CN106852914A - 一种peg原位共价接枝改性海藻酸盐微囊及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及了一种新型PEG原位共价接枝改性海藻酸盐/聚阳离子微胶囊。微胶囊为海藻酸盐的水凝胶珠，或，微胶囊内部为海藻酸盐的液体或水凝胶，外表面为通过聚阳离子和海藻酸盐形成的聚电解质复合水凝胶膜，在微胶囊上通过烯烃基与海藻酸盐羟基位点上取代的叠氮基发生点击化学反应生成共价键，将PEG原位共价接枝到海藻酸盐凝胶珠表面，或海藻酸盐/聚阳离子/海藻酸盐微胶囊上，产品主要用于生物活性物质以为活细胞的包埋。其微胶囊膜在保持优良生物相容性的同时，兼顾了优越的膜强度，保证了作为组织细胞移植、细胞培养应用过程中膜的完整性，通过大幅度提高PEG在微胶囊表面的接枝程度，具有很好的抗蛋白吸附性能。
Description
技术领域
本发明涉及了一种海藻酸盐/聚阳离子微胶囊产品，具体地说是一种新型PEG原位共价接枝改性海藻酸盐/聚阳离子微胶囊。
背景技术
自20世纪60年代,Chang报道了半透膜微胶囊,指出用其包埋蛋白质、酶等生物活性物质和细胞,可保持生物物质活性[Chang TMS.Semipermeable microcapsules,Science,1964,146:524-525]。20世纪80年代初,Lim和Sun针对组织/细胞功能缺损性疾病(如糖尿病),成功制备了海藻酸钠/α-聚赖氨酸(alginate/α-polylysine)半透膜微胶囊(简称α-APA微胶囊),包封Wistar大鼠胰岛细胞并移植入糖尿病WistarLewis大鼠体内,分泌释放胰岛素以调控血糖量[Lim F,Sun A M.Microencapsulated islets bioartificial endocrine pancreas,Science,1980,210:908-910]。由此推动了微囊化技术相关材料和制备方法研究的快速发展,在细胞移植、药物释放和基因治疗等生物医学领域的临床前研究中得到广泛应用[Wang W,Liu XD,Ma XJ,et al.Microencapsulation using natural polysaccharides for drug delivery and cell implantation,J.Mater.Chem.,2006,16:3252-3267]。随后，取自天然的多糖材料——壳聚糖由于成本低，成膜性能好，膜机械强度高，而被研究者看好用于聚赖氨酸替代品，越来越多的用于细胞包埋用微胶囊的制备[L.Baruch,M.Machluf,Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation:Effect on mechanical properties and on long-term viability,Biopolymers 82(2006):570-579]。但现有用于细胞包埋的海藻酸盐/聚阳离子微胶囊因其具有很大的表面粗糙度和表面电荷，导致移植体内后易引起蛋白吸附，进一步激发机体纤维化反应，致使移植体功能丧失。PEG由于具有良好的亲水性、链段柔韧性、稳定的空间结构等优点，被广泛应用于生物材料的抗蛋白修饰领域。目前通常采用的静电吸附、掺杂共混的方法实现PEG修饰微胶囊却存在稳定性差、排阻体积小、无法形成PEG刷状结构等缺陷。此外，针对于海藻酸微胶囊的PEG共价修饰主要发生在海藻酸的羧基部位[马小军，刘晓岑，PEG原位共价接枝的海藻酸盐微胶囊及其制备和应用，申请号：201410191312.5]，而受限于微囊的稳定性，以海藻酸的羧基为反应位点的微囊表面PEG修饰无法实现更高的PEG接枝率，导致修饰后微囊抗蛋白污染的能力提升有限。
发明内容
针对上述问题，本发明提出将PEG用于生物微胶囊的制备，发明了一种新型PEG原位共价接枝的海藻酸盐-聚阳离子微胶囊产品，以海藻酸盐的羟基作为 反应位点，利用点击化学的方法将高密度梳状结构的PEG通过共价键接枝到海藻酸盐微胶囊表面，既能避免反应位点为羧基时导致的微囊机械强度降低，同时又大大增加了PEG原位反应的位点，有效的增加了PEG在微囊表面的接枝密度，在保证微胶囊强度不被影响的前提下，实现显著的抗蛋白吸附效果，解决微胶囊体内移植后蛋白吸附及纤维化问题。
本发明采用的技术方案为：
本发明的一种新型PEG原位接枝改性海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，微胶囊为含有活细胞的海藻酸盐的水凝胶珠，海藻酸盐经叠氮化合物共价接枝改性其羟基基团，水凝胶珠表面由PEG原位共价接枝改性，水凝胶珠上的海藻酸盐与PEG的质量比为10:1-1:100；
或，微胶囊内部为含有活细胞的海藻酸盐的液体或水凝胶，海藻酸盐经叠氮化合物共价接枝改性其羟基基团，微胶囊表面为通过聚阳离子和海藻酸盐形成的聚电解质复合水凝胶膜，聚电解质复合水凝胶膜再由PEG原位共价接枝改性，聚电解质复合水凝胶膜中的海藻酸盐：聚阳离子：PEG的质量比为：10:1:1-1:10:100。
