色)，用于通过显微镜观察和分析。收获冷冻切片的眼睛并立即在2-甲基丁烷中用干冰快速冷冻，储存在-80℃直至切片。
玻璃体凝胶的稳定性：在注射具有或不具有AlexaFluor-647标记的HAK的玻璃体凝胶后，收集剩余的水凝胶。将水凝胶与PBS(1.5mL·mL-1的凝胶)在37℃孵育，直到牺牲动物。解剖组织以取出水凝胶并称重。水凝胶用PBS洗涤1小时。将水凝胶以3,500rpm的速度混合1分钟以机械解离水凝胶。将来自溶解在PBS中的10,000U·mL-1储备溶液的透明质酸酶添加到水凝胶中，以得到1,500U·g-1玻璃体凝胶的最终浓度。将悬浮液在37℃孵育过夜，将所得溶液移液到透明的96孔板中，并使用Tecan仪器以λex640 nmλem 675nm进行定量。HA-肟水凝胶的生物降解使用非线性拟合单相衰减与最小二乘拟合(R2＝0.982)与GraphPad Prism7建模，并通过等式描述，其中：
荧光＝100.3e-0.01585*天数
结果：玻璃体替代物水凝胶的稳定性和相容性结果描述如下。
玻璃体替代物水凝胶体外细胞相容性：为了测试HA-肟水凝胶的细胞相容性，使用多种视网膜细胞执行了体外活力测定：从CA-1人胚胎干细胞系分化而来的视网膜色素上皮细胞(RPE)(Adewumi等人，“Characterization of human embryonic stem cell lines bythe International Stem Cell Initiative,Nat Biotechnol.,25:803(2007))、小鼠GFP锥状杆感光细胞(cone-like rod photoreceptor)(cod)(Daniele等人，“Cone-likemorphological,molecular,and electrophysiological features of thephotoreceptors of the Nrl knockout mouse,”Investigative ophthalmology&visualscience,46:2156(2005)；Akimoto等人，“Targeting of GFP to newborn rods by Nrlpromoter and temporal expression profiling of flow-sorted photoreceptors,”Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3890(2006))和小鼠视网膜外植体。虽然我们不希望水凝胶玻璃体替代物与RPE或感光细胞直接接触，但RPE提供了对人类细胞将会如何应答以及小鼠感光细胞如何敏感的洞察。基于钙黄绿素AM和溴乙啡锭二聚体染色，在组织培养聚苯乙烯(TCPS)上和HA-肟薄涂层下培养24小时后，RPE保持96％的活力(图7A和图7B)。类似地，在HA-肟水凝胶薄涂层下方培养4天后，像在培养基中一样，用GFP标记的锥状感光细胞保持类似的活力(图7C和图7D)。为了更好地了解我们的HA-肟水凝胶如何与视网膜相互作用，将几种赋形剂-HA水凝胶制剂在小鼠视网膜外植体上培养24小时，然后解离感光细胞并通过流式细胞术定量。在进行或未进行水凝胶治疗的情况下，用7-氨基放线菌素(7-AAD)或膜联蛋白V(致力于凋亡的细胞)染色的死感光细胞的数量没有显著差异(图8A和图8B)。就细胞相容性而言，在体外没有观察到副作用。用内毒素减少的聚合物对水凝胶进行了体内测试(图9)。
玻璃体替代物体内稳定性：荧光标记的水凝胶用于监测玻璃体替代物的体内稳定性和降解。为了监测水凝胶的稳定性，将荧光AlexaFluor-647-酰肼与HA上的甲酸根基团缀合，HA也用酮官能度改性(图10A)。然后将这种HA-肟-AF647水凝胶注射至已被切除的兔眼中。将HA-肟-AF647与作为填料的硅油比较。在注射后1天时对眼睛进行冷冻切片，观察到玻璃体腔充满了HA-肟水凝胶，与使用硅油时观察到的类似(图10B)。为了对水凝胶的稳定性进行定量，通过从解剖的眼睛中取出凝胶，测量HA-肟-AF647凝胶随时间推移的荧光和质量。凝胶具有粘性并且很容易从玻璃体中去除。到第28天，与第1天相比，凝胶在荧光方面保持不变(图11A)。到第56天，水凝胶相对于第1天显著降解至初始荧光的40±15％。替代性地，可能有一些光漂白来解释荧光的更大减少。尽管如此，HA-肟体内稳定性基于荧光数据建模：计算了半衰期为43天，并且到第300天或10个月完全降解/再吸收(图11B)。类似地，观察到水凝胶质量历经植入的前28天没有体内变化，但在第56天显著下降(图11C)。HA-肟水凝胶作为玻璃体替代物的持续时间足够长，因为临床数据表明，接受部分平坦部玻璃体切除术(PPV)的患者在1个月后达到最佳矫正视力(Minami等人，“Effect of axial lengthand age on the visual outcome of patients with idiopathic epiretinal membraneafter pars plana vitrectomy,”Scientific Reports,9:19056(2019))。
玻璃体替代物水凝胶体内生物相容性：为了测试HA-肟水凝胶的生物相容性，随着时间的推移对视网膜进行了组织学检查，并与硅油和假手术比较。在56天的进程中，基于组织学检查结果，兔视网膜保持完整和健康(图12A)。在第7天、第28天和第56天对包含双极细胞、水平细胞和无长突细胞的内核层(INL)和包含杆状和锥状感光细胞的外核层(ONL)的厚度进行定量。INL和ONL两者中的细胞核数量在所有时间点都保持类似(图12B和图12C)，证明新的HA-肟水凝胶是生物相容的。平均眼压保持在报告的兔正常IOP范围13.50-25.92mmHg内(Zouache等人，“Intraocular Pressure and Aqueous Humour Flow Rate inVertebrate Eyes,”PLOS ONE 11:e0151490(2016))，用眼压计进行历时56天的测量(图13)，从而证明了这种水凝胶在体内的安全性(即，水凝胶不会随着其降解而导致眼压升高)。为了评估玻璃体替代物水凝胶使视网膜变平的能力，在新西兰白兔眼中诱导视网膜脱离，并在7天后通过组织学评估视网膜(图14A)。基于对视网膜的定量，INL和ONL是完整的(图14B)。与通过腙连接形成的Vitargus水凝胶导致一些患者IOP升高相比，在兔中观察到使用HA-肟水凝胶时的眼压没有显著变化，这可能是由于肟键与肼相比水解速度慢(Kalia等人，“Hydrolytic stability of hydrazones and oximes,”Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,47:7523(2008))。为了证明赋形剂的使用不会对视网膜产生毒性，通过在玻璃体切除术后向兔眼注射含有0.4M蔗糖的玻璃体凝胶来检查几种赋形剂-HA水凝胶制剂，并在第7天和第28天比较内核层和外核层(INL和ONL)的厚度(图15A、图15B和图15C)。在这一点上，所测试的HA水凝胶组与硅油组或假手术组之间没有明显差异。此外，眼内压(IOP)保持稳定并与接受含有0.4M蔗糖玻璃体的凝胶或假手术的眼睛中的正常兔IOP值类似(图16)(Ma等人Scientific reports.6:35187(2016))。
结论：HA-肟水凝胶在折射率、密度和透明度方面与天然玻璃体的特性相匹配。它很容易注射至兔眼中，填充玻璃体腔，满足在填塞视网膜、保持正常眼压、随时间吸收和生物相容性方面对于玻璃体替代物的需求。当其他物质失败时，这种透明质酸水凝胶成功的关键是由于稳定的点击化学，这释放了它被用作玻璃体替代物来治疗视网膜脱离的潜力。气体和油对患者有明显的不利影响，需要用改进的玻璃体替代物来替代。基于本文提供的实例中呈现的结果，水凝胶满足作为当前使用的气体或硅油填塞物的替代物的设计要求。
实例7–用于3D细胞培养系统的HA-肟水凝胶的合成、配制和表征
本实例描述了用于3D细胞培养系统的包括HAK、HAA和PEGOA4的HA-肟水凝胶的合成
背景：尽管使用计算方法改进了初始靶标鉴别(Leelananda等人，Methods 131:10(2017))，并且几种提议的水凝胶用于在药物开发的体外阶段培养细胞(Li等人，Sci.Adv.4(2018))，但在组织培养聚(苯乙烯)(TCPS)上的二维(2D)培养继续用于筛选癌症疗法。2D培养物不机械地或生物化学地代表体内微环境，从而导致假阳性(和可能假阴性)药物命中(Jacobi等人，Oncotarget 8:107423(2017))。体内异种移植肿瘤模型更忠实地概括了人类疾病，但由于使用免疫功能低下的小鼠而成本高、耗时且复杂(Hasan等人，J.Clin.Pathol.68:746(2015))。在2D中测试药物的不准确但快速且简单的方法加上异种移植模型的复杂性，推动了更具代表性的三维(3D)培养平台的开发。合适的3D培养系统必须足够稳定以进行药物筛选，并以金标准体内异种移植肿瘤模型为基准(Day等人，Cell163:39(2015))。这种3D模型的有限可用性导致对2D培养物的持续依赖，即使认识到2D培养物不能准确预测体内结果。
与其中乳腺上皮癌细胞形成单层的2D培养物不同，癌症的3D模型概括了许多疾病特征，例如形成具有紧密接合的癌症球体以及包含天然细胞外基质(ECM)的关键生化和机械线索(Ivascu等人，International Journal of Oncology,31:1403(2007)；Todd等人，Oncotarget 7:62939(2016)；Imamura et al.,Oncology reports,33:1837(2015))。通常，癌症球体是通过使用非粘附条件在3D中生长上皮癌细胞形成的。这种方法快速并且提供了对球体大小的显著控制(Madoux等人，SLAS Discov.22:516(2017))。然而，不出所料，这些通过聚集形成的癌症球体(CS)的基因表达谱比异种移植肿瘤更接近于2D培养的细胞(Boghaert等人，Neoplasia 19:695(2017))。因此，单独的球体形成不能概括体内微环境(Sero等人，Mol.Syst.Biol.11:0790(2015)；Gencoglu等人，ACS Biomater.Sci.Eng.4:410(2018))。非粘附条件缺乏关键的ECM成分，这两种成分都通过整联蛋白介导的信号传导途径(例如β1)影响细胞功能，并影响药物有效性(Xu等人，Integr.Biol.3:368(2011)；Lovitt等人，BMC Cancer 18:41(2018))。
富含层粘连蛋白的细胞外基质，例如源自Engelbreth-Holm-Swarm鼠肉瘤的因其包含一些模拟乳腺肿瘤微环境的生理相关ECM蛋白而受到青睐，适用于3D细胞培养(Weigelt等人，Adv.Drug Deliv.Rev.42:69-70(2014))。然而，基质胶的定义不明确(Hughes等人，Proteomics，10:1886(2010))，其成分、物理化学和生物力学特性的适用性有限(Lambricht等人，Dent.Mater.30:e349(2014))。此外，基质胶不包括在乳腺癌微环境中发现的关键基质成分，例如透明质酸(HA)，该关键基质成分由肿瘤和基质细胞产生并与疾病进展有关(Auvinen等人，Am.J.Pathol.156:529(2000))。跨乳腺癌亚型的细胞表面整联蛋白表达和肿瘤微环境特性的多样性需要一个可调节的模型来满足这些复杂性(Rizwan等人，Oncotarget 7:62939(2016))。
大多数化学交联的水凝胶利用具有快速反应动力学的化学物质(Wang等人，Advanced Functional Materials,27:1605609(2017))，例如巯基-迈克尔加成连接(Saito等人，ACS Chemical Biology,10:1026(2015))，并限制均匀的细胞封装，使体外细胞培养的可重复性具有挑战性。此外，由于对空气敏感的官能团(例如巯基)，许多支架组件需要储存在惰性气体中和/或需要外部刺激来促进交联，这使放大变得复杂(Fisher等人，J.Am.Chem.Soc.139:7416(2017)；Jha等人，Biomaterials,89:136(2016))。为了实现更可控的细胞封装系统，将快速反应的HA-醛和慢速反应的HA-酮与聚(乙二醇)(PEG)-氧胺合并，通过肟点击化学创建定义的3D水凝胶。肟连接是水解稳定的，因此可以长期封装乳腺癌细胞——这是当前策略的关键进步，这些策略本质上受到腙或Diels-Alder化学交联的可逆反应的限制(Kalia等人，Angew.Chem.Int.Ed.47:7523(2008)；Kascholke等人，Biomacromolecules 18:683(2017)；Baker等人，Biomacromolecules,18:4373(2017))。此外，肟化学性质对氧化不敏感，易于使用并且能够控制胶凝速率，这通常是其他点击化学反应不可能实现的。这些新合成的肟交联HA水凝胶用于对小鼠体内生长的肿瘤异种移植物的乳腺癌细胞的基因表达进行基准测试，并与基质胶和2D TCPS中的常规培养物比较来评估药物反应(图17A)。
