CN103301788B - Peg接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊及制备和应用 - Google Patents
Peg接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊及制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种PEG原位共价接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊，微胶囊结构分为微胶囊膜与内核两部分：其中，微胶囊膜是由壳聚糖和海藻酸盐形成的聚电解质复合水凝胶膜，其表面由PEG原位共价接枝改性，内核为含有活细胞的海藻酸盐液体或海藻酸盐水凝胶环境。这种微胶囊产品由于具有抗蛋白吸附性能应用于活细胞包埋作为细胞移植的免疫隔离载体。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于活细胞包埋的海藻酸盐微胶囊产品，具体地说是一种PEG原位共价接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊的制备及其在活细胞包埋中的应用。
背景技术
20世纪60年代，Chang报道了半透膜微胶囊，指出用其包埋蛋白质、酶等生物活性物质和细胞，可保持生物物质活性[Chang TMS.Semipermeablemicrocapsules，Science，1964，146：524-525]。20世纪80年代初，Lim和Sun针对组织/细胞功能缺损性疾病(如糖尿病)，成功制备了海藻酸钠/α-聚赖氨酸(alginate/α-polylysine)半透膜微胶囊(简称α-APA微胶囊)，包封Wistar大鼠胰岛细胞并移植入糖尿病WistarLewis大鼠体内，分泌释放胰岛素以调控血糖量[Lim F，Sun A M.Microencapsulated islets bioartificial endocrinepancreas，Science，1980，210：908-910]。由此推动了微囊化技术相关材料和制备方法研究的快速发展，在细胞移植、药物释放和基因治疗等生物医学领域的临床前研究中得到广泛应用[Wang W，Liu XD，Ma XJ，et al.Microencapsulation using natural polysaccharides for drug delivery and cellimplantation，J.Mater.Chem.，2006，16：3252-3267]。在众多的生物微胶囊中，海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊使用较多，但由于聚赖氨酸价格昂贵(300-400US$/g)，加之材料固有的生物相容性差，具有一定毒性，这极大地限制了海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊在临床上的应用[Strand B L，Ryan TL，Veld P I，etal.Cell Transplant.，2001，10：263-275]。壳聚糖是取自天然的多糖材料，因其成本低，成膜性能好，膜机械强度高，而被研究者看好用于聚赖氨酸替代品，用于细胞包埋用微胶囊的制备[L.Baruch，M.Machluf，Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation：Effect onmechanical properties and on long-term viability，Biopolymers 82(2006)：570-579]。但现有用于细胞包埋的壳聚糖微胶囊因其具有很大的表面粗糙度和表面电荷，导致移植体内后易引起蛋白吸附，进一步激发机体纤维化反应。
发明内容
针对上述问题，本发明提出将PEG用于生物微胶囊的制备，发明了一种新型PEG原位共价接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊产品，在保证微胶囊强度和免疫隔离性能的前提下，利用PEG高密度梳状结构起到抗蛋白吸附的效果，解决微胶囊体内移植后蛋白吸附及纤维化问题。
技术方案：
本发明的PEG原位共价接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊产品，其特征在于：微胶囊结构分为微胶囊膜与内核两部分：其中，微胶囊膜是由壳聚糖和海藻酸盐形成的聚电解质复合水凝胶膜，其表面由PEG原位共价接枝改性，海藻酸盐、壳聚糖、PEG三者质量比为10∶1∶1-1∶10∶100；内核为含有活细胞的海藻酸盐液体或海藻酸盐水凝胶环境。
其中，微胶囊产品为粒径100-1000微米的球形微胶囊，膜厚度在1-100微米；组成膜的海藻酸盐分子量10kDa-2000kDa(例如：50kDa-200kDa；200kDa-500kDa；600kDa-1000kDa；1000kDa-2000kDa)；壳聚糖的分子量为1kDa-500kDa(例如：1kDa-5kDa；10kDa-20kDa；50kDa-100kDa；100kDa-500kDa)；PEG的分子量100Da-1000kDa(例如：100-5kDa；5kDa-50kDa；50kDa-500kDa；500kDa-1000kDa)；内核中海藻酸盐浓度在1-50g/L，内核中细胞含量102-109个细胞/ml内核体积，且活性保持90％以上。