其中，修饰后微胶囊产品为粒径100-1000微米的球形微胶囊；修饰后微胶囊膜厚度在1-100微米；叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸盐的分子量为10kDa–2000kDa(例如：50kDa-200kDa；200kDa-500kDa；600kDa-1000kDa；1000kDa-2000kDa)；叠氮化物在海藻酸盐羟基位点的接枝率为1％-200％。微胶囊膜中聚阳离子材料包括：壳聚糖，其脱乙酰度为80-98％，分子量为1kDa-800kDa(例如：1kDa-5kDa；10kDa-20kDa；50kDa-100kDa；100kDa-800kDa)；α-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa(例如：2kDa-10kDa；70kDa-150kDa；150kDa-300kDa；300kDa-500kDa)；ε-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa(例如：2kDa-50kDa；50kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)；聚精氨酸，分子量为1kDa-500kDa(例如：1kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)；聚鸟氨酸，分子量为1kDa-500kDa(例如：1kDa-50kDa；50kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)；聚组氨酸，分子量为1kDa-500kDa(例如：1kDa-50kDa；50kDa-100kDa；100kDa-350kDa；350kDa-500kDa)。PEG-NH2分子量为100Da-1000kDa(例如：100-5kDa；5kDa-50kDa；50kDa-500kDa；500kDa-1000kDa)，PEG-NH2末端氨基的取代度为10％-100％。内核中海藻酸盐接枝叠氮化物的浓度在1-50g/L；内核中细胞含量102-109个细胞/ml内核体积，活性保持90％以上。
水凝胶珠或微胶囊内核中的海藻酸盐水凝胶为海藻酸的二价金属钙、钡或锌、或者三价金属钆盐中的一种或二种以上的叠氮化合物共价接枝羟基位点的海藻酸盐水凝胶；微胶囊内核中的海藻酸盐溶液为叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸的钾盐或钠盐溶液。
所用的叠氮化物包括下述中的一种或二种以上：末端含有伯氨基的1,2,3,4-四嗪、1,2,4,5-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及上述三种四嗪中任意一种在 6-位取代有苯环基、氨基、酰基、磺酰基等任意一种基团的四嗪衍生物；海藻酸盐羟基位点的叠氮化物接枝率(每100个海藻酸盐羟基接枝的叠氮化物分子百分数)为1％-200％。
微胶囊中PEG原位共价接枝改性到微胶囊表面海藻酸盐分子链上的产物反应示意式为：
其中，PEG的末端首先通过胺化得到末端氨基化PEG(PEG-NH2)，PEG的聚合度n为2-2500，PEG分子量为100Da-100kDa，PEG末端氨基的取代度(每100个PEG末端氨基取代的百分数)为10％-100％；其次末端氨基化PEG再利用酰胺化反应与烯烃基化合物相结合修饰，氨基化PEG的修饰率(每100个氨基化PEG末端氨基被烯烃基取代的百分数)为10％-100％；最后在微囊上通过烯烃基与海藻酸盐上的叠氮基发生点击化学反应生成共价键，将PEG原位共价接枝到海藻酸盐凝胶珠表面或聚电解质复合水凝胶膜外表面，PEG的接枝率(每100 个海藻酸盐单体接枝的PEG百分数)为1％-100％；
其中，烯烃化合物修饰PEG中所使用的烯烃化合物包括下述任意一种：含有碳碳双键(-C＝C-)、碳碳三键(-C≡C-)的C3～C18的直链脂肪烯烃或炔烃，或含有碳碳双键(-C＝C-)、碳碳三键(-C≡C-)的C4～C18的闭合环状脂肪烯烃或炔烃，以及上述任意一种烯烃或炔烃中在脂肪碳链上有苯环基、酰氯基、氨基等任意一种基团取代的衍生物。
聚阳离子材料包括下述任意一种或两种以上：壳聚糖，其脱乙酰度为80-98％，分子量为1kDa-800kDa；α-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa；ε-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa；聚精氨酸，分子量为1kDa-500kDa；聚鸟氨酸，分子量为1kDa-500kDa；聚组氨酸，分子量为1kDa-500kDa。微胶囊产品的膜成分中的海藻酸盐为叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸的钾盐或钠盐，接枝率1％-200％；或者为海藻酸的钾盐或钠盐。
上述的微胶囊可以是直接由经叠氮化物共价接枝羟基位点后的海藻酸盐经螯合制备得到三维凝胶珠，或者是外层再由海藻酸盐和聚阳离子两种高分子材料通过层层自组装形成聚电解质复合水凝胶膜，再通过共价键将烯烃化合物修饰的PEG原位接枝到微胶囊表面暴露出的叠氮基基团上。
产品的具体制备步骤为：
1)利用溴化氰活化法制备叠氮化物共价接枝改性羟基基团的海藻酸盐材料：
制备海藻酸溶液，将海藻酸溶于水中制备成1-5g/L的海藻酸溶液，NaOH溶液调节海藻酸溶液pH在10-11之间；称取溴化氰固体溶解后滴加于海藻酸溶液中，在pH 10-11之间对海藻酸钠羟基位点进行活化，室温活化1-3小时；超滤清洗除去未反应的溴化氰后，加入含伯氨基的叠氮化物，室温反应48小时；超滤纯化，对回收的产物溶液进行冷冻干燥得到叠氮化物共价接枝羟基基团的海藻酸盐材料其中，海藻酸盐接枝叠氮化物的分子量为10kDa-2000kDa；海藻酸盐接枝叠氮化物的接枝率为1％-200％；溴化氰投入摩尔量：海藻酸盐单体摩尔量为0.01:1-2:1，叠氮化物投入投入摩尔量：海藻酸盐单体摩尔量为0.01:1-2:1。
