CN101717767A - 一种组织工程微囊化肝细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种属于动物细胞组织工程领域的组织工程微囊化肝细胞及其制备方法。该制备方法是将肝细胞和血管内皮细胞以1∶0.5-1的数量比置于质量百分比浓度为1.5-2％的海藻酸钠水溶液中混合，制成细胞悬液，然后采用高压静电微囊发生仪制作海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊肝细胞，本发明还公开了组织工程微囊化肝细胞在制备肝衰竭药物方面的应用，制得的微囊化细胞具有体积小，生物相容性高、通透性好的特点，适合作为细胞移植的载体；可以在宿主体内长期的发挥作用，避免了反复使用化学药物所带来了的副作用；此微囊化肝细胞的制备过程简便，适合大批量的生产。

Description

一种组织工程微囊化肝细胞及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及动物细胞组织工程产品，更具体的说，涉及一种组织工程微囊化肝细胞及其制备方法和应用。

背景技术

肝功能衰竭是临床难治性疾病，死亡率很高。目前，在临床上治疗肝衰竭可行的方法主要有以下两种：肝脏移植与肝细胞移植。这些治疗方式虽然能明显改善患者症状，但也存在很多问题：如肝器官移植受到供体器官匮乏，高额费用和长期需要使用免疫抑制剂的限制。另外一种行之有效的方法是肝细胞的移植，如果在肝衰竭患者体内成功植入一定数量的肝细胞，其肝脏的功能将会得到提高，并明显促进肝脏的再生。但是，在移植后机体会产生强烈的免疫排斥反应，从而导致移植最终失败。尽管使用免疫抑制剂是一种常见的解决方法，但是它的毒副作用会使重症肝病患者产生相关的并发症。因此，微囊化细胞疗法为无免疫抑制剂的情况下的细胞移植开辟了广阔的前景。

微囊技术是指用半透膜包被生物活性物质以形成微囊的技术，形成的微囊可以阻遏免疫细胞以及大分子抗体通过半透膜，同时允许氧气、营养物质和一些具有生物活性的小分子物质自由出入，因此，该技术是目前细胞治疗、组织和器官替代治疗的主要方法之一。自从1964年，Chang引用微囊技术进行细胞移植，并首次提出“人工细胞”的概念以来，微囊技术取得了迅速发展。随后的二十年间，人们不断尝试用这种方法包埋胰岛细胞来控制糖尿病小动物模型的高血糖。1986年，O’Shea等人在已有基础上对成囊物质进行了革新，制成了海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微囊。近年来随着生物材料、细胞生物学、工程科学的发展，为微囊化人工细胞研究提供了强大动力，并先后在基因工程细胞、嗜铬细胞、干细胞以及胰岛微囊化研究中取得可喜进展。

微囊具有良好的生物相容性，合适的半透性、较强的机械稳定性和较低的免疫原性。微囊膜可提供细胞附着的基质，使肝细胞相互接触，并形成一种三维结构。此外，微囊膜的多孔性结构允许白蛋白、营养物质及代谢物的自由弥散，肝细胞可以跨膜获得养分，但又能阻止高分子量物质如免疫球蛋白和补体通过，从而避免免疫细胞及免疫分子对囊内细胞的损伤，起到免疫屏障作用。2000年，有文献报道肝细胞和干细胞进行微囊共包裹成功用于移植治疗后，微囊化肝细胞在急性肝衰竭治疗中的作用受到研究人员的广泛青睐，研究进展迅速。

血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞，在肝小叶中，内皮细胞和肝细胞互相连接排列形成多层三维组织结构，通过细胞连接、细胞外基质调控肝细胞的生长、分化、凋亡及功能。有研究证明，内皮细胞与肝细胞共培养能够维持肝细胞的活性及功能。AKIRA ITO等(Ito A，Takizawa Y，Honda H，HataK，Kagami H，Ueda M，Kobayashi T.Tissue engineering using magnetitenanoparticles and magnetic force：heterotypic layers of cocultured hepatocytes andendothelial cells，Tissue Eng.，2004，10(5-6)：833-40)将磁力标记了的内皮细胞与肝细胞共培养，发现这种共培养的结构与同型单纯肝细胞相比显著提高了肝细胞的白蛋白分泌。Takayama等(Takayama G，Taniguchi A，Okano T.Identificationof differentially expressed genes in hepatocyte/endothelial cell co-culture system，Tissue Eng.，2007，13(1)：159-66)证实了将大鼠肝细胞与人脐带静脉内皮细胞双层共培养后，与细胞连接相关的基因和肝特异性标志基因的表达都显著提高，这表明即使不同种的细胞之间通过细胞外基质和细胞因子信号的连接，也会发生相互间的作用，因此共培养体系可以作为一种分析细胞间作用的有用的模型。但是上述模型都是体外模型，一旦移植到体内就会引起机体的免疫排斥反应，本发明中的微囊是一种生物相容性高，具有较低免疫原性的半透膜，在植入机体体内后可以保护微囊内部的细胞免受机体免疫系统的排斥，以达到更好的发挥细胞功能的目的。

