CN102154209B

CN102154209B - 一种人骨肉瘤细胞株及其应用

Info

Publication number: CN102154209B
Application number: CN 201010110746
Authority: CN
Inventors: 姚阳; 沈赞; 余文熙
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-02-12
Filing date: 2010-02-12
Publication date: 2013-11-06
Anticipated expiration: 2030-02-12
Also published as: CN102154209A

Abstract

本发明提供了一种人骨肉瘤细胞株及其应用。该人骨肉瘤细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201002。该人骨肉瘤细胞株可用于在哺乳动物中产生骨肉瘤，制备骨肉瘤动物模型，可进一步用于筛选治疗骨肉瘤的候选药物。本发明的人骨肉瘤细胞株性状稳定，可稳定多次传代。体外传代自第30代至第90代性状保持稳定。本发明的骨肉瘤细胞株具有临床上骨肉瘤的生物学性状，尤其是同时具备原发耐药和高转移潜能的特性。对于解决原发耐药和远处转移这两个目前骨肉瘤治疗中无法回避的瓶颈问题，具有重要意义，是人骨肉瘤基础研究和临床前期应用的理想细胞株。

Description

一种人骨肉瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人骨肉瘤细胞株及其应用。

背景技术

早在5000年前的古埃及木乃伊上，医学研究人员就发现了骨肉瘤的存在(Marina N，etal.Biology and therapeutic advances for pediatric osteosarcoma.Oncologist2004；9(4)：422-41)。直至现在，骨肉瘤是儿童及青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤。尤其在20岁以前，骨肉瘤患者占到所有恶性骨肿瘤患者的近60％(Saeter G，Kloke O，JelicS，et al.ESMO Minimum Clinical Recommendations for diagnosis，treatment and follow-up ofosteosarcoma.Ann Oncol.2005；16Suppl 1：i71-2)，任何年龄均可发病，但是75％的骨肉瘤患者年龄在10～25岁。男性略多于女性，比例约为1.5∶1。通常，80％至90％的骨肉瘤发生在生长迅速骨骼的干骺段，包括股骨远端、胫骨近端和肱骨近端。自1970年以来，尤其是随着术前术后辅助化疗的广泛应用，骨肉瘤的诊疗取得了很大进展，但目前临床上骨肉瘤的诊疗现状仍不能令人满意，这一原因首先在于骨肉瘤极易出现远处转移，之前相关文献报道，如果在仅行手术切除治疗，骨肉瘤的远处转移率可达80％，大多发生在术后3-6个月之内(Saeter G，Kloke O，Jelic S，et al.ESMO Minimum ClinicalRecommendations for diagnosis，treatment and follow-up of osteosarcoma.Ann Oncol.2005；16 Suppl 1：i71-2)；其次在于骨肉瘤对化疗的耐药性，近年来骨肉瘤的化疗总体有效率仍然徘徊在60％左右，而制约骨肉瘤化疗疗效的一个主要原因就是骨肉瘤细胞对化疗的耐药性。而在临床上，化疗已成为骨肉瘤综合治疗中不可缺少的一种手段。骨肉瘤对化疗药物的耐药性分为内在耐药和获得性耐药两类。前者是肿瘤细胞在治疗的初始阶段即对多种抗肿瘤药物无明显反应；后者在化疗初期效果较好，但经过若干疗程后，肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生了耐药性。与其他肿瘤不同，骨肉瘤对化疗的耐药主要表现为内在性耐药(Marina N，et al.Biology and therapeutic advances for pediatric osteosarcoma.Oncologist 2004；9(4)：422-41)，这无疑进一步加大了临床上治疗的难度。以上问题的解决都需要研究人员对骨肉瘤的发病机制做出更加深入的探索，从而阐明相关分子机制，为骨肉瘤的治疗提供有效的靶点，进而最终改善骨肉瘤患者的预后。

为了进一步探讨骨肉瘤发病学所涉及的机制，近年来在骨肉瘤研究领域，建立相应的肿瘤动物模型，探索在动物体内肿瘤发生和发展规律，进而寻求切实有效的预防和治疗措施，成为诸多研究者的选择，建立动物肿瘤模型有动物自发肿瘤、物理化学手段诱发肿瘤以及移植性肿瘤三种方法。前二者对于实验动物的品系、实验环境和参数的标准化要求严格且周期较长，普遍开展有一定困难，且难以做到和人的肿瘤在组织学、放射学和生物学特性上的完全一致性。而移植性动物肿瘤模型具有生物学特性稳定、生长一致性、实验周期短、可操作性可重复性好等优点，是目前较为常用的造模方法(Goorin AM，Schwartzentruber DJ，Devidas M.et al.Presurgical chemotherapy compared with immediatesurgery and adjuvant chemotherapy for nonmetastatic osteosarcoma：Pediatric OncologyGroup Study POG-8651.J Clin Oncol.2003Apr 15；21(8)：1574-80)。尤其是免疫抑制动物如裸鼠的应用，使得研究者得以广泛开展异体移植，即将瘤块或细胞接种于裸鼠皮下，使肿瘤生长能模拟人恶性肿瘤成瘤后的过程，成瘤率高，成瘤时间均一，瘤体大小和重量容易测量，容易进行基础和临床研究，是目前研究最广泛的动物模型。