2)制备海藻酸盐凝胶微球，即将步骤1)制备的材料配制成1-50g/L的海藻酸盐溶液，然后通过锐孔挤出法、静电液滴法或乳化法等制备成海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球，其中海藻酸盐凝胶为海藻酸的二价金属钙、钡或锌，或者三价金属钆中一种或二种以上的叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸盐的水凝胶；
3)将步骤2)中的A微球浸入到烯烃化合物修饰的末端氨基化PEG的溶液中，微球与PEG溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤，即为表面由PEG原位共价接枝改性的海藻酸盐水凝胶珠产品；
烯烃化合物修饰末端氨基化PEG的配制方法是：烯烃化合物修饰末端氨基化PEG溶于生理盐水中、或pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中、或PBS溶液中任意一种，烯烃化物修饰末端氨基化PEG浓度为0.1-500g/L；
4)将步骤2)中的A微球浸入聚阳离子溶液中，A微球与聚阳离子溶液体积比为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，称之为C微球，取出用生理盐水洗涤；
聚阳离子溶液的配制方法是：
壳聚糖溶于pH为5.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液或3-9g/L NaCl溶液，壳聚糖浓度为0.1-15g/L；
或，α-聚赖氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，α-聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，ε-聚赖氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，ε-聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，聚精氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚精氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，聚鸟氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鸟氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，聚组氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鸟氨酸浓度为0.01-10g/L；
5)将步骤4)中的C微球浸入碱金属海藻酸钠盐溶液中，C微球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到海藻酸盐-聚阳离子-海藻酸盐微胶囊，称之为D微球，取出用生理盐水洗涤；
碱金属海藻酸盐为海藻酸的钾盐或钠盐，或叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸的钾盐或钠盐，分子量分布为10kDa-2000kDa，海藻酸盐溶液的配制方法是：海藻酸盐溶于3-9g/L NaCl或KCl溶液中，海藻酸盐浓度为0.1-5g/L；
6)交替重复步骤4)和步骤5)的过程1-5次，此时得到的微胶囊为E微球，取出用生理盐水洗涤；
7)将步骤4)或5)或6)中的C或D或E微球浸入到烯烃化物修饰的末端氨基化PEG的溶液中，微球与PEG溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到微胶囊，称之为F微球，取出用生理盐水洗涤，即为内部为海藻酸盐的水凝胶、外表面为由PEG原位共价接枝改性的聚电解质复合水凝胶膜的微胶囊；
烯烃化物修饰末端氨基化PEG的配制方法是：烯烃化物修饰末端氨基化PEG溶于生理盐水中、或pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中、或PBS溶液中任意一种，烯烃化物修饰末端氨基化PEG浓度为0.1-500g/L；
8)将步骤7)中的F微球浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的叠氮化物修饰的海藻酸盐凝胶，F微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态内核的G微球，即内部为海藻酸盐的溶液、外表面为由PEG原位共价接枝改性的聚电解质复合水凝胶膜的微胶囊。
其中，参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA。
微胶囊用于生物活性物质以及活细胞中的一种或二种以上的包埋，所述生物活性物质为酶、激素和蛋白质中的一种或两种以；所述活细胞为人或动物来源的离体的胰岛细胞、肝细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺髓质细胞、 肾小管细胞等具有分泌生物活性物质功能的细胞，细胞系细胞，基因工程细胞，干细胞或干细胞分化的各种细胞。
本发明的有益效果
1、与传统的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊和海藻酸钠-壳聚糖微胶囊相比，本发明的这种新型PEG原位共价接枝改性海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，其微胶囊膜表面因PEG形成高密度伸展梳状结构，具有理想的抗蛋白吸附特性，从而显示出新型微胶囊产品更佳的生物相容性。