微胶囊产品中的PEG原位共价接枝改性到微胶囊膜中壳聚糖分子链上的产物结构式为：
其中，PEG的聚合度n为2-2500，PEG分子量为100Da-1000kDa，PEG-CHO浓度为0.1-500g/L，PEG在微囊膜上的接枝率为1-100％。
微胶囊产品中壳聚糖材料的脱乙酰度90-98％，分子量为1kDa-500kDa，壳聚糖浓度为0.1-15g/L。
微胶囊产品的膜成分中的海藻酸盐为海藻酸的钾盐或钠盐。
微胶囊产品的内核中海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌的海藻酸盐水凝胶，海藻酸盐溶液为海藻酸的钾盐或钠盐溶液。
上述述微胶囊的制备方法是将海藻酸盐和壳聚糖两种高分子材料通过层层自组装形成聚电解质复合水凝胶膜，再通过共价键将PEG直接原位共价接枝到微胶囊膜上，产品的具体制备步骤为：
1)制备包埋有活细胞的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌的海藻酸盐水凝胶；
2)将步骤1)中的A微球浸入壳聚糖溶液中，A微球与壳聚糖溶液体积比为1∶1-1∶40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到海藻酸钠-壳聚糖微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖溶液的配制方法是：壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.1-15g/L；
3)将步骤2)中的B微球浸入碱金属海藻酸盐溶液中，B微球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为1∶1-1∶40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到的微胶囊为C微球，取出用生理盐水洗涤；
碱金属海藻酸盐为钾盐或钠盐，分子量分布为10kDa-2000kDa，海藻酸盐溶液的配制方法是：海藻酸盐溶于3-9g/L NaCl溶液中，海藻酸盐浓度为0.1-5g/L；
4)交替重复步骤2)和步骤3)的过程1-5次，此时得到的微胶囊为D微球，取出用生理盐水洗涤；
5)将步骤1)或2)或3)或4)中的A或B或C或D微球浸入到末端醛基化的PEG-CHO溶液中，滴加还原剂，微球、PEG-CHO溶液、还原剂溶液三者的体积比范围为1∶1∶1-1∶40∶40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到微胶囊，称之为E微球，取出用生理盐水洗涤；
PEG-CHO的配制方法是：PEG-CHO溶于生理盐水中，或pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，PEG-CHO浓度为0.1-500g/L；
还原剂为浓度0.1-200g/L的三乙酰氧基硼氢化钠溶液、氰基硼氢化钠溶液、或硼氢化钠溶液；
6)将步骤5)中的E微球浸入到碱金属海藻酸盐溶液中，重复步骤3)，得到内核为海藻酸盐水凝胶的微胶囊，为F微球；
7)将步骤6)中的F微球浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，F微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1∶1-1∶40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态内核的G微球。
其中，参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA。
该微胶囊产品用于活细胞的包埋。所述活细胞为人或动物(老鼠、牛、猪等)来源的离体的胰岛细胞、肝细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺髓质细胞具有分泌生物活性物质功能的细胞，细胞系细胞，基因工程细胞，干细胞或干细胞分化的各种细胞。
本发明的有益效果：
1、与传统的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊(APA微胶囊)和海藻酸钠-壳聚糖微胶囊(ACA微胶囊)相比，本发明的这种新型PEG原位共价接枝改性海藻酸盐-壳聚糖微胶囊产品(AC-PEGA微胶囊)，其微胶囊膜表面因PEG形成高密度伸展梳状结构，具有理想的抗蛋白吸附特性，从而显示出新型微胶囊产品更佳的生物相容性。
2、与PEG掺杂的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊(ACPA微胶囊)相比，本发明产品将PEG通过共价键固定到微胶囊膜的壳聚糖氨基上，显著提高了PEG修饰的稳定性，并且减少了PEG链与海藻酸钠或壳聚糖大分子链的缠绕作用，使PEG在微胶囊膜表面形成高密度伸展梳状结构，具有理想的抗蛋白吸附效果。
3、与海藻酸钠-PEG改性壳聚糖微胶囊(ACPEGA微胶囊)相比，本发明的这种新型PEG原位共价接枝改性海藻酸盐-壳聚糖微胶囊产品，避免了PEG改性壳聚糖接枝共聚物合成过程的繁琐，显著提高了PEG的接枝密度，其微胶囊膜表面因PEG形成高密度伸展梳状结构，具有理想的抗蛋白吸附特性，从而显示出新型微胶囊产品更佳的生物相容性。
