CN101875914B - 一种骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化的诱导液及其制备和应用 - Google Patents
一种骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化的诱导液及其制备和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种骨髓间充质干细胞定向分化上皮细胞诱导液及其在体外定向诱导骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化的应用,其由上皮细胞培养液与L-DMEM以2∶1~1∶2的体积比混合,内含6%v/v胎牛血清。本发明上皮细胞诱导液制备方法简便实用,来源经济,有确切的BMSC分化为上皮细胞的效果,为临床治疗修复具有上皮细胞的组织/器官缺损提供了一种安全、可靠的种子细胞来源。
Description
技术领域
本发明涉及一种干细胞定向分化的上皮细胞诱导液,特别是涉及一种骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化的诱导液及其制备和应用。
背景技术
上皮细胞是位于皮肤或腔道表层的细胞,具有分泌,排泄,保护和吸收等作用。由于上皮细胞的损伤或缺失而导致组织和器官的病变在临床上多见,组织工程在构建这些组织和器官中具有积极作用。组织工程研究中,涉及到以上皮细胞为种子细胞构建的组织或器官时,往往会遇到上皮细胞体外培养扩增困难的问题,主要原因是可获得的上皮来源少,细胞培养条件要求高且传代困难。
骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)在骨髓组织中含量最为丰富,它具有高度增殖,自我更新和多向分化潜能,不仅可以向骨,软骨,脂肪,肌肉,肌腱和韧带等多种间质组织分化,还能在一定的诱导条件下向神经元细胞,神经胶质细胞,血管内皮细胞,表皮干细胞,上皮细胞等分化,且免疫原性较弱和不存在伦理学等问题,来源广,取材方便,是较理想的组织工程种子细胞。
目前国内外文献已报道的将BMSCs体外诱导分化为上皮细胞的实验并不多见,而此类实验也多采用共培养或者在培养基中添加一些外源性因子进行诱导的方法,如:公告号为CN1766094名称为“入骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞的诱导液及其用途”的中国专利,公开了一种L-DMEM内含8-15ml/100ml胎牛血清、100U/ml青霉素、80U/ml链霉素、0.08-0.20mM氯化钙、10-50ng/ml碱性成纤维生长因子、10-50ng/ml表皮生长因子、10-50ug/ml胰岛素和5-20ug/ml维甲酸,用于诱导人骨髓间充质干细胞分化为表皮样细胞;韩桂林,丁芳宝,梅举,等.体外诱导犬骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化的初步研究.第二军医大学学报.2006,27(8).-858-862,公开了一种K-SFM+EGF+BPE联合培养液能够在体外诱导犬BMSCs向上皮样细胞分化;王素一,韩春茂,赖平平,岑航辉.人骨髓间质干细胞向表皮细胞分化的研究.中华烧伤杂志.2007,23(1).-66-68,公开了用普通L-DMEM培养基和含表皮生长因子、胰岛素、维甲酸、氯化钙的L-DMEM培养基诱导人骨髓间充质干细胞7d,含有表皮生长因子等外源性诱导因子的L-DMEM培养基可以将人骨髓MSC在体外可诱导分化为表皮细胞,等等。
还有一些文献报道人骨髓间充质干细胞体外诱导分化为上皮细胞的报道,但是均为用含有表皮生长因子等外源性诱导因子的培养基诱导分化而来。