2、与经静电吸附或掺杂共混得到的PEG修饰海藻酸钠-聚阳离子微胶囊相比，本发明将PEG通过共价键固定到微胶囊表面海藻酸盐的羧基上，显著提高了PEG修饰的稳定性，并且减少了PEG链与海藻酸钠或聚阳离子大分子链的缠绕作用，使PEG在微胶囊膜表面形成高密度伸展梳状结构，具有理想的抗蛋白吸附效果。
3、与PEG接枝聚阳离子链段为成膜材料制备的海藻酸盐/聚阳离子微胶囊相比，本发明的这种新型PEG原位共价接枝改性海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，选择微胶囊表面大量的羟基基团为反应位点，显著提高了PEG的接枝密度，理论值可达200％，其微胶囊膜表面因PEG形成高密度伸展梳状结构，具有理想的抗蛋白吸附特性，从而显示出新型微胶囊产品更佳的生物相容性。
4、与传统的海藻酸羧基位点接枝改性相比，本发明方法的反应基团被限定在海藻酸盐羟基位点上，不会因羧基反应位点被占据而影响海藻酸的成胶及成膜性能，在保证了PEG高接枝率的同时保证了微胶囊膜的机械稳定性。
5、本发明方法的过程条件温和，利用点击化学实现的原位共价接枝反应速率高、专一性强、副产物简单、无毒性、并且不需要加入如何催化剂，此外叠氮化物修饰的海藻酸盐、烯烃化物修饰的PEG均无毒且可溶于生理盐水中，有利于细胞的活性保持和功能提高，实现载细胞微胶囊在生理条件下的PEG原位共价修饰。
6、本发明产品的微胶囊膜在保持优良生物相容性的同时，兼顾了优越的膜强度，能保证作为组织细胞移植、细胞培养应用过程中膜的完整性。
7、本发明产品的微胶囊膜具有优越的免疫隔离性能，用于异种组织细胞移植时，能保持免疫隔离性能，即微囊内包埋的细胞不能出微胶囊，微囊外的抗体分子、补体分子、免疫细胞不能进入微胶囊内杀死细胞，同时又保持了微胶囊本身应有的通透性，即细胞代谢分泌的活性成分、微胶囊外的营养小分子能自由进出微胶囊。
附图说明
图1为实施例1制备的AB(OH)CPN微胶囊与比较例中制备的AC微胶囊表面IgG和Fgn吸附量的对比。
图2为实施例1制备的AB(OH)CPN微胶囊与比较例中制备的AC微胶囊球磨破碎率的对比。
图3为微胶囊中PEG原位共价接枝改性到微胶囊表面海藻酸盐分子链上的产物反应示意式。
具体实施方式
制备海藻酸盐微球的方法为静电液滴法(参考文献：In Vivo Culture of Encapsulated Endostatin-Secreting Chinese Hamster Ovary Cells for Systemic Tumor Inhibition,Human Gene Therapy.2007,18:474-481)、锐孔挤出法(参考文献：一种高经济鱼类微球开口饵料的制备方法，中国发明专利，200510136769.7)、乳化-外部凝胶化法(参考文献：Preparation of lactic acid bacteria-enclosing alginate beads in emulsion system:effect of preparation parameters on bead characteristics,Polym.Bull.2009,63:599-607)、乳化-内部凝胶化法(参考文献：乳化-内部凝胶化工艺制备固定化酵母微胶囊,化工学报,2009,60(3):710-717)或膜乳化法(参考文献：Preparation of uniform calcium alginate gel beads by membrane emulsification coupled with internal gelation,Journal of Applied Polymer Science,2003,87(5):848-852)；叠氮化物修饰海藻酸盐的方法为溴化氰活化法(参考文献：Systhesis and inclusion property ofα-cyclodextrin-linked alginate,Polymer,2005(46):9778-9783)；烯烃化物修饰PEG-NH2的方法(参考文献：Development of a Bioorthogonal and Highly Efficient Conjugation Method for Quantum Dots Using Tetrazine-Norbornene Cycloaddition,J.AM.CHEM.SOC.2010,132,7838-7839)；烯烃化物修饰PEG-NH2与叠氮化物修饰海藻酸盐共价键和的方法为点击化学反应(参考文献：Tetrazine-Based Cycloadditions:Application to Pretargeted Live Cell Imaging,Bioconjugate Chem.2008,19,2297-2299)。
实施例1
1)制备叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸盐的溶液：将海藻酸钠溶于水中制备成1g/L的海藻酸钠溶液，碱液调节海藻酸溶液pH在10-11之间。称取溴化氰(溴化氰投入投入摩尔量：海藻酸盐单体摩尔量为2:1)溶解后加入海藻酸溶液中，不断调节海藻酸溶液的pH值使之保持在10-11之间，活化时间3小时。超滤除去未反应的溴化氰，加入分子量为187g/mol的3-(4-氨甲基苯基)-1,2,4,5-四嗪(BAT)(叠氮化物投入投入摩尔量：海藻酸盐单体摩尔量为1.5:1)，室温搅拌反应2天。超滤纯化产物，冷冻干燥后得到叠氮化物共价修饰羟基位点的海藻酸钠，叠氮化合物(BAT)的接枝率为120％。将叠氮化物修饰的海藻酸钠溶解在生理盐水中，浓度为15g/L。
