CN114134195A - 预防前列腺癌的药剂的筛选方法、硝唑尼特在制药中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种预防前列腺癌的药剂的筛选方法、硝唑尼特在制药中的应用,包括以下步骤:S10、将前列腺癌细胞进行3D细胞培养,得肿瘤球状体;S20、将待筛选药剂配制成浓度为10μM的溶液,用溶液对肿瘤球状体进行细胞侵袭实验,并计算肿瘤球状体的侵袭面积,筛选出侵袭面积小于50%的肿瘤球状体对应的药剂,其中,待筛选药剂选自FDA上市及药典收录化合物库;S30、将筛选出的药剂配制成0~10μM的多个不同浓度梯度的溶液,并分别加入肿瘤球状体中培养后,计算肿瘤球状体的侵袭面积,筛选出侵袭面积小于70%的7个药剂;S40、测定7个药剂的IC50,筛选出IC50值小于28μM的药剂,即为预防前列腺癌的药剂。硝唑尼特安全性好,预防效果明显。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域,特别涉及一种预防前列腺癌的药剂的筛选方法、硝唑尼特在制药中的应用。
背景技术
前列腺癌是男性泌尿系统最常见的恶性肿瘤,全球癌症病发率居第四位。据估计,在2020年就有1414259例患者病发于前列腺癌,有375304例癌症患者死于前列腺癌。相比欧美国家,虽然我国的前列腺癌发病率较低,但是随着近年来我国社会人口老龄化,经济水平提高及人们饮食习惯改变,我国前列腺癌发病率逐年升高的趋势,严重威胁着我国中老年男性的健康。根据2013年中国前列腺癌发病现状和流行趋势分析显示,1998年中国男性前列腺癌发病率仅为3.52/10万,但至2008年发病率达到11.00/10万,10年间的年均增长比例为12.07%。前列腺癌骨转移是前列腺癌常见的并发症之一,也是患者发病和死亡的主要原因。前列腺癌在初始阶段,生长在局部的肿瘤可通过外科手术或放射疗法成功治疗,但是大约20~30%的患者会复发。虽然复发的患者一开始会对雄激素剥夺疗法或雄激素受体拮抗剂敏感,但是最终都会不可避免地发展为去势抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostate cancer,CRPC)。这一阶段会同时或随后迅速出现继发性肿瘤,90%的转移性去势抵抗性前列腺癌(mCRPC)都会转移到骨骼部位。尽管对于患有骨转移的CRPC患者建议使用denosumab或zoledronic acid预防或延迟骨骼相关事件(skeletal related events,SRE),但在癌症特异性和总体生存方面未见明显疗效。目前,多西紫杉醇和卡巴他赛是唯一对mCRPC患者具有生存益处的化疗药物,但实际上所有mCRPC最终都会产生耐药性,多西紫杉醇治疗的骨转移患者预后仍然较差。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种预防前列腺癌的药剂的筛选方法、硝唑尼特在制药中的应用,旨在筛选新的能够预防前列腺疾病的药剂。
为实现上述目的,本发明提出一种预防前列腺癌的药剂的筛选方法,包括以下步骤:
S10、将前列腺癌细胞进行3D细胞培养,得肿瘤球状体;
S20、将待筛选药剂配制成浓度为10μM的溶液,用所述溶液对所述肿瘤球状体进行细胞侵袭实验,并计算所述肿瘤球状体的侵袭面积,筛选出侵袭面积小于50%的肿瘤球状体对应的药剂,其中,所述待筛选药剂选自FDA上市及药典收录化合物库;
S30、将筛选出的所述药剂配制成0~10μM的多个不同浓度梯度的溶液,并分别加入肿瘤球状体中培养后,计算所述肿瘤球状体的侵袭面积,筛选出侵袭面积小于70%的7个药剂;
S40、测定所述7个药剂中至少部分药剂的IC50,筛选出IC50值小于28μM的药剂,即为预防前列腺癌的药剂。