方法：用于3D细胞培养的HA-肟水凝胶的合成、配制和表征方法如下所述。
HA-肟水凝胶组分的合成：HA-肟凝胶用HA-酮(HAK)、HA-醛(HAA)和PEG-氧胺合成。首先需要合成其中的每个组分。
HAK首次以两步反应合成：(1)3-(2-甲基-1,3-二氧戊环-2-基)丙-1-胺与作为活化剂的4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉氯化物(DMTMM)的酰胺偶联，以及(2)酸催化的酮脱保护(图17A、图17B、图17C、图17D、图17E和图17F)。将HAK和HAA与PEGOA4和层粘连蛋白(一种常见的细胞外基质蛋白)合并以产生具有可调生化特性的交联水凝胶，以生长乳腺癌球体(图17A)。通过分别将DMTMM的当量从1.0增加到2.5，发现酮取代度可在28±3％和55±2％之间进行调节(图18)。具有大约40％酮取代度的HAK用于生产水凝胶，因为它是水溶性的且易于处理。
类似地，醛改性的HA(HAA)也分两步合成：(1)HA上的甲酸基团与DMTMM/氨基乙醛二甲基乙缩醛的酰胺化，和(2)用酸水溶液对所得HA-缩醛进行脱保护(图19)。PEG取代的氧胺交联剂由4臂PEG-四胺或2臂PEG-双胺和(boc-氨基氧基)乙酸与碳二亚胺偶联制备，然后酸催化脱保护以分别产生PEGOA4和PEGOA2(图19)。
为了表明HAK和HAA生物聚合物均与PEG-氧胺交联，比较了由等重量百分比的HAK/HAA或未改性-HA/HAA与PEG-羟胺交联的水凝胶的稳定性：HAK/HAA水凝胶历经至少28天保持稳定(质量减少不到5％)，而由HA/HAA形成的凝胶缓慢解离，在第1天和第28天之间失去其质量的50±2％，反映未交联的HA的溶解(图20A、图20B和图20C)。与四臂PEGOA4交联的凝胶的溶胀明显低于与双官能PEGOA2交联的溶胶(图20B和图20C)。虽然两者均历经四周保持完整，但将PEGOA4用于所有后续实验，因为PEGOA2交联凝胶的溶胀增加将会改变水凝胶的机械特性并因此改变细胞表型(Lin等人，Oncotarget,6:20946(2015))。流变学用于表征具有不同HAK:HAA质量比的HA-肟水凝胶的胶凝速率(图21A、图21B、图21C、图21D、图21E、图21F)。
细胞分布和活力：将MDA-MB-468细胞(每孔4,000个细胞)封装在由HAK(0.60-1.20wt％)和HAA(0-0.60wt％)与PEGOA4以氧胺与酮加醛的比率为0.60交联制备的1.20wt％HA-肟水凝胶(25μL，384孔格式)中。胶凝(1.5-3.0小时)后，添加75μL的含有10％FBS的RPMI-1640培养基。24小时后，细胞在培养基中用钙黄绿素AM(1/250)和溴乙啡锭二聚体-1(1/250)染色，然后孵育45分钟。使用Olympus共聚焦显微镜以10倍放大率和7μm步长的z堆栈对细胞进行成像。对于在第14天的球体分布，根据制造商指南将细胞封装在HA-肟、基质胶或HyStem-C中，并在通过上文详述的染色进行可视化之前培养14天。活细胞和死细胞使用Imaris 8软件中的点鉴定通过Bitplane定位。细胞存活率由以下等式计算：存活率百分比＝100x活细胞数/(活细胞数+死细胞数)。使用由点鉴定的z位置坐标进行细胞或球体分布分析，并使用GraphPad Software Inc.的GraphPad Prism 5软件进行分析。频率分布图是在bin大小设置为50μm(第1天)或100μm(第14天)的情况下制备的。对于每种条件至少进行3次由不同细胞传代组成的独立重复。
乳腺癌细胞对含有蛋白质的HA-肟水凝胶的粘附：为了确定细胞对含有蛋白质的凝胶的粘附，将含有0.90wt％HA-酮、0.30wt％HA-醛和60mol％交联PEGOA4(1.04wt％)的含有Ln(25、75、125和250μg mL-1)的HA-肟水凝胶以每孔25μL以384孔格式制备。将T47D细胞以3,000个细胞孔-1接种在25μL RPMI-1640培养基中，该培养基含有10％FBS、10μg mL-1胰岛素和1％P/S，并孵育30分钟。用移液管轻轻去除培养基，并用冷却至4℃的PBS替换，以防止进一步粘附。在去除含有分离的细胞的PBS并用4％PFA固定带有粘附细胞的凝胶之前，将板在室温用基本变速数字轨道振荡器(IKA)以300rpm搅拌5分钟。T47D细胞用核染色剂Hoechst 33342(1/250，在PBS中，25μL孔-1)染色4小时。使用Olympus共聚焦显微镜以10倍放大率和12μm步长的z堆栈获得图像以捕获弯月面。通过Bitplane使用Imaris 8软件中的点鉴定对细胞数进行定量。为了确定蛋白质对细胞粘附的影响，相对于不含蛋白质的对照水凝胶计算了粘附细胞数量的倍数变化。对于每种条件至少进行3次由不同细胞传代组成的独立重复。
乳腺癌细胞系的保持：将细胞传代并在培养箱内的组织培养瓶上生长，培养箱保持在37℃、5％CO2和95％湿度。MCF7细胞使用Dulbecco改良的Eagle培养基和Ham F-12营养混合物培养。T47D、BT474、MDA-MB-468和MDA-MB-231-H2N细胞在RPMI-1640培养基中培养。MCF7和T47D培养基补充有10μg mL-1来自牛胰腺的胰岛素。所有细胞培养基均补充有10％胎牛血清、10U mL-1青霉素、10μg mL-1链霉素(PS)。MDA-MB-231-H2N细胞是Robert Kerbel博士(Sunnybrook健康科学中心)的慷慨礼物。所有其他细胞系均从ATCC购买，并且每个细胞系根据70-80％汇合度的供应商指南进行最多20次传代。
球体分析：将乳腺癌细胞(每孔4,000个细胞)封装在每孔35μL的基质胶(8.5mg·mL-1最终浓度)或与60mol％PEGOA4交联的HA-肟+/-Ln水凝胶中。球体以1,200DPI成像，并使用来自Oxford Optronix的GelCount仪器在96孔格式的透明TCPS板中进行分析。对于球体直径的定量，应用了由Oxford Optronix开发的专有算法，该算法避免了对聚集球体的计数。所有条件都使用相同的光罩，使用具有高级预处理的CHARM优化器检测球体，辐条数设置为10并使用0.30-0.60作为集落光密度。对于每种条件，至少进行3次由不同细胞传代组成的独立重复，以计算每孔球体数量和直径的平均值和标准偏差。
乳腺癌细胞的增殖：将MCF7、T47D、BT474、MDA-MB-231-H2N和MDA-MB-468乳腺癌细胞以每孔4,000个细胞接种在TCPS上、基质胶(8.5mg·mL-1)上或含有0.90wt％HA-酮、0.30wt％HA-醛和60mol％交联PEGOA4(1.04wt％)的HA-肟水凝胶+/-Ln(75μg·mL-1)上。在37℃使其完全胶凝90分钟后，添加150μL的所需培养基。24小时后，去除培养基并替换为150μL PrestoBlue，首先对其进行无菌过滤，然后在加热至37℃的培养基中稀释10倍。4.5小时后，通过在570nm激发并在590nm检测，使用Tecan酶标仪(Life Sciences)检测荧光。每48小时，从未测量的孔中去除培养基并更换为新鲜培养基。在第7天，去除培养基并在新孔中按上述方法进行PrestoBlue测定。通过从第1天和第7天的荧光数据减去仅培养基对照的背景荧光，然后将第7天的荧光数据除以第1天的荧光数据来计算细胞生长。对于每种条件，至少进行3次不同细胞传代组成的独立重复，由，以计算第7天的细胞生长相对于第1天的平均值和标准偏差。
乳腺癌异种移植物：所有动物研究均按照大学健康网络动物护理委员会根据加拿大动物护理委员会的指导方针批准的方案进行。NOD scid gamma(NSG)小鼠是内部饲养的，并在第10周注射癌细胞。接受MCF7、T47D或BT474细胞的小鼠在细胞移植前一天植入雌激素释放颗粒(0.72毫克，60天释放，Innovative Research of America)。对于原位细胞移植，将小鼠在异氟醚氧下麻醉，将手术区域脱毛并用优碘清洗。通过下腹部中线右侧的皮肤切口显露乳腺脂肪垫。将MCF7(3.37x106个细胞)、T47D(每只动物7.10x106个细胞)、BT474(每只动物7.80x106个细胞)、MDA-MB-231-H2N(每只动物1.70x106个细胞)或MDA-MB-468(每只动物9.30x106个细胞)细胞注射(50-80μL)至乳腺脂肪垫的右侧腹股沟区域内。通过对用于注射的细胞悬液在PBS中进行100倍稀释来计算注射的细胞数。使用以下公式从用卡尺测量的肿瘤的长度和宽度计算肿瘤体积：V＝(πx(短直径)2x(长直径))/6，如先前报导(Kumacheva等人，Sci.Adv.4(2018))。
qPCR：使用Nuclespin RNA纯化试剂盒(Macherey-Nagel)和DNAse(ThermoScientific)分离和纯化RNA。使用NanoDrop 1000UV-Vis光谱仪(Themo FisherScientific)测量RNA纯度，仅将260/280比率在1.8-2.2之间的样品储存在-80℃进行逆转录或下面讨论的NanoString。使用SuperScript III逆转录酶(Invitrogen)和SimpliAmp(Life Technologies)热循环仪进行RNA逆转录以制备cDNA。表4中详述的引物购自ACGTCorporation，将每个反应5ng cDNA和每个样品的三个技术重复通过移液器或使用epMotion 5070液体处理工作站(Eppendorf)加载到384孔板上。使用LightCycler 480SYBRGreen I Master(罗氏公司)和QuantStudio 6Flex(Life Technologies)检测系统对基因表达进行定量。将表达水平归一化至β-肌动蛋白，并根据δ-δ阈值循环(ΔΔCT)计算。所有qPCR反应均一式三份进行。数据表示相对于异种移植物的平均log2基因表达。
表4
免疫细胞化学：在第21天，去除培养基并替换为PBS。10分钟后，将PBS替换为4％PFA，并在室温固定细胞20分钟。细胞用PBS洗涤3次，每次10分钟，然后用含有1％BSA的0.5％皂苷在PBS中透化2小时。细胞用含有100mM甘氨酸的PBS洗涤3次，每次10分钟，然后将一抗添加到10％山羊血清与从10x免疫荧光(IF)储备溶液制备的1x IF洗涤液中。10x IF的制备如先前报导(Jacobi等人，Oncotarget,8:107423(2017))。如下所述使用了以下一抗：抗CD44(1/10)、兔单克隆抗HIF-1α(1/50)、小鼠单克隆抗E-钙粘素(1/100)、兔多克隆抗整联蛋白-β1(1/100)。对于96孔或384孔培养格式，分别以150μL或50μL添加稀释的一抗，并在4℃保持过夜。16小时后，去除一抗并用IF洗涤液洗涤3次。山羊抗鼠IgG(H+L)、用AlexaFluor 488标记的高度交叉吸附二抗和山羊抗兔IgG(H+L)Alexa Fluor 647以1/150添加到含有10％山羊血清的1X IF洗涤液中。4小时后，去除二抗并替换为1X IF，在1小时和16小时后再次替换。使用Hoechst 33342(1/100)和罗丹明标记的鬼笔环肽(1/100的300单位溶液，在1.5mL甲醇中)在1X IF洗涤液中对细胞核和F-肌动蛋白染色3h小时。在水凝胶内成像通常需要更高浓度的荧光探针。3小时后，去除染色溶液，并替换为1X IF洗涤液以进行成像。将水凝胶转移到磁性4室载玻片(Quorum Technologies Inc.)上，并通过1.5号盖玻片(VWR)使用Olympus共聚焦显微镜以40倍放大率进行成像。使用40倍物镜(E-钙粘素、CD44、整联蛋白-β1、HIF-1α)仅对水凝胶前200μm内的球体进行成像，而整个水凝胶中的球体均使用10倍长工作距离物镜进行成像。