2)制备壳聚糖溶液：壳聚糖分子量65kDa，脱乙酰度90％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度5g/L。
3)制备烯烃化物修饰PEG的溶液：PEG-NH2聚合度为44，分子量为2kDa，通过酰胺化法将PEG-NH2末端氨基与5-降冰片烯-2-羧酸的末端羧基共价键和，得到烯烃化物修饰的PEG，溶解在生理盐水中，浓度10g/L。
4)制备AB(OH)C微胶囊：将高压静电法制备的叠氮化物共价接枝羟基的海藻酸钙凝胶珠浸入壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1:10，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AB(OH)C微胶囊。
5)将AB(OH)C微胶囊浸入烯烃化物修饰PEG溶液中，AB(OH)C微胶囊与PEG溶液体积比为1:10，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AB(OH)CPN微胶囊。
6)将AB(OH)CPN微胶囊浸入IgG、Fgn蛋白溶液中2小时，测定蛋白在微胶囊膜表面的吸附量(见图1)，IgG吸附量与比较例相比，下降了86.7％；Fgn吸附量与比较例相比，下降了77.3％。
7)将AB(OH)CPN微胶囊浸入到生理盐水中，玛瑙球磨法考察微囊机械强度，150rpm培养2h后统计微胶囊的破碎率(见图2)，可以看出两者的破碎率统计并没有显著性差异，说明微囊的修饰方法对微囊的机械强度没有显著性影响。
比较例
1)制备海藻酸钠溶液：海藻酸钠分子量350kDa，溶解在生理盐水中，浓度15g/L。
2)制备壳聚糖溶液：壳聚糖分子量65kDa，脱乙酰度90％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度5g/L。
3)制备AC微胶囊：高压静电法制备海藻酸钙凝胶微球，将微球浸入壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1:10，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AC微胶囊。
4)将AC微胶囊浸入IgG、Fgn蛋白溶液中2小时，测定蛋白在微胶囊膜表面的吸附量(见图1)。
5)将AC微胶囊浸入到生理盐水中，玛瑙球磨法考察微囊机械强度，150rpm培养2h后统计微胶囊的破碎率(见图2)。
实施例2
1)制备叠氮化物修饰海藻酸盐的溶液：海藻酸钠分子量200kDa，通过溴化氰活化法将3-(4-氨甲基苯基)-1,2,4,5-四嗪的末端氨基与海藻酸钠羟基共价键和，海藻酸钠修饰率为55％，将叠氮化物修饰的海藻酸钠溶解在生理盐水中，浓度为50g/L。
2)制备烯烃化物修饰PEG的溶液：PEG-NH2分子量为500Da，通过酰胺化法将PEG-NH2末端氨基与5-降冰片烯-2-羧酸的末端羧基共价键和，得到烯烃化物修饰的PEG，溶解在生理盐水中，浓度25g/L。
3)将包埋有猪胰岛细胞的经叠氮化物修饰的海藻酸钙凝胶微球浸入步骤2)制备的PEG溶液中，凝胶微球与PEG溶液体积比为1:40，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ABPN凝胶珠
4)将包埋有猪胰岛细胞的ABPN凝胶珠通过注射器腹腔移植到糖尿病大鼠模型体内，大鼠糖尿病症状得到纠正，血糖恢复正常水平。一个月后处死大鼠，回收到形态保持完整的ABPN凝胶珠，表面没有纤维化现象，且微囊内胰岛细胞保持胰岛素双硫腙染色阳性。
实施例3
1)制备叠氮化物修饰海藻酸盐的溶液：海藻酸钠分子量500kDa，通过溴化氰活化法将3-氨基甲基-6甲基-1,2,4,5-四嗪的末端氨基与海藻酸钠羧基共价 键和，海藻酸钠修饰率为135％，将叠氮化物修饰的海藻酸钠溶解在生理盐水中，浓度为10g/L。
2)制备α-聚赖氨酸溶液：α-聚赖氨酸分子量20kDa，溶解在生理盐水中，浓度5g/L。
3)制备烯烃化物修饰PEG的溶液：PEG-NH2分子量为10kDa，通过酰胺化法将PEG-NH2末端氨基与5-降冰片烯-2-羧酸的末端羧基共价键和，得到烯烃化物修饰的PEG，溶解在生理盐水中，浓度5g/L。
4)将包埋有猪肝细胞的经叠氮化物修饰的海藻酸钙凝胶微球浸入步骤2)制备的α-聚赖氨酸溶液中，微球与α-聚赖氨酸溶液体积比为1:20，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成AP微胶囊。
5)将步骤4)制备的AP微胶囊浸入到1.5g/L叠氮化物修饰海藻酸钠的溶液中，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成APA微胶囊。
6)重复步骤4)，制备成APAP微胶囊。
7)将步骤6)制备的APAP微胶囊浸入到步骤3)制备的PEG溶液中，APAP微胶囊和PEG溶液体积比为1:20，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成APAPPEG微胶囊。
8)将包埋有猪肝细胞的APAPPEG微胶囊制备成体外人工肝系统，用于肝衰狗的动物模型，狗的肝衰症状得以纠正，血氨指标恢复正常，APAPPEG微胶囊在人工肝系统保持形态完整，血液灌流后未发现蛋白吸附现象。
Claims (8)
