CN101029303B - 一种诱导干细胞向软骨分化的物质和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种诱导干细胞向软骨分化的物质和方法，它可以有效地将干细胞诱导为软骨表型的细胞或诱导干细胞-可降解材料复合物形成组织工程化软骨。本发明使组织工程化软骨构建摆脱了软骨细胞来源问题的限制，并且建立了一种真正简便、经济、安全、有效而又容易大规模推广应用的软骨诱导方法。

Description

一种诱导干细胞向软骨分化的物质和方法

技术领域

本发明涉及医学和生物医学工程领域，更具体地涉及软骨细胞或软骨组织和/或两者分泌的可溶性物质制备方法及其诱导干细胞向软骨分化的方法和用途。

背景技术

先天畸形、外伤、感染、肿瘤或骨软骨炎等疾病均可以导致软骨的缺损或损伤。由于软骨组织损伤后自我修复能力很低，因此，软骨缺损或损伤的治疗一直是修复重建外科面临的巨大挑战。目前临床上常用的治疗手段包括：自体软骨的游离或带蒂移植(主要取自体肋软骨)、异体软骨的游离移植、自体或异体软骨细胞注射移植、骨膜或软骨膜移植及应用人工假体等。但这些方法均存在明显的缺点，如：自体软骨移植供体来源少、创伤大、移植后易吸收缩小，还可能出现各供区并发症。异体和异种软骨移植物不但具有免疫原性，而且存在传播艾滋病、肝炎等病原体的危险。虽然人工合成的软骨组织代用品具有制作简单，使用方便等优点，但是替代材料只具备充填、支持及维持美观的作用，缺少软骨生物学功能，不是真正意义上的结构与功能重建，而且可能发生移植部位疼痛、人工代用品外露等问题，无法满足患者的治疗要求。

组织工程技术的兴起为软骨缺损的完美修复带来了新的希望。其基本原理是将有特定功能的细胞与一定形状的可降解生物材料结合，通过体外培养构建出有相应功能的活体组织用于组织缺损的修复，或直接将细胞-材料复合物植入体内组织缺损部位进行修复。软骨是最早应用组织工程技术构建成功的组织，目前应用软骨细胞为种子细胞在体内外已经能够成功地构建出精确形状的成熟软骨组织。但获取软骨细胞同样会面临软骨移植时存在的供区创伤大、供体来源不足及同种异体免疫排斥反应等问题，而且软骨细胞体外大量扩增极易发生老化与去分化，常规培养传代3～4次后即丧失软骨形成能力。这些问题都是软骨组织工程迟迟未能应用于临床软骨缺损治疗的根本原因。因此，探索新的软骨组织工程种子细胞来源势在必行。

干细胞(stem cells)包括间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)的软骨分化潜能已被许多研究充分证实。干细胞来源广泛(可以来自骨髓、骨膜、软骨膜、脂肪、皮肤、血管周膜、胚胎中胚层未分化的间充质细胞以及建系的胚胎干细胞等)，体外扩增能力强，免疫原性低，而且自体来源的干细胞取材创伤小、供区广泛又不必担心免疫排斥反应，因此，干细胞是目前软骨组织构建的最佳种子细胞来源。

在干细胞软骨定向分化及组织工程化软骨构建的研究与应用中，选择何种软骨定向诱导方案一直是研究的难点和关键问题。现行的干细胞体外软骨定向诱导方案主要分为两大类：一类是通过添加外源性诱导因子或细胞外基质成分促进干细胞软骨分化。这种方法的主要缺点是操作繁复，诱导效率低，更重要的是诱导过程中添加的因子种类多、用量大、价格昂贵，不利于大规模临床推广应用。另一类诱导方法是将有软骨诱导作用的某些蛋白或生长因子的重组DNA通过转基因技术导入干细胞，诱导其向软骨定向分化。应用转基因技术虽然提高了分化效率，降低了成本，但由于存在安全性(致瘤性、表达量的调控)、伦理性等问题，距临床应用的要求仍有很大的差距。因此，如何建立一种简便、经济、安全而又有效的诱导方法，已成为干细胞软骨定向分化及组织工程化软骨构建的关键所在。

中国专利(申请号：02155171.5)揭示将软骨细胞与BMSCs按一定比例混匀，接种到生物支架材料后植入裸鼠皮下或进行体外培养后，BMSCs向软骨定向分化并在体内外形成成熟的软骨组织。然而，这种软骨细胞/干细胞混合培养的诱导方法最大缺点在于，软骨细胞必须直接参与干细胞的软骨定向分化或组织工程化软骨构建，这就同样面临着应用软骨细胞作为种子细胞所面临的自体软骨细胞来源不足、同种异体或异种软骨细胞的免疫原性、疾病传播等相关问题。

因此本领域迫切需要解决这些问题，使组织工程化软骨构建彻底摆脱软骨细胞来源问题的限制，建立一种真正简便、经济、安全、有效而又容易大规模推广应用的软骨诱导方法。

发明内容

本发明旨在提供一种能诱导干细胞向软骨分化的诱导剂。

本发明的另一目的是提供将所述的诱导剂用于诱导干细胞向软骨分化的方法。

在本发明的第一个方面，提供了一种软骨分化诱导剂，它具有以下特征：

(a)可诱导干细胞(如骨髓基质干细胞或胚胎干细胞)分化形成软骨细胞；

(b)来自体外培养软骨细胞或软骨组织的培养液。

所述诱导剂是用以下的制备方法获得的：

将体外培养软骨细胞或软骨组织所获得的培养液进行分离(如过滤或离心)，去除软骨细胞和软骨组织，从而获得不含细胞和细胞碎片的溶液。

在另一优选例中，所述诱导剂是用以下的制备方法获得的：

将体外培养软骨细胞或软骨组织所获得的培养液通过离心进行分离，去除软骨细胞和软骨组织，从而获得不含细胞和细胞碎片的溶液。

在另一优选例中，所述的培养液是培养软骨细胞或软骨组织1天-200天期间所获得的培养液。

在另一优选例中，培养软骨细胞的时间为1天-100天，培养软骨细胞构建的组织工程化软骨的时间为3天-200天。

在另一优选例中，所述的培养液是在换液后24小时-150小时期间获得的培养液。

在上述的诱导剂中，所述的软骨组织包括软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合所形成的组织工程化软骨移植物或组织工程化软骨。