泛癌组基因表达：来自上述在2D TCPS上、在生长因子减少的基质胶或HA-肟+/-Ln中培养21天的以及作为小鼠体内异种移植物的BT474、MDA-MB-231-H2N和MDA-MB-468细胞的纯化RNA，使用nCounter泛癌人类途径套件(PanCancer Human Pathways Panel)(NanoString Technologies)进行分析。RNA(每个样品100ng)按照制造商的方案进行杂交。对于每次分析，使用nCounter制备工作站(Prep Station)(NanoString Technologies)将12个样品加载到盒中，然后使用nCounter数字分析仪设备(NanoString Technologies)分析基因表达。通过NanoString技术使用nSolver分析软件3.0版处理数据。根据数据分析指南分析第一个质量控制标志，然后使用补充表4中显示的管家基因对基因表达计数进行归一化。所有NanoString分析均以至少三个独立的重复进行。通过单因素方差分析和Tukey事后检验分析基因表达的归一化计数。维恩图中表示的基因的完整列表列于表5A、5B、6A、6B、7A和7B中。这些基因与特定途径的关联使用GSVA进行分析，途径分类信息从可以作为可下载文件在PanCancer Pathways Panel在线获取的NanoString获得。
表5A
表5B
表6A
表6B
表7A
表7B
结果：用于3D细胞培养的HA-肟水凝胶的细胞分布和机械特性。
HA-肟水凝胶的可调胶凝影响3D细胞分布：为了实现均匀的3D细胞分布，水凝胶必须足够快地形成以避免在胶凝过程中由于重力引起的细胞聚集，但在实际应用中足够慢。仅含HAA的交联水凝胶(0:1HAK:HAA)形成得太快，无法封装细胞，需要在这些凝胶的顶部而不是在内部培养细胞(Baker等人，Biomacromolecules,18:4373(2017))。相比之下，仅用HAK(1:0HAK:HAA)和PEGOA4合成的水凝胶形成得太慢，胶凝时间为87±11分钟。因此，当单个乳腺癌细胞被封装在仅含HAK的HA-肟凝胶中时，由于酮与氧胺之间的缓慢交联反应，细胞会聚集在孔的底部(图17C)。随着HAA量的增加，胶凝速率显著增加(图21A、图21B、图21C、图图21D、图21E和图21F)。使用7:1或3:1的HAK:HAA质量比、以恒定为0.60的氧胺与酮/醛的摩尔比生产的HA-肟水凝胶的平均胶凝时间分别为35分钟和25分钟。在较快胶凝的HAA(HAK:HAA为1:1)的重量百分比较高时，所得交联凝胶形成得太快，无法通过流变学进行定量。3:1的HAK:HAA用于后续分析，发现活细胞分布均匀(图13C、图22A和图22B)。与在基质胶或市售HA基水凝胶HyStem-C(与PEG二丙烯酸酯交联的HA-硫醇/明胶-硫醇)中的细胞相比，当细胞在HA-肟水凝胶中生长时，这种均匀分布保持更长的时间(图22C)。
HA-肟水凝胶的受控于组成的机械特性和酶特异性降解：进行了以下研究以研究HA-肟水凝胶相对于基质胶的机械可调性，基质胶是3D细胞和类器官培养的当前标准。以蛋白质浓度8.50和18.43mg·mL-1购买的基质胶组合物的压缩模量分别为0.9±0.7kPa和1.6±0.4kPa，彼此之间没有显著差异(图17E)。这些制剂通常用于体外培养，并强调了基质胶提供的有限机械可调性(Smolina等人，Analyst,141:620(2016))。相比之下，HA-肟水凝胶的刚度随HAK与HAA的比率而变化。通过改变交联密度或HA的重量百分比，HA-肟水凝胶可在0.3到15kPa之间的2个数量级内高度可调(图23)。该范围覆盖了小鼠乳腺肿瘤(～1.5-4.0kPa)和人类乳腺癌组织(～5-16kPa)的硬度，分别通过压缩和原子力显微镜测量(Paszek等人，Cancer cell 8:241(2005)；Levental等人，Cell 139:891(2009)；Ansardamavandi等人，J.Mech.Behav.Biomed.Mater.60:234(2016))。
在氧胺与酮/醛的恒定摩尔比(0.80)下，仅含HAK(1.35wt％)的水凝胶(15±1kPa)比仅含HAA(1.35wt％)的水凝胶(5.5±0.4kPa)硬得多(图23)。HAK-肟水凝胶与HAA-肟水凝胶的模量差异归因于摩尔质量的差异。虽然使用相同摩尔质量的HA，但HAK的合成导致摩尔质量为311kg·mol-1而HAA的合成导致摩尔质量为122kg·mol-1，如通过凝胶渗透色谱法所测量。重要的是，所有HAK和HAA制剂中氧胺到肟的转化率没有变化，如通过1H NMR光谱所定量(图24)，进一步表明摩尔质量差异导致了压缩模量的差异。具有3:1和1:1HAK:HAA重量比的凝胶制剂的刚度与基质胶没有统计学差异，因此在未来的实验中使用3:1的比率，因为它更容易处理。HA-肟凝胶在PBS中溶胀或用胶原酶处理时稳定28天，并且仅在存在透明质酸酶的情况下降解，突出了酶特异性降解性(图17F)。重要的是，已知乳腺癌细胞产生透明质酸酶，它允许在细胞生长过程中动态的、基于细胞的时空重塑HA-肟水凝胶(Edjekouane等人，Journal of tissue engineering and regenerative medicine,5:790(2011))。
水凝胶稳定性和降解：将HA-肟水凝胶含有0.90wt％HA-酮、0.30wt％HA-醛和60mol％交联PEGOA4(1.04wt％)在预先称重的2mL最大回收管(Axygen)中在37℃制备过夜。在将水凝胶用200μL的Hank平衡盐溶液(HBSS)溶胀过夜后取水凝胶质量，然后将替换为含有20μg mL-1IV型胶原酶、50U mL-1或400U mL-1IV-S型透明质酸酶的HBSS添加到水凝胶中，将其在37℃孵育。每24小时，去除缓冲液并记录水凝胶质量并替换为新鲜溶液，直到水凝胶在第10天降解并且在第28天再次降解。降解数据记录为第0天的初始HBSS溶胀凝胶质量与经HBSS、透明质酸酶或胶原酶处理的水凝胶质量的比率。用3个独立样品进行实验以计算平均值和标准偏差。
通过ELISA对水凝胶中的Ln进行定量：为了确定封装后释放的层粘连蛋白-1(Ln)的量以及保留在HA-肟水凝胶中的量，使用了ELISA试剂盒(Abcam ab119572)。将小鼠Ln(Corning)75和250μg·mL-1封装在由HAK和HAA与PEGOA4制备的HA-肟水凝胶中。在37℃胶凝过夜后，添加PBS，并将样品在37℃孵育。24小时后，去除PBS并储存在-80℃。在将100μL透明质酸酶(2500U·mL-1)添加至凝胶之前，将水凝胶样品在PBS中进一步孵育6天。48小时后，将降解的凝胶与在Tris平衡盐水中稀释的Ln标准品与24小时释放样品比较。每个条件至少进行3个独立的重复。
生化调节的含有层粘连蛋白的HA-肟水凝胶与细胞相互作用：为了模拟乳腺癌细胞外基质的异质性并增强细胞与HA-肟水凝胶的相互作用(Caldwell等人，Adv.HealthcMater.6:1700254(2017))，在胶凝前将层粘连蛋白-1(Ln)与聚合物混合，发现它保留在凝胶中，无需共价固定：以75或250μg·mL-1掺入的Ln在7天后完全保留在水凝胶中，在PBS上清液中未检测到可溶性Ln(图25A)。鉴于Ln的大尺寸(850kDa)，它可能被物理包裹或缠结在HA-肟聚合物链中，但也可能被带正电荷的Ln与带负电荷的透明质酸甲酸根基团之间的任一(或两者)静电相互作用保留(Rinaudo等人，Int.J.Biol.Macromol.,43:444(2008))或被层粘连蛋白上的碱性赖氨酸基团与HA-酮/醛基团之间的可逆席夫碱形成保留(Stabenfeldt等人，J.Biomed.Mater.Res.,A部分，77:718(2006))。
为了研究细胞-Ln相互作用，比较了细胞对具有或不具有Ln的HA-肟凝胶的粘附。粘附在含有75μg·mL-1Ln的水凝胶表面的T47D管腔A乳腺癌细胞数量增加了一倍多，这类似于基质胶与不含Ln的对照(图25B)球体内的细胞彼此相互作用，如通过E-钙粘素(一种紧密接合的标志物)表达所证明(图26A和图26B)。细胞还通过CD44(一种透明质酸受体)与HA-肟水凝胶相互作用，并表达β1-整联蛋白(一种Ln受体)(图26C、图26D、图26E和图26F)。CD44对乳腺癌细胞的生长至关重要，并且β1-整联蛋白参与PI3K途径，该途径在乳腺癌中上调并构成药物靶点(Godar等人，Cell,134:62(2008)；Fotovati等人，Cancer Res.,70:2840(2010)；Castello-Cr□s等人，BMC Cancer,9:94(2009))。观察到了HIF-1α表达的证据，这是通常在乳腺癌肿瘤中观察到的活性氧或缺氧的标志物(图26G和图26H)。在具有或不具有Ln的情况下，水凝胶的机械特性没有改变，封装在HA-肟水凝胶中的乳腺癌细胞同样存活且分布均匀，球体的大小和数量相似(图27A、图27B、图27C、图27D、图27E、图27F和图27G)。在整个球体中或外围观察到E-钙粘素、CD44、β1-整联蛋白和HIF-1α表达，这已在其他癌症球体中观察到，并且可能代表核心区的活性氧与缺氧，因为氧气可以扩散通过～70μm直径的球体(图28A、图28B、图28C和图28D)(Wang等人，Polymer Chemistry,6:283(2015))。鉴于透明质酸与乳腺癌的相关性(Heldin等人，Int.J.Cancer132:531(2013))以及细胞与HA-肟水凝胶的相互作用，研究了在具有或不具有层粘连蛋白的HA-肟中培养对于基因表达水平的影响，与在基质胶和传统2D TCPS中培养进行比较。
HA-肟水凝胶使5种不同的乳腺癌细胞系和患者来源的原代乳腺癌细胞能够形成球体：当将来自5种不同乳腺癌细胞系的细胞在HA-肟水凝胶+/-Ln中培养21天时，它们形成了球体，这在2D培养物中没有观察到(图29)。这些细胞代表了4种乳腺癌亚型，它们具有不同的雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER2)表达谱：管腔AMCF7和T47D(ER+，PR+，HER2-)、管腔B BT474(ER+、PR+、HER2+)、过表达HER2+的MDA-MB-231-H2N(ER-，PR-，HER2+)和三阴性MDA-MB-468(ER-，PR-，HER2-)细胞。检查了在2D和3D中以及不同水凝胶培养物之间的增殖。
最近为开发体外癌症模型而开展的工作已使用定义不明确的基质胶使3D肿瘤类器官成长，该模型概括了人类乳腺癌的特征以进行临床前测试或个性化医疗。为了测试HA-肟水凝胶的这些应用，将患者来源的原代管腔B乳腺癌细胞封装在3D中并观察它们的存活和增殖：患者来源的细胞在水凝胶中生长为球体，但在2D TCPS上增殖为单层(图30A和图30B)。令人印象深刻的是，在培养21天后，来自分离的患者活检组织的封装的原代乳腺癌细胞在HA-肟+/-Ln和基质胶中形成了球体。在3D水凝胶内历经21天的培养，葡萄糖和/或氧梯度将有可能形成并导致异质性，与2D TCPS相比，这更接近地模拟异种移植物内的肿瘤微环境。这些结果促使我们对小鼠异种移植物和体外模型之间的基因表达进行了更广泛的比较，以便更好地了解这些体外模型之间的生物学差异。
体外培养的5种不同的乳腺癌细胞系的基因表达与作为肿瘤异种移植物的体内生长：为了解培养平台如何影响乳腺癌标志物和药物靶向途径，针对NOD SCIDγ小鼠中的原位小鼠异种移植物对在HA-肟+/-Ln中培养的5个细胞系的基因表达进行基准测试，并与在基质胶或2D TCPS中培养的细胞系进行比较(图31A、图31B、图31C、图31D和图31E)。一般来说，在HA-肟水凝胶+/-Ln或基质胶中培养的乳腺癌细胞的基因表达比在2D TCPS上培养的细胞更类似于小鼠异种移植模型(图32A、图32B、图32C、图32D和图32E)。与肿瘤异种移植物相比，在2D TCPS上培养时，有几个基因差异表达，但在HA-肟水凝胶中培养时则不然，这些基因包括表皮生长因子受体(EGFR)、人表皮生长因子受体2(ERBB2)和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α(PIK3CA)，它们与药物靶向途径有关(表8)。与基质胶相比，体外生长的所有乳腺癌细胞系在HA-肟+/-Ln水凝胶中表现出相似的增殖率，但BT474细胞除外，其在基质胶中的增殖增加(图33A)。此外，在HA-肟水凝胶和基质胶中培养21天时，所有细胞均形成适用于氧和营养物质渗透的～100μm类似直径的球体(Curcio等人，Biomaterials,28:5487(2007))(图33B)，至少表明了表型等效。
表8