1.一种PEG原位共价接枝改性的海藻酸盐微囊，其特征在于：
微胶囊为海藻酸盐的水凝胶珠，海藻酸盐经叠氮化合物共价接枝改性其羟基基团，水凝胶珠表面由PEG原位共价接枝改性，水凝胶珠上的海藻酸盐与PEG的质量比为10:1-1:100；
或，微胶囊内部为海藻酸盐的液体或水凝胶，海藻酸盐经叠氮化合物共价接枝改性其羟基基团，微胶囊表面为通过聚阳离子和海藻酸盐形成的聚电解质复合水凝胶膜，聚电解质复合水凝胶膜再由PEG原位共价接枝改性，聚电解质复合水凝胶膜中的海藻酸盐：聚阳离子：PEG的质量比为：10:1:1-1:10:100。
2.按照权利要求1所述的微胶囊，其特征在于：
修饰后微胶囊产品为粒径100-1000微米的球形微胶囊。
3.按照权利要求1所述的微胶囊，其特征在于：
水凝胶珠或微胶囊内核中的海藻酸盐水凝胶为海藻酸的二价金属钙、钡或锌、或者三价金属钆盐中的一种或二种以上的叠氮化合物共价接枝羟基位点的海藻酸盐水凝胶；
微胶囊内核中的海藻酸盐溶液为叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸的钾盐或钠盐溶液。
4.按照权利要求1或3所述的微胶囊，其特征在于：
水凝胶珠或微囊内核中的海藻酸盐为叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸盐，所用的叠氮化物包括下述中的一种或二种以上：末端含有伯氨基的1,2,3,4-四嗪、1,2,4,5-四嗪、1,2,3,5-四嗪以及上述三种四嗪中任意一种在6-位取代有苯环基、氨基、酰基、磺酰基等任意一种基团的四嗪衍生物；海藻酸盐羟基位点的叠氮化物接枝率(每100个海藻酸盐羟基接枝的叠氮化物分子百分数)为1％-200％。
5.按照权利要求1或3所述的微胶囊，其特征在于：
海藻酸盐水凝胶微球或海藻酸盐液滴表面可通过海藻酸的羧基与聚阳离子反应形成微胶囊膜，其为聚电解质复合水凝胶膜；
外表面带有聚电解质复合水凝胶膜的修饰后微胶囊膜厚在1-100微米；
其中，聚阳离子材料包括下述任意一种或两种以上：壳聚糖，其脱乙酰度为80-98％，分子量为1kDa-800kDa；α-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa；ε-聚赖氨酸，分子量为2kDa-500kDa；聚精氨酸，分子量为1kDa-500kDa；聚鸟氨酸，分子量为1kDa-500kDa；聚组氨酸，分子量为1kDa-500kDa。
6.按照权利要求1所述的微胶囊，其特征在于：
微胶囊产品中的PEG先经烯烃基化合物修饰，再利用点击化学反应与叠氮化物修饰的海藻酸盐上的叠氮基反应，通过共价键直接将烯烃化合物修饰的PEG原位接枝到海藻酸盐水凝胶珠表面或聚电解质复合水凝胶膜外表面；
其中，PEG的末端首先通过胺化得到末端氨基化PEG(PEG-NH2)，PEG的聚合度n为2-2500，PEG分子量为100Da-100kDa，PEG末端氨基的取代度(每100个PEG末端氨基取代的百分数)为10％-100％；其次末端氨基化PEG再利用酰胺化反应与烯烃基化合物相结合修饰，氨基化PEG的修饰率(每100个氨基化PEG末端氨基被烯烃基取代的百分数)为10％-100％；最后在微囊上通过烯烃基与海藻酸盐上的叠氮基发生点击化学反应生成共价键，将PEG原位共价接枝到海藻酸盐凝胶珠表面或聚电解质复合水凝胶膜外表面，PEG的接枝率(每100个海藻酸盐单体接枝的PEG百分数)为1％-100％；
其中，烯烃化合物修饰PEG中所使用的烯烃化合物包括下述任意一种：含有碳碳双键(-C＝C-)、碳碳三键(-C≡C-)的C3～C18的直链脂肪烯烃或炔烃，或含有碳碳双键(-C＝C-)、碳碳三键(-C≡C-)的C4～C18的闭合环状脂肪烯烃或炔烃，以及上述任意一种烯烃或炔烃中在脂肪碳链上有苯环基、酰氯基、氨基等任意一种基团取代的衍生物。
7.按照权利要求1-6任一所述微胶囊的制备方法，其特征在于：
水凝胶珠是直接由叠氮化物共价接枝改性羟基基团的海藻酸盐经螯合制备得到的凝胶微球；
或者是，内部为由叠氮化物共价接枝改性羟基基团的海藻酸盐的液体或水凝胶，外层由海藻酸盐和聚阳离子两种高分子材料通过层层自组装形成聚电解质复合水凝胶膜，再通过共价键将烯烃化合物修饰的PEG原位共价接枝到聚电解质复合水凝胶膜表面暴露出的叠氮基基团上；
产品的具体制备步骤为：
1)利用溴化氰活化法制备叠氮化物共价接枝改性羟基基团的海藻酸盐材料：
制备海藻酸溶液，将海藻酸溶于水中制备成1-5g/L的海藻酸溶液，NaOH溶液调节海藻酸溶液pH在10-11之间；称取溴化氰固体溶解后滴加于海藻酸溶液中，在pH 10-11之间对海藻酸钠羟基位点进行活化，室温活化1-3小时；超滤清洗除去未反应的溴化氰后，加入含伯氨基的叠氮化物，室温反应48小时；超滤纯化，对回收的产物溶液进行冷冻干燥得到叠氮化物共价接枝羟基基团的海藻酸盐材料其中，海藻酸盐接枝叠氮化物的分子量为10kDa–2000kDa；海藻酸盐接枝叠氮化物的接枝率为1％-200％；溴化氰投入摩尔量：海藻酸盐单体摩尔量为0.01:1-2:1，叠氮化物投入投入摩尔量：海藻酸盐单体摩尔量为0.01:1-2:1；
2)制备海藻酸盐凝胶微球，即将步骤1)制备的材料配制成1-50g/L的海藻酸盐溶液，然后通过锐孔挤出法、静电液滴法或乳化法等制备成海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球，其中海藻酸盐凝胶为海藻酸的二价金属钙、钡或锌，或者三价金属钆中一种或二种以上的叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸盐的水凝胶；