目前国内外尚未见微囊化肝细胞和血管内皮细胞治疗肝衰竭的相关报道。

发明内容

本发明的目的是要提供一种组织工程微囊化肝细胞及其制备方法。

一种组织工程微囊化肝细胞的制备方法，按照如下的操作步骤进行：

(1)将肝细胞和血管内皮细胞以1∶0.5-1的数量比置于质量百分比浓度为1.5-2％的海藻酸钠水溶液中混合，制成细胞悬液，使每毫升细胞悬液中含有的总细胞数为3-5×10⁶个；

(2)利用高压静电微囊发生仪将步骤(1)获得的细胞悬液喷射到100-120mM的氯化钙水溶液中，反应12-20min，形成海藻酸钙胶珠；

(3)将上述海藻酸钙胶珠洗涤后加入到质量百分比浓度为0.02-0.07％的多聚赖氨酸水溶液中，反应5-10min，自由沉降后，收集沉淀物；

(4)清洗步骤(3)获得的沉淀物后将其加入到质量百分比浓度为0.02-0.07％的海藻酸钠水溶液中，反应3-8min，自由沉降后，收集沉淀物；

(5)洗涤步骤(4)获得的沉淀物后将其加入到浓度为45-70mM的柠檬酸钠水溶液中，反应3-8min，收集沉降物并清洗，从而获得组织工程海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化肝细胞。

所述肝细胞具有90％以上的纯度。

在步骤(2)中将步骤(1)获得的悬液以200-500μm直径的胶珠状态分散。

按照上述制备方法获得的组织工程微囊化肝细胞。

步骤(5)获得的组织工程微囊化肝细胞可以转移到无血清的William’s E培养液中保存，每24小时换液1次，该组织工程微囊化肝细胞最好是现制备现使用。

上述组织工程微囊化肝细胞在制备肝衰竭药物方面的应用。

所述肝细胞的来源为同体或异体。

所述血管内皮细胞的来源为人源建系细胞。

与本领域的同类现有技术相比，本发明具有下列有益效果：

1、本发明制得的微囊化细胞具有体积小，生物相容性高、通透性好的特点，适合作为细胞移植的载体；

2、微囊化肝细胞可以在宿主体内长期的发挥作用，避免了反复使用化学药物所带来了的副作用；

3、微囊化肝细胞的制备过程简便，适合大批量的生产。

附图说明

图1是本发明组织工程微囊化肝细胞光镜图；

图2是急性肝衰竭大鼠移植本发明微囊化肝细胞后谷丙转氨酶(ALT)的变化曲线图；

图3是急性肝衰竭大鼠移植本发明微囊化肝细胞后谷草转氨酶(AST)的变化曲线图；

图4是急性肝衰竭大鼠移植本发明微囊化肝细胞后白蛋白(ALB分泌的曲线图。

具体实施方式

下面以Sprague-Dawley大鼠为例来进一步解释本发明，但是本发明不受这些具体实施例的限定。

以下实施例中使用的William’s E培养液购自Gibco公司。

实施例1组织工程微囊化肝细胞的制备

(1)SD大鼠肝细胞的分离与培养

使用成年Sprague-Dawley大鼠(250g，雄性)，戊巴比妥钠麻醉，剪开大鼠腹壁皮肤及肌肉；拨开胃肠暴露门静脉及下腔静脉。一次灌入含肝素12500U/L的PBS液250mL，前灌注液500mL，前灌注液灌至肝脏表面呈现黄色时，以含0.05wt％IV型胶原酶的后灌流液灌至肝脏包膜下组织出现龟背状裂隙为止。取下完整的肝脏，用眼科镊撕除包膜及纤维成分，钝性刮梳并反复吹打分离肝脏细胞，200目滤网过滤，制备肝细胞悬液，PBS冲洗3次。然后用体积百分比浓度为0.4％的台盼蓝排斥试验检测细胞活率。血球计数板计数法进行计数。加入无血清的William’s E培养液贴壁培养，培养48h后，显微镜观察肝细胞贴壁完全，用0.25％胰蛋白酶消化，以含有10％胎牛血清的William’s E培养液终止消化，800转/分离心5min，收集原代肝细胞。

上述前灌注液的配制方法为每升三蒸水中含有NaCl 168.8mmol，KCl3.15mmol，Na₂HPO₄·12H₂O 0.7mmol，HEPES 33mmol。