ERBB2和EGFR的表达可能导致细胞表型和致瘤性发生变化，也可能影响对疗法(包括直接靶向这些受体的药物)的应答(Ingthorsson等人，Oncogene,35:4244(2015))。此外，PIK3CA阳性乳腺肿瘤患者在所有分子亚型中的无病存活期较短，表明其作为治疗靶点的潜力(Aleskandarany等人，Breast Cancer Res.Treat.122:45(2010))。因此，这些结果进一步强调了需要使用具有代表性的3D模型来研究乳腺癌而不是传统的2D培养物。
除了传统激酶抑制剂之外，治疗乳腺癌的潜在策略包括新兴的代谢靶点，例如负责脂质合成的FASN。目前，正在临床试验中评估FASN抑制剂TVB-2640治疗晚期乳腺癌的效果(Menendez等人，Expert opinion on therapeutic targets,21:1001(2017)；Monaco等人，Oncotarget,8:29487(2017))。由于在2D培养物与异种移植模型之间观察到细胞脂肪酸和胆固醇含量的差异(Mori等人，Front.Oncol.,6:262(2016))，我们假设3D细胞培养物中的脂质代谢基因的表达比2D培养物更类似于异种移植肿瘤。负责脂质合成的FASN以及调节细胞内磷脂和胆固醇稳态的ATP结合盒式转运蛋白(ABCA1)的表达取决于细胞系和培养系统两者。例如，管腔AMCF7细胞在肿瘤异种移植物与HA-肟水凝胶培养物之间具有类似的ABCA1和FASN表达，但当在2D TCPS或基质胶上培养时，FASN表达上调(图32A和图32B)。这表明FASN表达受ECM的影响，并且使用HA-肟水凝胶概括了管腔A乳腺癌异种移植肿瘤的基因表达水平。然而，过表达HER2的MDA-MB-231-H2N细胞在所有体外模型中的FASN和ABCA1都上调，这表明与异种移植肿瘤相比，脂质代谢和分泌发生了改变。对于其他乳腺癌亚型未观察到FASN表达的这些差异，这支持2D中乳腺癌亚型依赖性脂质代谢(Lane等人，Metab.Eng.,43:125(2017))。考虑到在HA-肟水凝胶中培养并作为异种移植肿瘤生长的乳腺癌细胞的类似基因表达，对泛癌基因表达组进行了更严格的基准测试。
体外乳腺癌模型中的泛癌基因表达基准测试：为了更好地了解乳腺癌细胞3D体外培养物的预测能力，对代表3种不同乳腺癌亚型的3个不同细胞系作为肿瘤异种移植物进行基准测试：管腔B(BT474)；过表达HER2的(MDA-MB-231-H2N)；和三阴性(MDA-MB-468)。细胞在HA-肟、基质胶中进行3D培养或在TCPS上进行2D培养，并比较了730个癌症相关基因的基因表达组。相对于肿瘤异种移植物，管腔B、BT474细胞在HA-肟凝胶中培养时具有最少数量的差异表达基因(730个基因中24个下调，27个上调)，与在基质胶中培养的细胞(63个下调，135个上调)和在2D TCPS上培养的细胞(60个下调，45个上调)相比(表9A和9B)。令人惊讶的是，在基质胶中培养的细胞相对于异种移植物的差异比在2D TCPS上培养的细胞更大，这都反映了基质胶的不适合性，并且表明仅3D培养物不足以进行预测性药物筛选。
表9A
表9B
通过基因集变异分析对十二种途径和驱动基因进行分析，发现与肿瘤异种移植物相比，在基质胶中培养的BT474细胞改变了几种途径的表达，包括JAK-STAT和MAPK，而在HA-肟凝胶中培养的细胞则不然。这进一步激发了使用代表性的基准化3D体外模型(例如HA-肟水凝胶)来概括基因表达并评估针对JAK-STAT和MAPK的新候选药物(Garcia-Aranda等人，International journal of molecular sciences,18:2543(2017))。
将MDA-MB-231-H2N肿瘤的基因表达与3D水凝胶和2D培养物进行比较，我们发现当细胞在HA-肟凝胶中生长时，差异表达的基因更少(16个下调，12个上调)，与基质胶(28个下调，21个上调)和2D TCPS(33个下调，29个上调)两者相比(表10A和10B)。体外药物筛选中使用的细胞中治疗靶点的基因表达改变会产生误导性数据。在MDA-MB-231-H2N细胞的体外模型与肿瘤异种移植物之间分析了调节细胞存活和细胞命运的途径后，相对于肿瘤异种移植物，在HA-肟、基质胶或2D TCPS中培养的细胞之间发现了JAK-STAT途径的差异。
表10A
表10B
当三阴性乳腺癌(TNBC)MDA-MB-468细胞在HA-肟凝胶、基质胶或2D TCPS中培养时，与异种移植肿瘤相比，下调基因的数量类似(分别为125、134和122)，而与HA-肟和基质胶(分别为60和54个基因)相比，2D TCPS中上调基因的数量更高(94)(表11A和11B)。
表11A
表11B
对受影响途径的后续分析表明，相对于肿瘤异种移植物，在HA-肟、基质胶或2DTCPS中培养时，刺猬途径发生了改变。由于只有30％的三阴性乳腺癌涉及旁分泌刺猬(Hh)信号传导，这已在癌症相关成纤维细胞的背景下进行了研究，因此可能需要共培养模型来靶向这一途径(Hui等人，Journal of Clinical Oncology,36:e24216(2018))。
我们的基因表达途径分析表明，相对于异种移植物和HA-肟，在基质胶或2D TCPS中培养时，JAK-STAT途径在HER2+BT474和MDA-MB-231-H2N细胞系中都发生了改变.这强调需要在经过验证的模型上评估靶向特定途径的药物。值得注意的是，虽然基质胶被认为是体外培养的黄金标准，但它之前没有进行过基准测试，我们的数据清楚地表明它是次优的。总体而言，HA-肟凝胶与异种移植物最为类似，只有294个差异表达基因，而基质胶为434，2DTCPS为371。与异种移植肿瘤相比，在HA-肟水凝胶与HA-肟-Ln水凝胶(分别为294和308个基因)之间，相同细胞系的差异表达基因的数量类似。因此，3D培养物减少了但并没有消除2D培养物与异种移植物之间基因表达的差异。HA-肟中的3D培养物比基质胶中的培养物更好地模拟异种移植物的基因表达谱。
评估2D和3D模型之间药物应答的差异：为了解基因表达的这些差异是否会影响药物筛选中的细胞应答，我们特别选择了靶向异种移植物和在基质胶和2D TCPS中的体外培养物之间差异表达并且在HA-肟中没有差异表达的途径的药物(表12A、12B、12C和12D)。我们测试了一系列靶向在HA-肟与基质胶和2D TCPS中生长的BT474细胞中的MAPK(例如Rac信号传导)和JAK-STAT途径的药物。
表12A
表12B
表12C
表12D
用EHT-1864(Rac抑制剂，靶向MAPK/ERK途径)治疗的BT474细胞在HA-肟中培养时比在基质胶中更敏感。此外，与在基质胶中或在2D TCPS上培养的细胞相比，在HA-肟中培养的BT474细胞对AZD6482(参与JAK-STAT途径的PI3Kβ抑制剂)更敏感。为了获得对观察到的药物应答性差异背后机制的生物学见解，我们对MAPK和JAK-STAT信号途径中涉及的基因数量进行了定量，这些基因具有相对于肿瘤异种移植物的差异表达水平：在HA-肟中培养的细胞具有较少的差异表达基因(对于MAPK为14，对于JAK-STAT为4)，与在基质胶(对于MAPK为43，对于JAK-STAT为29)和2D TCPS(对于MAPK为23，对于JAK-STAT为10)中培养的细胞相比。这些结果共同证明了HA-肟在靶向特定途径的药物筛选中优于基质胶和2D TCPS。
有趣的是，在HA-肟中培养的细胞对maritoclax(一种Mcl-1抑制剂，可阻止Mcl-1在线粒体上的正常抗凋亡信号传导，导致细胞凋亡)的敏感性比那些在2D TCPS中培养的细胞高十倍以上，前者的IC50为0.59μM，而后者的IC50为5.5μM。此外，在3D HA-肟中培养的原代人类患者肿瘤管腔B乳腺癌细胞对maritoclax的敏感性显著高于在2D TCPS上培养的细胞，这证明了HA-肟水凝胶在个性化医疗中的潜力和培养条件在药物筛选中的重要性(图34)。作为线粒体上抗凋亡蛋白Mcl-1的抑制剂，Maritoclax靶向凋亡途径。与3D培养物相比，这种凋亡途径的调节剂BAD(促凋亡)和BCL2(抗凋亡)在2D TCPS上培养的BT474细胞中的水平降低，这解释了观察到的药物应答差异。
我们重点介绍了用BT474细胞进行的体外药物筛选的结果，其中HA-肟、基质胶和2D TCPS之间的IC50值不同。由于在疾病动物模型中测试药物的决定通常基于体外筛选，因此基于基质胶和/或2D TCPS中的培养物，将排除maritoclax、EHT-1864和AZD6482，从而反映在代表性基质例如HA-肟中培养的重要性。乳腺癌细胞的2D和3D培养物在基因表达和药物应答方面存在显著差异。虽然3种培养条件之间的细胞应答并不总是不同(如ZSTK474和阿法替尼所示)，但为了确保全面筛选，需要一个经过验证的代表性系统，如HA-肟。
为了使用其他细胞类型深入了解HA-肟水凝胶的更广泛用途，我们研究了厄洛替尼(一种EGFR抑制剂)对TNBC MDA-MB-468细胞的功效。在2D TCPS上、在基质胶或HA-肟中生长21天并用厄洛替尼治疗7天的细胞的IC50为37.6μM(p<0.01)，明显高于那些在3D中培养的细胞(～4.5μM)(图.35A和图35B)。与其他癌细胞系相比，在2D上培养的MDA-MB-468细胞对厄洛替尼的敏感性较低，尽管其在小鼠乳腺癌异种移植物中已确立有效性(Yamasaki等人，Mol.Cancer Ther.,6:2168(2007)；Lau等人，Oncotarget,5:10503(2014))，进一步强调了相关筛选分析的重要性。
结论：3D细胞培养具有几个使其对药物筛选具有吸引力的特征，但受到使用基质胶的限制，基质胶不能忠实地概括肿瘤异种移植物的基因表达谱，并且化学性质不明确。新合成的HA-肟水凝胶具有模拟乳房ECM的可控和可调节的凝胶化、机械特性和化学特性，这是使用2D TCPS无法实现的并且受到基质胶的限制。通过首次基准化至体内黄金标准，我们证明了在HA-肟水凝胶中生长的乳腺癌细胞在3种不同乳腺癌亚型的基因表达谱方面与原位异种移植物最相似。这影响了体外药物筛选的价值。与肿瘤异种移植物相比，将HA-肟水凝胶与层粘连蛋白配制在一起不会减少乳腺癌球体表达的差异表达基因的数量。我们使用基因表达数据对经典信号传导途径的分析表明了基因表达随着培养平台的乳腺癌亚型依赖性改变。我们证明了使患者来源的乳腺癌细胞在HA-肟水凝胶中生长的能力，从而鉴定相关的候选药物。因此，透明质酸-肟水凝胶弥合了体外与体内小鼠异种移植模型的2D药物筛选和之间的差距，为个性化医疗和更具预测性的药物筛选打开了大门。为了充分利用这个机会，需要放大并同时筛选多种药物。这种定义明确的水凝胶平台为更复杂的3D模型与多种细胞类型的共培养开辟了可能性，从而更好地模拟了肿瘤的复杂性。
实例8-药物筛选
以下实例描述了使用GraphPad Software Inc的Graphpad Prism中的非线性拟合计算IC50值的实验。
BT474：使BT474细胞在2D上、在基质胶中和在HA-肟+/-Ln水凝胶中以4,000个细胞/孔的接种密度以96孔格式生长。在2D中生长的细胞在24小时后开始使用含有高达0.2％DMSO的Hewlett-Packard(HP)D300数字分配器给药50nM到高达20μM之间的EHT-1864、AZD6482、Maritoclax、ZSTK474、阿法替尼(Afatinib)、TW-37、ABT-199、ABT-263和替西罗莫司(Temsirolimus)，然后在第一次给药后48小时再次治疗，并在治疗72小时后结束。在3D中生长的细胞在14天后每48小时用高达0.2％DMSO给药，持续7天。通过下述评估细胞活力：去除培养基并将其替换为100μL无菌RealTime-Glo MT(Promega)，将其在加热至37℃的培养基中稀释1000倍。1小时后，使用Tecan酶标仪(Life Sciences)以1秒积分时间检测发光。通过减去所有组的背景发光来计算细胞活力；将治疗孔与接受高达0.2％DMSO的对照孔进行比较。数据代表由针对每种条件的不同细胞传代组成的3个独立的重复，以计算细胞活力的平均值和标准偏差。
MDA-MB-468：使MDA-MB-468细胞在2D上、在基质胶中或在HA-肟+/-Ln水凝胶中以4,000个细胞/孔的接种密度以96孔格式生长21天。每48小时向细胞给药0.1、1、5、20和50μM的含有0.27％DMSO的盐酸厄洛替尼，持续7天。通过下述评估细胞活力：去除培养基并将其替换为150μL无菌PrestoBlue，将其在加热至37℃的培养基中稀释10倍。2.5小时后，通过在570nm激发并在590nm检测，使用Tecan酶标仪(Life Sciences)检测荧光。通过减去所有组的背景荧光来计算细胞活力；将治疗孔与接受0.27％DMSO的对照孔进行比较。数据代表由针对每种条件的不同细胞传代组成的3个独立的重复，以计算细胞活力的平均值和标准偏差。