4、本发明产品的微胶囊膜在保持优良生物相容性的同时，兼顾了优越的膜强度，能保证作为组织细胞移植、细胞培养应用过程中膜的完整性。
5、本发明产品的微胶囊膜具有优越的免疫隔离性能，用于异种组织细胞移植时，能保持免疫隔离性能，即微囊内包埋的细胞不能出微胶囊，微囊外的抗体分子、补体分子、免疫细胞不能进入微胶囊内杀死细胞，同时细胞代谢分泌的活性成分能自由进出微胶囊。
6、本发明产品的制备过程条件温和，PEG-CHO无毒且可溶于生理盐水中，有利于细胞的活性保持。
附图说明
图1为实施例1制备的AC-PEG微胶囊与比较例1、比较例2和比较例3中制备的AC、ACP和ACPEG微胶囊表面IgG吸附量的对比。
具体实施方式
制备海藻酸盐微球的方法为静电液滴法(参考文献：In Vivo Culture of EncapsulatedEndostatin-Secreting Chinese Hamster Ovary Cells for Systemic Tumor Inhibition，Human Gene Therapy.2007，18：474-481)、锐孔挤出法(参考文献：一种高经济鱼类微球开口饵料的制备方法，中国发明专，200510136769.7)、乳化-外部凝胶化法(参考文献：Preparation of lactic acid bacteria-enclosing alginate beads in emulsion system：effect of preparationparameters on bead characteristics，Polym.Bull.2009，63：599-607)、乳化-内部凝胶化法(参考文献：乳化-内部凝胶化工艺制备固定化酵母微胶囊，化工学报，2009，60(3)：710-717)或膜乳化法(参考文献：Preparation of uniform calcium alginate gel beads by membrane emulsification coupled withinternal gelation，Journal of Applied Polymer Science，2003，87(5)：848-852)；PEG末端醛基化的方法为二甲基亚砜/乙酸酐氧化法(参考文献：Dimethyl Sulfoxide-Acid Anhydride Mixturesfor the Oxidation of Alcohols.Journal of the American Chemical Society，1967，89(10)：2416-2423)。
实施例1
1)PEG的末端醛基化：PEG分子量500Da，通过氧化法将PEG的末端羟基氧化成醛基制备PEG-CHO，将PEG-CHO溶解在生理盐水中，浓度10g/L。
2)制备壳聚糖溶液：壳聚糖分子量20kDa，脱乙酰度90％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度10g/L。
3)制备AC微胶囊：将高压静电法制备的海藻酸钙凝胶珠浸入壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶40，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AC微胶囊。
4)将AC微胶囊浸入PEG-CHO溶液中，滴加还原剂三乙酰氧基硼氢化钠溶液，三乙酰氧基硼氢化钠浓度为0.1g/L，微球、PEG-CHO和三乙酰氧基硼氢化钠溶液体积比为1∶40∶40，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AC-PEG微胶囊。
5)将AC-PEG微胶囊浸入IgG蛋白溶液中2小时，测定蛋白在微胶囊膜表面的吸附量(见图1)，吸附量明显仅为比较例1的4％，仅为比较例2的6％，仅为比较例3的10％。
比较例1
1)制备壳聚糖溶液：壳聚糖分子量20kDa，脱乙酰度90％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度10g/L。
2)高压静电法制备海藻酸钙凝胶微球，将微球浸入壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶40，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AC微胶囊。
3)将AC微胶囊浸入IgG蛋白溶液中2小时，测定蛋白在微胶囊膜表面的吸附量(见图1)，吸附量明显高于实施例1，比实施例1高20倍。
比较例2
1)制备壳聚糖溶液：壳聚糖分子量20kDa，脱乙酰度90％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度10g/L。
2)制备PEG溶液：PEG分子量为500Da，溶解在生理盐水中，浓度10g/L。
3)高压静电法制备海藻酸钙凝胶微球，将微球浸入壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶40，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AC微胶囊。
4)将AC微胶囊浸入到PEG溶液中，微囊与PEG溶液的体积比为1∶40，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成ACP微胶囊。
5)将ACP微胶囊浸入IgG蛋白溶液中2小时，测定蛋白在微胶囊膜表面的吸附量(见图1)，吸附量明显高于实施例1的15倍。