可选地,步骤S10包括:
S11、用前列腺癌细胞PC3和连接体K369Q,构建前列腺癌高转移PC3-KQ细胞;
S12、将所述前列腺癌高转移PC3-KQ细胞进行3D细胞培养,得肿瘤球状体。
可选地,所述预防前列腺癌的药剂包括呋喃菌素、硝呋太尔、硝唑尼特和瑞他帕林。
进一步地,本发明还提出一种硝唑尼特在制备预防前列腺疾病的药物中的应用。
进一步地,本发明还提出一种硝唑尼特在制备预防前列腺癌的药物中的应用。
此外,本发明还提出一种硝唑尼特在制备预防前列腺癌骨转移的药物中的应用。
本发明提供的技术方案中,提出一种预防前列腺癌的药剂的筛选方法,先用高浓度的药物进行细胞侵袭实验,以在FDA上市及药典收录化合物库中进行第一次筛选,之后,设置药剂的浓度梯度,筛选出在低浓度下便可抑制侵袭面积的7个药剂,最后根据药剂的IC50值,筛选出IC50值小于28μM的药剂,本发明提出的药剂的筛选方法为高通量筛选中的三维筛选,能够在保持高通量特性的同时更真实地模拟体内癌症的微环境,此外,筛选出的硝唑尼特是FDA批准的药物,其药物安全性已被验证;硝唑尼特可从植物和动物来源大量获得,获取成本低。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例前列腺癌高转移PC3-KQ细胞和低转移PC3-KR细胞的细胞迁移实验结果;
图2为本发明实施例经3D培养的前列腺癌高转移PC3-KQ肿瘤球状体及前列腺癌低转移PC3-KR肿瘤球状体的图像;
图3为本发明实施例第一次筛选的结果图;
图4为本发明实施例第二次筛选的三维结果图;
图5为本发明实施例第二次筛选的统计结果图;
图6为本发明实施例不同浓度下7个化合物中5个的抑制细胞球侵袭面积图;
图7为本发明实施例的NTZ预防小鼠前列腺癌骨转移的模型设计图;
图8为活体成像检验PC3-KQ-LUC构建的成功性检验图;
图9为活体成像检测NTZ抗前列腺癌骨转移效果图;
图10为本发明实施例的生物发光分析图;
图11为本发明实施例的Micro-CT检测NTZ抗前列腺癌骨转移效果图;
图12为本发明实施例的在给药期间NTZ对小鼠体重影响图;
图13为本发明实施例的HE染色分析NTZ对癌细胞转移骨组织影响图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例,参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
另外,全文中出现的“和/或”的含义,包括三个并列的方案,以“A和/或B”为例,包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外,各个实施例之间的技术方案可以相互结合,但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础,当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在,也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
尽管对于患有骨转移的CRPC患者建议使用denosumab或zoledronic acid预防或延迟骨骼相关事件(skeletal related events,SRE),但在癌症特异性和总体生存方面未见明显疗效。目前,多西紫杉醇和卡巴他赛是唯一对mCRPC患者具有生存益处的化疗药物,但实际上所有mCRPC最终都会产生耐药性,多西紫杉醇治疗的骨转移患者预后仍然较差。
鉴于此,本发明提出一种预防前列腺癌的药剂的筛选方法,旨在筛选新的能够预防前列腺疾病的药剂。
本发明提出一种预防前列腺癌的药剂的筛选方法,包括以下步骤:
S10、将前列腺癌细胞进行3D细胞培养,得肿瘤球状体;
3D细胞培养是能在细胞培养过程中为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境的培养技术。确保了高质量、高密度的细胞繁殖,突破了传统有盖培养皿、培养瓶或微孔板细胞培养耗时繁琐,细胞产量微小等局限性。
具体地,步骤S10包括:
S11、用前列腺癌细胞PC3和连接体K369Q,构建前列腺癌高转移PC3-KQ细胞;
S12、将所述前列腺癌高转移PC3-KQ细胞进行3D细胞培养,得肿瘤球状体。
研究表明,前列腺癌细胞PC3和连接体K369Q构建的前列腺癌高转移PC3-KQ细胞,相比于前列腺癌细胞PC3和连接体K369R构建的前列腺癌低转移PC3-KR细胞,细胞迁移能力明显较强。
S20、将待筛选药剂配制成浓度为10μM的溶液,用所述溶液对所述肿瘤球状体进行细胞侵袭实验,并计算所述肿瘤球状体的侵袭面积,筛选出侵袭面积小于50%的肿瘤球状体对应的药剂,其中,所述待筛选药剂选自FDA上市及药典收录化合物库;
本步骤主要是在FDA上市及药典收录化合物库中进行第一次筛选,第一次筛选时,药剂的浓度较高,为10μM,主要筛选能够抑制肿瘤球状体侵袭面积增加的药剂,侵袭面积可以使用Image J软件计算。
S30、将筛选出的所述药剂配制成0~10μM的多个不同浓度梯度的溶液,并分别加入肿瘤球状体中培养后,计算所述肿瘤球状体的侵袭面积,筛选出侵袭面积小于70%的7个药剂;
本步骤中,在第一次筛选得到的药剂中进行第二次筛选,筛选出在低于10μM的浓度下依然具有抑制肿瘤球状体侵袭面积增加作用的药剂,0~10μM的多个不同浓度梯度的溶液,在本发明实施例中,分别采用的浓度为10μM、1μM、0.1μM、0.01μM、0.001μM、0μM,最终结果表明,在浓度为1μM、侵袭面积小于70%时,可以筛选出7个药剂,分别为Furagin(呋喃菌素)、Retapamulin、Ronidazole(罗硝唑)、Nitazoxanide(硝唑尼特)、Nifuratel、Bortezomib(硼替佐米)、Mitomycin_C(丝裂霉素C)。
S40、测定所述7个药剂中至少部分药剂的IC50,筛选出IC50值小于28μM的药剂,即为预防前列腺癌的药剂。
IC50(half maximal inhibitory concentration)是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。它能指示某一药物或者物质(抑制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质,比如酶,细胞受体或是微生物)的半量。在凋亡方面,可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%,该浓度称为50%抑制浓度,即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度,IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力,即诱导能力越强,该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。
根据上述筛选方法,能够得到四种药剂,呋喃菌素、硝呋太尔、硝唑尼特和瑞他帕林,上述物质均可以作为预防前列腺癌的药剂,其中,硝唑尼特的IC50值最低。
此外,在本法明实施例中,还需综合相关文献筛选,最终得到预防前列腺癌的药物Nitazoxanide(硝唑尼特)。
本发明提出的预防前列腺癌的药剂的筛选方法,先用高浓度的药物进行细胞侵袭实验,以在FDA上市及药典收录化合物库中进行第一次筛选,之后,设置药剂的浓度梯度,筛选出在低浓度下便可抑制侵袭面积的7个药剂,最后根据药剂的IC50值,筛选出IC50值最低的药剂,硝唑尼特,本发明提出的药剂的筛选方法为高通量筛选中的三维筛选,能够在保持高通量特性的同时更真实地模拟体内癌症的微环境,此外,筛选出的硝唑尼特是FDA批准的药物,其药物安全性已被验证;硝唑尼特可从植物和动物来源大量获得,获取成本低。
进一步地,本发明还提出一种硝唑尼特在制备预防前列腺疾病的药物中的应用。硝唑尼特具有抗原虫、抗肠道寄生虫、抗菌、抗病毒等药效,且抗寄生虫谱及抗菌谱较阿苯达唑、甲苯达唑及甲硝唑广泛,在本发明实施例中,硝唑尼特用来制备预防前列腺疾病的药剂,开发了硝唑尼特在药物领域的新用途。
进一步地,本发明还提出一种硝唑尼特在制备预防前列腺癌的药物中的应用。在本发明实施例中,硝唑尼特用来制备预防前列腺癌的药剂,开发了硝唑尼特在药剂领域的新用途。
进一步地,本发明还提出一种硝唑尼特在制备预防前列腺癌骨转移的药物中的应用。在本发明实施例中,硝唑尼特用来制备预防前列腺癌骨转移的药物,开发了硝唑尼特在药物领域的新用途。
以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明,应当理解,以下实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明实施例的细胞培养按照以下操作步骤进行:
1、细胞的增殖与传代
本发明所用的人前列腺癌细胞株PC3-KQ(高转移)和PC3-KR(低转移)在CO2浓度为5%,湿度为95%的37℃恒温CO2培养箱中进行培养,所使用的培养基为含有10%胎牛血清,1%青链霉素双抗的常规1640培养基。每日镜下观察培养瓶中培养基颜色变化,注意是否有浑浊,观察细胞状态,包括细胞的形态、密度以及伸展情况,待培养基颜色变淡后,进行换液。若细胞培养过程中发现细胞污染,立即丢弃所有细胞,并对细胞间进行彻底消毒,重新复苏细胞,待细胞状态良好,方可用于试验。
①每日显微镜下观察细胞,直至生长至80~90%的饱和度,准备进行细胞传代;
②对超净台和实验所用的物品进行30min的紫外线照射消毒;
③移除培养液,加入PBS(2mL/皿),仔细冲洗残留于培养瓶中的培养液以及细胞;
④移除PBS,每瓶加入1.5mL含有EDTA的0.25%胰蛋白酶,静置消化2~3min;
⑤显微镜下观察细胞变化,直至细胞收缩变圆,细胞间隙增大,部分细胞脱落,则可认为消化完全,加入与胰酶等量的含有血清的细胞培养基进行终止消化,巴氏吸管反复吹打,直至贴于瓶壁的细胞完全脱落;
⑥将吹打下来的细胞以及胰酶培养基混合液转移至15mL离心管,进行1200rpm离心,离心时间为3min;
⑦丢弃离心管中上清液,注意保护离心管底白色沉淀物为离心下来的细胞,防止丢弃细胞,在离心管中加入2mL新鲜细胞培养液,巴氏吸管反复吹打40次,使细胞重悬,形成单细胞悬液;
⑧将重悬为单细胞悬液的细胞,吸取1mL加入到新的10cm2细胞培养皿,并在培养瓶中加入9mL新鲜培养基;
⑨分别吸取重悬细胞1mL,加入到上述准备好的培养瓶中,并将培养瓶放平后左右上下轻微晃动,使细胞均匀铺满培养皿;
⑩镜下观察细胞,标记细胞名称及传代时间,再次置于培养箱中继续培养;将超净台整理整齐后再用75%的酒精擦拭超净台台面,熄灭酒精灯,紫外消毒。
2、细胞计数
①将细胞计数板及盖玻片用75%酒精擦拭干净,在酒精灯火焰上左右晃动数次烘干后,将盖玻片完全覆盖在计数板上,放平,勿使盖玻片滑动;
②按照细胞传代方法加入胰蛋白酶消化细胞,将收集的细胞转移到15mL无菌离心管中并且进行单细胞悬液的制备;