原代细胞存活：将表征为管腔A(ER+，PR+，HER2-)的患者活检组织分离，并将细胞悬浮在无血清乳腺癌类器官培养基中，如报导(Hasan等人，J.Clin.Pathol.,68:746(2015))。将细胞以每600μL 80,000个细胞接种在2D TCPS上或封装(每50μL 80,000个细胞)在基质胶(8.5mg·mL)或3:1HAK/HAA(PEGOA4交联)水凝胶+/-Ln中，将细胞接种于24孔板中。1小时后，将温热的培养基(600μL)添加至水凝胶。每48小时更换一次培养基，直到14天为止，此时使用Hoechst(1:100，1mg·mL)、Mito Tracker深红FM(1:3,000，1mM)和Sytox绿(1:200,000，5mM)将细胞可视化。2小时后，使用Olympus共聚焦显微镜以10倍放大率对细胞进行成像。
肿瘤来源的乳腺管腔上皮细胞(批号：LUMM062314，41岁女性)在第2代从Zen-Bio获得，并使用乳腺管腔生长培养基(Zen-Bio，LCM-1)培养至第4代。细胞在2D上、在基质胶或HA-肟+/-Ln水凝胶中以每孔3,000个细胞的接种密度生长。24小时后，使用1:200,000Sytox绿(Thermo Fisher Scientific)和1:3,000MitoTracker深红FM(Thermo FisherScientific)在培养基中将细胞可视化。1小时后，使用Olympus共聚焦显微镜以10倍放大率对细胞进行成像。通过Bitplane使用Imaris 8软件中的点鉴定对细胞数进行定量。数据代表由单独的细胞传代组成的3个独立的重复。
使用原代细胞进行药物筛选：肿瘤来源的乳腺管腔上皮细胞在2D上、在基质胶或HA-肟水凝胶中以每孔4,000个细胞的接种密度生长。在2D中生长的细胞在24小时后使用含有高达0.2％DMSO的Hewlett-Packard(HP)D300数字分配器给药10nM到高达20μM之间的Maritoclax，然后在第一次给药后48小时再次治疗，并在治疗72小时后结束。在3D中生长的细胞在14天后每48小时用高达0.2％DMSO给药，持续7天。通过下述评估细胞活力：去除培养基并将其替换为100μL无菌RealTime-Glo MT(Promega)，将其在加热至37℃的培养基中稀释1000倍。1小时后，使用Tecan酶标仪(Life Sciences)以1秒积分时间检测发光。通过减去所有组的背景发光来计算细胞活力；将治疗孔与接受高达0.2％DMSO的对照孔进行比较。IC50值使用GraphPad Software Inc的Graphpad Prism中的非线性拟合计算。数据代表由针对每种条件的不同细胞传代组成的3个独立的重复，以计算细胞活力的平均值和标准偏差。
统计分析：所有统计分析均使用GraphPad Software Inc的GraphPad Prism软件版本5和7进行。使用单因素方差分析(ANOVA)和Tukey事后检验分析两个以上的组之间的差异。NanoString数据首先使用nSolver分析软件3.0(NanoString Technologies)归一化至一组管家基因(表13)。归一化的基因表达值用于计算倍数变化、使用基因集变异分析的GSVA途径、单因素方差分析p值以及R版本3.3.3的Tukey事后检验。表13描述了用于归一化NanoString实验的基因表达的36种管家基因。
表13
实例9–用于3D细胞培养系统的具有肽交联剂的HA-肟水凝胶的合成
本实例描述了具有肽交联剂的水凝胶的合成。
方法：合成了含有共价固定肽的水凝胶。具体而言，合成了具有共价连接的纤连蛋白模拟肽GRGDSPASSKKG(RGD)的水凝胶。
该肽通过固相肽合成(SPPS)合成，随后用氧胺基团进行改性，以允许与HA上的酮和醛基团偶联。由于在与2-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)乙酸偶联期间的N-过度酰化以及氧胺肽与增塑剂的反应的报导，氧胺肽合成具有挑战性(Decostaire等人，TetrahedronLett.47:7057-7060(2006)；等人，J.Pept.Sci,17:39-46(2011)；Buré等人，RapidCommun.Mass Spectrom.14:2158-2164(2000)；Wahl等人，Tetrahedron Lett.37:6861-6864(1996))。为了克服这些挑战，首先分三个步骤制备6-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)己酸(化合物9-c)，详述如下。
6-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)己酸的合成
6-溴己酸苄酯(9-a)的合成：将6-溴己酸(1.0g，5.1mmol)溶于甲苯(50mL)中，并添加苯甲醇(0.8mL，7.7mmol)和对甲苯磺酸一水合物(48.6mg，0.26mmol)。将反应在140℃用迪安-斯塔克装置回流过夜，然后冷却至室温。粗品用25mL饱和碳酸氢钠洗涤并用甲苯(25mL)萃取三次。合并的有机部分用25mL饱和氯化钠洗涤并用硫酸镁干燥。去除溶剂并通过硅胶快速色谱法使用10％乙酸乙酯和己烷进行纯化。获得无色油状物(1.35g，92％收率)。1H NMR(CDCl3,400MHz)1.47-1.51(m,2H),1.61-1.72(m,2H),1.83-1.90(m,2H),2.38(t,J＝8Hz,2H),3.39(t,J＝8Hz,2H),5.12(s,2H),7.32-7.39(m,5H)。13C NMR(CDCl3,100MHz)24.2,27.8,32.5,33.6,34.2,66.3,128.4,128.7,136.1。(DART ESI)：[M+H]+计算值对于C13H18Br1O2：285.0490；实测值285.0498。
6-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)己酸苄酯(9-b)的合成：向己酸苄酯(10)(4.76g，16.7mmol)溶于乙腈(50mL)中的溶液中添加N-Boc-羟胺(3.11g，23.4mmol)，然后添加1,8-二氮杂双环(5.4.0)十一碳-7-烯(3.8g,25mmol)。在真空浓缩之前将反应在50℃搅拌15小时。将粗品重新悬浮在100mL乙酸乙酯中，并用50mL的pH 8.0的0.1M硫酸氢钾萃取三次。合并的水性部分用另外的100mL乙酸乙酯萃取，并且有机部分依次用100mL蒸馏水和50mL饱和氯化钠洗涤。有机部分经硫酸钠干燥，并通过硅胶快速色谱使用20-40％乙酸乙酯和石油醚进行纯化。获得无色油状物(2.44g，43％收率)。1H NMR(CD2Cl2,400MHz)1.40(m,2H),1.46(s,9H),1.57-1.70(m,4H),2.36(t,J＝8Hz,2H),3.80(t,J＝8Hz,2H),5.10(s,2H),7.23(bs,1H),7.35(m,5H)。13C NMR(CD2Cl2,100MHz)24.7,25.4,27.6,27.9,28.0,34.0,65.9,76.3,81.1,128.0,128.4,136.4,156.6,173.2。
6-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)己酸(9-c)的合成：向11(2.44g，7.3mmol)在THF(60mL)中的脱气溶液中添加Pd/C(0.1g，10％负载)。悬浮液用氮气脱气并在氢气下搅拌2小时，然后用氮气脱气并滤出催化剂。真空去除溶剂，得到无色油状物(1.79g，定量的)。1HNMR(CDCl3,400MHz)1.40-1.43(m,2H),1.48(s,9H),1.61-1.70(m,4H),2.36(t,J＝8Hz,2H),3.84(t,J＝8Hz,2H),7.33(bs,1H)。13C NMR(CDCl3,100MHz)24.9,25.9,28.1,28.7,34.3,82.2,100.4,157.6,179.6。(DART ESI)：[M+NH4]+计算值对于C11H25N2O5：265.1763；实测值265.1762。
氧胺改性的肽的合成：然后将化合物9-c与RGD缀合以制备如下详述的氧胺改性的RGD(RGDOA)。RGDOA是分五个步骤使用化合物9-c改性通过标准Fmoc化学使用固相肽合成制备的肽来制备的。RGDOA肽的制备收率为17％。
除了掺入粘附肽，许多水凝胶还被设计成具有可酶促降解的肽交联剂，其通常可被细胞分泌的基质金属蛋白酶(MMP)降解(Jha等人，Biomaterials,89:136-147(2016))。氧胺改性的MMP(MMPOA2)-可降解肽通过SPPS分四个步骤制备，如下所示。MMPOA2肽通过四个步骤制备，使用6-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)己酸改性通过标准Fmoc化学使用固相肽合成制备的肽。MMPOA2肽的制备收率为30％，可在突出显示的序列处切割。
RGD的合成：使用连接到Discover微波仪(CEM)的Liberty Blue肽合成仪，使用标准Fmoc化学方法制备肽。使用水和含有0.1％三氟乙酸的乙腈通过HPLC纯化肽。流速和梯度由连接到xBridge BEH C8 OBD制备柱(5μm，19mm x 150mm)的1525二元HPLC泵(Waters)调节。使用2489UV/Vis检测器(Waters)鉴定含有肽的级分，并使用级分收集器III(Waters)收集样品。在气流下去除乙腈后，通过冷冻干燥浓缩级分并通过质谱进行分析。纯化的肽在-20℃储存在玻璃小瓶中。
乙酰-GRGDSPASSKK(OA)G的合成：将Fmoc-Gly-Wang树脂(0.5mmol)在DMF中溶胀10分钟，然后使用Liberty Blue肽合成仪将F-moc脱保护并洗涤。将含有Fmoc-Lys(Alloc)-OH(0.57g，1.25mmol)、HBTU(0.95g，2.5mmol)、DIPEA(0.52mL，3mmol)的5mL DMF溶液添加至树脂并静置10分钟。添加另外的5mL DMF并进行微波偶联。Fmoc-Lys(Alloc)-OH在Gly-Wang树脂上的偶联通过比色TNBS测试(10-15个树脂珠在DMF中，5滴TNBS试剂和10滴DIPEA)确认，并合成其余序列。从反应容器中取出树脂并用含有1.6mL哌啶和1M 1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)的8mL Fmoc脱保护溶液处理2小时。树脂用DMF和CH2Cl2洗涤，然后添加N,N-二异丙基乙胺(0.9mL，5mmol)和乙酸酐(0.9mL，9.5mmol)。搅拌2小时后，将溶液排干并再次用CH2Cl2、DMF和CH2Cl2充分洗涤。使用TNBS测试确认保护，并将树脂在CH2Cl2(8mL)中搅拌并在氮气下脱气。将硼烷二甲胺络合物(20mg，0.34mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(45mg，0.04mmol)添加到树脂悬浮液中并将反应避光搅拌过夜。排干溶液并用CH2Cl2洗涤树脂。将6-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)己酸(0.22g，0.9mmol)和DIC(142mg，1.12mmol)在5mL CH2Cl2中合并1小时，然后将溶液添加到树脂中。24小时后去除溶液，树脂用CH2Cl2洗涤并干燥。树脂用三氟乙酸(4mL)、三异丙基硅烷(0.15mL)、苯硫醚(0.15mL)、水(0.15mL)和氨基氧基)乙酸半盐酸盐(0.24mg)处理2.5小时。肽在冷乙醚(50mL)中沉淀并再洗涤两次。纯化后，得到RGDOA，为白色结晶固体(114.9mg，17％收率)。ESI计算值，对于C53H92N18O21[M]+：1316.67；实测值1316.67。