在另一优选例中，所述的组织工程化软骨为软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料形成的固态细胞-材料复合物，且软骨细胞在复合物中的浓度为1×10⁶个细胞/cm³-1×10⁸个细胞/cm³。

在上述的诱导剂中，所述的制备方法还包括步骤：对获得的不含细胞和细胞碎片的溶液进行浓缩和/或干燥，从而制成浓缩的或固态的诱导剂。

在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：从所述的不含细胞和细胞碎片的溶液中分离出蛋白质物质。

在另一优选例中，所述的诱导剂包括软骨细胞和/或软骨组织培养过程中分泌的可溶性物质(主要的有效成份)。

在上述的诱导剂中，所述的软骨细胞是人或动物的软骨细胞。

在另一优选例中，所述的软骨细胞可来源于关节软骨、肋软骨、耳软骨、气管软骨等各种软骨组织。

在本发明的第二个方面，提供了一种上述诱导剂的用途，就是将它用作体外诱导干细胞定向分化为软骨细胞的诱导剂。

在本发明的第三个方面，是提供了一种诱导干细胞向软骨分化的方法，它包括步骤：在适合培养的条件下，在培养液中培养干细胞或干细胞-生物可降解材料的复合物，所述的复合物包括干细胞和药学上可接受的生物可降解材料，且干细胞在复合物中的浓度为1×10⁵个细胞/克-1×10⁸个细胞/克，培养时间为7天-180天，从而诱导干细胞分化为软骨细胞。

其中，在所述培养液中含有本发明提供的软骨分化诱导剂。

在另一优选例中，所述的诱导剂为液态或固态形式。

在另一优选例中，干细胞是人或动物的干细胞。

在另一优选例中，所述的干细胞包括各种间充质干细胞(如骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、肌肉干细胞、真皮多潜能干细胞等)和胚胎干细胞。更佳地，所述的干细胞包括间充质干细胞。

在另一优选例中，所述诱导剂的含量为0.1-1.0ml/ml培养液，其中诱导剂按未浓缩的软骨培养液体积计算。

在另一优选例中，所述的可降解材料为药学上可接受的、生物相容性良好的可降解材料，可选自下组：聚乳酸PLA、聚羟基乙酸PGA、PLGA、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六环酮、胶原、明胶、透明质酸、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、脱细胞基质，及其组合。

在本发明的第四个方面，提供了一种用于诱导干细胞分化为软骨细胞的培养基，所述培养基含有0.1-1.0ml/ml本发明提供的软骨分化诱导剂(按未浓缩的软骨培养液体积计算)。此外，所述的培养基还具有其他本领域常规的培养基组分，例如胎牛血清、L-谷氨酰胺、维生素C、青霉素、链霉素等。一种制备本发明培养基的方法包括步骤：在各种市售的或用常规方法配制的培养基中加入0.1-1.0ml/ml本发明的软骨分化诱导剂。

在本发明的第五个方面，提供了一种用于诱导干细胞分化成软骨细胞的培养装置，它包括以下组件：

一容器，所述容器内盛有培养干细胞和软骨细胞的培养液；

一隔离装置，所述隔离装置将所述容器分割成2个或多个隔离的培养单元，并且所述的隔离装置不能透过细胞或细胞碎片但可以透过直径小于0.4微米的大分子物质；

一适合培养干细胞和软骨细胞的培养液，所述的培养液流动于各培养液单元；

其中，在至少一个培养单元中含有不低于10⁵个软骨细胞或软骨组织，并且在至少一个培养单元中含有不低于10⁵个干细胞或干细胞与生物可降解材料复合物。

在另一优选例中，所述的隔离装置是孔径为0.4-2.0微米的过滤板。

在另一优选例中，所述的软骨细胞和干细胞来自同一个体或同种异体或不同物种。

本发明提供的诱导剂能有效地在体外模拟软骨诱导微环境，其制备过程对软骨细胞的种属来源和取材部位没有特别限制，使本发明所需的软骨细胞来源充足，容易获取且不必担心免疫原性等问题。使用本发明提供的诱导剂能有效地诱导干细胞团或干细胞-生物材料复合物向软骨定向分化或形成组织工程化软骨组织，该体外软骨诱导方法操作简便，诱导效果确切可靠，便于大规模推广应用。

附图说明

图1显示了体外培养8周时hBMSC-PGA复合物的大体标本；左为诱导组，右为对照组。

图2显示了体外培养8周时hBMSC-PGA复合物的HE染色结果；左为诱导组，右为对照组。

图3显示了体外培养8周时hBMSC-PGA复合物的Safranin-O染色结果；左为诱导组，右为对照组。

图4显示了体外培养8周时hBMSC-PGA复合物的甲苯胺蓝染色结果；左为诱导组，右为对照组。

图5显示了体外培养8周时hBMSC-PGA复合物的II型胶原免疫组化染色结果；左为诱导组，右为对照组。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现软骨细胞可以不直接参与干细胞的软骨定向分化或组织工程化软骨的形成，这样软骨细胞就不会影响干细胞构建组织工程化软骨的免疫原性，其来源也没有严格的限制；进一步地还发现体外培养软骨细胞或软骨组织的培养液，由于含有软骨细胞分泌的可溶性物质，可作用于干细胞团或干细胞-材料复合物，诱导它们向软骨定向分化并形成组织工程化软骨。