3)将步骤2)中的A微球浸入到烯烃化合物修饰的末端氨基化PEG的溶液中，微球与PEG溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤，即为表面由PEG原位共价接枝改性的海藻酸盐水凝胶珠产品；
烯烃化合物修饰末端氨基化PEG的配制方法是：烯烃化合物修饰末端氨基化PEG溶于生理盐水中、或pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中、或PBS溶液中任意一种，烯烃化物修饰末端氨基化PEG浓度为0.1-500g/L；
4)将步骤2)中的A微球浸入聚阳离子溶液中，A微球与聚阳离子溶液体积比为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，称之为C微球，取出用生理盐水洗涤；
聚阳离子溶液的配制方法是：
壳聚糖溶于pH为5.0-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液或3-9g/L NaCl溶液，壳聚糖浓度为0.1-15g/L；
或，α-聚赖氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，α-聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，ε-聚赖氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，ε-聚赖氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，聚精氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚精氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，聚鸟氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鸟氨酸浓度为0.01-10g/L；
或，聚组氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鸟氨酸浓度为0.01-10g/L；
5)将步骤4)中的C微球浸入碱金属海藻酸钠盐溶液中，C微球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到海藻酸盐-聚阳离子-海藻酸盐微胶囊，称之为D微球，取出用生理盐水洗涤；
碱金属海藻酸盐为海藻酸的钾盐或钠盐，或叠氮化物共价接枝羟基位点的海藻酸的钾盐或钠盐，分子量分布为10kDa-2000kDa，海藻酸盐溶液的配制方法是：海藻酸盐溶于3-9g/L NaCl或KCl溶液中，海藻酸盐浓度为0.1-5g/L；
6)交替重复步骤4)和步骤5)的过程1-5次，此时得到的微胶囊为E微球，取出用生理盐水洗涤；
7)将步骤4)或5)或6)中的C或D或E微球浸入到烯烃化物修饰的末端氨基化PEG的溶液中，微球与PEG溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到微胶囊，称之为F微球，取出用生理盐水洗涤，即为内部为海藻酸盐的水凝胶、外表面为由PEG原位共价接枝改性的聚电解质复合水凝胶膜的微胶囊；
烯烃化物修饰末端氨基化PEG的配制方法是：烯烃化物修饰末端氨基化PEG溶于生理盐水中、或pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中、或PBS溶液中任意一种，烯烃化物修饰末端氨基化PEG浓度为0.1-500g/L；
8)将步骤7)中的F微球浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的叠氮化物修饰的海藻酸盐凝胶，F微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态内核的G微球，即内部为海藻酸盐的溶液、外表面为由PEG原位共价接枝改性的聚电解质复合水凝胶膜的微胶囊；
其中，参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA。
8.一种权利要求1-6任一所述的微胶囊用于生物活性物质以及活细胞中的一种或二种以上的包埋，其特征在于：
所述生物活性物质为酶、激素和蛋白质中的一种或两种以上；
所述活细胞为人或动物来源的离体的胰岛细胞、肝细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺髓质细胞、肾小管细胞等具有分泌生物活性物质功能的细胞，细胞系细胞，基因工程细胞，干细胞或干细胞分化的各种细胞中的一种或两种以上。
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Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018136012A1 (en) * | 2017-01-20 | 2018-07-26 | Agency For Science, Technology And Research | A modified alginate copolymer, alginate nanoparticle and applications thereof |
| CN110280228A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-09-27 | 湖南嘉沣工程设计有限责任公司 | 一种制备吸附型介孔微球的方法 |