OA-SKAGAGPQGIQGQGAGKAK(OA)S的合成：将Fmoc-Ser(tBu)-Wang树脂(0.5mmol)在DMF中溶胀10分钟，然后使用Liberty Blue肽合成仪将F-moc脱保护并洗涤。将含有Fmoc-Lys(Alloc)-OH(0.57g，1.25mmol)、HBTU(0.95g，2.5mmol)、DIPEA(0.52mL，3mmol)的5mLDMF溶液添加至树脂并静置10分钟。添加另外的5mL DMF并进行微波偶联。Fmoc-Lys(Alloc)-OH在Ser(tBu)-Wang树脂上的偶联通过比色TNBS测试得到证实，并合成其余序列。将树脂从反应容器中转移并洗涤，然后在氮气下在CH2Cl2(8mL)中搅拌。将硼烷二甲胺络合物(20mg，0.34mmol)和四(三苯基膦)钯(0)(45mg，0.04mmol)添加到树脂悬浮液中并将反应避光搅拌过夜。排干溶液，并且用CH2Cl2然后用DMF洗涤树脂。树脂用含有1mL哌啶和1M 1-羟基苯并三唑水合物(HOBt)的5mL Fmoc脱保护溶液处理2小时，然后用CH2Cl2洗涤。将6-(((叔丁氧基羰基)氨基)氧基)己酸(0.30g，1.2mmol)和DIC(193mg，1.5mmol)在4mL CH2Cl2中合并1小时，然后将溶液添加到树脂中。24小时后去除溶液，树脂用CH2Cl2洗涤并干燥。树脂用三氟乙酸(7.2mL)、三异丙基硅烷(0.26mL)、苯硫醚(0.26mL)、水(0.26mL)和氨基氧基)乙酸半盐酸盐(0.50mg)处理3.5小时。肽在冷乙醚(50mL)中沉淀并再洗涤两次。纯化后，得到MMPOA2，为灰白色结晶固体(326mg，30％收率)。ESI计算值，对于C95H157N29O31[M]+：2201.16；实测值2200.16。
肽固定化的定量：含有0.90wt％HA-酮、0.30wt％HA-醛和60mol％交联PEGOA4(1.04wt％)交联剂的HA-肟水凝胶用PBS在预称重的2mL最大回收管(Axygen)在37℃制备过夜。对于每个条件，将100μL水凝胶的三个独立样品用200μL PBS简单洗涤10分钟，然后添加100μL的RGDOA溶液，使PBS中的最终浓度为250μM或1mM。通过用100μL的13.75mg mL-1羧甲氧基胺半盐酸盐在0.5M MES缓冲液pH 6.6中处理经PBS洗涤的水凝胶，历经24小时制备吸附对照，以淬灭未反应的醛和酮，然后再添加RGDOA溶液。在1小时或24小时后去除未反应的RGDOA溶液，并历经48小时用PBS洗涤凝胶。使用DAC 150FVZ Speedmixer(Flack Tec)以3500rpm的速度机械破坏水凝胶30秒。将100μL的IV-S型透明质酸酶溶液以250U mL-1添加到Hank平衡盐溶液中，样品在37℃在48小时后完全消解。将样品冻干，然后在PBS中以5mg mL-1复溶，并在110℃用6M HCl水解24小时。去除HCl并使用苯基异硫氰酸酯(PITC)改性氨基酸。使用Acquity UPLC BEH C18柱(2.1mm x 10cm)和在254nm测量的Acquity TUV检测器对氨基酸进行分离和定量。使用Pierce氨基酸标准H进行校准，使用Empower 2(Waters)处理结果，并使用精氨酸和丙氨酸值进行分析。为了计算固定化的RGDOA肽在HA-肟水凝胶上的浓度，从吸附对照中减去固定肽的量，然后与已知浓度的RGDOA与HA-肟凝胶成分的标准溶液进行比较。在1小时和24小时后，来自250μM溶液的固定化的RGDOA的浓度分别为34±12μM和65±14μM。在24小时后，来自1mM溶液的固定化的RGDOA的浓度为242±76μM。在1小时后，来自250μM溶液的固定化的RGDOA的浓度为65±14μM固定肽。
RGDOA细胞粘附测定：含有0.90wt％HA-酮、0.30wt％HA-醛和60mol％交联PEGOA4(1.04wt％)的HA-肟水凝胶以384孔格式以每孔25μL使用含有10％FBS和1％PS的RPMI-1640培养基制备。在37℃胶凝2小时后，将25μL的125、250、500和1000μM上述培养基中的RGDOA溶液添加至水凝胶。在37℃用RGDOA溶液处理1小时后，去除培养基并用每孔25μL的培养基洗涤凝胶三次。将MDA-MB-468细胞以3000个细胞孔-1的密度接种在25μL培养基中的水凝胶表面，并孵育30分钟。用移液管轻轻去除培养基并用冷却至4℃的PBS替换。在去除含有分离的细胞的PBS并用4％PFA固定带有粘附细胞的凝胶之前，将板在室温用基本变速数字轨道振荡器(IKA)以300rpm搅拌5分钟。细胞核用Hoechst 33342(1/250，在PBS中，25μL孔-1)染色4小时。使用Olympus共聚焦显微镜以10倍放大率和12μm步长的z堆栈获得图像。通过Bitplane使用Imaris 8软件中的点鉴定对细胞数进行定量。从不含RGDOA肽的对照水凝胶计算细胞数的倍数变化。对于每种条件至少进行3次由不同细胞传代组成的独立重复。
水凝胶稳定性和降解：将HA-肟水凝胶含有0.90wt％HA-酮、0.30wt％HA-醛和60mol％交联PEGOA4(1.04wt％)或60mol％交联MMPOA2(0.83wt％)在预先称重的2mL最大回收管(Axygen)中在37℃制备过夜。在将水凝胶用200μL的Hank平衡盐溶液(HBSS)溶胀过夜后取水凝胶质量，然后将替换为含有20μg mL-1IV型胶原酶、50U mL-1或400U mL-1IV-S型透明质酸酶的PBS或HBSS添加到水凝胶中，将其在37℃孵育。每24小时，去除缓冲液并记录水凝胶质量并替换为新鲜溶液，直到水凝胶在第10天降解并且在第28天再次降解。降解数据记录为第0天的初始HBSS溶胀凝胶质量与经PBS、透明质酸酶或胶原酶处理的水凝胶质量的比率。用3个独立样品进行实验以计算平均值和标准偏差。
结果：当不同浓度的RGDOA与HA-肟水凝胶在存在含有血清的全培养基的情况下仅缀合1小时时，MDA-MB-468细胞显示粘附细胞数量增加和增加的RGDOA浓度250-1000μM(图36A和图36B)。
HA-肟MMPOA2交联水凝胶可稳定28天，并且可被胶原酶和透明质酸酶两者降解(图37)。封装在与MMPOA2交联的HA-肟水凝胶中的乳腺癌MDA-MB-468细胞历经21天的进程形成了球体，这表明它适用于3D细胞培养。
实例10–HA-氧胺的合成
下面的方案描述了HA-氧胺的合成。首先，将端基上的HA还原以形成封端的HA。然后将透明质酸钠与DMTMM和(2-氨基乙氧基)氨基甲酸叔丁酯一起搅拌以生成Boc保护的HA-氧胺。然后在酸性条件下将HA-Boc-氧胺脱保护以得到HA-氧胺。
实例11–酮和醛改性的透明质酸(HAKA)的合成
本实例描述了用酮和醛官能团改性的HA的合成。在下面的方案中概述了合成步骤。
DMTMM步骤和脱保护步骤的程序与实例1中描述的程序类似。用于表征HAKA的1HNMR示于图38.
实例12–酮和降冰片烯(HANK)改性的透明质酸的合成
本实例描述了用酮和降冰片烯官能团改性的HA的合成。在下面的方案中概述了合成步骤。
DMTMM步骤和脱保护步骤的程序与实例1中描述的程序类似。用于表征HANK的1HNMR示于图39.
实例13-用于治疗骨关节炎的可注射水凝胶
本实例描述了使用酮改性的HA的HA-肟凝胶作为可注射水凝胶用于治疗骨关节炎(OA)的应用。
背景：管理OA的疼痛症状通常使用口服药物来实现，但这些治疗不会延迟疾病进展(Callhoff等人，“Disease Burden of Patients With Osteoarthritis:Results of aCross-Sectional Survey Linked to Claims Data,”Arthritis Care&Research,72:193-200(2019))。标准治疗包括对乙酰氨基酚、非甾体抗炎药(NSAID)、环氧合酶-2(COX-2)抑制剂、阿片类药物和糖皮质激素或HA的关节内治疗。有几种可能的机制介导HA在管理OA中的功效，包括润滑、镇痛、抗炎和软骨保护(Avenoso等人，“Hyaluronan in the experimentalinjury of the cartilage:biochemical action and protective effects,”Inflamm.Res.,67:5-20(2018)；Brandt等人，“Intraarticular injection of hyaluronanas treatment for knee osteoarthritis:what is the evidence？”Arthritis Rheum.,43:1192-1203(2000)；和Kawasaki等人，“Hyaluronic acid enhances proliferation andchondroitin sulfate synthesis in cultured chondrocytes embedded in collagengels,”J.Cell Physiol.,179:142-148(1999))。使用HA的一个问题是混合的临床结果，这可能归因于注射体积、注射频率、聚合物分子量和制剂的差异。所有这些变量都会影响治疗窗口并最终决定它从关节中清除的速度。交联的化学衍生物(Hylan G-F)和未改性的产品都已被注射至滑液腔内。未交联的透明质酸通常会被迅速清除并且半衰期很短(<7天)，而其他衍生物在兔膝关节中可持续超过一个月。在一些临床研究中，每周和每3周之间进行注射以替换被清除的材料。大多数研究集中在表征滑液的粘度；然而，注射后的滑液粘度低于注射的HA溶液的粘度，因为滑液会被迅速清除(Goto等人，“Intra-articular injection of hyaluronate(SI-6601D)improves joint painand synovial fluid prostaglandin E2 levels in rheumatoid arthritis:amulticenter clinical trial,”Clin.Exp.Rheumatol.,19:377-383(2001)。
方法：制备用于骨关节炎的HA-肟凝胶的程序类似于实例1和实例5中描述的程序。
结果：用Alexa Fluor-647标记的HA-肟凝胶可以用33号针头注射至小鼠的滑液腔中(图40A)。制备用于骨关节炎的HA-肟凝胶的程序类似于实例1和实例5中描述的程序。
实例14-用于细胞移植的可注射水凝胶
本实例描述了使用酮改性的HA的HA-肟凝胶作为可注射水凝胶用于体内细胞递送的应用。
方法：制备用于细胞移植的HA-肟凝胶的程序类似于实例1中描述的程序以及实例9中基质金属蛋白酶肽交联剂(MMPOA2)的制备。
源自患者的异种移植物：在取自PDX肿瘤(DCXTO.58)的类器官中建立了取自肝转移的乳腺癌患者的细胞。将细胞在50μL基质胶中以400,000个细胞·mL-1扩增，直至第11代。为了制备用于注射的细胞，从孔中去除培养基，并将类器官用500μL TrypLE表达酶解离并孵育30分钟。用涂有1％FBS(在PBS中)的吸头移液来破坏基质胶，以防止基质或类器官的吸附。进一步孵育10分钟后，合并孔中的内容物并以1,000RPM离心5分钟。去除上清液，将沉淀物重新悬浮在5mL冷完全培养基中并再次沉淀。去除上清液后，将细胞用PBS洗涤两次，离心沉淀并通过进行1:10的稀释将细胞密度定量。通过将层粘连蛋白(2mg·mL-1)或胶原蛋白(0.5mg·mL-1)与相应的具有匹配体外研究的1.6mM MMPOA2肽交联剂的HA-肟软凝胶混合，将细胞与HA溶液混合并在注射前储存在冰上。对于DCXTO.58PDX，麻醉20只至少5周龄的雌性SCID小鼠，在下腹部切开一个切口，用27号针头将含有1x106个细胞的100μL基质递送至乳腺脂肪垫内。使用夹子闭合伤口，并给予小鼠术后镇痛剂以减轻术后疼痛。在细胞植入后跟踪肿瘤生长两周，并使用以下方程计算：体积＝0.5×长×宽×高。
结果：当用HA-肟水凝胶配制时，在通过27号规格注射后生存的细胞类似于用基质胶时(图41)。为了研究HA-肟水凝胶在细胞移植中的应用，我们使用了临床相关的三阴性(DCBXTO.58)细胞，这些细胞来源于被表征为三阴性乳腺癌(ER-，PR-，HER2-)且转移至肝脏的患者肿瘤，在肝脏处进行活检。比较了三种水凝胶制剂：3种HA-肟制剂，含有0.8wt％HA和1.6mM MMPOA2，并且无添加剂(HA Soft)或含有层粘连蛋白(LAM)(2,000μg·mL-1)、胶原蛋白(COLL)(500μg·mL-1)。然后将细胞封装在HA Soft、HA+LAM和HA+COLL中，然后注射至scid小鼠的乳腺脂肪垫中，这表明它们支持体内生长(图42)。
实例15-环丁酮(HAC)改性的透明质酸的合成
本实例描述了用环丁酮官能团改性的HA的合成。在下面的方案中概述了合成步骤。
DMTMM步骤和脱保护步骤的程序与实例1中描述的程序类似。用于表征HAC的1HNMR示于图43.