具体地，将软骨细胞或软骨组织与干细胞或干细胞-材料复合物置于同一个培养装置中，两者之间通过一个过滤板隔离而不互相接触，通过隔离共培养的方式将干细胞团或干细胞-材料复合物诱导为软骨组织；

或者应用除去了细胞和细胞碎片的软骨细胞或软骨组织的培养液作为诱导因素，或以这些培养液中提取的可溶性物质作为诱导因子，同样成功地将干细胞团或干细胞-材料复合物诱导为软骨组织。

据此本发明人建立了一种真正简便、经济、安全、有效而又容易大规模临床推广应用的软骨诱导方案，摆脱了干细胞构建组织工程化软骨过程中对软骨细胞来源的限制，完成了本发明。

术语

术语“软骨细胞的分离培养”指将存在于人或动物软骨组织中的软骨细胞通过酶消化的方法选取出来并进行体外培养的过程。

术语“接种”指将细胞均匀分布于三维支架材料上的过程。

术语“构建”指体外分离培养种子细胞，并将细胞与生物材料混合，通过体外培养和/或体内植入，使细胞-材料复合物形成组织工程化组织的过程。

术语“组织工程化软骨”指将软骨细胞或具有软骨分化潜能的干细胞接种于生物可降解材料，通过体外培养和/或体内植入，生物材料部分或全部降解后所形成的软骨样组织。

术语“干细胞”指具有自我更新能力及多向或定向分化潜能的细胞群体，它们主要存在于人或动物的特定组织或胚胎组织中，也可以通过建立细胞系而获得。

术语“诱导”指提供特殊的生化环境，将具有多向或定向分化能力的干细胞等细胞群体转变为另一种功能特性不同的细胞群体的过程。

软骨细胞

本发明中软骨细胞的来源没有特别限制，可以是人或动物的软骨细胞，可来源于关节软骨、肋软骨、耳软骨、气管软骨等各种软骨组织。一种优选的来源是来自人或动物的关节软骨。

分离获得软骨细胞的方法是文献多次报道的公认方法。一种优选的方法是全麻或局麻下无菌切取软骨组织，经磷酸缓冲液(PBS)清洗后，加入5-10倍软骨体积的胶原酶溶液(浓度一般在0.5-3mg/ml，以PBS或培养液配制)，37℃恒温振荡消化4-20小时(依软骨组织的来源及消化进展程度而定)，过滤收集软骨细胞悬液，离心、洗涤、台盼蓝染色、显微镜下计数，原代软骨细胞活力一般应在80％以上。

软骨细胞的培养、传代方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是将软骨细胞在CO₂培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不限于)：1)F-12培养基或DMEM培养基+5％-20％胎牛血清；2)F-12培养基或DMEM培养基+5％-20％自体(或异体)人血清；3)F-12/DMEM培养基(1∶1)+2％-20％胎牛血清或人血清。一类特别优选的软骨细胞是体外分离培养的原代-第3代的软骨细胞。此时的软骨细胞功能和活力均良好，具有很强的软骨形成能力，经免疫细胞化学染色证明有II型胶原表达，RT-PCR及原位杂交检测证明有II型胶原及蛋白聚糖(aggrecan)mRNA的表达。

软骨组织

本发明所称的软骨组织包括软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合所形成的组织工程化软骨移植物或组织工程化软骨。

软骨细胞构建组织工程化软骨的方法是本领域中熟知的。一类优选的方法是将原代-第3代的软骨细胞接种到可降解生物材料形成软骨细胞-材料复合物，再进行体外培养，使细胞充分与材料接触并分泌细胞外基质，同时材料被逐渐降解，最终形成软骨组织。软骨细胞-生物材料复合物的细胞接种浓度通常约为1×10⁷/ml至7×10⁷/ml或更高。生物材料的种类和来源没有特别限制，一类优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固体、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原及其多聚物和混合物等。制备细胞-材料复合物时，以培养液调整细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例也没有特别限制，但是以该固体材料所能够吸附培养液的最大量为准。当支架材料为特殊三维形状时，如耳廓或鼻背形，按实际体积的大小来进行计算。

软骨细胞构建组织工程化软骨的体外培养方法没有特别限制，一类优选的培养方法是置于培养瓶、培养皿、离心管或生物反应器中培养，培养过程中可以对组织工程化软骨施加各种物理的或化学的刺激。软骨细胞构建组织工程化软骨的体外培养时间没有特别的限制，优选的体外培养时间为3天-6个月，软骨组织形成的时间为1周-8周。

可用于构建本发明组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明质酸、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐以及各种脱细胞基质等；

(c)上述材料的共聚物或复合型材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。

优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固体、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原等。本发明中的材料可预制成各种精确的大小与形状，以适应不同大小和形状的软骨组织构建。当材料为固体型材料时，可以直接将材料预制成需要的大小与形状，也可以通过计算机辅助及快速成型技术定制的模型对材料进行精确的塑性。

1诱导剂-诱导干细胞向软骨分化的物质

本发明所称的诱导剂来自体外培养软骨细胞或软骨组织的培养液，并且可诱导干细胞(如骨髓基质干细胞)分化形成软骨细胞。

所述的诱导剂是软骨细胞或软骨组织分泌的可溶性物质；或是培养软骨细胞或软骨组织时得到的培养液；或是从上述培养液中分离纯化得到的，来自软骨细胞和/或软骨组织分泌的部分或全部可溶性物质。这些可溶性物质中有些成份是已知的(如胰岛素样生长因子、转化生长因子等)，有些是未知的，但所有来自软骨细胞或软骨组织分泌的可溶性物质(部分或全部)，只要可用于干细胞的软骨定向诱导分化，均属于本发明的权利要求范围之内。

制备本发明所述的诱导干细胞向软骨分化的诱导剂，一种优选的方法是直接收集培养软骨细胞或软骨组织时的培养液；另一优选的方法是通过蛋白质浓缩纯化的方法从上述培养液中提纯出软骨细胞和/或软骨组织分泌的部分或全部可溶性物质。

软骨细胞或软骨组织的体外培养时间没有特别限制，当培养物为软骨细胞时，优选的体外培养时间为1天-90天，优选的收集培养液时间为换液后的24小时-120小时。当培养物为软骨细胞构建的组织工程化软骨时，优选的体外培养时间为3天-180天，优选的收集培养液时间为换液后的24小时-96小时。

诱导剂的制备方法

将体外培养软骨细胞或软骨组织所获得的培养液进行分离(如过滤或离心)，去除软骨细胞和软骨组织，从而获得不含细胞和细胞碎片的溶液。

一种优选的方法是将体外培养软骨细胞或软骨组织所获得的培养液通过离心进行分离，去除软骨细胞和软骨组织，从而获得不含细胞和细胞碎片的滤液。

所述的培养液是培养软骨细胞或软骨组织1-200天期间所获得的培养液；更优选地，培养软骨细胞的时间为1天-90天，培养软骨细胞构建的组织工程化软骨的时间为3天-180天。

所述的培养液是在换液后24小时-150小时期间获得的培养液；更优选地，当培养物为软骨细胞时，收集培养液时间为换液后的24小时-120小时，当培养物为软骨细胞构建的组织工程化软骨时，收集培养液时间为换液后的24小时-96小时。

另一个优选的方法是对获得的不含细胞和细胞碎片的溶液进行浓缩和/或干燥，从而制成浓缩的或固态的诱导剂；或是从所述的不含细胞和细胞碎片的溶液中提取纯化出软骨细胞或软骨组织分泌的可溶性物质。

干细胞

干细胞的分离、培养、体外扩增方法是本领域中熟知的。干细胞的来源没有特别限制，包括人或动物的各种间充质干细胞(如骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞、肌肉干细胞、真皮多潜能干细胞等)和胚胎干细胞。一种优选的干细胞是人或动物的骨髓基质干细胞(bone marrow stem cells，BMSC)，可以通过骨髓密度梯度离心或全骨髓贴壁培养方法获得。

生物可降解材料

可用于本发明的组织工程化软骨的材料是医学上可接受的生物可降解材料，包括(但并不限于)：

(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、PLGA、聚羟基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明质酸、聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；

(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸盐以及各种脱细胞基质等；

(c)上述材料的共聚物或复合型材料，尤其是高分子材料与天然材料的复合材料，以及固体材料与可注射性材料的复合材料。

优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固体、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原等。本发明中的材料可预制成各种精确的大小与形状，以适应不同大小和形状的软骨组织构建。当材料为固体型材料时，可以直接将材料预制成需要的大小与形状，也可以通过计算机辅助及快速成型技术定制的模型对材料进行精确的塑性。

干细胞-生物材料复合物

干细胞-生物材料复合物的制备方法也是本领域中熟知的。一种优选的制备方法是将干细胞直接接种到可降解生物材料上。干细胞-生物材料复合物的细胞接种浓度通常约为1×10⁷/ml至7×10⁷/ml或更高。生物材料的种类和来源没有特别限制，一类优选的医学上可接受的生物可降解材料是固体材料或固体、液体复合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、胶原及其多聚物和混合物等。制备细胞-材料复合物时，以培养液调整细胞浓度，然后与固体性材料混合，其中混合时培养液与固体性材料的比例也没有特别限制，但是以该固体材料所能够吸附培养液的最大量为准。

干细胞软骨定向诱导

诱导干细胞或干细胞-生物材料复合物向软骨定向分化的方法的主要步骤包括：(1)将干细胞离心形成干细胞团或与药学上可接受的生物可降解材料混合形成干细胞-材料复合物；(2)以软骨细胞或软骨组织分泌的可溶性物质作为诱导因素，诱导干细胞团或干细胞-生物材料复合物向软骨定向分化。

诱导因素的施加方式没有特别限制，以软骨细胞或软骨组织作为诱导因素时，优选的施加诱导因素方式是通过隔离共培养的方式诱导干细胞团或干细胞-材料复合物向软骨定向分化；以软骨细胞或软骨组织的培养液作为诱导因素时，优选的施加诱导因素方式是将这些培养液直接作为诱导干细胞团或干细胞-材料复合物向软骨定向分化的培养液；以软骨细胞或软骨组织分泌的可溶性物质部分或全部提取物作为诱导因素时，优选的施加诱导因素方式是将提取物加入到干细胞团或干细胞-材料复合物的培养液中诱导其向软骨定向分化。

体外诱导的开始时间及持续时间也没有特别限制，优选的开始诱导时间为干细胞团或干细胞-材料复合物构建完成即刻至28天，优选的体外诱导持续时间为7天-180天。

诱导培养装置

一种常规诱导培养装置是在常用的培养装置内(培养瓶、培养皿、离心管及生物反应器等)加入用于诱导干细胞分化为软骨细胞的培养基，其中含有胎牛血清、L-谷氨酰胺，维生素C，青、链霉素等常规的培养成分(剂量和浓度可参考具体实施例和相关文献报道)和0.1-1.0ml/ml软骨细胞或软骨组织的培养液；或在上述常规培养成份的基础上加入一定量的软骨细胞或软骨组织培养液的浓缩液或其可溶性物质提取物。

另一种优选的培养装置是使其在原位直接产生诱导物质，即通过隔离共培养的方式诱导干细胞团或干细胞-材料复合物向软骨分化；所述的隔离共培养是指将软骨细胞或软骨组织与干细胞团或干细胞-材料复合物置于同一培养孔内培养，两者之间通过一个隔离装置隔离使其互不接触而培养液可以相互流动，软骨细胞或软骨组织分泌的可溶性物质可以通过扩散的方式发挥诱导作用。所述的装置包括容器，所述容器内盛有培养干细胞和软骨细胞的培养液；隔离装置，所述隔离装置将所述容器分割成2个或多个隔离的培养单元，并且所述的隔离装置不能透过细胞或细胞碎片但可以透过直径小于0.4微米的大分子物质；和适合培养干细胞和软骨细胞的培养液，所述的培养液流动于各培养液单元。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明提供的诱导方法能有效地诱导干细胞团或干细胞-生物材料复合物向软骨定向分化或形成组织工程化软骨组织，这些诱导产物可以用于各种软骨组织工程相关的实验研究，也可以用于修复病人的各种软骨缺损或软骨损伤。

(2)以软骨细胞或软骨组织分泌的可溶性物质作为诱导因素，有效地在体外模拟了软骨诱导微环境，并避免了以往报道的诱导方法的诸多不足，如应用生长因子诱导时因子用量大、种类多、价格昂贵且诱导效果不稳定及通过转基因技术诱导时的安全性等。

(3)本发明的诱导剂制备过程中虽然应用了软骨细胞，但软骨细胞不直接参与干细胞的软骨分化与软骨形成，对软骨细胞的种属来源和取材部位没有特别限制，因此，发明中所需的软骨细胞来源充足，容易获取且不必担心免疫原性等问题。

(4)软骨定向诱导剂制备方法简单易学，成本低廉，便于大规模推广应用，还可以开发出产业化的产品。

(5)体外软骨诱导方法操作简便，诱导效果确切可靠，便于大规模推广应用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照文献报道的常规条件，例如实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1

制备诱导干细胞向软骨分化的诱导剂I

一、分离、培养软骨细胞

实验动物：

幼猪5头，体重约10kg，雌雄不限。

实验方法：

1.动物以氯氨酮10～20mg/kg、阿托品0.5～1mg肌注麻醉诱导及抑制腺体分泌，耳缘静脉缓慢静推水合氯醛(10％)1ml/kg或戊巴比妥钠(2.5％)1ml/kg麻醉；

2.常规消毒铺巾，无菌切取膝关节软骨组织，剪成2mm×3mm大小碎片，磷酸盐缓冲液冲洗两遍；

3.按改良的Klagsbrun法，加入5倍体积的1mg/mlII型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床内消化8-12小时，过滤，离心；

4.沉淀细胞用PBS洗涤2次，以含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C 50ug/ml，青、链霉素各100U/ml的DMEM培养液制成细胞悬液，计数，台盼蓝染色检查软骨细胞活力，一般活力＞85％；

5.根据计数结果以2.5×10⁴个细胞/cm²密度接种于培养皿；

6.在37℃，5％CO₂及饱和湿度的培养箱中连续培养48小时后更换培养液，以后隔日换液；

7.当软骨细胞生长达到80％以上的融合状态时，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA(PBS配制)消化，收集细胞，计数，按2.5×10⁴个细胞/cm²密度接种于培养皿，进行传代培养，隔日换液；

8.当细胞生长再次达到80％以上的融合状态时，按上述相同的方法进行传代培养，直到传代培养至第3-4代。

二、收集培养过软骨细胞的培养液

收集体外培养软骨细胞过程中得到的培养液，制得诱导干细胞向软骨分化的诱导剂I，-80℃冷冻保存备用。

实施例2

制备诱导干细胞向软骨分化的诱导剂II

一、软骨细胞-材料复合物构建

(1)聚羟基乙酸(PGA)三维支架制备

无纺PGA纤维购自Albany公司(Albany，NY，USA)，真空保存。纤维直径13-15μm，将PGA纤维精确称量为20mg/块，用特制的模具分别压制成直径13mm、厚2mm的圆柱体小块，待形状固定后，将材料支架完全浸入到75％乙醇中消毒30分钟。PBS冲洗3遍，再用含10％胎牛血清的DMEM培养基浸泡10分钟，吸干后准备接种细胞。

(2)软骨细胞-材料复合物构建

1.单层培养的第一代软骨细胞达到90％汇合时，应用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，收集细胞，计数；

2.2000rpm离心8min使细胞沉淀，弃去上清液，振荡分散细胞；

3.按5×10⁷个细胞/cm³的密度将软骨细胞悬液均匀地接种到支架材料上，每块支架材料接种细胞总量约1.5×10⁷个；

4.接种完成后，将细胞-材料复合物置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的环境中静态培养4-5小时，待细胞与PGA纤维充分粘附后，补足培养液；

5.培养24小时后首次更换培养液，以后每隔36-48小时更换培养液，体外持续培养3个月。

二、收集培养过软骨细胞-材料复合物的培养液

收集体外培养软骨细胞-材料复合物过程中得到的培养液，制得诱导干细胞向软骨分化的诱导剂II，-80℃冷冻保存备用。

实施例3

制备诱导干细胞向软骨分化的诱导剂III

浓缩纯化实施例1和2所获得的诱导剂I和II，制得诱导干细胞向软骨分化的诱导剂III。主要的浓缩纯化方法和步骤包括：

(1)冷冻干燥法浓缩诱导剂I和II

将实施例1和2所获得的诱导剂I和II转移到玻璃培养皿内，置于冷冻干燥机内真空冷冻干燥24小时-48小时，初步浓缩诱导剂I和II。

(2)盐析法浓缩沉淀蛋白质

在上述冷冻干燥法得到的初步浓缩液中加入足量(一般要加入原浓缩液体积2倍以上)的饱和硫酸铵溶液并充分搅拌，直至絮状的沉淀物不再增加，将混合液体转移至离心管，在3500转/分、4℃条件下离心5分钟，吸弃上层澄清液体，下层絮状沉淀物保留继续进行下一步的纯化与浓缩。

(3)透析法除盐纯化蛋白质

将盐析法得到的絮状沉淀物转移至透析袋内，置于3000毫升去离子水中在4℃恒温室内透析24小时-48小时，透析期间每隔4小时更换一次去离子水，除去沉淀物中的大部分盐离子及小分子物质。

(4)冷冻干燥制得诱导剂III

将透析后得到的产物再次进行冷冻干燥，根据需要可以制备成高蛋白浓度的浓缩液或冻干粉，即为诱导干细胞向软骨分化的诱导剂III，-80℃冷冻保存备用。

实施例4

人骨髓基质干细胞(hBMSCs)的分离、培养与hBMSC-材料复合物构建

骨髓来源：

骨髓取自捐献者的髂骨，供体年龄5-20岁，无恶性肿瘤、传染性疾病及血液系统疾病。

(1)hBMSCs的获取与培养

取材部位局麻，常规消毒铺巾，16号穿刺针于髂前上脊穿刺，抽取骨髓5～8ml，置于肝素化的离心管中。

将抽取的骨髓先后用5ml和1ml一次注射器反复抽吸数次，转移至另一离心管内，加入少量的无血清DMEM培养液，混匀，3000rpm离心10分钟，轻轻吸除脂肪及大部分上清液，注意不要搅动下方的沉淀物，重新振荡混匀，在另一15ml离心管内加入新鲜配制的Percoll分离液(Pharmacia公司)，分离液表面轻轻加入上述的骨髓细胞悬液(体积为分离液的一半)，900g离心30分钟，此时离心管内液体分为四层：第一层主要是血清和少量的培养液，第二层为有核细胞层，第三层为Percoll分离液，第四层主要是沉淀下来的红细胞。轻轻吸取第二层的有核细胞转移至另一离心管内，加入适量的无血清DMEM培养液洗涤离心二次，沉淀细胞以含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml的DMEM(Gibco，Gland Island，NY，USA)培养液制成细胞悬液。取少量细胞悬液用4％乙酸等体积稀释破坏残存的红细胞，常规计数有核细胞。根据计数结果，按2.5×10⁵/cm²的细胞密度接种于培养皿。

将接种好的培养皿置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的CO₂培养箱内，培养48小时后首次换液，此时在低倍镜下可清楚地见到多个克隆形成。吸除旧培养液，PBS洗涤2-3次，加入新鲜培养液，继续在相同的条件下培养，隔日更换三分之二量的培养液，一般7-9天后可达到融合状态，可继续传代培养。传代时吸除培养液，以少量PBS洗涤一次，加入1.5-2.0ml的消化液(含0.02％EDTA及0.25％胰蛋白酶的PBS)，镜下见大部分细胞胞质回缩、形态变圆后，轻轻吸除消化液，加入适量的含血清的DMEM条件培养液中止消化，收集细胞悬液、计数，以1.5×10⁴/cm²细胞密度接种于新的培养皿内，继续在相同的条件下培养。隔日更换三分之二量的培养液，一般4-5天后又可达到融合状态，可继续传代培养或直接用于实验。本实例中应用的是体外培养第2-3代的细胞。

(2)PGA三维支架的制作

将无纺PGA纤维(来源同前)精确称量为5mg/块，用特制的模具分别压制成直径5mm、厚1.5mm的圆柱体小块，待形状固定后，将材料支架完全浸入到75％乙醇中消毒30分钟。PBS冲洗3遍，再用含10％胎牛血清的DMEM培养基浸泡10分钟，吸干后准备接种细胞。

(3)hBMSC-材料复合物构建

单层培养第2～3代的hBMSCs达到90％汇合时，以0.25％胰酶+0.02％EDTA消化收集细胞，计数。1500rpm离心5min使细胞沉淀，弃去上清液，振荡分散细胞，按5×10⁷个细胞/cm³的密度将hBMSCs悬液均匀接种到材料支架上。每块支架材料接种细胞总量约2×10⁶-3×10⁶个细胞。接种完成后，将细胞-材料复合物置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的环境中静态培养4-5小时，待细胞与PGA纤维充分粘附后，补足培养液。培养24小时后首次更换培养液，以后每36-48小时换液一次。

实施例5

hBMSC-材料复合物的诱导培养

(1)隔离共培养

将接种72小时后的实施例4所得的hBMSC-PGA复合物与实施例2中所得的软骨细胞-PGA复合物置于同一培养孔内共培养，但两者之间通过一个孔径0.4um的Transwell insert(购自Falcon公司)隔离使其互不接触，软骨细胞-PGA复合物分泌的可溶性物质可以通过扩散的方式作用于hBMSC-PGA复合物。其中含有1到3个软骨细胞-PGA复合物，含有1到3个hBMSC-PGA复合物。为保证营养和软骨细胞-PGA复合物分泌的可溶性物质浓度，共培养体系每隔36-48小时半量换液。

(2)以实施例1所得的诱导剂I作为诱导因素

先收集体外培养2天-20天的软骨细胞培养液，即诱导剂I，离心去除细胞及细胞碎片等杂质成份，然后作为条件诱导液，直接用于hBMSC-PGA复合物的诱导培养，诱导剂I在诱导培养液中的含量为0.7-0.9ml/ml。为保证培养液的营养条件，可以添加10％的胎牛血清，并每24-36小时全量换液。所有构建的复合物在体外培养或诱导培养4-12周后取材，分别从大体外观、重量、体积、蛋白多糖含量、组织学及免疫组织化学等方面对诱导后的hBMSC-PGA复合物进行软骨特异性相关的评价。

