CN103966167B - 用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途 - Google Patents
用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途。在本发明的细胞培养组合物在上皮来源的肿瘤细胞原代培养中的用途中，所述的细胞培养组合物包含角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清。本发明的细胞培养组合物能够成功地对上皮来源的肿瘤细胞进行体外原代培养，大大地提高了上皮来源的肿瘤细胞原代培养的成功率，并且能够抑制癌组织中的间质细胞如成纤维细胞和内皮细胞的生长，例如，应用本发明所述的细胞培养组合物能在10天内使上皮来源的肿瘤细胞原代培养成功，培养的成功率大部分在80％以上；并基本上能稳定传代至8代以上，可成功建系。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，涉及一种用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途、原代培养方法。
背景技术
目前肿瘤细胞培养技术中，对肿瘤细胞进行原代培养及建系最常用的技术是应用添加了10％的胎牛血清(可简称FCS)的基础培养基对肿瘤细胞进行培养。但是目前应用该肿瘤细胞培养技术培养原代肿瘤细胞，其成功率非常低。例如，应用10％FCS+RPMI1640培养原代肺癌和前列腺癌细胞，其成功率均低于10％，能传代建系的成功率就更低。因此，目前肿瘤研究中多应用已经建成的细胞系。由于已建成的细胞系多经过了长期的体外培养和传代，它们已丧失了很多肿瘤细胞原有的生物学特性，这极大地限制了肿瘤的生物学特性的研究。另外，肿瘤免疫治疗现在进展迅速，而自体肿瘤细胞疫苗无疑是最好的肿瘤抗原，但由于肿瘤细胞原代培养的困难性，限制了该技术的应用。
最近发展了应用无血清培养基培养脑胶质瘤细胞，使脑胶质瘤原代细胞培养的成功率有所提高。但是应用无血清或低血清培养基培养原代癌细胞，其成功率仍十分低下，多数不超过20％，且培养时间多需在1月以上。
发明内容
为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供了一种用于原代培养肿瘤细胞的细胞培养组合物及用途、原代培养方法。
具体而言，本发明提供：
(1)一种细胞培养组合物在上皮来源的肿瘤细胞原代培养中的用途，其中所述的细胞培养组合物包含角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清。
(2)根据(1)所述的用途，其中，所述的角质细胞无血清培养基为选自干系角质细胞培养基II(Keratinocyte MediumII)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM)中的一种。
(3)根据(1)所述的用途，其中，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27supplement)、不包含维生素A的B27添加剂(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加剂(N-2supplement)中的一种；优选为B27添加剂。
(4)根据(1)所述的用途，其中，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以1倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以0.2-1倍的稀释比例使用。
(5)根据(1)所述的用途，其中，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞及食管癌细胞中的一种。
(6)根据(1)-(5)中任意一项所述的用途，其中，所述的细胞培养组合物中还包含：表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种；
其中，如果存在的话，所述的表皮细胞生长因子的含量优选为5-50ng/ml；所述的成纤维细胞生长因子的含量优选为2.5-50ng/ml；所述的转化生长因子β的含量优选为2-10ng/ml。
(7)一种用于原代培养上皮来源的肿瘤细胞的细胞培养组合物，其包含：角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清。
(8)根据(7)所述的细胞培养组合物，其中，所述的角质细胞无血清培养基为选自干系角质细胞培养基II(KeratinocyteMedium II)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM)中的一种。
(9)根据(7)所述的细胞培养组合物，其中，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27supplement)、不包含维生素A的B27添加剂(B27supplement without Vitamin A)以及N-2添加剂(N-2supplement)中的一种；优选为B27添加剂。
(10)根据(7)所述的细胞培养组合物，其中，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以1倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以0.2-1倍的稀释比例使用。
(11)根据(7)-(10)中任意一项所述的细胞培养组合物，其中，所述的细胞培养基还包含：表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种；