生长因子是一类通过与特异的、高亲和的细胞膜受体结合,调节细胞生长与其他细胞功能等多效应的多肽类物质。由于人的器官分化是一个非常复杂的过程,人类的认识不可避免地具有局限性,虽然添加外源性生长因子可以诱导干细胞分化,但是也可能会因外源性生长因子干扰细胞、机体自身代谢调控,出现过度生长甚至形成肿瘤,如骨形态发生蛋白(bonemorphogenetic protein,BMP)用于治疗骨缺损,有文献报道导致骨肉瘤形成。因此,添加外源性生长因子的方法存在诱导结果不确定和安全性的问题,极大地限制了其临床应用。
而采用受损组织匀浆与骨髓间充质干细胞共培养方法诱导分化上皮细胞(Baer PC.Bereiter-Hahn J.Missler C.Brzoska M.Schubert R.Gauer S.Geiger H.Conditioned medium from renal tubular epithelial cells initiates differentiation ofhuman mesenchymal stem cells.Cell Proliferation.42(1):29-37,2009以及Qian H.Yang H.Xu W.Yan Y.et al.Bone marrow mesenchymal stem cells ameliorate ratacute renal failure by differentiation into renal tubular epithelial-like cells.International Journal of Molecular Medicine.22(3):325-32,2008)对获得足量的可用于临床修复的种子细胞也是一种极大的限制。
口腔粘膜上皮细胞是比较容易得到的一种上皮细胞,在发明人前期的研究中发现其在组织修复中有良好的效果(Wei RQ,Tan B,Tan MY,Luo JC,Deng L,Chen XH,Li XQ,Zuo X,Zhi W,Yang P,Xie HQ,Yang ZM.Grafts of porcinesmall intestinal submucosa with cultured autologous oral mucosal epithelial cellsfor esophageal repair in a canine model.Exp Biol Med,2009;234:453-461),但是同样因为传代困难,细胞数量有限,直接用口腔粘膜上皮细胞做组织工程种子细胞也存在应用受限的问题。因此需要找到能够方便地得到大量种子细胞的方法。
基于干细胞在体内发挥再生与修复功能与干细胞/ECM/信号分子的相互作用密切相关,在已有研究的基础上,发明人通过研究BMSC与上皮细胞的相互作用,设想通过上皮细胞分泌的细胞因子等信号分子作为诱导因子作用于BMSC,从而诱导BMSC分化为上皮细胞,即用该种含上皮细胞分泌的信号分子的诱导液可以使BMSC分化为上皮细胞,从而获得足量的,安全的,可用于临床修复具有上皮细胞的组织/器官缺损的组织工程种子细胞。
发明内容:
本发明提供一种骨髓间充质干细胞定向分化上皮细胞诱导液,其由上皮细胞培养液与L-DMEM[低糖达氏修正依氏培养基(low glucose Dulbecco′smodified Eagle′s medium,L-DMEM),一般称为低糖DMEM]以2∶1~1∶2的体积比混合而成,内含6%v/v(体积比)胎牛血清。
优选的,所述的上皮细胞为口腔粘膜上皮细胞,上皮细胞培养液与L-DMEM的体积比为1∶1,诱导液蛋白浓度为1500~2500μg/ml。
进一步的,所述的上皮细胞培养液由以下方法制备:
a、将口腔粘膜上皮细胞接种于DK-SFM(限制性角质形成细胞无血清培养基,Defined Keratinocyte-SFM)中培养,接种浓度1×105个/cm2种于25cm2培养瓶中,于37℃、5%CO2培养箱中培养24±6小时,换液,吸弃未贴壁细胞及培养液,按常规细胞培养时需要的培养液量更换新鲜培养液;