上述后灌流液的配制方法为每100毫升Hank’s溶液中含有IV型胶原酶0.05g。

(2)微囊化肝细胞的制备

以1∶0.5的数量比将原代肝细胞与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(购于中科院上海细胞资源中心)置于2wt％的海藻酸钠水溶液中混合制成细胞悬液，最终达到每毫升海藻酸钠水溶液中总细胞的数量为5×10⁶个。在6kV的静电场电压作用下，采用高压静电微囊发生仪将细胞悬液喷入100mM的CaCl₂水溶液中，反应12分钟，以形成海藻酸钙胶珠。待胶珠沉降后，吸出上部CaCl₂水溶液，然后先后放入0.55％和0.28％的CaCl₂水溶液中清洗5分钟，弃去上清，再与生理盐水和2-(环己胺)-1-乙磺酸(CHES)溶液清洗5分钟，接着将沉淀物与0.05％多聚赖氨酸水溶液充分反应6min，收取自由沉降物，获得的沉降物分别放在生理盐水、2-(环己胺)-1-乙磺酸(CHES)水溶液中清洗5分钟，弃去上清，加入0.05％的海藻酸钠水溶液反应4min，形成APA微囊化，弃去上清，获得的沉降物分别在生理盐水、100mM的CaCl₂水溶液中清洗5分钟。再将其与0.55mM的柠檬酸钠溶液反应3min，液化其囊芯，收集沉降物，用生理盐水溶液中清洗沉降物，即制成可用于移植治疗的组织工程APA微囊化细胞，如图1所示，可见微囊表面光滑，无褶皱，囊内细胞边界清晰。

实施例2急性肝衰竭动物模型的建立与治疗

将SD大鼠(250g，雌性)按每千克体重注射D-氨基半乳糖1.2g的比例腹腔一次性给药诱导急性肝功能衰竭模型，在注射后48h，由于肝细胞的大面积死亡，肝细胞内的各种酶释放到血液中，导致酶指标增高，此急性肝衰竭模型的自然病程为2周(判定标准：ALT，AST较正常值大幅升高，ALB较正常值大幅降低)；

在急性肝衰竭的24h内移植5ml实施例1中制得的组织工程微囊化肝细胞到肝衰竭大鼠腹腔内，该实验组称为共包裹组，同时设定三个对照组，分别为空囊组、游离肝细胞组和微囊化肝细胞组。其中空囊组中移植的是APA微囊；游离肝细胞组中移植的是按照实施例1中步骤(1)制备的原代肝细胞；微囊化肝细胞组中移植的是仅将肝细胞微囊化，而未掺入血管内皮细胞的APA微囊化肝细胞。于植入前和植入后的1d、3d、7d、2w、3w、4w眼眦静脉取血测定各组大鼠的肝脏生化指标，并观察死亡率和死亡时间。

根据试剂盒(购自北京北化康泰临床试剂有限公司谷丙转氨酶(ALT)试剂盒、谷草转氨酶(AST)试剂盒、白蛋白(ALB)试剂盒)说明书，使用分光光度计测定并计算谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和白蛋白(ALB)值，检测其肝功能变化。

从图2、3和4的结果可以看出，由于微囊的包裹和血管内皮细胞的加入，共包裹组的肝功能值要明显好于单纯微囊化肝细胞组，而由于机体的免疫排斥反应，游离的肝细胞组的效用也逐渐消失。

此外，通过实验观察，本发明的组织工程微囊化肝细胞的植入可以提高肝衰竭大鼠的存活率，存活时间超过一个月。

Claims (5)

1.一种组织工程微囊化肝细胞的制备方法，其特征在于，按照如下操作步骤进行：

(1)将肝细胞和血管内皮细胞以1∶0.5-1的数量比置于质量百分比浓度为1.5-2％的海藻酸钠水溶液中混合，制成细胞悬液，使每毫升细胞悬液中含有的总细胞数为3-5×10⁶个；

(2)利用高压静电微囊发生仪将步骤(1)获得的细胞悬液喷射到100-120mM的氯化钙水溶液中，反应12-20min，形成海藻酸钙胶珠；

(3)将上述海藻酸钙胶珠洗涤后加入到质量百分比浓度为0.02-0.07％的多聚赖氨酸水溶液中，反应5-10min，自由沉降后，收集沉淀物；

(4)清洗步骤(3)获得的沉淀物后将其加入到质量百分比浓度为0.02-0.07％的海藻酸钠水溶液中，反应3-8min，自由沉降后，收集沉淀物；

(5)清洗步骤(4)获得的沉淀物后将其加入到浓度为45-70mM的柠檬酸钠水溶液中，反应3-8min，收集沉降物并清洗，从而获得组织工程海藻酸钠-多聚赖氨酸-海藻酸钠微囊化肝细胞。

2.根据权利要求1所述的组织工程微囊化肝细胞的制备方法，其特征在于，所述肝细胞具有90％以上的纯度。

3.根据权利要求1所述的组织工程微囊化肝细胞的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中将步骤(1)获得的细胞悬液以200-500μm直径的胶珠状态分散。

4.按照权利要求1-3任一所述制备方法获得的组织工程微囊化肝细胞。

5.权利要求4所述的组织工程微囊化肝细胞在制备肝衰竭药物方面的应用。

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