(3)以实施例2所得的诱导剂II作为诱导因素

先收集体外培养3天-28天的软骨细胞-PGA复合物的培养液，即诱导剂II，离心去除细胞及细胞碎片等杂质成份，然后作为条件诱导液，直接用于hBMSC-PGA复合物的诱导培养，诱导剂II在诱导培养液中的含量为0.6-0.8ml/ml。为保证培养液的营养条件，可以添加10％的胎牛血清，并每24-36小时全量换液。所有构建的复合物在体外培养或诱导培养4-12周后取材，分别从大体外观、重量、体积、蛋白多糖含量、组织学及免疫组织化学等方面对诱导后的hBMSC-PGA复合物进行软骨特异性相关的评价。

(4)以实施例3所得的诱导剂III作为诱导因素

将实施例3所得的诱导剂III(蛋白浓缩液或冻干粉)直接添加到hBMSC-PGA复合物的培养液中，使诱导剂III可以直接作用于hBMSC-PGA复合物。诱导剂III的加入量可根据其总蛋白含量进行计算，本实例诱导培养液中诱导剂III的含量为2-4毫克/ml。所有构建的复合物在体外培养或诱导培养4-12周后取材，分别从大体外观、重量、体积、蛋白多糖含量、组织学及免疫组织化学等方面对诱导后的hBMSC-PGA复合物进行软骨特异性相关的评价。

为充分证实软骨细胞或软骨细胞-PGA复合物分泌可溶性因子的软骨定向诱导作用，本实例中还特别设立了几个对照组进行证明。主要包括：(1)单纯应用含10％胎牛血清的DMEM培养液培养hBMSC-PGA复合物对照组；(2)以hBMSCs替代上述诱导方法中的软骨细胞，应用hBMSCs自身分泌的可溶性因子作为诱导因素的对照组。(3)以人皮肤成纤维细胞替代软骨细胞，应用人皮肤成纤维细胞分泌的可溶性因子作为诱导因素的对照组。

结果：

根据本实例的研究结果，这些对照组中的hBMSC-PGA复合物均未形成明显的软骨组织，也未检测到软骨特异性细胞外基质的表达。

以下代表性地列举了实施例5(1)所示的以软骨细胞-PGA复合物分泌的可溶性因子作为诱导因素，在体外诱导培养8周时的诱导结果(诱导组)以及与其相对应的以人皮肤成纤维细胞-PGA复合物分泌的可溶性因子作为对照诱导因素(对照组)的培养结果。

(a)体外培养8周时hBMSC-PG A复合物大体观察

体外培养8周时，见图1。

结果显示：

诱导组：hBMSC-PGA复合物能够保持原有的大小和形状，呈半透明的乳白色，外观类似软骨组织，质地柔韧并有一定弹性；

对照组：hBMSC-PGA复合物体积明显缩小，呈不透明的暗黄色，质地柔软无弹性。

(b)体外培养8周时hBMSC-PGA复合物组织学及免疫组化检查

HE染色

体外培养8周时，见图2。

结果显示：

诱导组：复合物可见大量典型的软骨陷窝样结构，细胞外基质着色深，PGA纤维已大部分降解，均质的软骨样组织已基本形成；

对照组：复合物主要为纤维性组织，未见典型的软骨陷窝样结构。

Safranin-O染色

体外培养8周时，见图3。

结果显示：

诱导组：复合物Safranin-O染色呈阳性，可见大量染成红色的细胞外基质分布于软骨陷窝周围，表明诱导组有大量的软骨特异性基质沉积；

对照组：复合物未见明显的红染基质，表明无明显的软骨基质沉积。

甲苯胺蓝染色

体外培养8周时，见图4。

结果显示：

诱导组：复合物甲苯胺蓝染色呈阳性，可见大量染成蓝色的细胞外基质分布于软骨陷窝周围，表明诱导组有大量的软骨特异性蛋白多糖沉积；

对照组：复合物未见明显的蓝染基质，表明无明显的蛋白多糖沉积。

II型胶原免疫组化

体外培养8周时，见图5。

结果显示：

诱导组：复合物II型胶原免疫组化呈阳性，可见大量染成棕黄色的细胞外基质分布于软骨陷窝周围，表明诱导组有大量的软骨特异性II型胶原沉积；

对照组：复合物未见明显的棕黄基质，表明无明显的II型胶原沉积。

结果表明，以软骨细胞构建的组织工程化软骨分泌的可溶性因子作为诱导因素，能够有效地诱导hBMSC-PGA复合物向软骨定向分化并最终形成成熟的软骨样组织。从附图中还可以看出，应用本发明所提供的物质和方法诱导hBMSC-PGA复合物形成的组织工程化软骨具有接近正常软骨的外观和组织学特征，并能分泌大量的软骨特异性细胞外基质和特征性蛋白，诱导效果好。而在应用hBMSCs或人皮肤成纤维细胞替代软骨细胞作用的相应对照组中，干细胞-材料复合物均明显缩小，且未形成软骨特征性的组织学结构，也未检测到软骨特异性的细胞外基质表达。这表明本发明提供的诱导方法所具有的软骨定向诱导作用，是软骨细胞或软骨组织所特有的性质。当然，这些实施例和实验例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例6-8

hBMSC-材料复合物的诱导培养

实施例5(2)-5(4)所示的以实施例1-3所制得的诱导剂I-III作为诱导因素，诱导hBMSC-材料复合物软骨定向分化的诱导结果(诱导组)以及与其相对应的以人皮肤成纤维细胞-PGA复合物作为对照诱导因素(对照组)的培养结果，与实施例5(1)的结果相似，表明以培养软骨细胞、软骨细胞构建的组织工程化软骨的培养液，以及由该培养液浓缩提纯的可溶性物质作为诱导因素，同样能够有效地诱导hBMSC-PGA复合物向软骨定向分化并最终形成成熟的软骨样组织。