其中，如果存在的话，所述的表皮细胞生长因子的含量优选为5-50ng/ml；所述的成纤维细胞生长因子的含量优选为2.5-50ng/ml；所述的转化生长因子β的含量优选为2-10ng/ml。
(12)一种上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法，其包括：使用根据(7)-(11)中任意一项所述的细胞培养组合物对所述的上皮来源的肿瘤细胞进行原代培养。
(13)根据(12)所述的原代培养方法，其中，所述的原代培养方法包括以下步骤：
1)在体外用胶原酶对肿瘤组织进行消化，从而得到单个肿瘤细胞；以及
2)用所述的细胞培养组合物对步骤1)得到的肿瘤细胞进行培养，从而得到肿瘤细胞系。
(14)根据(12)或(13)所述的原代培养方法，其中，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞或食管癌细胞。
本发明的细胞培养组合物及上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法与现有技术相比具有以下优点和积极效果：
本发明的细胞培养组合物能够成功地对上皮来源的肿瘤细胞进行体外培养，特别是进行原代培养，并且大大地提高了上皮来源的肿瘤细胞的原代培养成功率，从而相应地克服了现有技术中癌细胞难以进行原代培养或培养成功率极低的缺陷，因此对肿瘤研究具有非常重要的现实意义和实用价值。例如，应用本发明所述的细胞培养组合物可使(例如)肺癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌的原代肿瘤细胞在10天内培养扩增成功，肿瘤细胞培养的成功率大部分在80％以上，最高可达100％；并能稳定传代，成功建系。
此外，本发明的细胞培养组合物还能够抑制癌组织中的间质细胞如成纤维细胞和内皮细胞的生长，从而选择性地培养癌组织中的肿瘤细胞。因此，本发明的细胞培养组合物使原代培养的癌细胞纯度非常高，解决了现有的原代培养的癌细胞中常常污染有大量间质细胞的问题。
本发明的上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法，能在10天内使上皮来源的肿瘤细胞(包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌及食管癌)原代培养成功，肿瘤细胞培育的成功率大部分在80％以上，最高可达100％；并基本上能稳定传代至8代以上，可成功建系。
附图说明
图1为试验例1中原代培养的4种类型的肺癌细胞的光镜图(200×，即200倍)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的；其中，A为肺鳞癌；B为小细胞肺癌；C为大细胞肺癌；D为肺腺癌；
图2为试验例1中原代培养的前列腺癌细胞的光镜图(200×)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的；
图3为试验例1中原代培养的乳腺癌细胞的光镜图(200×)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的；
图4为试验例1中原代培养的食管癌细胞的光镜图(400×)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的；
图5为试验例2中原代培养的肺鳞癌、肺腺癌及大细胞肺癌接种于小鼠皮下的示意图；其中A为大细胞肺癌接种于小鼠皮下的示意图；B为肺腺癌接种于小鼠皮下的示意图；C为肺鳞癌接种于小鼠皮下的示意图；
图6为试验例3中肺腺癌细胞经免疫组化检测Ber-ep4表达的光镜图(200×)，其使用的是实施例1的培养基进行培养的。
具体实施方式
以下通过具体实施方式的描述并结合附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
在本文中，术语“上皮来源的肿瘤细胞”通常是指由上皮细胞演化而来的肿瘤细胞，如为良性肿瘤细胞通常称为瘤，如为恶性肿瘤细胞通常称为癌。本文所述的上皮来源的肿瘤细胞主要来源于哺乳动物。
在本文中，术语“角质细胞”也称为角化细胞、角质形成细胞，英文名称为：Keratinocyte，是指细胞内含有角蛋白的细胞，是上皮细胞的一种。所有的哺乳动物都含有角蛋白。例如，角质细胞所形成的天然高分子纤苎是头发的主要成分。
在本文中，术语“血清”的英文名称为Serum，指的是血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。血清的组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或抑制生长活性是达到生理平衡的。对血清的成分和作用的研究虽有很大进展，但仍存在一些问题。主要如下：第一，血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其中一些多肽类生长因子、激素和脂类等尚未充分认识，这给研究工作带来许多困难；第二，血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使实验的标准化和连续性受到限制；第三，不能排除血清中含有易变物质，这被认为是“瓶中恶化”的原因之一。