比较例3
1)制备PEG接枝改性壳聚糖：PEG分子量500Da，取代度70％，壳聚糖骨架材料分子量60kDa，脱乙酰度90％，通过共价交联制备PEG接枝改性壳聚糖，将PEG接枝改性壳聚糖溶解在生理盐水中，浓度10g/L。
2)将高压静电法制备的海藻酸钙凝胶微球浸入PEG接枝改性壳聚糖溶液中，微球与PEG接枝改性壳聚糖溶液体积比为1∶40，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成ACPEG微胶囊。
3)将ACPEG微胶囊浸入IgG蛋白溶液中2小时，测定蛋白在微胶囊膜表面的吸附量(见图1)，吸附量明显高于实施例1的9倍。
实施例2
1)PEG的末端醛基化：PEG分子量2kDa，通过氧化法将PEG末端的羟基氧化成醛基制备PEG-CHO，将PEG-CHO溶解在生理盐水中，浓度5g/L。
2)制备壳聚糖溶液：壳聚糖分子量60kDa，脱乙酰度90％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度5g/L，溶液用C表示。
3)将包埋有猪胰岛细胞的海藻酸钙凝胶微球浸入步骤2)制备的壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶10，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AC微胶囊。
4)将步骤3)制备的AC微胶囊浸入到步骤1)制备的PEG-CHO溶液中，滴加还原剂氰基硼氢化钠溶液，氰基硼氢化钠浓度为0.1g/L，微球、PEG-CHO和氰基硼氢化钠溶液体积比为1∶20∶40，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AC-PEG微胶囊。
5)将步骤4)制备的AC-PEG微胶囊浸入到1.5g/L海藻酸钠溶液中，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成AC-PEGA微胶囊。
6)将包埋有猪胰岛细胞的AC-PEGA微胶囊通过注射器腹腔移植到糖尿病大鼠模型体内，大鼠糖尿病症状得到纠正，血糖恢复正常水平。一个月后处死大鼠，回收到形态保持完整的AC-PEGA微胶囊，表面没有纤维化现象，且微囊内胰岛细胞保持胰岛素双硫腙染色阳性。
实施例3
1)PEG的末端醛基化：PEG分子量10kDa，通过氧化法将PEG末端的羟基氧化成醛基制备PEG-CHO，将PEG-CHO溶解在生理盐水中，浓度5g/L。
2)制备壳聚糖溶液：壳聚糖分子量100kDa，脱乙酰度90％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度5g/L，溶液用C表示。
3)将包埋有猪肝细胞的海藻酸钙凝胶微球浸入步骤2)制备的壳聚糖溶液中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成AC微胶囊。
4)将步骤3)制备的AC微胶囊浸入到1.5g/L海藻酸钠溶液中，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACA微胶囊。
5)重复步骤3)，制备成ACAC微胶囊。
6)将步骤5)制备的ACAC微胶囊浸入到步骤1)制备的PEG-CHO溶液中，滴加还原剂硼氢化钠溶液，硼氢化钠浓度为0.1g/L，微球、PEG-CHO和氰基硼氢化钠溶液体积比为1∶10∶20，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACAC-PEG微胶囊。
7)将步骤6)制备的ACAC-PEGA微胶囊重复步骤4)制备成ACAC-PEGA微胶囊。
8)将包埋有猪肝细胞的ACAC-PEGA微胶囊制备成体外人工肝系统，用于肝衰狗的动物模型，狗的肝衰症状得以纠正，血氨指标恢复正常，ACAC-PEGA微胶囊在人工肝系统保持形态完整，血液灌流后未发现蛋白吸附现象。
实施例4
1)PEG的末端醛基化：PEG分子量100kDa，通过氧化法将PEG末端的羟基氧化成醛基制备PEG-CHO，将PEG-CHO溶解在生理盐水中，浓度5g/L。
2)将包埋有大鼠甲状腺细胞的海藻酸钙凝胶微球浸入壳聚糖溶液(壳聚糖分子量100kDa，脱乙酰度90％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度1g/L)中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶40，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AC微胶囊。
3)将步骤2)制备的AC微胶囊浸入到1g/L海藻酸钠溶液中，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACA微胶囊。
4)将ACA微胶囊浸入壳聚糖溶液(壳聚糖分子量20kDa，脱乙酰度98％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度5g/L)中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶8，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACAC微胶囊。
5)重复步骤3)，制备成ACACA微胶囊。