其他实施例
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用以其整体并入本文，并入程度如同单个出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示通过引用以其整体并入一样。当发现本申请中的术语在通过引用并入本文的文件中被不同地定义时，本文提供的定义用作该术语的定义。
本申请要求于2019年7月3日提交的美国临时序列号62/870,497的权益，其全部内容通过引用并入本文。
虽然已经结合其特定实施例对本发明进行描述，但是应当
理解，本发明能够进行进一步的修改，并且本申请旨在覆盖以下本发明的任何变型、用途或改编，通常，本发明的原理以及包括与本公开的此类偏离均落入本发明所属领域的已知或惯常实践之内，并且可以应用于前文阐述的基本特征，并落入权利要求的范围内。
其他实施例在权利要求的范围内。

Claims (178)

1.一种式(I)化合物：
HAP-K
(I)，
其中
HAP为透明质酸聚合物；并且
K为携带能够与氧胺反应形成肟的酮基团的部分，其中所述酮基团通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C6上的取代基与所述透明质酸聚合物共价连接，所述部分具有式(Ia)或式(Ib)的结构：
其中
RX为C1-20亚杂烷基，其中所述C1-20亚杂烷基通过酰胺键与葡糖醛酸的C6结合；并且
R1为C1-6烷基，
或其盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其进一步以式(III)描述：
[A]n[B]m[C]1-(n+m)
(III)，
其中[A]具有式(IIIa)的结构：
其中
RA1、RA2、RA3、RA4、RA5和RA6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；并且
K为通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C6上的取代基与所述透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Ia)或式(Ib)的结构：
其中
RX为C1-20亚杂烷基，其中所述C1-20亚杂烷基通过酰胺键与葡糖醛酸的C6结合；并且
R1为C1-6烷基，
[B]具有式(IIIb)的结构：
其中
RB1、RB3、RB4、RB5和RB6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；
RB2为H、C1-12酰基、C1-12烷基或C1-12杂烷基，其中的每一个任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；
RB7为H或C1-6烷基；
Y为NRB8、O或S；
Z为NRB9、O或S；并且
RB8和RB9中的每一个独立地为H或C1-6烷基；
[C]具有式(IIIc)的结构：
其中
RC1、RC2、RC3、RC4、RC5和RC6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；并且
Ma为阳离子；
并且
n和m中的每一个独立地为大于零且小于1的分数，其中(n+m)<1。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中K具有式(Ia)的结构：
4.根据权利要求1所述的化合物，其中R1为–CH3或–CH2CH3。
5.根据权利要求1或2所述的化合物，其中K具有式(Ib)的结构：
6.根据权利要求5所述的化合物，其中K具有的结构。
7.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RA1为H。
8.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RA2为H。
9.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RA3为H。
10.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RA4为
11.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RA5为H。
12.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RA6为H。
13.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RB1为H。
14.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RB2为H。
15.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RB3为H。
16.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RB4为
17.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RB5为H。
18.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RB6为H。
19.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RB7为H。
20.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中Y为O。
21.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中Z为O。
22.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RC1为H。
23.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RC2为H。
24.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RC4为
25.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RC5为H。
26.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中RC6为H。
27.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中m和n介于0.35到0.65之间。
28.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中m和n介于0.45到0.55之间。
29.根据权利要求2、4和6中任一项所述的化合物，其中[A]具有式(A1)的结构：
其中p为1、2、3、4、5或6。
30.根据权利要求29所述的化合物，其中p为3。
31.根据权利要求2、4、6和30中任一项所述的化合物，其中[B]具有式(B1)的结构：
32.根据权利要求2、4、6和30中任一项所述的化合物，其中[C]具有式(C1)的结构：
33.一种(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(IV-i)或式(IV-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物：
其中
R1为C1-6烷基，
RX为通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C6上的取代基与所述透明质酸聚合物共价连接的部分；
RX为C1-20亚杂烷基，其中所述C1-20亚杂烷基通过酰胺键与葡糖醛酸的C6结合；并且
RY为从所述多聚体聚合性交联剂形成的片段，
或其盐。
34.根据权利要求33所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂为能够与式(IV-i)的两个连接基团共价连接的二聚体、能够与式(IV-i)的三个连接基团共价连接的三聚体、能够与式(IV-i)的四个连接基团共价连接的四聚体、能够与式(IV-i)的五个连接基团共价连接的五聚体、能够与式(IV-i)的六个连接基团共价连接的六聚体、能够与式(IV-i)的七个连接基团共价连接的七聚体、或能够与式(IV-i)的八个连接基团共价连接的八聚体。
35.根据权利要求34所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂为能够与式(IV-i)的四个连接基团共价连接的四聚体。
36.根据权利要求33所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂为能够与式(IV-ii)的两个连接基团共价连接的二聚体、能够与式(IV-ii)的三个连接基团共价连接的三聚体、能够与式(IV-ii)的四个连接基团共价连接的四聚体、能够与式(IV-ii)的五个连接基团共价连接的五聚体、能够与式(IV-ii)的六个连接基团共价连接的六聚体、能够与式(IV-ii)的七个连接基团共价连接的七聚体、或能够与式(IV-ii)的八个连接基团共价连接的八聚体。
37.根据权利要求36所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂为能够与式(IV-ii)的四个连接基团共价连接的四聚体。
38.根据权利要求33至37中任一项所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂具有小于100MDa的平均分子量。
39.根据权利要求33至37中任一项所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂具有小于500kDa的平均分子量。
40.根据权利要求33至37中任一项所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂具有小于30kDa的平均分子量。
41.根据权利要求33至37中任一项所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂具有100Da至30kDa的平均分子量。
42.根据权利要求33至37中任一项所述的交联聚合物，其中RY包含C1-200亚烷基、C2-200亚烯基、C2-200亚炔基、C1-200亚杂烷基、C2-200亚杂烯基或C2-200亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
43.根据权利要求42所述的交联聚合物，其中RY包含任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-200亚杂烷基。
44.根据权利要求43所述的交联聚合物，其中RY为任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-200亚杂烷基。
45.根据权利要求44所述的交联聚合物，其中用于形成式(IV-i)或式(IV-ii)的所述交联聚合物的所述多聚体聚合性交联剂具有式(IVa)的结构：
其中a为介于1到90之间的整数。
46.根据权利要求45所述的交联聚合物，其中a为29。
47.根据权利要求45所述的交联聚合物，其中a为54。
48.根据权利要求44所述的交联聚合物，其中用于形成式(IV-i)或式(IV-ii)的所述交联聚合物的所述多聚体聚合性交联剂具有式(IVb)的结构：
其中b为介于1到90之间的整数。
49.根据权利要求48所述的交联聚合物，其中b为75。
50.根据权利要求42所述的交联聚合物，其中RY进一步包含多肽。
51.根据权利要求50所述的交联聚合物，其中所述多肽包含细胞粘附肽。
52.根据权利要求50或51所述的交联聚合物，其中所述多肽包含RGD肽。
53.根据权利要求50或51所述的交联聚合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的序列。
54.一种水凝胶，其包含根据权利要求33至53中任一项所述的交联聚合物。
55.根据权利要求54所述的水凝胶，其中所述水凝胶为玻璃体替代物。
56.根据权利要求55所述的玻璃体替代物在制备用于治疗疾患的药物中的用途，其中所述玻璃体替代物用于注射至有此需要的受试者的眼睛内。
57.根据权利要求54所述的水凝胶在制备用于治疗疾患的药物中的用途，其中所述水凝胶用于关节内注射至有此需要的受试者。
58.根据权利要求54所述的水凝胶在制备用于治疗疾患的药物中的用途，其中所述水凝胶用于注射至有此需要的受试者的滑液腔内。
59.一种水凝胶细胞培养物，其包含根据权利要求33至53中任一项所述的交联聚合物和至少一个细胞。
60.根据权利要求59所述的水凝胶细胞培养物，其进一步包含促进生理相关组织的生长的至少一种药剂。
61.根据权利要求59所述的水凝胶细胞培养物，其进一步包含选自由胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白组成的组的细胞外基质蛋白。
62.根据权利要求59至61中任一项所述的水凝胶细胞培养物，其中所述水凝胶细胞培养物为癌症的体外筛选模型。
63.根据权利要求62所述的水凝胶细胞培养物，其中所述癌症为乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤癌、肺癌、脑癌、卵巢癌或前列腺癌。
64.根据权利要求63所述的水凝胶细胞培养物，其中至少一个细胞经体内移植。
65.一种制备根据权利要求33至53中任一项所述的交联聚合物的方法，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求1至32中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物。
66.一种制备包含根据权利要求33至53中任一项所述的交联聚合物的水凝胶的方法，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求1至32中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物。
67.第一组合物和第二组合物在制备药物中的用途，所述药物用于形成包含根据权利要求33至53中任一项所述的交联聚合物的玻璃体替代物的方法中，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求1至32中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物，其中所述混合物被注射至受试者的眼睛内。
68.根据权利要求67所述的用途，其中所述受试者患有视网膜脱离。
69.一种形成三维水凝胶的方法，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求1至32中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)在存在至少一个细胞的情况下，将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物，
其中当在所述三维水凝胶中培养至少一个细胞时，所述三维水凝胶支持生理相关组织的生长。
70.一种形成包含根据权利要求33至53中任一项所述的交联聚合物的三维水凝胶的方法，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求1至32中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)在存在至少一个细胞的情况下，将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物，
其中当在所述三维水凝胶中培养至少一个细胞时，所述三维水凝胶支持生理相关组织的生长。
71.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述混合在存在至少一种促进生理相关组织的生长的药剂的情况下进行。
72.根据权利要求69或70所述的方法，其中所述混合在存在选自由胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白组成的组的细胞外基质蛋白的情况下进行。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白为层粘连蛋白。
74.根据权利要求69至70和73中任一项所述的方法，其中所述细胞为乳腺癌细胞。
75.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的浓度为至少0.5wt％交联聚合物。
76.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中步骤(iii)在37℃的温度进行。
77.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的pH水平为小于9.0。
78.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的pH水平为6.0至8.5。
79.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的pH水平为7.0至8.0。
80.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的pH水平为7.4。
81.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中步骤(ii)包括形成包含摩尔比为5:1至1:1的所述第一组合物和所述第二组合物的混合物。
82.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中所述多聚体聚合性交联剂携带两个末端氧胺基团。
83.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中所述多聚体聚合性交联剂携带四个末端氧胺基团。
84.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中具有所述携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂的根据权利要求1至32中任一项所述的化合物的交联程度为介于0.01％到80％之间。
85.根据权利要求65至70和73中任一项所述的方法或用途，其中所述方法进一步包括：
(iv)提供第三组合物，其包含醛改性的透明质酸；以及
(v)将所述混合物与所述第三组合物合并。
86.根据权利要求85所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有在HBS中在37℃介于1秒到24小时之间的胶凝时间。