而建立移植性动物肿瘤模型自然离不开骨肉瘤细胞株的帮助，现在已经有部分商品化的骨肉瘤细胞株如MG-63、Saos-2、U2-0S、UOS等在市场上供应，为研究人员提供了良好的支持平台。但与其他肿瘤相比，目前骨肉瘤细胞株的生物性状多样性仍显不足，这大大限制了骨肉瘤发病学分子机制的研究(Bacci G，Longhi A，Fagioli F.et al.Adjuvantand neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremities：27year experience atRizzoli Institute，Italy.Eur J Cancer.2005 Dec；41(18)：2836-45.Epub 2005Nov 17；Bacci G，Ferrari S，Mercuri M，et al.Neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremities inpatients aged 41-60years：outcome in 34cases treated with adriamycin，cisplatinum andifosfamide between 1984and 1999.Acta Orthop.2007Jun；78(3)：377-84)，此外，这些骨肉瘤细胞株的生物学特性与临床上骨肉瘤的生物学性状相比存在一定差异，尤其是在原发耐药和高转移潜能这两个方面，目前鲜有同时具备以上两种生物学特性骨肉瘤细胞株建系的报道，而原发耐药和远处转移恰恰是目前骨肉瘤治疗中两个个无法回避的瓶颈问题。正因为如此，不少研究者致力于以手术方式从骨肉瘤患者身上取下新鲜瘤体组织标本进行原代细胞培养，并完成原代细胞株建株，对骨肉瘤的生物学特性进行研究，以期在骨肉瘤的研究上取得突破(Bacci G，Longhi A，Fagioli F.et al.Adjuvant and neoadjuvantchemotherapy for osteosarcoma of the extremities：27 year experience at Rizzoli Institute，Italy.Eur J Cancer.2005 Dec；41(18)：2836-45.Epub 2005 Nov 17；Bacci G，Ferrari S，Mercuri M，etal.Neoadjuvant chemotherapy for osteosarcoma of the extremities in patients aged 41-60 years：outcome in 34 cases treated with adriamycin，cisplatinum and ifosfamide between 1984 and1999.Acta Orthop.2007 Jun；78(3)：377-84；Bacci G，Ferrari S，Longhi A，Picci P，et al.Highdose ifosfamide in combination with high dose methotrexate，adriamycin and cisplatin in theneoadjuvant treatment of extremity osteosarcoma：preliminary results of an Italian SarcomaGroup/Scandinavian Sarcoma Group pilot study.J Chemother，2002 Apri；14(2)：198-206)。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的人骨肉瘤细胞株存在的生物多样性低，与临床上骨肉瘤的生物学性状相差较大的不足，提供一种新的人骨肉瘤细胞株及其用途。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种人骨肉瘤细胞，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-C201002。

本发明还提供如上所述的人骨肉瘤细胞的子代细胞。

本发明还提供如上所述的人骨肉瘤细胞的用途，用于在哺乳动物中产生骨肉瘤。所述的哺乳动物优选裸鼠。所述的裸鼠优选BALB/c-nu/nu裸鼠。所述的骨肉瘤较佳的是软骨母细胞型骨肉瘤。

本发明还提供一种筛选治疗骨肉瘤的候选药物的方法，包括以下步骤：将测试化合物施用于动物模型，施用后导致骨肉瘤症状改善或治愈的测试化合物就是治疗骨肉瘤的候选化合物，其中所述的动物模型具有如上所述的人骨肉瘤细胞所导致的骨肉瘤。所述的动物模型优选裸鼠。所述的裸鼠优选BALB/c-nu/nu裸鼠。在施用步骤中，将测试化合物的施用方式优选局部施用于骨肉瘤病灶处、或口服给药。

本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明除特别说明之外，所用的百分比都是质量百分比。

本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。

相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

(1)本发明的人骨肉瘤细胞株性状稳定，可稳定多次传代。

(2)本发明的骨肉瘤细胞株具有临床上骨肉瘤的生物学性状，尤其是同时具备原发耐药和高转移潜能的特性。对于解决原发耐药和远处转移这两个目前骨肉瘤治疗中无法回避的瓶颈问题，具有重要意义，是人骨肉瘤基础研究和临床前期应用的理想细胞株。

本发明的人骨肉瘤细胞株，于2010年2月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，中国)，保藏藏号为CCTCC-C201002，培养物名称为人骨肉瘤细胞株SF-86。

附图说明

以下结合附图说明本发明的特征和有益效果。

图1：光镜下原代细胞培养至第5代时细胞图，黑色箭头所指部分即为成纤维细胞中的散在异形细胞集落。

图2：光镜下原代细胞培养至第30代时细胞图。

图3：光镜下原代细胞培养至第90代时细胞图。

图4：光镜下细胞株培养至90代以后行细胞爬片HE染色图，其间可见部分细胞呈集落生长(黑色箭头)，并见多核巨细胞(蓝色箭头)。

图5：原代细胞株周期分布图。

图6：MTT法测定细胞生长曲线。

图7：细胞悬液法建立移植瘤体积生长曲线与时间关系。

图8：细胞悬液法成瘤后第4周裸鼠荷瘤情况。

图9：细胞悬液法成瘤后第5周裸鼠荷瘤情况，可见肿瘤表面血管极为丰富。

图10：荷瘤裸鼠肝脏表面的可疑病灶(黑色箭头)，后经病理检查证实为骨肉瘤肝转移灶。

图11：荷瘤裸鼠肺脏表现的可疑病灶(黑色箭头)(后经病理检查证实为骨肉瘤肺转移灶)。

图12：移植瘤切除后巨体观。

图13：移植瘤切除后剖面巨体观。

图14：移植瘤行石蜡包埋后HE染色切片：光镜下可见大量肉瘤样异形细胞生长，细胞间可见大量类骨质及软骨(黑色箭头)形成。

图15：细胞悬液法建立移植瘤免疫组化，Bcl-2阳性。

图16：细胞悬液法建立移植瘤免疫组化，CD99阳性。

图17：细胞悬液法建立移植瘤免疫组化，CD117阴性。

图18：细胞悬液法建立移植瘤免疫组化，Des阴性。

图19：细胞悬液法建立移植瘤免疫组化，Ki67阳性。

图20：细胞悬液法建立移植瘤免疫组化，MG阴性。

图21：细胞悬液法建立移植瘤免疫组化，P53阳性。

图22：细胞悬液法建立移植瘤免疫组化，SMA阳性

图23：细胞悬液法建立移植瘤免疫组化，Vim阳性。

图24：组织块接种法后2周末，可见移植瘤(左侧背部皮肤)右方出现了明显的皮下转移灶(黑色箭头)，病理证实为皮下转移瘤。

图25：组织块接种法建立裸鼠移植瘤，处死裸鼠时见肝脏表面可疑病灶，经病理学证实为骨肉瘤肝转移灶(黑色箭头)。

图26：组织块接种法建立裸鼠移植瘤，处死裸鼠时见肺脏表面可疑病灶，经病理学证实为骨肉瘤肺转移灶(黑色箭头)。

图27：组织块法移植瘤体积生长曲线与时间关系。

图28：移植瘤行石蜡包埋后HE染色切片：光镜下可见大量肉瘤样异形细胞生长，细胞间可见大量类骨质及软骨(黑色箭头)形成，符合典型的骨肉瘤病理学特征。

图29：组织块接种法建立移植瘤免疫组化，Bcl-2阳性。

图30：组织块接种法建立移植瘤免疫组化，CD99阳性。

图31：组织块接种法建立移植瘤免疫组化，CD117阴性。

图32：组织块接种法建立移植瘤免疫组化，Des阴性。

图33：组织块接种法建立移植瘤免疫组化，Ki67阳性。

图34：组织块接种法建立移植瘤免疫组化，MG阴性。

图35：组织块接种法建立移植瘤免疫组化，p53阳性。

图36：组织块接种法建立移植瘤免疫组化，SMA阳性。

图37：组织块接种法建立移植瘤免疫组化，Vim阳性。

具体实施方式

本发明采用原代组织块培养法对新鲜骨肉瘤手术标本进行培养，待有细胞晕生长后通过选择性消化以去除成纤维细胞，在体外传代至少达80代以上以完成初步建系。对所建立的原代细胞株进行形态学观察、细胞爬片HE染色、细胞周期检查、生长曲线测定、分裂指数及贴壁率测定、MTT药敏实验测定、异种移植实验，并将采用瘤块/细胞接种法所产生的移植瘤进行HE染色及免疫组化测定，与原发肿瘤标本进行对比以确定是否完整保留了原发肿瘤的特性。

本发明经90次体外传代后，初步建立了高度原发耐药的原代骨肉瘤细胞株，且经荷瘤动物模型证实该细胞株具备高度转移潜能，而且由于该细胞株的耐药和转移特性为原发具有，而不是通过诱导获得，较采用诱导方式获得的耐药表型更加稳定，而且也更符合临床上骨肉瘤耐药的特点。为今后进一步探索骨肉瘤病因学、尤其是耐药和转移的分子生物学机制提供了理想的研究样本。

本发明中，筛选治疗骨肉瘤的候选药物的方法包括以下步骤：

(1)将所述的骨肉瘤细胞或其子代细胞制备成细胞悬液，接种于哺乳动物皮下，进行饲养，获得人骨肉瘤动物模型；或者，上述接种的哺乳动物饲养直至接种区皮下出现移植瘤，取下移植瘤，切碎，接种于另一哺乳动物皮下，饲养，获得人骨肉瘤动物模型。

(2)将测试化合物施用于动物模型，施用后导致骨肉瘤症状改善或治愈的测试化合物就是治疗骨肉瘤的候选化合物。较佳的使用对照实验。

采用细胞悬液注射或瘤组织块移植来建立动物模型。细胞悬液注射成瘤对瘤细胞浓度要求较高，在预实验中发现，以10⁵/ml浓度进行皮下注射，5只裸鼠中仅1只成瘤，而采用5×10⁷/ml浓度后，10只裸鼠均形成了皮下移植瘤。本发明采用组织块接种法成瘤率较细胞悬液法为高，且成瘤后瘤体生长速度也更快。

下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为15℃。

实施例1原代骨肉瘤细胞株SF-86的建立与生物学特性鉴定

1.实验材料：

1.1原代细胞组织来源及细胞培养所需主要试剂：

组织来源：男性17岁患者，2008年5月因左股骨上段骨肉瘤行左大腿高位截肢术，病理诊断成骨肉瘤(软骨母细胞型)，术后按骨肉瘤术后辅助化疗常规予术后辅助化疗，08年6月发现右上臂，左臀部出现肿块，于08年6月行右上臂，左臀部肿块切除，术后病理：转移性骨肉瘤，免疫组化：p53(+)、Vim(+)、Des(-)、SMA(-)、Ki67(+)、CD117(-)、CD99(+)、Bcl-2(+)、MG(-)，08年7月发现双肺内出现多发转移灶，同时08年8月又发现右侧头皮下软组织转移灶。本实验中原代细胞培养组织来源取材自08年6月行右上臂肿块切除术中取下的软组织转移灶。培养液为含有青霉素(100IU/mL)及链霉素(100μg/mL)双抗的DMEM培养液，添加20％胎牛血清后-20℃保存。

1.2实验中主要化学药品与试剂：

Saos-2骨肉瘤细胞株及MG-63细胞株，由美国ATCC收录，购自上海中科院细胞所；人成骨肉瘤耐MTX细胞株(Saos-2/MTX 4.4)，由上海市第六人民医院肿瘤内科实验室于2007年成功诱导培育建系(王建军；姚阳；耐甲氨蝶呤人骨肉瘤细胞株建立及其生物学特性；肿瘤，2007年08期)；胎牛血清，购自杭州四季清生物工程材料有限公司；含有双抗的DMEM培养液及RPMI-1640培养液，购自美国GIBCO公司；胰蛋白酶，购自美国Amresco公司；四甲基偶氮唑盐(MTT)，购自美国SIGMA公司；二甲基亚砜(DMSO)，碘化丙啶(propidium iodide，PI)，RNA裂解酶，购自美国SIGMA公司；MTT药敏实验中所用的化疗药物由上海市第六人民医院肿瘤药敏实验室所提供。

1.3实验中主要仪器：

CO₂恒温培养箱，美国Thermo电子器械公司；

超净工作台，上海上净净化设备厂；

IX-70倒置相差显微镜及配备拍照系统，日本Olympus公司；

电热恒温水槽DK-600，上海精宏实验设备有限公司；

台式离心机TGL-16B，上海安亭科学仪器厂；

小型台式高速离心机，德国Eppendorf；

流式细胞仪FACStarPLUS，美国B.D公司；

电子天平，JA1003N，上海精密科学仪器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱，DHG型，上海精宏实验设备有限公司；

超低温冰箱MDF-293型，日本SANYO公司；

器皿及耗材：96孔细胞培养板、细胞培养瓶(25cm²及75cm²)、细胞计数板、盖玻片、Eppendorf移液器、离心管(15ml)、冻存管(2ml)。

2.实验方法：

2.1SF-86细胞株的建立与培养：

肿瘤标本用Hanks液冲洗数次。剪成直径1mm左右的小块后，再反复冲洗，贴壁接种于培养瓶底，底面朝上，同时加入含体积分数为20％胎牛血清及含有青霉素(100IU/mL)及链霉素(100μg/mL)双抗的DMEM培养液5ml，置37℃培养箱内，2h后缓慢将培养瓶翻转。4d后见有细胞晕生长，定期半量换液。1个月后，待细胞长满培养瓶时采用选择性胰酶消化法传第1代，此时细胞处于一个生长相对缓慢期，半个月后再用胰酶消化法传第2代。至第8代时，细胞生长速度逐渐加快，镜下见异形细胞比例逐渐增多，渐迅速生长，以后均采用选择性传代法，每4～5天传代1次，至08年10月传至第20代时，细胞生长速度已较前明显加快，镜下见异形细胞已取得明显生长优势，此时不再采用选择性胰酶消化传代，仅用常规胰酶消化，并逐步将培养液中的胎牛血清比例减低至10％，每2-3天传代一次。该细胞株命名为人骨肉瘤细胞株SF-86。

2.2细胞培养冻存：

MG-63及SF-86：取对数期细胞，弃培养瓶中的旧液，加入0.25％胰蛋白酶1ml消化后，加入培养液终止消化。反复吹打贴壁细胞成单细胞悬液，用滴管将悬液移至离心管中，1000r/min离心5min，弃上清液，加入细胞冻存液(含10％DMSO的细胞培养液，两者体积之比为1∶9)1.8ml，重悬细胞，使冻存液中细胞终浓度为5×10⁶个/ml～5×10⁷个/ml。用吸管将其移入冻存管(2ml)中。冻存管标记后，4℃放置30分钟，-20℃放置30分钟，-40℃放置30分钟，-80℃放置30分钟，最后移入液氮中保存。

Saos-2及Saos-2/MTX 4.4：培养方法同上，仅培养液用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液。

2.3细胞培养复苏：

从液氮中取出细胞冻存管，迅速置于37℃水浴箱内，并快速晃动，直到细胞冻存液完全融解。用吸管将细胞悬液移入离心管，1000r/min离心5min，弃上清液。再此加入DMEM培养液重悬细胞，离心，弃上清液。然后加入含10％胎牛血清的DMEM培养液后重悬细胞，将细胞悬液移至培养瓶内，置于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养，次日换液。

Saos-2及Saos-2/MTX 4.4：培养复苏方法同上，仅培养液用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液。

2.4光镜下SF-86细胞形态观察：

在倒置相差显微镜下观察SF-86原代细胞株建株过程中细胞形态结构的变化，并照像。

2.5SF-86细胞爬片，染色：

(1)爬片用玻片的制备：

选用一般的盖玻片，先浸入洗涤液中约半小时，洗净后置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍，用绸布搽拭凉干。置于已消毒过的玻璃培养皿中烘干，进行高压消毒。

(2)细胞爬片：

取对数期细胞，弃培养瓶中的旧液，加入0.25％胰蛋白酶1ml消化后，加入培养液终止消化。反复吹打贴壁细胞成单细胞悬液，调整细胞接种密度至1×10⁴/ml。细胞爬片选用六孔培养板，将盖玻片置于孔中，往盖玻片上滴加1000个左右细胞(100μl，再加入约500μl培养液，混匀)而后在盖玻片周围滴入8滴PBS，保持培养环境湿润。置入培养箱中培养，培养48小时，待镜下见细胞在盖玻片上生长至80％左右时，取玻片进行HE染色。

固定：细胞爬片后用4％的多聚甲醛固定20分钟后，PBS洗2遍后进行染色。

染色：用中性树胶把无细胞面和载玻片固定以便于染色。先置于苏木素中1～1.5分钟；自来水洗数遍，洗去苏木素和浮色，放入分化液片刻以溶解苏木素，放入伊红1～2分钟；而后按80％酒精2～3分钟；95％酒精I2～3分钟；95％酒精II5分钟；100％酒精I5分钟；100％酒精II10分钟；二甲苯I10分钟；二甲苯II10分钟；将玻片细胞面和载玻片用中性树胶封片。最后拍照。

2.6SF-86细胞株细胞分裂指数测定：

过程同细胞爬片培养，消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。在CO₂培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上，取出盖片，按下列顺序操作：PBS漂洗3分钟→甲醇∶冰醋酸＝3∶1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。以公式：分裂指数＝分裂细胞数/总细胞数×100％进行计算，取三片盖玻片进行计算，取平均值。

2.7SF-86细胞株细胞贴壁率测定：

取对数生长期细胞，以1×10⁶个/ml进行接种(接种于25cm²培养瓶中)，分别于接种4小时、8小时后消化已贴壁细胞，在倒置相差显微镜下进行计数，计算贴壁率，实验重复三次。

2.8SF-86细胞株细胞倍增时间测定：

采用Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间：Td＝Tlg2/lg(Nt/N0)，Td：倍增时间(h)；T：细胞数由N0增至Nt所用时间；N：细胞数。实验重复三次。

2.9SF-86细胞株细胞周期测定：

(1)流式细胞术PI染色测定细胞周期原理：

PI，即碘化丙锭，可以与细胞内DNA和RNA结合，采用RNA抑制剂将RNA消化后，通过流式细胞术检测到的与DNA结合的PI的荧光强度直接反映了细胞内DNA含量的多少。由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。因此，通过流式细胞术PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期，S期和G2/M期，并可通过特殊软件计算各时相的百分率。由于PI不能通过细胞膜完整的细胞(如活细胞和早期凋亡细胞)，在标本制备时，必须先用乙醇或其他破膜剂增强细胞膜的通透性，才能使PI进入细胞内与细胞内的核酸结合。

(2)流式细胞术PI染色测定细胞周期方法：

取对数生长期细胞，用胰酶消化法收集1×10⁶个细胞，PBS洗两遍(800转/分钟离心5分钟)，弃上清，振荡，重悬，加入70％预冷乙醇中，吹打均匀，4℃固定过夜。离心(800转/分钟离心5分钟)弃去上清，冰PBS液洗两次并重悬，吹打时注意轻柔，防止出现过多细胞碎片干扰检测。移入流式细胞仪离心管中，加入终浓度为100μg/ml的RNase酶，37度水浴中处理30分钟；加入终浓度为50μg/ml的PI液，避光4度孵育30分钟，之后用300目尼龙网过滤，用cloter XL型流式细胞仪分析细胞株周期分布，实验重复三次。

2.10MTT法测定SF-86细胞生长曲线及耐药性：

(1)药敏实验中药物的配制：

化疗药物储存液的配制：分别用无血清的DMEM培养液及RPMI-164培养液融解药物MTX(甲氨蝶呤)、DDP(顺铂)、PTX(紫杉醇)、EPI(表阿霉素)、IFO(异环磷酰胺)、THP(吡柔比星)；配置成1000×血浆峰浓度(peak serum concentration，PSC)储存液，-20℃保存。每月重新配制一次，使用前用对应培养液稀释至相应浓度。

各药物的血浆峰浓度1PSC(μg/ml)

MTX 10μg/ml；DDP 100μg/ml；PTX 46μg/ml；EPI 50μg/ml；IFO 2220μg/ml；THP8μg/ml(以上数据由上海市第六人民医院肿瘤药敏实验室提供)。

(2)MTT法药敏及MTT法测定细胞生长曲线实验原理：

四唑蓝(microculture tetrazolium，商品名噻唑蓝，简称MTT)是一种能接受氢原子的染料。该物质能够进入活细胞内，并在线粒体内琥珀酸脱氢酶的作用下使外源性的MTT还原为难溶性的紫色结晶物甲簪(Formazan)沉积在细胞中。因为死细胞的线粒体没有这个功能，故不能形成紫色结晶。化学试剂二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲簪，最后所产生的蓝紫色液体用酶标仪在一定波长下测出其吸光光度值，从而间接地反映出活细胞的数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量(以吸光光度值表示)与活细胞数呈正比。利用此原理可以测定抗肿瘤药物处理后细胞的存活率，从而预测肿瘤细胞对某种药物的敏感程度；此外亦可以利用此原理测定SF-86细胞的生长曲线。

(3)实验方法：

MTT法测定细胞周期：

接种细胞：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用含10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以每孔5×10³个细胞(已行预实验测定)接种于96孔培养板中，每孔体积200μl，每板接种8孔，共接种8块96孔板。同时每板均设与试验孔平行不加细胞只加培养液的空白对照。

培养细胞：将培养板放入CO₂孵箱，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下，进行培养。

呈色：自接种时算起，每隔24小时取出一块96孔板，每孔加入MTT 20μL，培养箱内培养4小时，然后用移液器小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150μL，溶解结晶成淡蓝紫色液体，轻摇96孔板10min，使结晶溶解充分。用Wellscan MK3型酶标仪在570nm波长下测每孔吸光光度值。测定8孔后计算吸光光度值均值，实验一共重复3次。

比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，纪录结果，空白孔调零。以时间为横轴，光吸收值(A)为纵轴绘制细胞生长曲线。

MTT法药敏实验测定SF-86多药耐药表型：

设定0.001×PPC、0.01×PPC、0.1×PPC、1×PPC、5×PPC、10×PPC、100×PPC七个梯度浓度，用MTT法计算不同药物在7种浓度下对SF-86、MG-63、Saos-2、Saos-2/MTX 4.4四株细胞株药物的肿瘤细胞体外抑制率(ID)，ID＝(1-用药孔OD值/无药对照孔OD值)×100％，并据此计算各种药物对三株细胞株的细胞50％抑制率药物剂量(IC50)。

具体方法：

SF-86及MG-63细胞株：用0.25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，用10％胎牛血清的DMEM培养液配成单个细胞悬液，以1×10⁴个/mL的细胞悬液浓度将细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔体积100μL，置于37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养24小时。24小时后观察，细胞形态佳、贴壁牢。根据实验分组加入工作浓度药物，每孔100μL。同时设置有细胞不加药物的对照组和没有细胞加药的空白组。继续培养24小时后，每孔加入MTT 20μL，培养箱内培养4小时，然后用移液器小心吸去上清液，每孔加入DMSO 150μL，溶解结晶成淡蓝紫色液体，轻摇96孔板10min，使结晶溶解充分。用Wellscan MK3型酶标仪在570nm波长下测每孔吸光光度值。每个药物浓度重复3孔，实验一共重复3次。

Saos-2及Saos-2/MTX 4.4细胞株：除使用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液配成单个细胞悬液，加入工作浓度药物时稀释液应与培养液相同外，其余同上。

2.11支原体污染检查：

采用荧光染色法进行支原体污染检查，荧光染色用能与DNA特异性结合的荧光染料Hoechst 33258，可使支原体内含有的DNA着色，染色后用荧光显微镜观察。

SF-86细胞培养中，每培养20代，将细胞接种盖玻片上，在细胞未长满前取出玻片，用不合酚红的Hanks液漂洗一下，用1∶3醋酸甲酵固定10分钟，然后用生理盐水漂洗。置于用生理盐水配浓度为50pg/ml的Hoechst 33258中染色10分钟。染色后用蒸溜水洗1-2分钟。向细胞面滴加pH5.5磷酸缓冲液数滴，然后置荧光显微镜下观察。镜下如见到散在于细胞同围或附于细胞膜表面的亮绿色小点即判定为支原体污染。对SF-86细胞株进行细胞生物学特性鉴定前均行支原体污染检测，无支原体污染方可进行。

3.实验结果

3.1.光镜下SF-86细胞形态观察：

原代细胞培养至第5代时，光镜下可见大量成纤维细胞，胞体较大，扁平梭形为主，形成单层后呈现放射状，交叉排列，胞核呈卵圆形。部分成纤维细胞间可见散在异形细胞集落，表现为光镜下形态不规则，生长形态较紊乱，与周围生长走向均一的成纤维细胞差异明显(图1，黑色箭头所指部分)。随着选择性消化传代的进行，光镜下异形细胞的比例逐渐增多，至第30代时，光镜下可见大量贴壁生长，体积中等，大小均匀，呈梭形或三角形，细胞核较大，核仁清晰，生长形态紊乱、走向不一的异形细胞，形态上与MG-63、Saos-2骨肉瘤细胞形态类似，部分呈集落生长，未见成纤维细胞生长(图2)。至第90代时光镜下观察，细胞形态始终保持稳定，未见成纤维细胞生长(图3)。培养过程中镜下细胞形态保持稳定，未见细菌、真菌、原虫污染及其他细胞株交叉污染表现，冻存复苏后，台盼蓝拒染活细胞在90％以上。

3.1.2SF-86细胞爬片制备后HE染色观察：

HE染色后光镜下观察，可见大量异型性细胞呈贴壁生长，呈上皮样细胞排列，部分形成集落，极性较差，细胞质嗜碱，核大且深染，核浆比例倒置，核染色质较粗，核仁大，部分可见核分裂相，并可见多核瘤巨细胞(图4)。

3.1.3SF-86细胞分裂指数测定：

以公式：分裂指数＝分裂细胞数/总细胞数×100％进行计算，取三片盖玻片进行计算取平均值，该细胞株分裂指数为20.36％。

3.1.4SF-86细胞贴壁率测定：

取对数生长期细胞，以1×10⁶个/ml进行接种(接种于25cm²培养瓶中)，4小时后贴壁率为35％，8小时后贴壁率为58％。

3.1.5SF-86细胞倍增时间测定：

采用Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间：Td＝Tlg2/lg(Nt/N0)，Td：倍增时间(h)；T：细胞数由N0增至Nt所用时间；N：细胞数。该细胞株倍增时间为：27.8小时。

3.1.6流式细胞仪测定SF-86细胞株周期：

运用流式细胞仪测定细胞周期结果显示，该细胞株G1期所占比例为61.3％，G2期细胞所占比例为22.0％，S期细胞所占比例为16.7％(图5)。

3.1.7MTT法测定SF-86细胞生长曲线(见图6)。

3.1.8MTT法测定SF-86的多药耐药表型：

统计出由酶标仪所测得的每个试验组的OD平均值，以空白孔OD值调零，用公式：细胞抑制率(％)＝(1-加药组平均OD值/对照组平均OD值)×100％，计算出相应的细胞活性抑制率。

结果见表1，可见该细胞株表现出对目前临床上骨肉瘤常用化疗药物明显的耐药性。

表1.与Saos-2、MG-63、Saos-2/MTX 4.4相比SF-86的耐药表型测定

IC50(μg/ml)	SF-86	Saos-2	MG-63	Saos-2/MTX 4.4
					MTX	83.736	0.032	0.533	0.328
EPI	11.872	0.011	0.012	0.043
					THP	6.384	0.013	0.008	0.039
PTX	119.593	0.005	0.003	0.013
					IFO	47343	0.058	0.042	2.347
DDP	91.99	0.128	0.87	0.157

3.1.9培养过程中支原体污染检查：

至第100代，未发现支原体污染。

获得的该株骨肉瘤细胞株SF-86于2010年2月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(武汉，中国)，保藏编号为CCTCC-C201002，培养物名称为人骨肉瘤细胞株SF-86。

实施例2利用原代骨肉瘤细胞株建立人骨肉瘤高转移模型

1.实验材料：

BALB/c-nu/nu裸鼠20只，由上海市第六人民医院实验动物中心提供，鼠龄3～4周，雄性，体重15-18g。

实验和饲养均在SPF级条件下超净层流架内进行，灭菌处理的水和SPF级专用饲料供动物自由摄取，以上实验条件均由上海市第六人民医院实验动物中心提供。

其余实验材料及试剂参见第一部分。

移植瘤免疫组化所使用抗体由上海市第六人民医院病理科提供。

2.实验方法：

2.1细胞培养条件：

SF-86细胞株于常规5％CO₂，37℃环境中培养，培养条件为：DMEM培养液，含10％胎牛血清。以0.25％胰酶消化细胞，3～4天传代1次，每次按1∶2的比例接种于25cm²培养瓶中。

2.2细胞悬液法建立动物模型：

将液氮冻存的已建系的SF-86细胞株解冻复苏，细胞生长迅速而旺盛，3～4天传代1次，共传代4次。收集对数生长期的骨肉瘤细胞，PBS洗涤1次，调整细胞浓度，制备成5×10⁷/ml细胞悬液，无菌条件下接种于右侧后背部皮下。每只接种约0.2ml，每只小鼠皮下接种约1×10⁷个瘤细胞，共接种10只。

2.3过程观察：

接种后每日观察裸鼠一般情况，待裸鼠接种区皮下出现质地韧小包块后每周以游标卡尺测量肿瘤短径(a)和长径(b)，根据公式V＝0.5×a²×b计算相对肿瘤体积并绘制生长曲线。实验老鼠在接种成瘤后1个半月全部以颈椎脱臼法处死，期间如发现裸鼠出现恶液质征象(体重下降明显、不愿活动、精神萎靡、全身发红、呼吸急促等)则立即处死。处死裸鼠后，剥取肿瘤组织送行病理学检查。同时取出裸鼠肺、肝组织送病理学检查，如发现肉眼可见转移灶则立刻拍照。

2.4组织学检查：

标本用10％福尔马林液固定，所有组织均常规石蜡包埋，切片4-6μm。

部分移植瘤行苏木精-伊红染色并拍照，其余移植瘤在制成石蜡包块后行进一步免疫组化检查。

附：石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色步骤：

(1)、切片在二甲苯中脱蜡5～10分钟；

(2)、移入二甲苯和纯酒精(1∶1)混合液中5分钟左右；

(3)、入100％、95％、85％、70％酒精，各级为2～5分钟。最后经蒸馏水转入染液。苏木精染液染色5～15分钟；

(4)、水洗玻片上多余染液，0.5～1％盐酸酒精(70％酒精配制)分色片刻。镜检控制直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数10秒钟；

(5)、流水冲洗15～30分钟，短时间碱化或蓝化，使细胞核呈蓝色；

(6)、蒸馏水短洗后在0.1～0.5％伊红染液染色1～5分钟；

(7)、依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟；

(8)、二甲苯透明(二次)，共约10分钟；

(9)、封片：擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固。

2.5免疫组织化学检查：

调阅该骨肉瘤原代细胞株来源的手术标本病理报告，选择报告中所提及的免疫组织化学指标(共9个：P53、Vim、Des、EMA、Ki67、CD117、CD99、Bcl-2、MG)，在移植瘤石蜡切片上重复测定这9个免疫组织化学指标的表达情况，以确定该细胞株所产生的移植瘤是否保留了原始肿瘤的生物学特性。

具体步骤采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(S-P法，DAB显色)，同时采用用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

(1)、烤片，68℃，20分钟；

(2)、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；

(3)、阻断灭活内源性过氧化物酶：3％H₂O₂37℃孵育10min，PBS冲洗3×5min；

(4)、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液(pH6.0)中用煮沸(95℃，15-20min)，自然冷却20min以上，再用冷水冲洗加快冷却至室温，PBS冲洗3×5min；

(5)、正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗；

(6)、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3×5min；滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3×5min；

(7)、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3×5min；

(8)、DAB/H₂O₂反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。

2.6组织块接种法建立动物模型：

从采用细胞悬液法建立的动物模型裸鼠中取下移植瘤，将部分移植瘤体切碎成约2mm×2mm×2mm的组织，将瘤体组织接种于另外10只裸鼠的双侧后腿根部前上方的背部皮下。术后SPF级独立送回风净化笼具饲养并观察。

接种后过程观察、组织学检查、免疫组织化学检查同细胞悬液法建立动物模型。

3.实验结果：

3.1细胞悬液法建立动物模型：

3.1.1肿瘤生长曲线：

肿瘤生长呈逐渐增大趋势，起初生长较慢，自第3周开始肿瘤生长明显加快，第4周肿瘤膨大异常明显，表面可见静脉怒张(图7)。随着肿瘤体积的进一步增大，裸鼠一般情况开始恶化，表现为进食明显减少，毛色发红，呼吸急促，精神萎靡，渐发生恶病质，最终因全身衰竭死亡(见表2)。

表2.裸鼠荷瘤后移植瘤大体观察情况

移植肿瘤

1周

2周

3周

4周

5周

6周

长径×短径

1mm×1mm

2mm×2mm

6mm×4mm

10mm×8mm

17mm×12mm

21mm×15mm

形状

小米粒状

隆起物

球状物

球形膨大

球形膨大，伴分叶

质地

软

有韧性

较硬，略带韧性

质地中等，略带韧性

局部皮肤血管情况

无血管怒张

肿瘤表面有少许血管迂曲扩张

血管迂曲扩张明显

血管较丰富

血管极度丰富

裸鼠一般情况

佳

尚可

精神略差，部分裸鼠出现萎靡不振

部分死亡，存活者亦萎靡不振

3.1.2过程观察：

接种当天局部皮下有液泡形成，2～3天后液泡吸收，2周左右局部出现小包块，接种3周后可见明显局部肿瘤形成，无自然消退现象，10只裸鼠移植均成功，移植率为100％。自第4周开始局部肿瘤生长迅速，说明瘤细胞的生长远大于丢失，肿瘤呈膨胀性生长，挤压周围正常组织，外观皮肤呈紫红色，表面可见静脉怒张(图8，9)，同时自成瘤后第5周末开始，裸鼠出现恶病质并日益加重，成瘤后第5周至第六周内有5只裸鼠死亡。每只裸鼠死亡后均立即解剖观察肝肺肾组织，肉眼即发现10只裸鼠中有6只裸鼠的肺脏中出现可疑病灶，5只裸鼠的肝脏中出现了可疑病灶，经病理证实为骨肉瘤转移灶(图10，图11)。

3.1.3移植瘤组织学检查：

处死裸鼠后，仔细解剖剥离肿瘤组织，大体观见肿瘤组织与正常组织连接紧密，难以剥离，血管网丰富。肿瘤质地较韧，剖开肿瘤时有明显阻力感，见断面呈鱼肉样组织，未见明显中心坏死组织(图12、13)。光镜下见瘤细胞弥漫性生长，细胞体积大，大小不一，深染，核圆形或卵圆形，核浆比例大，核膜清楚，核仁清晰可见，病理性核分裂相多，细胞间质少，呈肉瘤特性；细胞间质间可见大量类骨质、软骨形成，符合典型的骨肉瘤病理学特征(图14)。

3.1.4移植瘤免疫组织化学检查：

调阅该骨肉瘤原代细胞株来源的手术标本病理报告，选择报告中所提及的免疫组织化学指标(共9个：p53、Vim、Des、EMA、Ki67、CD117、CD99、Bcl-2、MG)，在移植瘤石蜡切片上重复测定这9个免疫组织化学指标的表达情况，结果显示，在裸鼠身上形成的移植瘤以上9个免疫学指标表达情况与原发于患者身上肿瘤完全相同，证明该原代细胞株很好保留了原发肿瘤的生物学性状(图15-图23)。

3.2.组织块接种法建立动物模型：

3.2.1过程观察：

组织块接种后，约1周左右手术缝线脱落，手术伤口愈合良好，10只裸鼠均未出现局部伤口炎症反应。术后2～3天皮即下形成斑丘状组织团，触之软，1周后包块轮廓明显较前硬，2周后可见明显局部肿瘤形成，无自然消退现象，10只裸鼠中有4只在移植瘤周围出现了皮下可见转移灶，性状同移植瘤(图24)；自第3周开始局部肿瘤即生长迅速，呈膨胀性生长，外观皮肤呈紫红色，表面可见静脉怒张，同时自术后第4周开始，即有部分裸鼠出现恶病质并日益加重并相继死亡，至术后第五周末10只裸鼠均因机能衰竭死亡。死亡后均立即解剖观察肝肺肾组织，肉眼发现9只裸鼠肺脏中出现了可疑病灶，7只肝脏中出现了可疑病灶，经病理证实均为骨肉瘤肺、肝转移(图25，图26)。

3.2.2肿瘤生长曲线：

肿瘤种植后无自然消退现象，生长呈逐渐增大趋势，但较细胞悬液接种法生长更迅速，自第3周开始肿瘤生长明显加快，随着肿瘤体积的进一步增大，裸鼠一般情况开始恶化，渐发生恶病质并加重，在第4至第5周间均因全身衰竭而死亡(图27、表3)。

表3.裸鼠荷瘤组织块接种法后对移植瘤大体观察情况

移植肿瘤	1周	2周	3周	4周	5周
						长径×短径	2mm×2mm	6m×4.5mm	11mm×7mm	18mm×9mm	23mm×14mm
形状	小米粒状隆起物	较大隆起物	球状物	球形膨大	球形膨大，伴分叶
						质地	软	有韧性	有韧性	较硬，略带韧性	质地中等，略带韧性
局部皮肤血管情况	无血管怒张	肿瘤表面有少许血管迂曲扩张	血管迂曲扩张明显	血管较丰富	血管丰富
						裸鼠一般情况	佳	佳	尚可	部分萎靡不振	陆续死亡

3.2.3移植瘤组织学检查：

处死裸鼠后，仔细解剖剥离肿瘤组织，大体观见肿瘤组织与正常组粘连紧密，难以剥离，血管网丰剖开肿瘤时有质韧感，见断面呈鱼肉样白色，未见明显中心坏死组织。

光镜下见瘤细胞弥漫性生长，细胞体积大，大小不一，深染，核圆形或卵圆形，核浆比例大，核膜清楚，核仁清晰可见，病理性核分裂相多，细胞间质少，呈肉瘤特性；细胞间质间可见大量类骨质、软骨形成，符合典型的骨肉瘤病理学特征(图28)。

3.2.4移植瘤免疫组织化学检查：

在裸鼠身上以组织块接种法种植产生的移植瘤上重复p53、Vim、Des、SMA、Ki67、CD117、MG、CD99、Bcl-2等9个免疫组化指标证实，该移植瘤以上9个免疫学指标表达情况与患者原发肿瘤及移植用瘤组织块完全相同(图29到图37)。

结论

1.经90代体外培养，初步建立原代骨肉瘤细胞株SF-86，体外传代自第30代至第90代性状保持稳定，其形态学表现符合骨肉瘤细胞株的特征，采用细胞异种移植或瘤块异种移植成瘤率均达100％，其异种移植所产生的移植瘤具备典型的骨肉瘤特征。

2.经对异种移植所产生的移植瘤行免疫组化，共9个指标，证实与患者术后手术标本免疫组化结果完全一致，证明该骨肉瘤细胞株很好的保留了原发肿瘤的生物学特性。

3.经动物模型实验证实，即使仅行皮下移植成瘤，该骨肉瘤细胞株仍表现出极高的转移性；体外药敏实验证实与其他骨肉瘤细胞株相比，该细胞株对目前临床上多种常见化疗药物存在高度耐药。

4.在建立骨肉瘤动物模型方面，组织块成瘤法较细胞悬液法成瘤时间更短，速度更快，发生远处转移率也较高，能更好的模拟人体中骨肉瘤的自然病程。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种人骨肉瘤细胞，其特征在于，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C201002。

2.如权利要求1所述的人骨肉瘤细胞的子代细胞。