6)重复步骤4)，制备成ACACAC微胶囊。
7)将步骤6)制备的ACACAC微胶囊浸入到步骤1)制备的PEG-CHO溶液中，滴加还原剂三乙酰氧基硼氢化钠溶液，三乙酰氧基硼氢化钠浓度为0.1g/L，微球、PEG-CHO和三乙酰氧基硼氢化钠溶液体积比为1∶40∶40，反应60分钟，生理盐水洗涤，制备成ACACAC-PEG微胶囊。
8)将步骤7)制备的ACACAC-PEG微胶囊重复步骤3)制备成ACACAC-PEGA微胶囊。
9)将包埋有大鼠甲状腺细胞的ACACAC-PEGA微胶囊用于异种大鼠甲低模型三角肌移植，疾病大鼠的甲低症状得以纠正，ACACAC-PEGA微胶囊移植三个月后回收，回收到形态保持完整的ACACAC-PEGA微胶囊，表面没有纤维化现象。
实施例5
1)PEG的末端醛基化：PEG分子量1000kDa，通过氧化法将PEG末端羟基醛基化制备PEG-CHO，将PEG-CHO溶解在生理盐水中，浓度5g/L。
2)将包埋有牛肾上腺髓质细胞的海藻酸钙凝胶微球浸入壳聚糖溶液(壳聚糖分子量200kDa，脱乙酰度90％，溶解在pH6.0的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度2.5g/L)中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶20，反应20分钟，生理盐水洗涤，制备成AC微胶囊。
3)将步骤2)制备的AC微胶囊浸入到1g/L海藻酸钠溶液中，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACA微胶囊。
4)将ACA微胶囊浸入壳聚糖溶液(壳聚糖分子量50kDa，脱乙酰度98％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度5g/L)中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成ACAC微胶囊。
5)重复步骤3)，制备成ACACA微胶囊。
6)将ACACA微胶囊浸入壳聚糖溶液(壳聚糖分子量10kDa，脱乙酰度98％，溶解在pH6.5的醋酸钠/醋酸缓冲液中，浓度5g/L)中，微球与壳聚糖溶液体积比为1∶10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制成ACACAC微胶囊。
7)重复步骤5)，制备成ACACACA微胶囊。
8)重复步骤6)，制备成ACACACAC微胶囊。
9)将步骤8)制备的ACACACAC微胶囊浸入到步骤1)制备的PEG-CHO溶液中，滴加氰基硼氢化钠溶液，氰基硼氢化钠浓度为0.1g/L，微球、PEG-CHO和氰基硼氢化钠溶液体积比为1∶40∶40，反应60分钟，生理盐水洗涤，制备成ACACACAC-PEG微胶囊。
10)将步骤9)制备的ACACACAC-PEG微胶囊重复步骤3)制备成ACACACAC-PEGA微胶囊。
11)将包埋有牛肾上腺髓质细胞的ACACACAC-PEGA微胶囊用于帕金森疾病模型猴的颅内定位移植，疾病大鼠的帕金森症状得以纠正，ACACACAC-PEGA微胶囊移植六个月后回收，回收到形态保持完整的ACACACAC-PEGA微胶囊，表面没有纤维化现象。
Claims (8)
1.一种PEG接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊，其特征在于：
PEG接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊，其为PEG原位共价接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊，其特征在于:微胶囊结构分为微胶囊膜与内核两部分：其中，微胶囊膜是由壳聚糖和海藻酸盐形成的聚电解质复合水凝胶膜，其表面由PEG原位共价接枝改性，海藻酸盐、壳聚糖、PEG三者质量比为10:1:1-1:10:100；内核为含有活细胞的海藻酸盐液体或海藻酸盐水凝胶环境；微胶囊膜由海藻酸盐和壳聚糖两种高分子材料通过层层自组装形成聚电解质复合水凝胶膜，再通过共价键将PEG直接原位接枝到微胶囊膜上，产品的具体制备步骤为：
1)制备包埋有活细胞的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌的海藻酸盐水凝胶；
2)将步骤1)中的A微球浸入壳聚糖溶液中，A微球与壳聚糖溶液体积比为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到海藻酸钠-壳聚糖微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖溶液的配制方法是：壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.1-15g/L；
3)将步骤2)中的B微球浸入碱金属海藻酸盐溶液中，B微球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到的微胶囊为C微球，取出用生理盐水洗涤；
碱金属海藻酸盐为钾盐或钠盐，分子量分布为10kDa-2000kDa，海藻酸盐溶液的配制方法是：海藻酸盐溶于3-9g/L NaCl溶液中，海藻酸盐浓度为0.1-5g/L；
4)交替重复步骤2)和步骤3)的过程1-5次，此时得到的微胶囊为D微球，取出用生理盐水洗涤；