87.根据权利要求85所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于1秒到30秒之间的胶凝时间。
88.根据权利要求85所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于10秒到1分钟之间的胶凝时间。
89.根据权利要求85所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于30秒到5分钟之间的胶凝时间。
90.根据权利要求85所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于1分钟到30分钟之间的胶凝时间。
91.根据权利要求85所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于1分钟到1小时之间的胶凝时间。
92.根据权利要求85所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于30分钟到1小时之间的胶凝时间。
93.根据权利要求85所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于1小时到24小时之间的胶凝时间。
94.根据权利要求65至70中任一项所述的方法或用途，其中所述交联聚合物在HBS中在37℃历经28天失去至多5％的质量。
95.一种式(V)化合物：
HAP-OA
(V)，
其中
HAP为透明质酸聚合物；并且
OA为通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C6上的取代基与所述透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Va)的结构：
其中
RW为C1-20亚杂烷基，其中所述C1-20亚杂烷基通过酰胺键与葡糖醛酸的C6结合；并且
R3为H或C1-6烷基，
或其盐。
96.根据权利要求95所述的化合物，其进一步以式(VII)描述：
[D]q[E]r[F]1-(q+r)
(VII)，
其中
[D]具有式(VIIa)的结构：
其中
RD1、RD2、RD3、RD4、RD5和RD6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；并且
OA为通过D-葡糖醛酸或其衍生物的C6上的取代基与所述透明质酸聚合物共价连接的部分，其具有式(Va)的结构：
其中
RW为C1-20亚杂烷基，其中所述C1-20亚杂烷基通过酰胺键与葡糖醛酸的C6结合；并且
R3为H或C1-6烷基；
[E]具有式(VIIb)的结构：
其中
RE1、RE3、RE4、RE5和RE6中的每一个独立地为H，任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基，或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12杂烷基；
RE2为H、C1-12酰基、C1-12烷基或C1-12杂烷基，其中的每一个任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代；
RE7为H或C1-6烷基；
Y2为NRE8、O或S；
Z2为NRE9、O或S；并且
RE8和RE9中的每一个独立地为H或C1-6烷基；
[F]具有式(VIIc)的结构：
其中
RF1、RF2、RF3、RF4、RF5和RF6中的每一个独立地为H或任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、
氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-12烷基；并且
Mb为阳离子；并且
q和r中的每一个独立地为大于零且小于1的分数，其中(q+r)<1。
97.根据权利要求95或96所述的化合物，其中R3为H。
98.根据权利要求96所述的化合物，其中RD1为H。
99.根据权利要求96所述的化合物，其中RD2为H。
100.根据权利要求96所述的化合物，其中RD3为H。
101.根据权利要求96所述的化合物，其中RD4为
102.根据权利要求96所述的化合物，其中RD5为H。
103.根据权利要求96所述的化合物，其中RD6为H。
104.根据权利要求96所述的化合物，其中RE1为H。
105.根据权利要求96所述的化合物，其中RE2为H。
106.根据权利要求96所述的化合物，其中RE3为H。
107.根据权利要求96所述的化合物，其中RE4为
108.根据权利要求96所述的化合物，其中RE5为H。
109.根据权利要求96所述的化合物，其中RE6为H。
110.根据权利要求96所述的化合物，其中RE7为H。
111.根据权利要求96所述的化合物，其中Y2为O。
112.根据权利要求96所述的化合物，其中Z2为O。
113.根据权利要求96所述的化合物，其中RF1为H。
114.根据权利要求96所述的化合物，其中RF2为H。
115.根据权利要求96所述的化合物，其中RF4为
116.根据权利要求96所述的化合物，其中RF5为H。
117.根据权利要求96所述的化合物，其中RF6为H。
118.根据权利要求96所述的化合物，其中q和r介于0.35到0.65之间。
119.根据权利要求96所述的化合物，其中q和r介于0.45到0.55之间。
120.根据权利要求96所述的化合物，其中[D]具有式(D1)的结构：
其中s为1、2、3、4、5或6。
121.根据权利要求120所述的化合物，其中s为2。
122.根据权利要求96或121所述的化合物，其中[E]具有式(E1)的结构：
123.根据权利要求96或121所述的化合物，其中[F]具有式(F1)的结构：
124.一种(i)透明质酸聚合物与(ii)多聚体聚合性交联剂通过式(VIII-i)或式(VIII-ii)的至少一个连接基团缀合的交联聚合物：
其中
R4为C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6杂烷基、C2-6杂烯基、C2-6杂炔基、C3-10碳环基、C6-10芳基、C2-9杂环基或C2-9杂芳基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代，
RW为与所述透明质酸聚合物共价连接的部分；
RW为C1-20亚杂烷基，其中所述C1-20亚杂烷基通过酰胺键与葡糖醛酸的C6结合；并且
RZ为从所述多聚体聚合性交联剂形成的片段，
或其盐。
125.根据权利要求124所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂为能够与式(VIII-i)的两个连接基团共价连接的二聚体、能够与式(VIII-i)的三个连接基团共价连接的三聚体、能够与式(VIII-i)的四个连接基团共价连接的四聚体、能够与式(VIII-i)的五个连接基团共价连接的五聚体、能够与式(VIII-i)的六个连接基团共价连接的六聚体、能够与式(VIII-i)的七个连接基团共价连接的七聚体、或能够与式(VIII-i)的八个连接基团共价连接的八聚体。
126.根据权利要求124所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂为能够与式(VIII-ii)的两个连接基团共价连接的二聚体、能够与式(VIII-ii)的三个连接基团共价连接的三聚体、能够与式(VIII-ii)的四个连接基团共价连接的四聚体、能够与式(VIII-ii)的五个连接基团共价连接的五聚体、能够与式(VIII-ii)的六个连接基团共价连接的六聚体、能够与式(VIII-ii)的七个连接基团共价连接的七聚体、或能够与式(VIII-ii)的八个连接基团共价连接的八聚体。
127.根据权利要求124至126中任一项所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂具有小于100MDa的平均分子量。
128.根据权利要求124至126中任一项所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂具有小于500kDa的平均分子量。
129.根据权利要求124至126中任一项所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂具有小于30kDa的平均分子量。
130.根据权利要求124至126中任一项所述的交联聚合物，其中所述多聚体聚合性交联剂具有100Da至30kDa的平均分子量。
131.根据权利要求124至126中任一项所述的交联聚合物，其中RZ包含C1-200亚烷基、C2-200亚烯基、C2-200亚炔基、C1-200亚杂烷基、C2-200亚杂烯基或C2-200亚杂炔基，其中的任一者任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代。
132.根据权利要求131所述的交联聚合物，其中RZ包含任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-200亚杂烷基。
133.根据权利要求132所述的交联聚合物，其中RZ为任选地经氧代、卤素、羟基、烷氧基、叠氮基、氰基、硝基、氨基和巯基中的一者或多者取代的C1-200亚杂烷基。
134.根据权利要求133所述的交联聚合物，其中RZ进一步包含多肽。
135.根据权利要求134所述的交联聚合物，其中所述多肽包含细胞粘附肽。
136.根据权利要求134或135所述的交联聚合物，其中所述多肽包含RGD肽。
137.根据权利要求131所述的交联聚合物，其中所述多肽包含SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2的序列。
138.一种水凝胶，其包含根据权利要求124至137中任一项所述的交联聚合物。
139.根据权利要求138所述的水凝胶，其中所述水凝胶为玻璃体替代物。
140.根据权利要求139所述的玻璃体替代物在制备用于治疗疾患的药物中的用途，其中所述玻璃体替代物用于注射至有此需要的受试者的眼睛内。
141.根据权利要求138所述的水凝胶在制备用于治疗疾患的药物中的用途，其中所述水凝胶用于关节内注射。
142.根据权利要求138所述的水凝胶在制备用于治疗疾患的药物中的用途，其中所述水凝胶用于注射至有此需要的受试者的滑液腔内。
143.一种水凝胶细胞培养物，其包含根据权利要求124至137中任一项所述的交联聚合物和至少一个细胞。
144.根据权利要求143所述的水凝胶细胞培养物，其进一步包含促进生理相关组织的生长的至少一种药剂。
145.根据权利要求144所述的水凝胶细胞培养物，其进一步包含选自由胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白组成的组的细胞外基质蛋白。
146.根据权利要求143至145中任一项所述的水凝胶细胞培养物，其中所述水凝胶细胞培养物为癌症的体外筛选模型。
147.根据权利要求146所述的水凝胶细胞培养物，其中所述癌症为乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、淋巴瘤癌、肺癌、脑癌、卵巢癌或前列腺癌。
148.根据权利要求143所述的水凝胶细胞培养物，其中至少一个细胞经体内移植。
149.一种制备根据权利要求124至137中任一项所述的交联聚合物的方法，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求95至123中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个酮基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物。
150.一种制备包含根据权利要求124至137中任一项所述的交联聚合物的水凝胶的方法，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求95至123中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个酮基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物。
151.第一组合物和第二组合物在制备药物中的用途，所述药物用于形成包含根据权利要求124至137中任一项所述的交联聚合物的玻璃体替代物的方法，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求95至123中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个酮基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物，其中所述混合物被注射至受试者的眼睛内。
152.根据权利要求151所述的用途，其中所述受试者患有视网膜脱离。
153.一种形成三维水凝胶的方法，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求95至123中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个酮基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)在存在至少一个细胞的情况下，将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物，
其中当在所述三维水凝胶中培养至少一个细胞时，所述三维水凝胶支持生理相关组织的生长。
154.一种形成包含根据权利要求124至137中任一项所述的交联聚合物的三维水凝胶的方法，所述方法包括：
(i)提供第一组合物，其包含根据权利要求95至123中任一项所述的化合物；
(ii)提供第二组合物，其包含携带一个或多个酮基团的多聚体聚合性交联剂；以及
(iii)在存在至少一个细胞的情况下，将所述第一组合物与所述第二组合物合并以形成混合物，
其中当在所述三维水凝胶中培养至少一个细胞时，所述三维水凝胶支持生理相关组织的生长。
155.根据权利要求153或154所述的方法，其中所述混合在存在至少一种促进生理相关组织的生长的药剂的情况下进行。
156.根据权利要求153或154所述的方法，其中所述混合在存在选自由胶原蛋白、纤连蛋白和层粘连蛋白组成的组的细胞外基质蛋白的情况下进行。
157.根据权利要求156所述的方法，其中所述细胞外基质蛋白为层粘连蛋白。
158.根据权利要求153至154和157中任一项所述的方法，其中所述细胞为乳腺癌细胞。
159.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的浓度为至少0.5wt％交联聚合物。
160.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中步骤(iii)在37℃的温度进行。
161.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的pH水平为小于9.0。
162.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的pH水平为6.0至8.5。
163.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的pH水平为7.0至8.0。
164.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中所述混合物的pH水平为7.4。
165.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中步骤(ii)包括形成包含摩尔比为5:1至1:1的所述第一组合物和所述第二组合物的混合物。
166.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中所述多聚体聚合性交联剂携带两个末端氧胺基团。
167.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中所述多聚体聚合性交联剂携带四个末端氧胺基团。
168.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中具有所述携带一个或多个末端氧胺基团的多聚体聚合性交联剂的根据权利要求87至117中任一项所述的化合物的交联程度为介于0.01％到80％之间。
169.根据权利要求150至154和157中任一项所述的方法或用途，其中所述方法进一步包括：
(iv)提供第三组合物，其包含醛改性的透明质酸；以及
(v)将所述混合物与所述第三组合物合并。
170.根据权利要求169所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有在HBS中在37℃介于1秒到24小时之间的胶凝时间。
171.根据权利要求169所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于1秒到30秒之间的胶凝时间。
172.根据权利要求169所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于10秒到1分钟之间的胶凝时间。
173.根据权利要求169所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于30秒到5分钟之间的胶凝时间。
174.根据权利要求169所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于1分钟到30分钟之间的胶凝时间。
175.根据权利要求169所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于1分钟到1小时之间的胶凝时间。
176.根据权利要求169所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于30分钟到1小时之间的胶凝时间。
177.根据权利要求169所述的方法或用途，其中步骤(iii)和/或步骤(v)在存在时具有介于1小时到24小时之间的胶凝时间。
178.根据权利要求169所述的方法或用途，其中所述交联聚合物在HBS中在37℃历经28天失去至多5％的质量。
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人脐带透明质酸的制备及其动物实验;沈渤江等;《中国生化药物杂志》;19961231(第03期);第1-5页 *
顾其胜 等.《实用生物医用材料学》.上海科学技术出版社,2005,(第01版),第124-125页. *

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