b、首次换液后每隔2d(即首次换液后第3天开始)收集一次上皮细胞培养液,按常规细胞培养时需要的培养液量,更换新鲜培养液;
c、混合收集到的上皮细胞培养液,即得。
优选的,所述的上皮细胞培养液由1~3代上皮细胞培养过程中收集的培养液混合而成,混匀后,用0.22μm滤膜过滤,分装,-20℃保存备用。
当细胞生长达到一定密度,即细胞达90%左右汇合,需要进行传代培养时为一代,一般进行传代培养前需要进行1~3次换液,以确保给生长的细胞提供持续丰富的营养成分。
另一方面,本发明还提供制备权利要求1所述的上皮细胞诱导液的方法,包括:
①制备上皮细胞培养液:
a、将口腔粘膜上皮细胞接种于DK-SFM中培养,接种浓度1×105个/cm2种于25cm2培养瓶中,于37℃、5%CO2培养箱中培养24±6小时,换液,吸弃未贴壁细胞及培养液,更换新鲜培养液;
b、首次换液后,每隔2d收集一次上皮细胞培养液,并更换新鲜培养液;
c、混合收集到的上皮细胞培养液,备用;
②将上皮细胞培养液与L-DMEM以2∶1~1∶2的体积比混合,并加入胎牛血清,使混合液含6%v/v胎牛血清,即得。
优选的,步骤①所述的上皮细胞培养液由1~3代上皮细胞培养过程中收集的培养液混合而成;步骤②中,上皮细胞培养液与L-DMEM体积比为1∶1,所得到的上皮细胞诱导液蛋白浓度为1500~2500μg/ml。
再一方面,本发明还提供一种由骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化制备上皮细胞的方法,包括:
a)骨髓间充质干细胞的培养与鉴定;
b)制备权利要求1所述的上皮细胞诱导液;
c)取骨髓间充质干细胞,用消化液在室温下消化、传代,加入b)步骤制备的上皮细胞诱导液培养,每两天用上皮细胞诱导液半量换液,诱导培养21天后,骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞。
优选的,所述的骨髓间充质干细胞为第2代~第5代干细胞。
本发明BMSC向上皮细胞分化的方法步骤如下:
1)BMSC的培养;
2)BMSC向上皮细胞分化的诱导液的制备;
a)口腔粘膜上皮细胞培养液制备:含6%胎牛血清的DefindedKeratinocyte-SFM(Gibco公司,美国);
b)BMSC向上皮细胞分化的诱导液的制备:无菌条件下收集犬三代前口腔上皮细胞培养液混匀,并与L-DMEM以2∶1~1∶2体积比混合,加入FBS(胎牛血清),使此诱导液ECCM(epithelial cells conditioned medium,即本发明的上皮细胞诱导液)含FBS为6%,-20℃保存备用;
3)体外诱导BMSC定向分化为上皮细胞:取第2代~5代任意一代的犬BMSCs,按2×104个/孔的密度接种于6孔板中,加入L-DMEM 12h后,更换为上皮细胞诱导液(ECCM)继续培养。此后每隔2d更换上皮细胞诱导液一次,培养21天检测。实验重复三次。
本发明还提供上述的上皮细胞诱导液在体外定向诱导干细胞向上皮细胞分化的应用。
本发明的上皮细胞诱导液制备方法简便实用,来源经济,类似天然的诱导条件,有确切的BMSC分化为上皮细胞的效果,并且不添加外源性的生长因子,为临床治疗修复具有上皮细胞的组织/器官缺损提供了一种安全、可靠的种子细胞来源。
以下的具体实施方式是对本发明的进一步详细说明,但并非对本发明的限制,任何基于本发明实质内容作出的变形都属于本发明保护的范围。
附图说明
图1MSCs的鉴定
1A:原代BMSCs培养14d,细胞呈涡旋状生长(×100);1B:第2代BMSCs的HE染色核呈淡蓝紫色,细胞质呈淡粉红色(×200);1C:培养21d的BMSCs可被诱导成脂肪,视野满布红色小脂滴和若干大脂滴(×200);1D:培养21d的BMSCs钙结节染色(×200)可见红色钙化基质。