5)将步骤1)或2)或3)或4)中的A或B或C或D微球浸入到末端醛基化的PEG-CHO溶液中，滴加还原剂，微球、PEG-CHO溶液、还原剂溶液三者的体积比范围为1:1:1-1:40:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到微胶囊，称之为E微球，取出用生理盐水洗涤；
PEG-CHO的配制方法是：PEG-CHO溶于生理盐水中、或pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，PEG-CHO浓度为0.1-500g/L；
6)将步骤5)中的E微球浸入到碱金属海藻酸盐溶液中，重复步骤3)，得到内核为海藻酸盐水凝胶的微胶囊，为F微球；
7)将步骤6)中的F微球浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，F微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态内核的G微球。
2.按照权利要求1所述的微胶囊，其特征在于：微胶囊产品为粒径100-1000微米的球形微胶囊；膜厚度在1-100微米，组成膜的海藻酸盐分子量10kDa-2000kDa；内核中海藻酸盐浓度在1-50g/L，内核中细胞含量102-109个细胞/ml内核体积，且活性保持90％以上。
3.按照权利要求1所述的微胶囊，其特征在于：微胶囊产品中的PEG是通过共价键直接原位接枝到微胶囊膜中的壳聚糖上，反应产物的结构式为：
其中，PEG的末端通过氧化得到末端醛基化PEG(PEG-CHO)，PEG的聚合度n为2-2500，PEG分子量为100Da-1000kDa，PEG在微囊膜上的接枝率为1-100％，其中接枝率的定义为每100个壳聚糖氨基接枝的PEG百分数。
4.按照权利要求1所述的微胶囊，其特征在于：微胶囊产品中壳聚糖材料的脱乙酰度90-98％，分子量为1kDa-500kDa。
5.一种PEG接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊的制备方法，其特征在于：
微胶囊膜由海藻酸盐和壳聚糖两种高分子材料通过层层自组装形成聚电解质复合水凝胶膜，再通过共价键将PEG直接原位接枝到微胶囊膜上，产品的具体制备步骤为：
1)制备包埋有活细胞的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球；海藻酸盐凝胶为二价金属钙、钡或锌的海藻酸盐水凝胶；
2)将步骤1)中的A微球浸入壳聚糖溶液中，A微球与壳聚糖溶液体积比为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到海藻酸钠-壳聚糖微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤；
壳聚糖溶液的配制方法是：壳聚糖溶于pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为0.1-15g/L；
3)将步骤2)中的B微球浸入碱金属海藻酸盐溶液中，B微球与碱金属海藻酸盐溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到的微胶囊为C微球，取出用生理盐水洗涤；
碱金属海藻酸盐为钾盐或钠盐，分子量分布为10kDa-2000kDa，海藻酸盐溶液的配制方法是：海藻酸盐溶于3-9g/L NaCl溶液中，海藻酸盐浓度为0.1-5g/L；
4)交替重复步骤2)和步骤3)的过程1-5次，此时得到的微胶囊为D微球，取出用生理盐水洗涤；
5)将步骤1)或2)或3)或4)中的A或B或C或D微球浸入到末端醛基化的PEG-CHO溶液中，滴加还原剂，微球、PEG-CHO溶液、还原剂溶液三者的体积比范围为1:1:1-1:40:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，此时得到微胶囊，称之为E微球，取出用生理盐水洗涤；
PEG-CHO的配制方法是：PEG-CHO溶于生理盐水中、或pH为5.5-7.0的醋酸-醋酸钠缓冲液中，PEG-CHO浓度为0.1-500g/L；
6)将步骤5)中的E微球浸入到碱金属海藻酸盐溶液中，重复步骤3)，得到内核为海藻酸盐水凝胶的微胶囊，为F微球；
7)将步骤6)中的F微球浸入有机金属螯合剂溶液中，液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，F微球与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-37℃，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态内核的G微球。
6.按照权利要求5所述微胶囊的制备方法，其特征在于：参与液化反应的有机金属螯合剂溶液为40-70mmol/L的柠檬酸钠或50-200mmol/L的EDTA。
7.一种权利要求1所述的微胶囊用于活细胞的包埋。
8.按照权利要求7所述的微胶囊用于活细胞的包埋，其特征在于：所述活细胞为人或动物来源的离体的胰岛细胞、肝细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺髓质细胞，细胞系细胞，基因工程细胞，干细胞或干细胞分化的各种细胞。
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