讨论

发明人在严谨的实验工作中发现，关节微环境能够诱导干细胞向软骨定向分化并在关节软骨缺损表面形成软骨组织。根据这一科学现象，本发明人提出假设：软骨细胞能够提供一种软骨微环境诱导干细胞向软骨定向分化。为证实这一设想，我们将软骨细胞与BMSCs按一定比例混匀，并以此混合细胞作为种子细胞，接种到可降解生物支架材料后植入裸鼠皮下或进行体外培养，使软骨细胞与BMSCs充分接触并为其提供软骨微环境。研究结果发现只需少量的软骨细胞就能诱导多量的BMSCs向软骨定向分化并在体内外形成成熟的软骨组织，表明软骨细胞能作为一个良好的综合诱导因素，为BMSCs向软骨定向分化提供诱导因子或诱导微环境。

本发明所提供的干细胞软骨定向诱导物质和方法，经过系统的研究和论证，充分证实了其有效性和实用性。例如，我们以软骨细胞或软骨细胞构建的组织工程化软骨作为诱导因素，通过隔离共培养的方式(软骨细胞不再与干细胞相互接触，不直接参与干细胞的软骨定向分化及组织工程化软骨形成)，成功地将干细胞团或干细胞-材料复合物诱导为软骨组织。在进一步的研究中，我们应用软骨细胞或软骨细胞构建组织工程化软骨的培养液作为诱导因素，或以这些培养液中提取的蛋白成份作为诱导因素，同样成功地将干细胞团或干细胞-材料复合物诱导为软骨组织。

本发明所提供的干细胞软骨定向诱导的物质和方法，诱导效果稳定而特异，这为干细胞作为种子细胞构建组织工程化软骨并应用于临床软骨缺损的修复提供了坚实的研究基础和技术条件，其所涉及的方法、试剂及诱导产物有希望成为产业化生产的关键技术或进一步开发成为组织工程化软骨产品。

本发明为应用干细胞构建组织工程化软骨提供了一个确实可行的技术体系，并提供了其中关键的诱导物质及其制备方法。本发明提供的诱导方法能有效地诱导干细胞团或干细胞-生物材料复合物向软骨定向分化或形成组织工程化软骨组织，这些诱导产物可以用于各种软骨组织工程相关的实验研究，也可以用于修复病人的各种软骨缺损或软骨损伤，具有广阔的应用前景和实用价值。而且，以软骨细胞或软骨组织分泌的可溶性物质作为诱导因素，有效地在体外模拟了软骨诱导微环境，并避免了以往报道的诱导方法的诸多不足，如应用生长因子诱导时因子用量大、种类多、价格昂贵且诱导效果不稳定；通过转基因技术诱导时的安全性等。

更重要的是，在这一技术体系中，软骨细胞不直接参与干细胞的软骨定向分化及组织工程化软骨形成，而是通过软骨细胞或软骨细胞构建的组织工程化软骨分泌的可溶性物质作用于干细胞团或干细胞-材料复合物，诱导它们向软骨定向分化并形成组织工程化软骨，对软骨细胞的种属来源和取材部位没有特别限制。也就是说，本发明所提供的诱导方法中，软骨细胞不会影响干细胞构建组织工程化软骨的免疫原性，其来源可以是自体、同种异体甚至其它种属，因此，本发明所提供的诱导方法既简便、经济而又安全、有效，因为动物来源的软骨细胞很容易得到，只要大量收集这些软骨细胞或软骨组织的培养液，从中提纯出由软骨细胞或组织工程化软骨所分泌的可溶性物质，即可大规模地应用于干细胞的软骨定向分化或组织工程化软骨构建。

此外，本发明所提供的干细胞软骨定向诱导方法操作简单易学，所提供的试剂制备方法简单，成本低廉，诱导效果确切可靠，便于大规模推广应用。而且本发明所提供的诱导方法和试剂也为应用干细胞构建组织工程化软骨并应用于临床软骨缺损修复提供了坚实的研究基础和技术平台，其所涉及的方法、试剂及诱导产物很有希望发展成为产业化生产的关键技术或进一步开发成为组织工程化软骨相关产品。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种软骨分化诱导剂，其特征在于，它具有以下特征：

(a)可诱导干细胞分化形成软骨细胞；

(b)来自体外培养软骨组织的培养液；所述诱导剂是用以下的制备方法获得的：

将体外培养软骨组织所获得的培养液进行分离，去除软骨细胞和软骨组织，从而获得不含细胞和细胞碎片的溶液；

所述的软骨组织包括软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合所形成的组织工程化软骨移植物或组织工程化软骨；

所述的组织工程化软骨移植物或组织工程化软骨为软骨细胞与药学上可接受的生物可降解材料形成的固态细胞-材料复合物，且软骨细胞在复合物中的浓度为1×10⁶个细胞/cm³-1×10⁸个细胞/cm³。

2.如权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述的制备方法还包括步骤：对获得的不含细胞和细胞碎片的溶液进行浓缩和/或干燥，从而制成浓缩的或固态的诱导剂。

3.如权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述的诱导剂包括软骨组织培养过程中分泌的可溶性物质。

4.如权利要求1所述的诱导剂，其特征在于，所述的软骨细胞是人或动物的软骨细胞。

5.一种如权利要求1所述的诱导剂的用途，其特征在于，用作体外诱导干细胞定向分化为软骨细胞的诱导剂。

6.一种诱导干细胞向软骨分化的方法，其特征在于，包括步骤：

在适合培养的条件下，在培养液中培养干细胞-生物可降解材料的复合物，所述的复合物包括干细胞和药学上可接受的生物可降解材料，且干细胞在复合物中的浓度为1×10⁵个细胞/克-1×10⁸个细胞/克，培养时间为7天-180天，从而诱导干细胞分化为软骨细胞。

其中，在所述培养液中含有权利要求1所述的诱导剂。

7.一种用于诱导干细胞分化为软骨细胞的培养基，其特征在于，它含有0.1-1.0ml/ml权利要求1所述的诱导剂，按未浓缩的软骨培养液体积计算。

Images