图2培养21d的犬2代MSCs免疫组织化学染色(SABC×100)2A:
实验组CK-19染色阳性,核呈蓝色,胞浆为棕黄色;2B:对照组CK-19染色呈阴性,细胞核蓝染,胞浆极弱黄染;2C:实验组AE1/AE3染色阳性,细胞核蓝染,胞浆为深棕黄色;2D:对照组AE1/AE3染色阴性,细胞核蓝染,胞浆不着色。
图3口腔黏膜上皮细胞与材料复合构建组织工程食管修复犬食管缺损3A:术后8周钡餐摄片见钡剂通过顺利,管腔通畅,光滑,上下吻合端均无狭窄;3B:术后8周取材,大体标本观察,无吻合口瘘及狭窄形成、无溃疡及糜烂,修复食管腔面光滑,已上皮化,黏膜下血管丰富;3C:术后4周,HE染色组织学观察见有多层完整上皮样结构形成;3D:术后8周,Masson’s trichrome染色组织学观察见排列规整的胶原纤维,其中可见很多骨骼肌束,肌细胞岛。
上述图片为黑白图片,为了更清除地说明本发明骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化的特征,发明人同时提交彩色图片作为参考。
具体实施方式
实施例1制备本发明的上皮细胞诱导液
●收集上皮细胞培养液
(1)成年健康比格犬一只,体重11kg(四川大学动物实验中心提供)。全麻后打开口腔,碘伏反复擦拭消毒,用含500U/ml庆大霉素溶液冲洗3次,剥离口腔黏膜,在洁净工作台上将黏膜下组织用剪刀去除,组织剪成约4mm×4mm大小,放入盛有0.25%Dispase II的培养皿中,4℃过夜消化。眼科镊分离表皮,即可得到含基底层的口腔黏膜上皮组织。将分离后的上皮组织置于0.25%胰蛋白酶中,37℃消化10min,FBS中和胰蛋白酶。1200r/min×5min离心,弃上清,加入含6%胎牛血清的Definded Keratinocyte-SFM的培养液重悬细胞,以1×105/cm2种于25cm2培养瓶中,于37℃、5%CO2培养箱中培养。
(2)第2天换液,吸弃未贴壁细胞及培养液,更换新鲜DK-SFM培养液。以后每隔2d换液1次。无菌条件下收集培养犬口腔黏膜上皮细胞(3代前,含3代)的换下的培养液。
●制备上皮细胞诱导液
将上述步骤收集的培养液混匀,与L-DMEM以2∶1~1∶2体积比混合,优选1∶1的体积比混合,加入FBS,使此诱导液(ECCM)含FBS为6%,混匀后,用0.22μm滤膜过滤,分装,-20℃保存备用。
通过上述方法得到本发明上皮细胞诱导液,备用。
实施例2骨髓间充质干细胞的体外诱导
A、BMSC的培养:
无菌条件下,髂骨后上棘骨穿法取成年健康比格犬骨髓5ml(肝素抗凝)后与5ml低糖DMEM培养基(L-DMEM)混匀,室温下1200r/min离心5min后,弃去脂肪层,血清层,培养基。取下层血细胞与等体积L-DMEM制成悬液约5ml,用吸管轻轻吹打混匀,将此悬液缓缓铺于事先准备好的加有5ml犬淋巴细胞分离液的离心管里。室温2000r/min离心20分钟后,小心收集界面上有核细胞的白膜层,加入L-DMEM清洗,离心,收集细胞。用L-DMEM重新悬浮,计数细胞,调节细胞密度,将细胞以2×105个/cm2接种于25cm2的培养瓶中。在37℃、5%CO2及饱和湿度细胞培养箱内培养,48h后换液,以后每2~3天换液一次。当培养的细胞相互汇合达到90%生长表面时,用0.25%胰蛋白酶-0.1%EDTA液消化分散细胞。取第二代~第五代任意一代BMSC备用。
结果:倒置相差显微镜下,细胞培养2d后呈短棒或者棱形,散在分布,体积较小。7d后细胞增殖迅速,呈长纤维状集落生长,折光性强,体积较大,14d后细胞融合,呈旋涡状或放射状。并且,犬BMSCs可被诱导成脂肪细胞,油红-O染色光镜下可见视野满布红色小脂滴和若干大脂滴;亦可被诱导为成骨细胞,茜素红染见钙结节。见图1,说明成功得到了BMSC。
B、体外诱导BMSC定向分化为上皮细胞:
取第2代犬BMSCs,按2×104个/孔的密度接种于预置了血盖片的6孔板中,加入L-DMEM 12h后,更换为诱导液(ECCM)继续培养的为实验组,直接以L-DMEM的为对照组。此后每2d相应换液一次,实验重复三次。MSCs经诱导21d后,分别以鼠抗人细胞角蛋白19和鼠抗人细胞角蛋白AE1/AE3单克隆抗体对细胞进行免疫组织化学鉴定。结果显示实验组细胞核呈蓝色,胞浆为棕黄色的阳性反应,细胞趋向于三角形,圆形等;透射电镜下可见细胞间紧密连接,证实已诱导为上皮细胞;对照组CK-19染色呈阴性,细胞核蓝染,胞浆极弱黄染,AE1/AE3染色阴性,细胞核蓝染,胞浆不着色,说明未诱导为上皮细胞。见图2。
实施例3口腔黏膜上皮细胞与材料复合构建组织工程食管修复犬食管缺损
A:口腔黏膜上皮细胞培养
成年健康比格犬一只,体重11kg(四川大学动物实验中心提供)。全麻后打开口腔,碘伏反复擦拭消毒,用含500U/ml庆大霉素溶液冲洗3次,剥离口腔黏膜,在洁净工作台上将黏膜下组织用剪刀去除,组织剪成约4mm×4mm大小,放入盛有0.25%Dispase II的培养皿中,4℃过夜消化。眼科镊分离表皮,即可得到含基底层的口腔黏膜上皮组织。将分离后的上皮组织置于0.25%胰蛋白酶中,37℃消化10min,FBS中和胰蛋白酶。1200r/min×5min离心,弃上清,加入含6%胎牛血清的Definded Keratinocyte-SFM的培养液重悬细胞,以1×105/cm2种于25cm2培养瓶中,于37℃、5%CO2培养箱中培养;
B:OMECs与生物材料的复合培养
将合适大小的灭菌生物材料置入无菌6孔板中,用DKSFM培养基浸泡2d,然后向材料上滴入6%FBS,于37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中过夜。
将步骤A培养的口腔黏膜上皮细胞用含0.02%EDTA的0.25%胰蛋白酶消化,1200r/min离心5min,收集制成细胞悬液。以2×105个细胞/孔将口腔黏膜上皮细胞接种到膜状生物材料上,放入37℃、5%CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养。制备成由口腔黏膜上皮细胞与材料复合构建组织工程食管。
C:食管重建术
将试验犬仰卧固定于手术台上,颈部垫高,建立静脉通路输液,采用戊巴比妥钠麻醉(25-30mg/kg),手术中用安定维持麻醉。消毒术野,铺巾,左颈沿胸锁乳突肌前缘斜切口长约7~8cm,经胸锁乳突肌前入式。距食管咽部约5cm处分离自身食管,切除5cm长自身食管,“内套式”吻合食管,对照组(单纯膜状生物材料)6例,实验组(上述B步骤制备的组织工程食管)6例,两端套入长度约0.5cm。采用3-0涤纶线间断式吻合,间距3mm,边距3mm。钛夹标记食管两端,食管床留置半管引流,经洗必泰液冲洗后将人工食管置于原位,逐层缝合。
术后一周内,青霉素80万u肌肉注射bid;术后第一周,给予静脉高营养支持;术后2周,给予普食;
术后8周,将硫酸钡500克以温开水1000毫升混匀在麻醉下经胃管注入连续摄影行钡餐X-ray检查。
术后4、8周,按计划处死取材,进行大体标本和组织学检查(新生食管标本取材纵切包含近、远端吻合口,10%甲醛固定,经脱水、透明、石腊包埋、切片等步骤制成5um厚的石腊切片,行常规HE染色和Masson’s trichrome染色,光镜镜检。)
结果如图3所示。
本实验中,所有动物术后均正常存活并恢复良好,术后动物一般情况良好,未见严重的手术并发症发生。术后8周钡餐摄片见对照组和实验组修复食管均固定于原位,管腔通畅,钡剂顺利通过,上下吻合端均无狭窄,但实验组比对照组更光滑。术后8周取材,进行大体标本观察。所有实验犬均无吻合口瘘及狭窄形成、无溃疡及糜烂,对照组有齿状物突起于腔面;实验组修复后与自身食管相似,腔面已发生上皮化,黏膜下血管丰富,比对照组更光滑。组织学观察:术后4周,对照组有炎性细胞,出现部分上皮样结构。实验组有3层完整上皮样结构形成,仅有少量炎性细胞;术后8周,对照组没有肌肉细胞的再生,在正常骨骼肌周围少有骨骼肌束,但有新生的血管形成,Masson’s trichrome染色可见波浪形的胶原纤维;实验组可见较多骨骼肌束和新生血管形成,并见肌肉细胞和结缔组织的胶原基质。
