CN114344331B

CN114344331B - 小分子化合物在制备激活原始卵泡的药物中的应用

Info

Publication number: CN114344331B
Application number: CN202111588688.6A
Authority: CN
Inventors: 张美佳; 韩琳程; 黄莹莹; 李彪; 范怡杰
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2021-12-23
Filing date: 2021-12-23
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2041-12-23
Also published as: CN114344331A

Abstract

本发明提供了小分子化合物在制备激活原始卵泡的药物中的应用，属于生物技术领域。本发明聚焦于小分子化合物，筛选出了一批可促进原始卵泡激活的物质。所述的小分子化合物为如下金属盐或金属盐组合物：锰盐、钆盐、铅盐、铝盐、铬盐、铁盐、锌盐、锂盐和锰盐组合物，可作为治疗原发性卵巢功能不全患者的口服药物，具有良好的应用前景。

Description

小分子化合物在制备激活原始卵泡的药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及小分子化合物在制备激活原始卵泡的药物中的应用。

背景技术

女性卵巢内具有数量确定且不可再生的原始卵泡，其随着年龄的增长逐渐消耗，直到最后耗竭。抗癌药物、环境污染以及晚婚晚育等对卵巢的影响很容易导致女性生育力下降。尽管辅助生殖技术得到了广泛的应用，但是由于对生殖生理机制的不完全明确，人类依然承受着众多的生殖障碍与疾病的困扰。其中，原发性卵巢功能不全(POI)是影响女性生育能力和健康的最普遍的卵巢疾病，POI的形成与原始卵泡激活关系密切。开展人原始卵泡维持与激活的分子机制研究，阐明原始卵泡激活及卵泡发育的分子机制是对于这些卵巢疾病的诊断和治疗至关重要的。

原始卵泡库在出生前后建立产生。原始卵泡形成后，大部分的原始卵泡都保持着静止状态，只有少部分原始卵泡被周期性招募进入生长卵泡阶段，最终发育成熟和排卵。原始卵泡的前颗粒细胞收到信号，哺乳动物雷帕霉素靶点1(mTORC1)信号通路被激活，促进颗粒细胞蛋白质翻译，KIT配体(KITL)表达分泌。KITL与卵母细胞表面的KIT相结合，卵母细胞内的磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)信号通路被激活，因磷酸化而活化的蛋白激酶B(AKT)磷酸化叉头基因盒子O3 alpha(FOXO3a)，导致其出核，卵母细胞活化。肿瘤抑制基因结节性硬化复合物1(TSC1)和肿瘤抑制基因结节性硬化复合物2(TSC2)组成的异二聚体可以负调控mTORC1的活化，人第10号染色体缺失的磷酸酶基因(PTEN)可以将磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸酯(PIP3)去磷酸化为磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸酯(PIP2)负调控PI3K信号通路。在小鼠中，颗粒细胞特异性敲除Tsc1和卵母细胞特异性敲除Pten都会导致原始卵泡过度激活，而抑制颗粒细胞mTORC1信号通路和卵母细胞PI3K信号通路会抑制原始卵泡的激活。卵原始卵泡不激活就会导致POI。目前采用治疗这种POI的方法主要依靠捐赠卵母细胞或者原始卵泡体外激活后手术移植。这些方法受到很多限制、需要进行手术，且成功率低。目前还没有通过口服药物促进原始卵泡激活而恢复POI患者的生育力的治疗方案。

许多的小分子化合物是人体必不可少的，它们对人的生长发育、日常生命活动有着重要作用。许多微量元素以小分子化合物形式被人体吸收，参与到人的物质循环中。钙、铁、锌、硒、锰、钼、铬等作为人必需微量元素，钙、铁、锌、硒、锰的缺乏会导致生殖障碍。铁、硒在卵泡发育过程中有着重要的作用，可以促进卵泡的生长发育；锌、锰、钙在卵母细胞成熟阶段有着重要作用，可以调节减数分裂，促进卵母细胞成熟；低浓度的钼可以提高卵母细胞质量，改善卵巢功能；铬作为必需微量元素，可以提高胰岛素功能，控制血糖。铝、砷、铅、钆、锂等虽不是人体必需元素，但在日常生活中也经常接触到。铅自然毒性低，在肠道中易形成不溶物；砷作为有毒元素，合适浓度的砷可治疗疾病，比如砒霜(三氧化二砷)可以治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)；钆在核磁共振中常被使用，而钆可以影响钙信号震荡来影响卵母细胞的成熟；锂在电池中被广泛使用，锂盐还可治疗某些精神类疾病。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供小分子化合物在制备激活原始卵泡的口服药物中的应用。本发明聚焦于小分子化合物，筛选出了一批可促进原始卵泡激活的物质，可作为治疗POI口服的药物。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

小分子化合物在制备治疗原发性卵巢功能不全的药物中的应用，所述的小分子化合物为如下金属盐或金属盐组合物：锰盐、钆盐、铅盐、铝盐、铬盐、铁盐、锌盐、锂盐和锰盐组合物。

进一步地，所述的应用为小分子化合物在制备激活原始卵泡的药物中的应用。

进一步地，所述锂盐包括氯化锂、碳酸锂等中的任意一种或多种；所述锰盐包括氯化锰、葡萄糖酸锰等中的任意一种或多种；所述钆盐包括氯化钆；所述铅盐包括醋酸铅；所述铝盐包括氯化铝；所述铬盐包括氯化铬、硫酸铬等中的任意一种或多种；所述铁盐包括氯化铁、硫酸铁等中的任意一种或多种；所述锌盐包括硫酸锌、葡萄糖酸锌等中的任意一种或多种。

进一步地，在所述的应用中，小分子化合物的剂量按个体体重计算，每50kg体重施用锂离子含量为10mg～200mg，或锰离子含量为1mg～20mg，或钆离子含量为2mg～40mg，或铅离子含量为5μg～100μg，或铝离子含量为1mg～20mg，或铬离子含量为2μg～60μg，或铁离子含量为2mg～50mg，或锌离子含量为3mg～70mg的小分子化合物。

进一步地，所述的原始卵泡为小鼠的原始卵泡。

进一步地，所述的药物的给药方式为口服给药。

与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：

POI是临床上比较严重的卵巢疾病，该病呈现年轻化的趋势，发病率不断提高，严重影响女性生育能力和身体健康。

为了确保雌性哺乳动物(包括人)在整个生育周期中有成熟卵子可用，其原始卵泡库中的原始卵泡激活必须受到精密的调控。在本研究中我们筛选出了七种金属离子的小分子化合物具有促进新生小鼠卵巢原始卵泡激活的作用，加药处理组生长卵泡均显著上升。我们所研究的小分子化合物中主要起作用的元素大多为体内所需微量元素，可以用于口服，具有良好的应用前景。

附图说明

图1为2dpp新生小鼠卵巢添加本发明小分子化合物培养4天的形态观察和卵泡计数结果图；其中，(A)对照组和添加小分子化合物组之间的形态学比较；(B)生长卵泡统计计数；(C)原始卵泡统计计数；(D)总卵泡统计计数。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1

1.1体外培养相关试剂配置

1.1.1药物溶液配置

每毫升超纯水中分别加入0.667mg氯化铝、1.332mg六水合氯化铬、25.168mg氯化锰、2.433mg氯化铁、8.073mg硫酸锌、5.272mg氯化钆、3.793mg三水合醋酸铅、25.168mg氯化锰与42.390mg氯化锂配置成5μM氯化铝溶液、5μM氯化铬溶液、200μM氯化锰溶液、15μM氯化铁溶液、50μM硫酸锌溶液、20μM氯化钆溶液、10μM醋酸铅溶液、1M氯化锂与200μM氯化锰溶液，待固体完全溶解之后，0.22μm滤器过滤，在超净台中操作，用封口膜封口并置于-20℃保存。

1.1.2DMEM/F12培养基(250ml)配置，如表1所示：

表1 DMEM-F12培养基

注:SP为买的商品化的青霉素和链霉素的双抗，添加到培养基用量为每100μL添加100mL培养基中。定容至250mL之后用0.22μm滤器过滤，在超净台中操作，用封口膜封口并在4℃保存。

1.1.3磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered solution，PBS，1L，pH：7.2)配制，如表2所示：

表2 PBS缓冲液

用去离子水定容至1L，高压灭菌，4℃保存。

1.2小鼠卵巢的分离和体外培养

1.2.1小鼠卵巢的分离

1)所有的手术器械，玻璃平皿等都进行灭菌处理，细胞间打开紫外灯照射半个小时灭菌。

2)本实验以2天大ICR雌鼠作为材料，用颈椎脱臼的方法处死小鼠解剖，将小鼠的头腹部和带有双侧肾的尾部分离，并把尾部放到冷的PBS里。

3)在体视显微镜操作，把小鼠卵巢和卵巢膜一起取出，并用注射针把卵巢周围包裹的膜分离。

1.2.2小鼠卵巢的体外培养

1)在六孔板每个孔中加入3mL DMEM/F12培养基，再加入3μL提前配置好的药物溶液(此时培养基药物浓度比配置的药物溶液药物浓度小1000倍)，吹打混匀，每个孔上放入0.44μm培养膜，放在二氧化碳培养箱37℃孵育30分钟。

2)将分离好的卵巢放到培养膜上，置于37℃恒温二氧化碳培养箱中培养；

3)每两天换一次液，共培养4天。

1.2.3卵巢包埋、切片与苏木精染色

1)样品的固定：培养4天的小鼠卵巢在4％的多聚甲醛中4℃固定12-16小时；

2)酒精浓度梯度脱水和透明：70％酒精，80％酒精，95％酒精/伊红染液，95％酒精，无水酒精，无水乙醇/二甲苯(体积1：1)，二甲苯，每个梯度5分钟，最后的二甲苯用滤纸吸干。

3)浸蜡和包埋：将卵巢在隔绝水(封口膜)的60℃环境中浸蜡2小时后转移到石蜡盒中。

4)组织切片：切片一般厚度为5μm。

5)展片：蜡带在42℃水浴锅充分的伸展后用载玻片捞起.

6)烤片：42℃过夜。

1.2.4苏木精染色

1)脱蜡复水：将切好的片子依次经过二甲苯，二甲苯，无水酒精，无水酒精，95％酒精，80％酒精，70％酒精。每个梯度各5分钟，最后用去离子水冲洗。

2)染色：用苏木精染料染1分钟左右，用水冲洗。

3)脱水封片：依次经过70％酒精，80％酒精，95％酒精，无水酒精，无水酒精，二甲苯，二甲苯，每个梯度各3分钟，最后用中性树脂封片。

1.3卵巢卵泡计数

对染色的连续切片进行计数，每连续5张切片取一张进行计数，最终的统计结果是将计数结果相加后乘以5。根据卵泡的形态学特点可以区分为：原始卵泡：周围三到五个扁平的颗粒细胞和中间的一个卵母细胞；激活卵泡：周围一层立方状的颗粒细胞或者周围立方状的和扁平状混合的一层颗粒细胞和中间一个长大的卵母细胞。

1.4卵巢卵泡计数结果

结果如图1所示，其中：

(A)对照组和添加小分子化合物组之间的形态学比较，黑色箭头指向为激活的生长卵泡。标尺：50μm；(B)生长卵泡统计计数。与对照组相比，5μM氯化铝组、5μM氯化铬组、200μM氯化锰组、15μM氯化铁组、50μM硫酸锌组、20μM氯化钆组、10μM醋酸铅组、1M氯化锂与200μM氯化锰联合组可以极显著促进原始卵泡的激活(P<0.01)。与氯化锰组相比1M氯化锂和200μM氯化锰联合组可以显著促进原始卵泡的激活(P<0.05)；(C)原始卵泡统计计数。氯化铝组和对照组原始卵泡数目没＝没有显著差异，氯化铬组、氯化钆组和醋酸铅与对照组之间有着显著差异(P<0.05)，氯化锰组、氯化铁组、硫酸锌组、氯化锂与氯化锰联合组与对照组之间有着极显著差异(P<0.01)，氯化锂与氯化锰联合组与氯化锰组之间没有显著差异。(D)总卵泡统计计数。各实验组与对照组之间没有明显差异。

本发明对2dpp新生小鼠卵巢添加小分子化合物或不添加药物培养4天，观察其卵巢结构。连续切片统计分析表明，与对照组相比(426.1±12.6，数据表示每个卵巢中的原始卵泡激活数量)，5μM氯化铝(793.3±18.3)、5μM氯化铬(793.3±11.6)、200μM氯化锰(988.3±39.7)、15μM氯化铁(1135.0±10.8)、50μM硫酸锌(1105.0±85.0)、20μM氯化钆(623.3±15.3)、10μM醋酸铅(661.7±10.6)、1mM氯化锂与200μM氯化锰联合(1180.0±12.5)可以显著促进原始卵泡的激活。因小分子化合物的作用，生长卵泡的增多导致原始卵泡数目下降，但小鼠卵巢总卵泡数没有影响，说明这些小分子化合物对原始卵泡的形成以及卵泡凋亡不产生影响。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.小分子化合物在制备治疗原发性卵巢功能不全的药物中的应用，其特征在于：

所述的小分子化合物为如下金属盐或金属盐组合物：锰盐、钆盐、铅盐、铝盐、铁盐、锌盐、锂盐和锰盐组合物；

所述锂盐为氯化锂；所述锰盐为氯化锰；所述钆盐为氯化钆；所述铅盐为醋酸铅；所述铝盐为氯化铝；所述铁盐为氯化铁；所述锌盐为硫酸锌；

小分子化合物的剂量按个体体重计算，每50 kg体重施用锂离子含量为10mg～200mg，或锰离子含量为1mg～20mg，或钆离子含量为2mg～40mg，或铅离子含量为5μg～100μg，或铝离子含量为1mg～20mg，或铁离子含量为2mg～50mg，或锌离子含量为3mg～70mg的小分子化合物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的应用为小分子化合物在制备激活原始卵泡的药物中的应用。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述的原始卵泡为小鼠的原始卵泡。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：

所述的药物的给药方式为口服给药。