在本文中，术语“无血清培养基”的英文名称为：Serum FreeMedium(也可简称为SFM)，无血清培养基是无菌的液体培养基，并且不含血清。通常包含必需和非必需氨基酸、有机和无机化合物、微量矿物质等。大多数的无血清培养基产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质如清蛋白，纤连蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反应器剪切力，提供细胞贴壁所需的基质，作为脂类和其他生长因子的载体等。目前无血清培养基作为基础培养基被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。随着无血清培养技术的不断发展与完善，目前市场上各主要生物技术公司均推出了用于培养多种类型的细胞的无血清培养基的商业化产品，因此目前现有技术中应用最为广泛的用于培养各种不同类型的细胞的无血清培养基主要来源于商购渠道。但是本发明不限于此，本领域技术人员可以理解的是，当体外培养某一特定类型的细胞时，也可采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的各种常用的无血清培养基配方，或自行配制的与商购渠道获得的无血清培养基的主要组分相同或相似的无血清培养基。
在本文中，术语“角质细胞无血清培养基”(或称为培养角质细胞的无血清培养基)指的是一种专门为培养角质细胞用的无血清培养基，这类培养基主要用于培养人或动物的正常角质细胞。角质细胞无血清培养基可通过商购途径获得，例如，可得自美国Invitrogen公司(现为Life Technology子公司)、美国Combo公司、美国Gibco公司或者上海艾研生物技术有限公司等，但是本发明不限于此；本领域技术人员可以理解的是，当体外培养角质细胞时，也可采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的各种常用的角质细胞无血清培养基配方，或自行配制的与商购渠道获得的角质细胞无血清培养基的主要组分相同或相似的角质细胞无血清培养基。例如，也可使用现有技术文献中公开的各种常用的角质细胞无血清培养基。例如，科技文献“Pittelkow，M.R.and Scott，R.E.NewTechniques for theCultureof Human Skin Keratinocytes and In Vitro Perspectives on Their UseforGrafting of Patients with Extensive Burns.Mayo Clinic Proceedings.61：771-777(1986).”中公开的角质细胞无血清培养基，此外，本领域人员所公知的是，还可在常用的MCDB153培养基的基础上通过添加氨基乙醇、磷酸乙醇胺、碘甲腺氨酸钠并降低钙离子浓度等措施自行配制角质细胞无血清培养基。
在本文中，术语“神经细胞培养用无血清添加剂”(或称为培养神经细胞的无血清添加剂)指的是一类专门为使用无血清培养基培养神经细胞过程中需添加的添加剂，本领域技术人员所熟知的是，神经细胞培养用无血清添加剂通常可包括(但不限于)：B27添加剂、N-2添加剂等。随着无血清培养技术的不断发展与完善，目前市场上各主要生物技术公司也推出了神经细胞培养用无血清添加剂的商业化产品，因此目前现有技术中应用最为广泛的神经细胞培养用无血清添加剂主要来源于商购渠道。例如，可得自美国Invitrogen公司(现为Life Technology子公司)、美国Combo公司、美国Gibco公司等。但是本发明不限于此，本领域技术人员可以理解的是，当体外培养神经细胞时，也可采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的各种常用的神经细胞培养用无血清添加剂配方，或自行配制的与商购渠道获得的神经细胞培养用无血清添加剂的主要组分相同或相似的神经细胞培养用无血清添加剂。
在本文中，术语“B27添加剂”也称为B27添加物、添加剂、添加物、神经元细胞培养添加剂B-27，或简称为B27、B-27、等，是一种神经细胞培养中常用的无血清添加剂，适合应用于大多数神经细胞培养，例如，可用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性。此外，B27还可以与培养基或培养基组合使用，用于神经细胞培养而不需要再添加饲养层细胞。B27为多种蛋白质、激素以及维生素的混合物，可通过商购途径获得，例如，可得自(例如)美国Invitrogen公司(现为Life Technology子公司)、美国Gibco公司等。但是本发明不限于商购途径获得的B27；本领域技术人员可以理解的是，也可以采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的与商购渠道获得的B27的主要组分相同或相似的添加剂配方。例如，包括但不限于以下科技文献：“Svendsen CN，Fawcett JW，Bentlage C，DunnettSB.Increased survival of rat EGF-generated CNSprecursor cells usingB27supplemented medium.Exp Brain Res.1995；102(3)：407-14.”。
在本文中，术语“N-2添加剂”也称为N2添加剂，指的是化学成分确定的，不含血清的，基于Bottenstein’s的N1配方的添加剂。N-2添加剂主要用于神经细胞培养的基础培养基。它主要被推荐用于成神经细胞瘤以及周围神经系统(PNS)与中枢神经系统(CNS)的原代细胞培养中有丝分裂后期神经元的生长和表达。N-2添加剂可以替代Bottenstein’s的N1添加剂。现有技术中通常用于添加了生长因子bFGF及EGF的神经细胞培养的基础培养基。N-2添加剂可通过商购途径获得，例如，可得自(例如)美国Invitrogen公司(现为LifeTechnology子公司)、美国Gibco公司等。但是本发明不限于商购途径获得的N-2添加剂；本领域技术人员可以理解的是，也可以采用根据现有科技文献、专利文献或其它资料公开的与商购渠道获得的B27的主要组分相同或相似的添加剂配方。例如在美国Invitrogen公司生产的浓缩倍数为100的N-2添加剂的配方如表1所示：
表1
在本文中，术语“表皮细胞生长因子”也称为上表皮生长因素，英文名称为Epidermal growth factor(也可简称EGF)。早在60年代初Montalcini和Cohen教授在纯化小鼠颌下腺神经生长因子(NGF)时发现一组可促进新生小鼠提早开眼、长牙且对热稳定的多肽类物质。最早发现它具有抑制胃酸分泌作用，故又称抑胃素。随后将这一活性组份加入培养的皮肤表皮时发现，它可直接促进表皮生长，为此而定名为表皮生长因子。1974年从人尿中提纯出人的表皮生长因子(hEGF)，其结构由53个氨基酸组成，分子量6201道尔顿，分子内有6个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环型结构，组成生物活性所必须的受体结合区域。EGF无糖基部位，非常稳定，耐热耐酸，广泛存在于体液和多种腺体中，主要由颌下腺、十二指肠合成，在人体的绝大多数体液中均已发现，在乳汁、尿液、精液中的含量特异性地增高，但在血清中的浓度较低。众多的实验研究表明，EGF可刺激多种细胞的增殖，主要是表皮细胞、内皮细胞。用于角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合取得了很好的疗效。EGF是人体内存在的一种生长因子，它的主要功能是促进皮肤细胞的分裂。本领域技术人员可以理解的是，具有与EGF相同或类似的结构或功能的重组表皮细胞生长因子也包含在本发明所述的“表皮细胞生长因子”的保护范围内。
在本文中，术语“成纤维细胞生长因子”也称为纤维母细胞生长因子或肝素结合生长因子(heparin binding growth factor)，成纤维细胞生长因子的英文名称为fibroblast growth factor(也可简称为FGF)。成纤维细胞生长因子是由垂体和下丘脑分泌的多肽，有酸性(pI5.6)和碱性(pI9.6)两种。成纤维细胞生长因子能促进成纤维细胞有丝分裂、中胚层细胞的生长，还可刺激血管形成，可在创伤愈合及肢体再生中发挥作用。本领域技术人员可以理解的是，具有与FGF相同或类似的结构或功能的重组成纤维细胞生长因子也包含在本发明所述的“成纤维细胞生长因子”的保护范围内。
在本文中，术语“转化生长因子β”的英文名称为transforminggrowth factor-β(也可简称为TGF-β)。TGF-β是由两个结构相同或相近的、分子量的12.5kDa亚单位借二硫键连接的双体。TGF-β是一多功能蛋白质，可以影响多种细胞的生长，分化、细胞凋亡及免疫调节等功能。转化生长因子β包括三个亚型：转化生长因子β1，转化生长因子β2和转化生长因子β3。转化生长因子β属于转化生长因子β超家族蛋白。本领域技术人员可以理解的是，具有与TGF-β相同或类似的结构或功能的重组转化生长因子β也包含在本发明所述的“转化生长因子β”的保护范围内。
本发明的一个目的在于提供一种新的细胞培养组合物在上皮来源的肿瘤细胞原代培养中的用途。
本发明的另一个目的在于提供一种细胞培养组合物。
本发明的再一个目的在于提供一种上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法。
本发明人通过实验出人意料地发现：将通常用于培养角质细胞的无血清培养基中添加神经细胞培养用无血清添加剂后，所得的培养基能非常容易地从癌组织中培养原代肿瘤细胞，包括但不限于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、食管癌等癌细胞，从而建立上述癌细胞的新的细胞系。以后通过进一步添加细胞因子优化组合，使原代癌细胞的培养效率更加提高，能够使所述的原代培养的成功率提高至80％以上。因此，在该发现的基础上，本发明人进一步得到了本发明的技术方案。
(一)细胞培养组合物在上皮来源的肿瘤细胞原代培养中的用途
具体而言，本发明首先提供了一种细胞培养组合物在上皮来源的肿瘤细胞原代培养中的用途，其中所述的细胞培养组合物包含角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清。
优选的是，所述的角质细胞无血清培养基为选自干系角质细胞培养基II(Keratinocyte Medium II)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM)中的一种。更优选的是，所述的角质细胞无血清培养基为选自Sigma公司的Keratinocyte Medium II培养基、Invitrogen公司的keratinocyte-SFM培养基以及Invitrogen公司的DefinedKeratinocyte-SFM培养基中的一种。
优选的是，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27supplement)、不包含维生素A的B27添加剂(B27supplement withoutVitamin A)以及N-2添加剂(N-2supplement)中的一种；优选为B27添加剂。更优选的是，所述的无血清添加剂为选自Invitrogen公司的B27添加剂、Invitrogen公司的不包含维生素A的B27添加剂以及Invitrogen公司的N-2添加剂中的一种；更优选为Invitrogen公司的B27添加剂。
优选的是，所述的角质细胞无血清培养基不为DMEM类无血清培养基、RPMI1640等培养基，其中所述DMEM类无血清培养基可得自(例如)美国Sigma公司，不采用DMEM类无血清培养基主要是因为其主要用于培养已建成的细胞系的细胞，用其培养原代癌细胞的效率十分低下。RPMI1640可得自(例如)美国Gibco公司。
优选的是，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以1倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以0.2-1倍的稀释比例使用。
优选的是，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞及食管癌细胞中的一种。
优选的是，所述的细胞培养组合物中还包含：表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种。
优选的是，所述的表皮细胞生长因子的含量为5-50ng/ml，更优选为20ng/ml。
优选的是，所述的成纤维细胞生长因子的含量为2.5-50ng/ml，更优选为10ng/ml。
优选的是，所述的转化生长因子β的含量为2-10ng/ml，更优选为5ng/ml。
(二)细胞培养组合物
本发明还提供一种用于原代培养上皮来源的肿瘤细胞的细胞培养组合物，其包含：角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清。
优选的是，所述的角质细胞无血清培养基为选自干系角质细胞培养基II(Keratinocyte Medium II)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM)中的一种。更优选的是，所述的角质细胞无血清培养基为选自Sigma公司的Keratinoc yte Medium II培养基、Invitrogen公司的keratinocyte-SFM培养基以及Invitrogen公司的DefinedKeratinocyte-SFM培养基中的一种。
优选的是，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27supplement)、不包含维生素A的B27添加剂(B27supplement withoutVitamin A)以及N-2添加剂(N-2supplement)中的一种；优选为B27添加剂。更优选的是，所述的无血清添加剂为选自Invitrogen公司的B27添加剂、Invitrogen公司的不包含维生素A的B27添加剂以及Invitrogen公司的N-2添加剂中的一种；更优选为Invitrogen公司的B27添加剂。
优选的是，所述的角质细胞无血清培养基不为DMEM无血清培养基、RPMI1640等培养基，其中所述DMEM类无血清培养基可得自(例如)美国Sigma公司。RPMI1640可得自(例如)美国Gibco公司。
优选的是，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以1倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以0.2-1倍的稀释比例使用。
优选的是，所述的细胞培养组合物还包含：表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种。
优选的是，所述的表皮细胞生长因子的含量为5-50ng/ml，更优选为20ng/ml。
优选的是，所述的成纤维细胞生长因子的含量为2.5-50ng/ml，更优选为10ng/ml。
优选的是，所述的转化生长因子β的含量为2-10ng/ml，更优选为5ng/ml。
(三)上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法
本发明还提供了一种上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法，其包括：使用本发明所述的细胞培养组合物对所述的上皮来源的肿瘤细胞进行原代培养。
优选的是，所述的原代培养方法包括以下步骤：
1)在体外用胶原酶对肿瘤组织进行消化，从而得到单个肿瘤细胞；以及
2)用所述的细胞培养组合物对步骤1)得到的肿瘤细胞进行培养，从而得到新的肿瘤细胞系。
优选的是，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞或食管癌细胞。
优选的是，所述的胶原酶包括混合胶原酶。所述的混合胶原酶是1、2、3、4型胶原酶(可得自sigma公司)的混合物，重量比为1∶1∶1∶1。
优选的是，消化肿瘤组织时胶原酶的浓度为1～2mg/ml，更2mg/ml。
优选的是，肿瘤细胞和细胞培养组合物的用量比例为每百万个细胞用10ml培养基培养。
优选的是，步骤1)所述的消化的温度为4℃-37℃，更优选为37℃，消化时间为1-4小时，更优选为2小时。
优选的是，步骤2)所述的培养是在5％浓度的CO2培养箱中37℃培养。
例如，可按如下流程进行原代培养和传代培养：
1)通过手术标本或细针穿刺组织得到新鲜的无菌肿瘤组织，其中新鲜的肿瘤组织是指手术切除后30分钟内获得的肿瘤组织。
2)在体外用胶原酶(可得自sigma公司)对肿瘤组织进行消化，消化条件为37℃消化2小时，从而得到分离的原代肿瘤细胞。
3)应用细胞培养组合物对步骤1)得到的所述的分离的原代肿瘤细胞进行培养，培养条件为5％浓度的CO2培养箱中37℃培养，肿瘤细胞生长至80％愈合时原代培养成功。
4)用胰酶消化传代，传代培养条件为5％浓度的CO2培养箱中37℃培养，第二代细胞培养成功后继续传代，从而成功建立细胞系。
以下通过例子的方式进一步解释或说明本发明内容，但这些例子不应被理解为对本发明保护范围的限制。
在以下例子中，角质细胞无血清培养基分别采用的是得自Invitrogen公司的Defined Keratinocyte-SFM、得自Sigma公司的Keratinocyte Medium II培养基、或者得自Invitrogen公司的keratinocyte-SFM培养基。添加剂B27supplement50×或B27supplement without vitamin A50×或N-2supplument50×均可购自Invitrogen公司。磷酸盐缓冲液(PBS)的配制方法如下：秤取NaCl8克，KCl0.2克，Na2HPO4·12H2O3.63克，KH2PO40.24克，溶于800毫升蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH至7.2，最后加蒸馏水至1000毫升。
在以下例子中，表皮细胞生长因子可得自Sigma公司；碱性成纤维细胞生长因子可得自Sigma公司；转化生长因子β1可得自PerproTech公司；转化生长因子β2可得自PerproTech公司；RPMI1640培养基可得自Gibco公司；胶原酶可得自Sigma公司NOD/SCID小鼠可得自中国医学科学院实验动物研究所。
实施例1：细胞培养组合物1及其制备方法
细胞培养组合物1：
Invitrogen公司的Defined Keratinocyte-SFM： 500ml；
Invitrogen公司的B27supplement50×： 10ml；
总计： 510ml。
制备方法：将上述角质细胞无血清培养基与B-27进行混合，从而得到细胞培养组合物1。
实施例2：细胞培养组合物2及其制备方法
细胞培养组合物2：
Sigma公司的Keratinocyte Medium II： 500ml；
Invitrogen公司的B27supplement50×： 2ml；
总计： 502ml。
制备方法：将上述角质细胞无血清培养基与B-27进行混合，从而得到细胞培养组合物2。
实施例3：细胞培养组合物3及其制备方法
细胞培养组合物3：
Invitrogen公司的keratinocyte-SFM： 500ml；
Invitrogen公司的B27 supplement without vitamin A 50×： 10ml；
表皮细胞生长因子： 2550ng；
总计： 510ml。
制备方法：将上述角质细胞无血清培养基与B-27添加剂、表皮细胞生长因子进行混合，从而得到细胞培养组合物3。
实施例4：细胞培养组合物4及其制备方法
细胞培养组合物4：
Invitrogen公司的Defined Keratinocyte-SFM：500ml；
Invitrogen公司的N-2 supplument 50×： 10ml；
表皮细胞生长因子： 10000ng；
总计： 510ml。
制备方法：将上述角质细胞无血清培养基与N-2添加剂、表皮细胞生长因子进行混合，从而得到细胞培养组合物4。
实施例5：细胞培养组合物5及其制备方法
细胞培养组合物5：
Invitrogen公司的Defined Keratinocyte-SFM： 500ml；
Invitrogen公司的N-2 supplument 50×： 10ml；
碱性成纤维细胞生长因子： 1500ng；
总计： 510ml。
制备方法：将上述角质细胞无血清培养基与N-2添加剂、碱性成纤维细胞生长因子进行混合，从而得到细胞培养组合物5。
实施例6：细胞培养组合物6及其制备方法
细胞培养组合物6：Sigma公司的Keratinocyte Medium II： 500ml；
Invitrogen公司的N-2 supplument 50×： 10ml；
碱性成纤维细胞生长因子： 5000ng；
总计： 510ml。
制备方法：将上述角质细胞无血清培养基与N-2添加剂、碱性成纤维细胞生长因子进行混合，从而得到细胞培养组合物6。
实施例7：细胞培养组合物7及其制备方法
细胞培养组合物7：Sigma公司的Keratinocyte Medium II： 500ml；
Invitrogen公司的B27 supplement 50×： 10ml；
转化生长因子β1： 1500ng；
总计： 510ml。
制备方法：将上述角质细胞无血清培养基与B-27添加剂、转化生长因子β1进行混合，从而得到细胞培养组合物7。
实施例8：细胞培养组合物8及其制备方法
细胞培养组合物8：
Invitrogen公司的keratinocyte-SFM： 500ml；
Invitrogen公司的B27 supplement without vitamin A 50×： 10ml；
转化生长因子β2： 2500ng；
总计： 510ml。
制备方法：将上述角质细胞无血清培养基与不包含维生素A的B-27添加剂、转化生长因子β2进行混合，从而得到细胞培养组合物8。
实施例9：细胞培养组合物9及其制备方法
细胞培养组合物9：Sigma公司的Keratinocyte Medium II： 500ml；
Invitrogen公司的B27 supplement 50× without vitamin A： 10ml；
表皮细胞生长因子： 10000ng；
碱性成纤维细胞生长因子： 5000ng；
转化生长因子β1： 2500ng；
总计： 510ml。
制备方法：将上述角质细胞无血清培养基与不包含维生素A的B-27添加剂、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β1进行混合，从而得到细胞培养组合物9。
比较例1：现有技术中的肿瘤细胞培养基1及其制备方法
现有技术中的肿瘤细胞培养基1：
RPMI1640培养基： 450ml；
胎牛血清： 50ml；
总计： 500ml；
制备方法：将上述RPMI1640培养基与胎牛血清进行混合，从而得到现有技术中的肿瘤细胞培养基1。
比较例2：现有技术中的肿瘤细胞无血清培养基2及其制备方法
现有技术中的肿瘤细胞无血清培养基2：
Invitrogen公司的DMEM/F12培养基 500ml；
Invitrogen公司的B27 supplement 50×： 10ml；
表皮细胞生长因子： 10000ng；
碱性成纤维细胞生长因子： 5000ng；
总计： 510ml。
制备方法：将上述DMEM/F12无血清培养基与添加剂、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子进行混合，从而得到细胞培养组合物比较例2。
比较例3
Invitrogen公司的keratinocyte-SFM：500ml。
试验例1
1.所需材料：
培养瓶、吸管、6孔板、胶原酶、及实施例1-9以及比较例1-3所述的培养基。
2.实验方法：
1)取新鲜的小细胞肺癌组织、大细胞肺癌组织、肺腺癌组织、肺鳞癌组织、乳腺癌组织、前列腺癌组织以及食管癌组织，上述组织分别来源于河南省肿瘤医院的38例患者相应部位的癌组织。
2)对于上述每种癌组织，分别用剪刀切碎至1mm3大小，并分别在6孔板中每孔分别加入约30块切碎的癌组织，悬浮于2ml的RPMI1640培养液，用500单位/毫升的胶原酶1毫升消化2-4小时，温度为37℃，从而得到单个细胞，反复离心3次，洗掉胶原酶(防止胶原酶对以后细胞生长的影响)后将各癌细胞分别接种3×105个细胞于底面积为25cm2的培养瓶中，分别用6ml实施例1-9和比较例1-3所述的培养基进行培养，培养条件为5％的二氧化碳培养箱中37℃培养。
3)每天用倒置光学显微镜观察培养的细胞，培养大约10天后，当肿瘤细胞生长至80％愈合后，用吸管吸出培养瓶中的无血清培养基，然后用1％的胰酶消化液TrypLETMExpress(得自美国Invitrogen公司)37℃消化5分钟，使贴壁的肿瘤细胞悬浮，然后再用RPMI1640培养液洗涤细胞3次以清除残存的胰酶，最后收集处理过的肿瘤细胞，并按1/5的比例稀释到新的培养瓶中进行传代扩增，每一代培养至肿瘤细胞生长至80％愈合后，进行下一代传代。
3.实验结果：
1)对各种肿瘤细胞在实施例1的培养基中进行原代培养后得到的细胞进行拍照，结果可参见图1-4。其中，图1为原代培养的4种类型的肺癌细胞的光镜图(200×，即200倍)，其中A为肺鳞癌；B为小细胞肺癌；C为大细胞肺癌；D为肺腺癌。图2为原代培养的前列腺癌细胞的光镜图(200×)。图3为原代培养的乳腺癌细胞的光镜图(200×)。图4为原代培养的食管癌细胞的光镜图(400×)。
采用同样的方法，可以得到的每种肿瘤细胞在实施例2-9的培养基中进行原代培养后得到的细胞的照片，结果分别与图1-4基本相同。
2)各种肿瘤细胞在实施例1-9和比较例1-3的培养基中进行原代培养的成功率参见表2。其中，成功率计算公式为原代培养成功例数/取标本总例数×100％，并且用各培养基对以下多种细胞重复试验3次，取平均值。
表2各种肿瘤细胞在实施例1-9和比较例1-3的培养基中进行原代培养的成功率
从以上结果可以看出：本发明的原代细胞无血清培养基培养的肺癌、前列腺癌、食管癌及乳腺癌的成功率均极高，大部分都在80％以上，并可高达100％；而将现有技术中的无血清培养基作为对照时，培养的成功率很低。
3)各种肿瘤细胞在实施例1-9和比较例1-3的培养基中进行原代培养的可传代次数参见表3。其中，用各培养基对上述各种细胞分别重复试验3次，取平均值。
表3各种肿瘤细胞在实施例1-9和比较例1-3的培养基中进行原代培养的可传代次数
从以上结果可以看出：本发明的原代细胞无血清培养基培养的肺癌、前列腺癌、食管癌及乳腺癌的成功率均极高，基本上在8代以上；而将常规的无血清培养基作为对照时，培养的成功率很低，所传代数亦非常低，最高也不超过5代。
试验例2
1.所需材料：
培养瓶、吸管、6孔板、胶原酶、生理盐水、NOD/SKID小鼠及实施例1-9以及比较例1-3所述的培养基。
2.实验方法：
1)取新鲜的肺鳞癌、大细胞肺癌组织、肺腺癌组织各2例，上述组织分别来源于河南省肿瘤医院的6例患者相应部位的癌组织。
2)对于上述每种癌组织，分别用剪刀切碎至1mm3大小，并分别在6孔板中每孔分别加入约30块切碎的癌组织，悬浮于2ml的RPMI1640培养液，用500单位/毫升的胶原酶1毫升消化2-4小时，温度为37℃，从而得到单个细胞，反复离心3次，洗掉胶原酶(防止胶原酶对以后细胞生长的影响)后将各癌细胞分别接种3×105个细胞于底面积为25cm2的培养瓶中，分别用6ml实施例1-9和比较例1-3所述的培养基进行培养，培养条件为5％的二氧化碳培养箱中37℃培养。
3)每天用倒置光学显微镜观察培养的细胞，当肿瘤细胞生长至80％愈合后，用吸管吸出培养瓶中的无血清培养基，然后用1％的胰酶消化液37℃消化5分钟，使贴壁的肿瘤细胞悬浮，然后再用RPMI1640培养液洗涤细胞3次以清除残存的胰酶，最后收集处理过的肿瘤细胞，并按1/5的比例稀释到新的培养瓶中进行传代扩增。
4)将1百万个的传代次数为第3代的肿瘤细胞悬浮于100微升的PBS中，接种于NOD/SCID小鼠皮下，每只小鼠皮下接种100微升。每个细胞系接种3只小鼠，另设3只小鼠皮下注射单纯的磷酸盐缓冲液100微升作为对照。本实验中的小鼠均为雌性小鼠，5～6周龄大，体重15～18克。定期观察小鼠肿瘤生长情况并照相。
3.实验结果：
如图5所示，其中A、B、C三图中的箭头所指的分别是大细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌所形成的肿瘤，由此可见，所培养的细胞系接种于NOD/SCID后均能在小鼠皮下长出肿瘤，而只含有PBS的对照组不能生长肿瘤。
试验例3
应用免疫组化方法检测上皮细胞标记分子Ber-ep4的表达情况。所述的免疫组化方法为本领域的常用方法，例如，可参见Giuffre et al，Hematopoietic progenitorcells(HPC s)in node-negative invasive breastcarcinomas：Immunohistochemicalanalysis and clinico-pathologicalcorrelations，Pathol Res Pract，2011，207(8)：487-491。因此，以下将以肺腺癌细胞为例，描述所述的免疫组化方法的主要步骤。
1.所需材料：
培养瓶、吸管、6孔板、胶原酶、及实施例1-2所述的培养基、玻片、鼠抗人Ber-ep4单抗(可得自DACO公司)及同型对照抗体(可得自DACO公司)、标记有辣根过氧化物酶的兔抗鼠二抗(得自DACO公司)、显色液。
2.试验方法：
1)收集2百万个试验例1的方法培养的原代肺腺癌细胞，在15ml离心管中培养，300G离心5分钟，小心去掉上清，加入3滴人血浆(得自TaKaRa公司)和2滴凝血酶(得自TaKaRa公司)并混匀，在混合物凝固之前，加入4％(w/v)的多聚甲醛溶液。然后用石蜡包被凝固的细胞标本。
2)将4微米厚的石蜡切片在75％及95％的酒精中脱水脱蜡，然后在磷酸盐缓冲液中微波暴露表位。然后将玻片室温放入3％(v/v)的过氧化氢溶液中5分钟阻断内源性过氧化物酶。
3)将鼠抗人Ber-ep4单抗及同型对照抗体对照滴加到切片上，室温放置30分钟。
4)滴加标记有辣根过氧化物酶的兔抗鼠二抗于玻片上，室温放置30分钟。
其中，在上述步骤3)至4)的每次孵育步骤的间隔，都用TBS吐温缓冲液冲洗三次。
5)用苏木素染色玻片5分钟，再加3，3′-二氨基联苯胺显色液显色。
6)将染色后的细胞在显微镜下观察，拍照。
结果分析：所有原代培养肺癌细胞的细胞膜均被染色(黄褐色)，如图6所示，细胞膜的颜色变深。而同型对照的细胞膜上不被染色(图未示出)，说明培养的肺癌细胞100％表达Ber-ep4，而同型对照的结果为阴性。Ber-ep4上皮来源细胞特有的分子，成纤维细胞及血管内皮细胞不表达该分子，说明原代培养的细胞100％为上皮来源的肿瘤细胞，不含有成纤维细胞及血管内皮细胞。
采用同样的方法，可以得到每种肿瘤细胞在实施例2-9的培养基中进行原代培养后经免疫组化而得到的细胞的照片，结果与图6基本相同。即，经鉴定表明原代培养的细胞均为上皮细胞来源的肿瘤细胞，不含有成纤维细胞及血管内皮细胞。
Claims (11)
1.一种细胞培养组合物在上皮来源的肿瘤细胞原代培养中的用途，其中所述的细胞培养组合物包含角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清；
其中，所述的角质细胞无血清培养基为选自角质细胞培养基II(Keratinocyte Medium II)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM)中的一种；
其中，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27 supplement)、不包含维生素A的B27添加剂(B27 supplement without Vitamin A)以及N-2添加剂(N-2 supplement)中的一种；
其中，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以1倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以0.2-1倍的稀释比例使用。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞及食管癌细胞中的一种。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述的细胞培养组合物中还包含：表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述的无血清添加剂为B27添加剂。
5.根据权利要求3所述的用途，其中，所述的表皮细胞生长因子的含量为5-50ng/ml；所述的成纤维细胞生长因子的含量为2.5-50ng/ml；所述的转化生长因子β的含量为2-10ng/ml。
6.一种上皮来源的肿瘤细胞的原代培养方法，其包括：使用细胞培养组合物对所述的上皮来源的肿瘤细胞进行原代培养，其中所述的细胞培养组合物包含角质细胞无血清培养基和神经细胞培养用无血清添加剂，并且所述的细胞培养组合物中不包含血清；
其中，所述的角质细胞无血清培养基为选自角质细胞培养基II(Keratinocyte Medium II)、角质细胞无血清培养基(keratinocyte-SFM)以及成分确定的角质细胞无血清培养基(Defined Keratinocyte-SFM)中的一种；
其中，所述的无血清添加剂为选自B27添加剂(B27 supplement)、不包含维生素A的B27添加剂(B27 supplement without Vitamin A)以及N-2添加剂(N-2 supplement)中的一种；
其中，以所述的细胞培养组合物的总体积计，当所述的角质细胞无血清培养基以1倍稀释比例使用时，所述的神经细胞培养用无血清添加剂以0.2-1倍的稀释比例使用。
7.根据权利要求6所述的原代培养方法，其中，所述的细胞培养组合物中还包含：表皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子以及转化生长因子β中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的原代培养方法，其中，所述的表皮细胞生长因子的含量为5-50ng/ml；所述的成纤维细胞生长因子的含量为2.5-50ng/ml；所述的转化生长因子β的含量为2-10ng/ml。
9.根据权利要求6所述的原代培养方法，其中，所述的无血清添加剂为B27添加剂。
10.根据权利要求6所述的原代培养方法，其中，所述的原代培养方法包括以下步骤：
1)在体外用胶原酶对肿瘤组织进行消化，从而得到单个肿瘤细胞；以及
2)用所述的细胞培养组合物对步骤1)得到的肿瘤细胞进行培养，从而得到肿瘤细胞系。
11.根据权利要求6-10中任一项所述的原代培养方法，其中，所述的上皮来源的肿瘤细胞选自肺癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞或食管癌细胞。
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