动物实验结果表明,由口腔黏膜上皮细胞与材料复合构建组织工程食管可有效修复5cm长食管半周缺损,上皮化完全,有更多的新生血管和骨骼肌束形成,为进一步的基础研究和临床应用提供了实验依据。
口腔粘膜上皮细胞是一种分化完全的上皮细胞,在食道上皮组织分化中具有良好的修复效果,本发明制备得到的上皮细胞严格来说是上皮样细胞,还有可继续分化的能力,我们认为本发明定向分化的上皮样细胞,在组织修复上具有更加明显的优势。
上述实验证明,利用本发明的上皮细胞诱导液可以很方便地从骨髓间充质干细胞得到上皮细胞,并且本发明定向分化得到的上皮细胞修复缺损组织效果良好,为临床治疗修复具有上皮细胞的组织/器官缺损提供了一种安全、可靠的种子细胞来源。
Claims (1)
1.一种骨髓间充质干细胞定向分化上皮细胞诱导液,其特征在于:其由上皮细胞培养液与L-DMEM以2:1~1:2的体积比混合而成,内含6%v/v胎牛血清;所述诱导液的蛋白浓度为1500~2500μg/ml;所述的上皮细胞为口腔粘膜上皮细胞。
2、根据权利要求1所述的上皮细胞诱导液,其特征在于:所述上皮细胞培养液与L-DMEM的体积比为1:1。
3、根据权利要求1或者2所述的上皮细胞诱导液,其特征在于:所述的上皮细胞培养液由以下方法制备:
a、将口腔粘膜上皮细胞接种于DK-SFM中培养,接种浓度1×105个/cm2种于25 cm2培养瓶中,于37℃、5%CO2培养箱中培养24±6小时,换液,吸弃未贴壁细胞及培养液,更换新鲜培养液;
b、首次换液后,每隔2 d收集一次上皮细胞培养液,并更换新鲜培养液;
c、混合收集到的上皮细胞培养液,即得,所述的上皮细胞培养液由1~3代上皮细胞培养过程中收集的培养液混合而成。
4、制备权利要求1所述的上皮细胞诱导液的方法,包括:
①制备上皮细胞培养液:
a、将口腔粘膜上皮细胞接种于DK-SFM中培养,接种浓度1×105 个/cm2种于25 cm2培养瓶中,于37℃、5%CO2培养箱中培养24±6小时,换液,吸弃未贴壁细胞及培养液,更换新鲜培养液;
b、首次换液后,每隔2 d收集一次上皮细胞培养液,并更换新鲜培养液;
c、混合收集到的上皮细胞培养液,备用,所述的上皮细胞培养液由1~3代上皮细胞培养过程中收集的培养液混合而成;
②将上皮细胞培养液与L-DMEM以2:1~1:2的体积比混合,并加入胎牛血清,使混合液含6%v/v胎牛血清,即得,所得到的上皮细胞诱导液蛋白浓度为1500~2500μg/ml。
5、根据权利要求4所述的上皮细胞诱导液的制备方法,其特征是:步骤①所述的上皮细胞培养液由1~3代上皮细胞培养过程中收集的培养液混合而成;步骤②中,上皮细胞培养液与L-DMEM体积比为1:1。
6、一种由骨髓间充质干细胞体外定向诱导分化制备上皮细胞的方法,包括:
a) 骨髓间充质干细胞的培养;
b) 制备权利要求1所述的上皮细胞诱导液;
c) 取骨髓间充质干细胞,用消化液在室温下消化、传代,加入b)步骤制备的上皮细胞诱导液培养,每2天用上皮细胞诱导液半量换液,诱导培养21天后,骨髓间充质干细胞分化为上皮细胞;
步骤c)所述的骨髓间充质干细胞为第2代~第5代任意一代干细胞。
7、权利要求1所述的上皮细胞诱导液在体外定向诱导骨髓间充质干细胞向上皮细胞分化的应用。
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2009
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