| CN111388445A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-10 | 杭州鹿扬科技有限公司 | 具有延长释放活性药物成分的微胶囊材料及其制备方法 |
| CN113017129A (zh) * | 2019-12-24 | 2021-06-25 | 深圳波顿香料有限公司 | 高含水量胶囊及其制备方法 |
| CN114181883A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-15 | 大连大学 | 一种含基质胶的硬度可调的水凝胶类器官球及其制备方法和应用 |
| CN114466869A (zh) * | 2019-07-03 | 2022-05-10 | 莫莉·桑德拉·萧伊凯特 | 水凝胶组合物及其用途 |
| CN115990462A (zh) * | 2022-06-13 | 2023-04-21 | 江苏恰瑞生物科技有限公司 | 双重生物矿化制备血液灌流器用填料的方法 |
| CN116712400A (zh) * | 2023-06-25 | 2023-09-08 | 广州东智盟化妆品有限公司 | 一种抗寒抗高温软胶囊囊皮及其制备方法和应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105078923A (zh) * | 2014-05-07 | 2015-11-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | Peg原位共价接枝的海藻酸盐微胶囊及其制备和应用 |
-
2015
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105078923A (zh) * | 2014-05-07 | 2015-11-25 | 中国科学院大连化学物理研究所 | Peg原位共价接枝的海藻酸盐微胶囊及其制备和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| WEERANUCH PLUEMSAB,ET AL: "Synthesis and inclusion property of α-cyclodextrin-linked alginat", 《POLYMER》 * |
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018136012A1 (en) * | 2017-01-20 | 2018-07-26 | Agency For Science, Technology And Research | A modified alginate copolymer, alginate nanoparticle and applications thereof |
| CN114466869B (zh) * | 2019-07-03 | 2024-03-19 | 莫莉·桑德拉·萧伊凯特 | 水凝胶组合物及其用途 |
| CN114466869A (zh) * | 2019-07-03 | 2022-05-10 | 莫莉·桑德拉·萧伊凯特 | 水凝胶组合物及其用途 |
| CN110280228B (zh) * | 2019-07-05 | 2022-04-22 | 中煤嘉沣(湖南)环保科技有限责任公司 | 一种制备吸附型介孔微球的方法 |
| CN110280228A (zh) * | 2019-07-05 | 2019-09-27 | 湖南嘉沣工程设计有限责任公司 | 一种制备吸附型介孔微球的方法 |
| CN113017129A (zh) * | 2019-12-24 | 2021-06-25 | 深圳波顿香料有限公司 | 高含水量胶囊及其制备方法 |
| CN113017129B (zh) * | 2019-12-24 | 2022-08-05 | 深圳波顿香料有限公司 | 高含水量胶囊及其制备方法 |
| CN111388445A (zh) * | 2020-03-30 | 2020-07-10 | 杭州鹿扬科技有限公司 | 具有延长释放活性药物成分的微胶囊材料及其制备方法 |
| CN114181883A (zh) * | 2021-12-03 | 2022-03-15 | 大连大学 | 一种含基质胶的硬度可调的水凝胶类器官球及其制备方法和应用 |
| CN114181883B (zh) * | 2021-12-03 | 2024-04-19 | 大连大学 | 一种含基质胶的硬度可调的水凝胶类器官球及其制备方法和应用 |
| CN115990462A (zh) * | 2022-06-13 | 2023-04-21 | 江苏恰瑞生物科技有限公司 | 双重生物矿化制备血液灌流器用填料的方法 |
| CN116712400A (zh) * | 2023-06-25 | 2023-09-08 | 广州东智盟化妆品有限公司 | 一种抗寒抗高温软胶囊囊皮及其制备方法和应用 |
| CN116712400B (zh) * | 2023-06-25 | 2024-02-09 | 广州东智盟化妆品有限公司 | 一种抗寒抗高温软胶囊囊皮及其制备方法和应用 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20170616 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |