CN111621479A - 一种用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基 - Google Patents
一种用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基。本发明提供的用于培养妇科肿瘤原代细胞培养基为配制特殊无血清培养基，利用该培养基对妇科肿瘤来源的实体瘤细胞进行体外悬浮培养，可以保证肿瘤细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。利用本发明方法得到的妇科肿瘤原代细胞培养物可用于多种细胞水平体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可预见，这种培养方法在妇科肿瘤的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基。
背景技术
常见的妇科肿瘤有乳腺癌、卵巢癌和子宫内膜癌等。据国家癌症中心2018年数据统计，2014年，我国乳腺癌占女性恶性肿瘤发病率的16.5％，死亡率达7.8％，分别排女性肿瘤的第一位和第五位。当前，我国乳腺癌5年生存率仅73.1％vs 90％(美国)，与发达国家还有较大差距。此外，我国卵巢癌发病率占据女性恶性肿瘤的2.5％，过去十年增低加了30％。这些妇科肿瘤对我国女性的生命健康提出了严峻的挑战。
尽管世界各国的科研和医疗机构对妇科肿瘤的病因以及发生发展过程的研究都有很大力度的投入，但是人类对这种疾病仍然知之甚少。妇科肿瘤是一类复杂疾病，其发生、发展是一个动态的过程，涉及到诸多信号分子相互作用，形成了一个复杂的分子调控网络，同时还受到外界环境因素的影响。妇科肿瘤的病因和发生发展过程有很强的个体差异性，不能一概而论。因此将妇科肿瘤实体瘤原代细胞培养物作为模型进行个体化精准研究是妇科肿瘤研究领域乃至妇科肿瘤诊断治疗领域的趋势。
现有的原代肿瘤细胞培养技术主要有2D培养，3D培养，重编程培养等几类，这些方法都不同程度的面临培养周期极长，培养成功率低，杂细胞难以去除等问题。
发明内容
为了有效解决上述技术问题，本发明提供了一种新的妇科肿瘤原代细胞培养技术及配套试剂，本发明配制特殊的无血清培养基，利用悬浮培养体系对妇科肿瘤原代细胞进行体外培养，保证肿瘤细胞正常扩增的同时最大限度的排除正常细胞的干扰。
第一方面，本发明要求保护一种用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基。
本发明所要求保护的用于培养培养妇科肿瘤原代细胞的培养基由抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP、N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)、N-2Supplement、Y-27632、孕酮(Progesterone)、β-雌二醇(β-Estradiol)和Advanced DMEM/F12培养基组成。其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL(如250ng/mL)；所述HEPES的终浓度为8-12mM(如10mM)；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(如1％，％表示体积百分含量)；所述人重组蛋白EGF的终浓度为10-100ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白MSP的终浓度为5-25ng/mL；所述N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)的终浓度为0.5-2mM；所述N-2Supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述Y-27632的终浓度为5-20μM；所述孕酮的终浓度为50-100nM；所述β-雌二醇的终浓度为10-50nM；余量均为Advanced DMEM/F12培养基。
进一步地，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)组成如下：每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B。所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)为“Antibiotic-Antimycotic,100X”(如Gibco#15240062，或与其组成相同的其他产品)。所述“Antibiotic-Antimycotic,100X”每毫升包含10000单位青霉素(碱)、10000μg链霉素(碱)和25μg两性霉素B，利用0.85％盐液形式的青霉素G(钠盐)、硫酸链霉素和两性霉素B作为
抗真菌剂。所述GlutaMAX为“GlutaMAXTMSupplement”(如Gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述“GlutaMAXTMSupplement”的成分为L-alanyl-L-glutamine，是L-glutamine的替代物，浓度为200nM，溶剂为0.85％NaCl溶液。所述N-2Supplement为“N-2Supplement(100X)”(如Gibco#17502001，或与其组成相同的其他产品)。所述“N-2Supplement(100X)”中含有终浓度为1mM的人全铁转铁蛋白(Human Transferrin(Holo))、500mg/L的重组胰岛素全链(Insulin Recombinant Full Chain)、0.63mg/L的孕酮(Progesterone)、10mM的腐胺(Putrescine)、0.52mg/L的亚硒酸盐(Selenite)。所述GlutaMAX是一种高级细胞培养添加剂，可直接替代细胞培养基中的L-谷氨酰胺。所述GlutaMAX为“GlutaMAXTMSupplement”(如Gibco#35050061，或与其组成相同的其他产品)。所述Y-27632为“Y-27632dihydrochloride(一种ATP竞争性的ROCK-I和ROCK-II抑制剂，Ki分别为220nM和300nM)”(如MCE#129830-38-2，或与其组成相同的其他产品)。
在本发明的具体实施例中，所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)的品牌货号为Gibco#15240062；所述HEPES的品牌货号为Gibco#15630080；所述GlutaMAX的品牌货号为Gibco#35050061；所述人重组蛋白EGF的品牌货号为Peprotech AF-100-15-100；所述人重组蛋白bFGF的品牌货号为Peprotech AF-100-18B-50；所述人重组蛋白HGF的品牌货号为Peprotech AF-100-39-100；所述人重组蛋白MSP的品牌货号为R&D#352-MS-050；所述N-acetyl-L-cysteine的品牌货号为Sigma#A9165；所述N-2Supplement的品牌货号为Gibco#17502001；所述Y-27632的品牌货号为MCE#129830-38-2；所述孕酮(Progesterone)的品牌货号为Sigma#V900699；所述β-雌二醇(β-Estradiol)的品牌货号为Sigma#E2758；所述Advanced DMEM/F12培养基的品牌货号为Gibco#12634010。
进一步地，所述用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基的存在形式可为两种：
其一，所述用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基为含有所述抗菌抗真菌剂三抗(青霉素-链霉素-两性霉素B)、所述HEPES、所述GlutaMax、所述人重组蛋白EGF、所述人重组蛋白bFGF、所述人重组蛋白HGF、所述人重组蛋白MSP、所述N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine)、所述N-2Supplement、所述Y-27632、所述孕酮(Progesterone)、所述β-雌二醇(β-Estradiol)和所述Advanced DMEM/F12培养基的溶液。
所述培养基配制好后需用0.22μM针头式滤器(Millipore SLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。
其二，所述用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基中的各组分单独存在，使用时按照配方进行配制。
更进一步地，其中的人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP可以储液(母液)形式保存(-80℃长期保存)，具体可为1000倍储液(母液)。皮质醇(Hydrocortisone)和Y-27632可以储液(母液)形式保存(-20℃长期保存)，具体可为1000倍储液(母液)。孕酮(Progesterone)和β-雌二醇(β-Estradiol)可以储液(母液)形式保存(-20℃长期保存)，具体可为100000倍储液(母液)。
1000×人重组蛋白EGF储液由人重组蛋白EGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白EGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。
1000×人重组蛋白bFGF储液由人重组蛋白bFGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。
1000×人重组蛋白HGF储液由人重组蛋白HGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白HGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。
1000×人重组蛋白MSP储液由人重组蛋白MSP、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白MSP的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS。
上述四种1000倍储液中，所述BSA是可以100倍储液(母液)形式存在(现配现用)，具体由BSA和PBS组成，其中BSA(Sigma#A1933)的终浓度为0.1g/mL，余量均为PBS。
另外，1000×N-乙酰-L-半胱氨酸储液由N-乙酰-L-半胱氨酸和超纯水组成，其中所述N-乙酰-L-半胱氨酸的浓度为0.5M，余量均为超纯水。
1000×Y-27632由Y-27632和超纯水组成，其中Y-27632的终浓度为10mM，余量均为超纯水。
100000×Progesterone储液由Progesterone和无水乙醇组成，其中Progesterone的终浓度为1mM，余量均为无水乙醇。
100000×β-Estradiol储液由β-Estradiol和无水乙醇组成，其中β-Estradiol的终浓度为1mM，余量均为无水乙醇。
第二方面，本发明要求保护一种用于培养妇科肿瘤原代细胞的成套试剂。
本发明所提供的用于培养妇科肿瘤原代细胞的成套试剂，含有前文所述培养基和如下试剂中的至少一种：下文所述的消化终止液和所述细胞冻存液。
第三方面，本发明要求保护所述培养基或成套试剂在培养妇科肿瘤原代细胞中的应用。
第四方面，本发明要求保护一种培养妇科肿瘤原代细胞的方法。
本发明所提供的培养妇科肿瘤原代细胞的方法，具体可包括如下步骤：使用具有低吸附表面(low-attachment-surface)的培养容器，利用所述培养基悬浮培养所述妇科肿瘤原代细胞，37℃，5％CO2条件下进行培养，每2-4天(如3天)更换一次培养基，直至细胞形成直径80-120μm(如100μm)的团块。
其中，初始接种密度可为105个/cm2容器底面积，以六孔板为例，按每孔106个细胞的密度铺板。
进一步地，所述方法还可包括如下步骤：待所述妇科肿瘤原代细胞形成直径80-120μm(如100μm)的团块时，对所述妇科肿瘤原代细胞进行传代。
其中，进行所述传代时采用的消化终止液(配制好后可在4℃保存一个月)由胎牛血清、双抗P/S(青霉素-链霉素)和DMEM培养基组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为8-12％(如10％，％表示体积百分含量)；所述双抗P/S中的青霉素的终浓度为100-200U/mL(如100U/mL)；所述双抗P/S中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL(如100μg/mL)；余量均为DMEM培养基。
在本发明的具体实施例中，所述双抗P/S的品牌货号为Gibco#15140122；所述PBS的品牌货号为Gibco#21-040-CVR。
更加具体地，进行所述传代的步骤：收集待传代的细胞团块，离心后用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，再离心，然后用所述细胞消化液重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化，直到细胞团块都被消化为单个细胞，用所述消化终止液(其用量可为5-10倍，如10倍体积)终止消化反应，收集细胞悬液；离心后用所述妇科肿瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，计数，然后使用具有低吸附表面的培养容器悬浮培养细胞(初始接种密度可为105个/cm2容器底面积，以六孔板为例，按每孔106个细胞的密度铺板)，培养条件为37℃，5％CO2。上述传代步骤中的所有离心均具体可为800-1000g(如800g)室温离心10-20分钟(如10分钟)。
进一步地，所述方法还可包括对经过2-3次传代扩增后的所述妇科肿瘤原代细胞进行冻存和/或复苏的步骤。
其中，进行所述冻存时采用的细胞冻存液由Advanced DMEM/F12培养基、DMSO和1％甲基纤维素溶液组成；其中，所述Advanced DMEM/F12培养基、所述DMSO和所述1％甲基纤维素溶液的体积配比为20:2:(0.8-1.2)，如20:2:1；所述1％甲基纤维素溶液是浓度为1g/100ml的甲基纤维素水溶液。
在本发明的具体实施例中，所述Advanced DMEM/F12培养基的品牌货号为Gibco#12634010；所述DMSO的品牌货号为Sigma#D2438；所述甲基纤维素的品牌货号为Sigma#M7027。
更进一步地，进行所述冻存的具体步骤：收集待冻存的细胞团块，离心后用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，再离心，然后用所述细胞消化液重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化，直到细胞团块都被消化为单个细胞，用所述消化终止液(其用量可为5-10倍，如10倍体积)终止消化反应，收集细胞悬液；离心后用所述细胞冻存液，按0.5-2×106/mL(如106/mL)的密度重悬细胞沉淀，梯度降温盒过夜冻存后转移至液氮中长期保存。上述冻存步骤中的所有离心均具体可为800-1000g(如800g)室温离心10-20分钟(如10分钟)。
更进一步地，进行所述复苏的具体步骤：将装有待复苏细胞的冻存管从液氮中取出，在37-39℃(如37℃)无菌水中迅速融化细胞；离心(如800-1000g，如800g室温离心5-10分钟，如10分钟)后用所述妇科肿瘤原代细胞培养基重悬细胞沉淀，然后使用具有低吸附表面的培养容器悬浮培养细胞(初始接种密度可为105个/cm2容器底面积)，每管细胞(106个)复苏至3.5cm培养皿)，培养条件为37℃，5％CO2。
在上述各方面中，所述妇科肿瘤可为原发性妇科肿瘤或其转移病灶。所述妇科肿瘤具体可为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌或其转移病灶。
在上述各方面中，所述妇科肿瘤原代细胞分离自妇科肿瘤患者的手术样本或穿刺活检样本或胸腹水样本(胸水或腹水)。其中，手术样本获得的妇科肿瘤实体瘤组织标本最好重量超过20mg，穿刺活检样本(属于实体瘤样本)超过4条，胸腹水样本超过100mL。
在本发明中，以上所有的所述PBS均可为1×PBS，pH7.3-7.5。其具体组成如下：溶剂为水，溶质及浓度为：KH2PO4 144mg/L，NaCl 9000mg/L，Na2HPO4·7H2O 795mg/L。
本发明提供了一种从新鲜妇科肿瘤手术样本或穿刺活检样本或胸腹水样本中提取培养妇科肿瘤原代细胞的方法和配套试剂，该方法具有以下优点：
1、组织样本用量少，仅需20mg左右的妇科肿瘤实体瘤手术样本；
2、培养周期短，仅需3-10天即可获得107数量级的原代肿瘤细胞；
3、培养稳定性高，用本方法对合格的妇科肿瘤实体瘤手术标本进行体外培养的成功率高达70％；
4、细胞纯度高，利用本方法得到的妇科肿瘤原代细胞培养物中，肿瘤细胞的比例可以达到70％-95％，杂细胞干扰少。
利用本发明方法得到的妇科肿瘤原代细胞培养物可以用于多种细胞水平的体外实验、二代测序、构建动物模型、构建细胞系等等。可以预见，这种培养方法在妇科肿瘤的研究和临床诊断治疗领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为乳腺癌组织经过处理后得到的单细胞。标尺为100μm，100倍放大。
图2为乳腺癌组织原代培养后得到的细胞团块。标尺为100μm，100倍放大。
图3为乳腺癌组织原代培养后得到的妇科肿瘤细胞HE染色图。标尺为100μm，200倍放大。
图4为乳腺癌组织原代培养后得到的肿瘤细胞团块石蜡切片免疫组化染色图。标尺为100μm，200倍放大。
图5为本发明微孔板芯片设计图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、配制用于培养妇科肿瘤原代细胞的试剂
1、样本保存液(100mL)
样本保存液(100mL)的具体配方如表1所示。
表1样本保存液(100mL)
样本保存液配制完成后，用15mL离心管进行分装，每管5mL。分装后可于4℃保存1个月。
2、样本清洗液(100mL)
样本清洗液(100mL)的具体配方如表2所示。
表2样本清洗液(100mL)
样本清洗液需现配现用。
3、样本解离液(10mL)
样本解离液(10mL)的具体配方如表3所示。
表3样本解离液(10mL)
注：样本解离液现配现用。
表3中，胶原酶储液的配制如表4-表6所示。
表4 10×胶原酶I储液(100mL)
10×胶原酶I储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。
表5 10×胶原酶III储液(100mL)
10×胶原酶III储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。
表6 10×胶原酶IV储液(100mL)
10×胶原酶IV储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，每管1mL。该储液可在-20℃长期保存。
表4-表6中，用蛋白酶的酶活来定义胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶III或所述胶原酶IV)的单位U：在37℃，pH 7.5的条件下，用1U蛋白酶处理胶原酶(所述胶原酶I、所述胶原酶III或所述胶原酶IV)5小时，可以释放L-亮氨酸1μmol。
4、细胞消化液(10mL)
细胞消化液(10mL)的具体配方如表7所示。
表7细胞消化液(10mL)
细胞消化液现配现用。
5、消化终止液(100mL)
消化终止液(100mL)的具体配方如表8所示。
表8消化终止液(100mL)
消化终止液配制后，可在4℃保存一个月。
6、妇科肿瘤原代细胞培养基(100mL)
妇科肿瘤原代细胞培养基(100mL)的具体配方如表9所示。
表9妇科肿瘤原代细胞培养基(100mL)
妇科肿瘤原代细胞培养基配制完成后，用0.22μM针头式滤器(MilliporeSLGP033RS)过滤除菌，在4℃可以保存两周。
表9中，人重组蛋白储液的配制如表11-表14所示，hydrocortisone储液的配制如表15所示，Y-27632储液的配制如表16所示；Progesterone储液的配制如表17所示；β-Estradiol储液的配制如表18所示。配制这些储液时所需的100×BSA溶液配制如表10所示。
表10 100×BSA溶液(1mL)
100×BSA溶液现配现用。
表11 1000×人重组蛋白EGF储液(5mL)
1000×人重组蛋白EGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。
表12 1000×人重组蛋白bFGF储液(2.5mL)
1000×人重组蛋白bFGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。
表13 1000×人重组蛋白HGF储液(5mL)
1000×人重组蛋白HGF储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。
表14 1000×人重组蛋白MSP储液(2.5mL)
1000×人重组蛋白MSP储液配制后，用1.5mL无菌离心管分装，该储液可在-80℃长期保存。
表15 1000×N-acetyl-L-cysteine储液(5mL)
1000×N-acetyl-L-cysteine储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
表16 1000×Y-27632储液(3.125mL)
1000×Y-27632储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
表17 100000×Progesterone储液(15.9mL)
100000×Progesterone储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
表18 10000×β-Estradiol储液(18.36mL)
10000×β-Estradiol储液配制后，用0.5mL无菌离心管分装，该储液可在-20℃长期保存。
7、细胞冻存液
细胞冻存液的具体配方如表19所示。
表19细胞冻存液
细胞冻存液现配现用。
表19中，1％甲基纤维素溶液的配制如表20所示。
表20 1％甲基纤维素溶液(10mL)
1％甲基纤维素溶液配制后可在4℃长期保存。
8、1％CYTOP溶液
表21 1％CYTOP溶液(100mL)
1％CYTOP溶液配制完成后，可于常温长期保存。
9、细胞分离缓冲液(100mL)
细胞分离缓冲液(100mL)的具体配方如表22所示：
表22细胞分离缓冲液(100mL)
细胞分离缓冲液配制完成后，可于4℃保存1个月。
表22中，肝素钠溶液的配制如表23所示。
表23 1000×肝素钠(1mL)
1000×肝素钠溶液现配现用。
实施例2、妇科肿瘤术后标本/活检穿刺标本/胸腹水样本的获取
1、与三甲医院合作，合作的开展通过了正规的医学伦理审查。
2、主治医生医生按照医学指南规定的临床指征选择入组患者，并根据术中临床指征选择合适的样本用于体外培养，样本的选取标准为：原发性乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌或其转移病灶，手术标本重量超过20mg的样本，或胸腹水样本超过100mL的样本，或穿刺活检标本超过4条的样本。
3、主治医生提供患者的性别、年龄、病史、家族史、吸烟史、病理分期分型、临床诊断等基本临床信息。隐去患者的姓名、身份证号等与病人隐私相关的信息，用统一的实验编号代替，实验编号的命名原则为采集样本的八位数字日期+患者住院号后四位。例如2018年1月1日提供的样本，患者住院号为T001512765，则样本实验编号为201801012765。
4、术中由外科医生，在手术室无菌环境中采集新鲜术后标本/活检穿刺标本，置于事先准备好的样本保存液(见实施例1)中。样本离体后在冰上暂存，两小时内运输到实验室进行下一步操作。胸腹水样本48小时内运输到实验室进行下一步操作。
实施例3、妇科肿瘤实体瘤组织样本解离前处理
下述操作需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。
下述操作中用到的手术器材，均需事先高温高压灭菌，烘干后才能使用。
1、样本称重。
2、用75％(体积百分含量)乙醇清洗样本表面10到30秒。
3、用样本清洗液清洗样本5次，用无菌的PBS溶液清洗样本5次。
4、用眼科剪、眼科镊、手术刀等器材，小心将样本中的脂肪组织、结缔组织、坏死组织剥离。
实施例4、妇科肿瘤实体瘤组织样本解离
下述实施例中用到的手术器材，均需事先高温高压灭菌，烘干后才能使用。
1、用眼科剪将组织剪碎成1mm3左右的小块。
2、按0.1mL样本解离液(见实施例1)每mg组织的用量，用事先37℃预热的样本解离液处理剪碎的组织样本，在37℃条件下进行样本解离，解离时间15分钟至3小时。每15分钟在显微镜下观察样本的解离情况，直到观察到大量的单个细胞。
3、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液。
4、用100μm无菌细胞滤网过滤细胞悬液，去除组织残片和粘连细胞。
5、800g室温离心10分钟，弃去上清。
6、用5mL无菌PBS重悬细胞，800g室温离心10分钟，弃去上清。
7、用妇科肿瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，在显微镜下观察细胞状态，进行细胞计数。
如图1所示，解离得到的单细胞悬液中，除了肿瘤细胞以外还混杂着大量各种类型的其他细胞，如红细胞，淋巴细胞，纤维细胞等等。本方法的优势之一就是在后续的培养过程中，只有癌细胞可以进行大量扩增，而其他细胞的比例逐渐减少甚至消失，最终获得纯度较高的妇科肿瘤原代肿瘤细胞。
实施例5、妇科肿瘤胸腹水样本预处理
下述操作需要在冰上操作，整个操作步骤需要在10分钟内完成。
1、妇科肿瘤胸腹水样本冰上静置30分钟左右，使样本中的凝血块和大的不溶固体沉降至样本管底部；
2、小心将上清液转移至50mL无菌离心管中，加入一倍体积预冷的PBS混匀；
3、2000g，4℃离心5分钟，弃去上清；
4、用细胞分离缓冲液(见实施例1)重悬细胞沉淀，2000g，4℃离心5分钟，弃去上清；
5、用细胞分离缓冲液(见实施例1)重悬细胞沉淀，调整细胞浓度至107/mL。
实施例6、妇科肿瘤胸腹水样本密度梯度离心
1、用50mL无菌离心管取与细胞悬液等体积的Ficoll细胞分离液(MP#50494)。
2、小心将细胞悬液加在细胞分离液上层，使两者之间形成一个清晰的界面。
3、2000g水平式常温离心20分钟。
4、吸取中间层白膜，至新管中。
5、用20mL无菌的PBS重悬细胞沉淀，1500g常温离心10分钟，弃去上清。
6、用妇科肿瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，在显微镜下观察细胞状态，进行细胞计数。
结果所示，分离得到的单细胞悬液中，除了肿瘤细胞以外还混杂着大量各种类型的其他细胞，如红细胞，淋巴细胞，纤维细胞等等。本方法的优势之一就是在后续的培养过程中，只有癌细胞可以进行大量扩增，而其他细胞的比例逐渐减少甚至消失，最终获得纯度较高的妇科肿瘤原代细胞。
实施例7、妇科肿瘤原代细胞培养
1、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行妇科肿瘤原代细胞悬浮培养，所用培养基即为实施例1中的妇科肿瘤原代细胞培养基(其中，人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL；人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白MSP的终浓度为20ng/mL；N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；Y-27632的终浓度为10μM；Progesterone的终浓度为100nM；β-Estradiol的终浓度为10nM)，以六孔板为例，按每孔106个细胞的密度铺板，37℃，5％CO2条件下在细胞培养箱中进行培养。
2、每天观察细胞状态，每3天更换一次培养基，直至细胞形成直径100μm左右的团块。
如图2所示，经过3-10天的培养，肿瘤细胞大量扩增形成直径100μm大小的细胞团块，肿瘤细胞总数量可以超过107，其他类型的细胞数量明显减少甚至消失。本方法经过大量样本测试，妇科肿瘤原代肿瘤细胞体外培养成功率可以达到70％。
实施例8、妇科肿瘤原代细胞传代
1、收集培养皿中的细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。
2、用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。
3、用细胞消化液(见实施例1)重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化。每5分钟在显微镜下观察细胞团块消化的情况，直到细胞团块都被消化为单个细胞。
4、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液。
5、800g室温离心10分钟，弃去上清。
6、用妇科肿瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，细胞计数。
7、使用低吸附表面(low-attachment-surface)进行妇科肿瘤原代细胞培养，所用培养基即为实施例1中的妇科肿瘤原代细胞培养基，以六孔板为例，按每孔106个细胞的密度铺板，37℃，5％CO2条件下在细胞培养箱中进行培养。
实施例9、妇科肿瘤原代细胞的冻存
悬浮培养的妇科肿瘤原代细胞经过2-3次传代扩增后，可以进行冻存：
1、收集培养皿中的细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。
2、用无菌的PBS溶液清洗细胞团块，800g室温离心10分钟，弃去上清。
3、用细胞消化液(见实施例1)重悬细胞团块，在37℃条件下进行消化。每15分钟在显微镜下观察细胞团块消化的情况，直到细胞团块都被消化为单个细胞。
4、用10倍体积的消化终止液(见实施例1)终止解离反应，收集细胞悬液，细胞计数。
5、800g室温离心10分钟，弃去上清。
6、用细胞冻存液(见实施例1)，按106/mL的密度重悬细胞沉淀，2mL冻存管每管1mL细胞悬液，梯度降温盒过夜冻存后转移至液氮中长期保存。
实施例10、妇科肿瘤原代细胞的复苏
液氮中保存的妇科肿瘤原代细胞可以进行复苏：
1、提前五分钟准备37℃无菌水。
2、将冻存管从液氮中取出，在37℃无菌水中迅速融化细胞。
3、800g室温离心10分钟，弃去上清。
4、用妇科肿瘤原代细胞培养基(见实施例1)重悬细胞沉淀，使用低吸附表面进行妇科肿瘤原代细胞培养，每管细胞复苏至3.5cm培养皿中，37℃，5％CO2条件下在细胞培养箱中进行培养。
实施例11、妇科肿瘤原代细胞的HE染色鉴定
下述实施例中用到的试剂耗材说明：
HE染色试剂盒(北京索莱宝生物科技有限公司，#G1120)；
阳离子防脱玻片(北京中杉金桥生物科技有限公司)；
二甲苯、甲醇、丙酮(北京化学试剂公司，分析纯)；
中性树脂胶(北京益利精细化学品有限公司)。
1、将悬浮细胞制成浓度为104/mL的细胞悬液，滴加10μL于阳离子防脱玻片上，自然晾干。
2、在风干的细胞上小心滴加50μL经4℃预冷过的甲醇/丙酮混合液(体积比1:1)，然后将玻片放入4℃冰箱固定10mins。
3、取出固定细胞的玻片，室温自然晾干。
4、用200μL PBS清洗玻片两次。
5、待玻片上水分微干时加入100μL苏木精染液染色1mins。
6、吸去苏木精染液，用200μL自来水清洗玻片3次。
7、滴加100μL分化液分化1mins。
8、吸去分化液，依次用自来水清洗玻片2次，蒸馏水清洗玻片1次。
9、吸去玻片表面水分，滴加200μL伊红染液染色40s。
10、吸去伊红染液，依次用75％、80％、90％、100％乙醇漂洗脱水20s、20s、40s、40s。
11、等乙醇晾干后，滴加50μL二甲苯进行细胞通透。
12、等二甲苯晾干完全后，滴加一滴中性树脂胶，用盖玻片封片，在显微镜下观察并拍照。
图3展示了体外培养得到的妇科肿瘤原代肿瘤细胞HE染色效果图，可以看到这些细胞普遍具有核质比高、核深染、核内染色质凝集、多核、细胞大小不均一等肿瘤细胞特征。
实施例12、妇科肿瘤原代细胞的免疫组化染色鉴定
下述实施例中用到的试剂说明：
多聚甲醛(北京化学试剂公司，分析纯)，用超纯水溶解多聚甲醛粉末，制成4％(4g/100mL)多聚甲醛溶液；
双氧水(北京化学试剂公司，35％)；
封闭用正常山羊血清(Solarbio，SL038)；
免疫组化一抗抗体(福建迈新，kit-0012)；
免疫组化二抗抗体(Abcam，ab205719)；
EDTA修复液(Abcam，ab93684)；
DAB显色液(
DAB Substrate Kit，8059S)
收集实施例1中的妇科肿瘤原代细胞培养基(其中，人重组蛋白EGF的终浓度为50ng/mL；人重组蛋白bFGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白HGF的终浓度为20ng/mL；人重组蛋白MSP的终浓度为20ng/mL；N-acetyl-L-cysteine的终浓度为1mM；Y-27632的终浓度为10μM；Progesterone的终浓度为100nM；β-Estradiol的终浓度为10nM)培养得到的妇科肿瘤细胞团块进行石蜡切片，按以下步骤操作：
1.将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ(10min)。
2.再次浸入无水乙醇Ⅰ(5min)-无水乙醇Ⅱ(5min)-95％酒精(5min)-80％酒精(5min)-70％酒精(5min)，然后去离子水冲洗2次，每次2min。
3.将组织切片放入修复盒，然后加入适量稀释好的EDTA修复液(pH 9.0)，液面要浸没组织。
4.微波中档修复10min(液体沸腾时开始计时)，此过程中勿使组织干片。
5.将修复盒从微波炉中拿出，自然冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，PBS(pH 7.4)冲洗3遍，每次3min(冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织)。
6.将配制好的3％的过氧化氢(去离子水稀释30％过氧化氢)滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15min，PBS冲洗3次，每次3min。
7.吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加10％的山羊血清(与二抗种属来源一致或相似)，37℃封闭60min。
8.用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，用油性笔在组织周围画圈，然后滴加稀释好的一抗，于湿盒中4℃孵育过夜。
9.PBS冲洗切片3次，每次3min，吸水纸擦干切片后滴加辣根过氧化物酶标记二抗，室温孵育60min。
10.PBS冲洗切片3次，每次3min，甩去PBS液体后吸水纸擦干切片，每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号后自来水冲洗切片终止显色。
11.苏木素复染，1min，水洗后使用酸性乙醇分化液分化，再用自来水冲洗返蓝。
12.将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入：70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明，每个试剂中放置2min，最后在通风橱中风干切片。
13.使用中性树胶封片，用盖玻片盖上。置于通风橱中晾干。
14.晾干的切片可以在显微镜下观察或拍照。
图4展示了体外培养的乳腺癌原代肿瘤细胞团块免疫组化染色的效果图，可以看到组成细胞团块的细胞ER阳性，与患者病理结果一致，证实了本方法培养得到的是纯度较高的肿瘤细胞。
实施例13、不同类型妇科肿瘤样本原代肿瘤细胞体外培养
本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，仅样本病理类型有区别。进行测试的各样本情况见表24。
表24多种病理类型妇科肿瘤原代肿瘤细胞体外培养情况
可以看到，本方法对各种类型的妇科肿瘤实体瘤样本进行原代肿瘤细胞体外培养，均可以达到非常高的成功率。
实施例14、用CYTOP修饰的细胞培养耗材进行妇科肿瘤原代肿瘤细胞培养
本实施例中所有样本原代培养的操作方法流程均完全一致(参照前文所述)，CYTOP的修饰方法均完全一致，仅细胞培养耗材材质有所区别(表25)。
其中CYTOP修饰的方法为：首先对细胞培养容器进行纯氧刻蚀，刻蚀条件为功率20W，刻蚀时间为3分钟。然后用适量(以96孔板为例，每孔20μL，适量是指完全覆盖培养皿底部)1％CYTOP溶液覆盖培养皿或培养平板表面，待CYTOP溶液完全晾干后即可使用。
表25 CYTOP修饰耗材对妇科肿瘤原代细胞培养的影响
注：聚苯乙烯(Polystyrene，缩写PS)。
由表25可见：可以看到CYTOP修饰后可以大幅度提高样本培养成功率。
实施例15、微孔板芯片加工
本实施例中使用注塑加工的方式，用PMMA材料(或者PS、PC、COC、COP、LAS等材料)加工得到用于培养本发明妇科肿瘤原代细胞所用的微孔板芯片。该芯片可以用于原代妇科肿瘤细胞培养以及体外药敏检测实验。微孔板芯片设计图纸见图5。
实际应用过程中，具体是采用PMMA材料(或者PS、PC、COC、COP、LAS等材料)制备得到设计图纸见图5的微孔板芯片的结构，然后再通过上述的CYTOP修饰方法(见实施例14)对其表面进行CYTOP修饰，就得到了这里所说的可用于妇科肿瘤原代细胞培养的微孔板芯片。
Claims (10)
1.一种用于培养妇科肿瘤原代细胞的培养基，其特征在于：所述培养基由抗菌抗真菌剂三抗、HEPES、GlutaMax、人重组蛋白EGF、人重组蛋白bFGF、人重组蛋白HGF、人重组蛋白MSP、N-乙酰-L-半胱氨酸、N-2Supplement、Y-27632、孕酮、β-雌二醇和Advanced DMEM/F12培养基组成；其中，所述抗菌抗真菌剂三抗中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL；所述抗菌抗真菌剂三抗中的两性霉素B的终浓度为250-250ng/mL；所述HEPES的终浓度为8-12mM；所述GlutaMax的终浓度为0.8-1.2％(体积百分含量)；所述人重组蛋白EGF的终浓度为10-100ng/mL；所述人重组蛋白bFGF的终浓度为10-50ng/mL；所述人重组蛋白HGF的终浓度为5-25ng/mL；所述人重组蛋白MSP的终浓度为5-25ng/mL；所述N-乙酰-L-半胱氨酸的终浓度为0.5-2mM；所述N-2Supplement的终浓度为1％(体积百分含量)；所述Y-27632的终浓度为5-20μM；所述孕酮的终浓度为50-100nM；所述β-雌二醇的终浓度为10-50nM；余量均为Advanced DMEM/F12培养基。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基为含有所述抗菌抗真菌剂三抗、所述HEPES、所述GlutaMax、所述人重组蛋白EGF、所述人重组蛋白bFGF、所述人重组蛋白HGF、所述人重组蛋白MSP、所述N-乙酰-L-半胱氨酸、所述N-2Supplement、所述Y-27632、所述孕酮、所述β-雌二醇和所述Advanced DMEM/F12培养基的溶液。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基中的各组分单独存在。
4.根据权利要求3所述的培养基，其特征在于：所述人重组蛋白EGF、所述人重组蛋白bFGF、所述人重组蛋白HGF、所述人重组蛋白MSP、所述N-乙酰-L-半胱氨酸、所述Y-27632、所述孕酮、所述β-雌二醇以母液形式存在；
具体的，所述母液为1000-100000倍母液；
1000×人重组蛋白EGF储液由人重组蛋白EGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白EGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS；
1000×人重组蛋白bFGF储液由人重组蛋白bFGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白bFGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS；
1000×人重组蛋白HGF储液由人重组蛋白HGF、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白HGF的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS；
1000×人重组蛋白MSP储液由人重组蛋白MSP、BSA和PBS组成，其中所述人重组蛋白MSP的终浓度为20μg/mL，所述BSA的终浓度为0.01g/mL，余量均为PBS；
1000×N-乙酰-L-半胱氨酸储液由N-乙酰-L-半胱氨酸和水组成，其中所述N-乙酰-L-半胱氨酸的浓度为0.5M，余量均为水；
1000×Y-27632由Y-27632和水组成，其中Y-27632的终浓度为10mM，余量均为水；
100000×孕酮储液由孕酮和无水乙醇组成，其中孕酮的终浓度为1mM，余量均为无水乙醇；
100000×β-雌二醇储液由β-雌二醇和无水乙醇组成，其中β-雌二醇的终浓度为1mM，余量均为无水乙醇。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于：在所述1000×人重组蛋白EGF储液、所述1000×人重组蛋白bFGF储液、所述1000×人重组蛋白HGF储液、所述1000×人重组蛋白MSP储液中，所述BSA以母液形式存在；
具体的，所述BSA以100倍母液形式存在；100×BSA溶液由BSA和PBS组成；其中BSA的终浓度为0.1g/mL，余量均为PBS。
6.用于培养妇科肿瘤原代细胞的成套试剂，含有权利要求1-5中任一所述的培养基和如下试剂中的至少一种：权利要求9中所述的消化终止液和所述细胞冻存液。
7.权利要求1-5中任一所述的培养基或权利要求6所述的成套试剂在培养妇科肿瘤原代细胞中的应用。
8.一种培养妇科肿瘤原代细胞的方法，包括如下步骤：使用具有低吸附表面的培养容器，利用所述培养基悬浮培养所述妇科肿瘤原代细胞，37℃，5％CO2条件下进行培养，每2-4天更换一次培养基。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：待所述妇科肿瘤原代细胞形成直径80-120μm的团块时，对所述妇科肿瘤原代细胞进行传代；
具体的，进行所述传代时采用的消化终止液由胎牛血清、双抗P/S和DMEM培养基组成；其中，所述胎牛血清的终浓度为8-12％；所述双抗P/S中的青霉素的终浓度为100-200U/mL；所述双抗P/S中的链霉素的终浓度为100-200μg/mL；余量均为DMEM培养基；
和/或
所述方法还包括对经过2-3次传代扩增后的所述妇科肿瘤原代细胞进行冻存和/或复苏的步骤；
具体的，进行所述冻存时采用的细胞冻存液由Advanced DMEM/F12培养基、DMSO和1％甲基纤维素溶液组成；其中，所述Advanced DMEM/F12培养基、所述DMSO和所述1％甲基纤维素溶液的体积配比为20:2:(0.8-1.2)；所述1％甲基纤维素溶液是浓度为1g/100ml的甲基纤维素水溶液。
10.根据权利要求1-9中任一所述的培养基或成套试剂或应用或方法，其特征在于：所述妇科肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、宫颈癌或其转移病灶。
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