③移液枪吸取20μL单细胞悬液于1.5mL离心管中与20μL台盼蓝混匀;
④细胞技术仪计数;
⑤记录细胞计数结果,计算每皿细胞密度。
实施例1预防前列腺癌的药剂的筛选
一、前列腺癌高转移PC3-KQ细胞和低转移PC3-KR细胞的构建
1、转化
将大肠杆菌感受态于-80℃冰箱取出后,置于冰上融化;将实验室已构建的连接产物(K369R、K369Q)加入大肠杆菌感受态,冰上孵育;42℃热激90s之后置于冰上2min;于超净台内向感受态中加入200μL的LB培养基、1μL抗生素,移液枪吹打均匀后涂含有抗生素的平板;涂板后37℃恒温培养箱培养过夜。
2、质粒扩增
用10μL枪头挑取平板上的单克隆菌落后放入EP管中,摇床中200rpm摇菌12h,根据质粒提取试剂盒提取质粒。
3、病毒包装
待293T细胞生长汇合度为80%左右,进行质粒转染,分别于48h和72h收取病毒,1500rpm离心5min;将制备好的病毒分装至1.5mL的EP管中,-80℃冰箱冻存备用。
4、病毒感染
将前列腺癌细胞PC3按照30%的汇合度铺到6孔板中,完全培养基培养,每孔2mL;
37℃的二氧化碳恒温培养箱培养;16~28h后,初次感染,吸去旧培养基,每孔加入500μL新鲜完全培养基和500μL病毒(分别为K369R、K369Q),最后加入1μL阳离子吸附剂(polybrene),摇晃均匀后放入37℃的二氧化碳恒温培养箱培养,6h后,每孔补入1mL新鲜完全培养基,Mock代表不加入病毒,筛选稳定克隆的空白对照;16~24h后,二次感染,吸去旧的培养基和病毒,每孔加入500μL新鲜完全培养基和500μL病毒以及1μL阳离子吸附剂,37℃的二氧化碳恒温培养箱培养。6h后,每孔补入1mL新鲜完全培养基。16~24h后,感染完毕。
5、转基因多克隆细胞系筛选
将前列腺癌细胞PC3感染后16~24h,吸去旧的培养基和病毒,将细胞消化下来,转入10cm培养皿,每皿6mL完全培养基,继续培养;24h后,当细胞贴壁之后,吸去旧的培养基,选择压为PC3:800μg/mL的潮霉素B(Hygromycin B);每隔两天更换一次含有选择压的培养基;两周之后,当Mock皿中的细胞全部被选择压杀死之后,可认为处理中的阴性细胞也都被选择压杀死,而活下来的细胞则为筛选出来的阳性细胞;将筛选出来的细胞扩增培养,一部分用来收取RNA和裂解蛋白,检测目的基因是否成功表达;一部分用来冻存保种;一部分用来继续培养,完成后续实验。
6、细胞迁移实验
将生长至对数期的K369R、K369Q细胞用0.25%胰酶消化,1200rmp离心3min,弃上清,PBS洗1次。无血清培养基悬浮细胞,以台盼蓝计数细胞,并调整为2.5×105个/mL。取出Transwell小室,先在下室加入肿瘤细胞趋化因子800μL完全培养基(含15%胎牛血清),再把调配好的细胞悬液各取200μL(含5×104)细胞接种于上室上(小心不要有气泡产生),随后将装置移于37℃,5%的CO2细胞培养孵育24h。孵育结束后用PBS稍稍水洗,用棉签擦去滤膜上表面未穿膜的肿瘤细胞。将Transwell小室浸泡在600μL的4%多聚甲醛中固定10min,风干后再以500μL结晶紫染色5min。自来水冲洗Transwell小室后,风干,显微镜下观察membrane下表面的细胞分布,每个孔取5个视野。最后在24孔板加入500μL的33%的醋酸,将Transwell小室置于其中,浸膜,震荡10min,充分溶解,取出Transwell小室,把24孔板置于酶标仪上570nm测OD值,以间接反应细胞数。
细胞迁移实验结果如图1所示,可以看出,将乙酰化KLF5(KQ)和去乙酰化KLF5(KR)稳转入PC3细胞,PC3-KQ细胞的迁移能力明显比PC3-KR细胞强。
二、3D细胞球侵袭筛选药物系统
1、肿瘤球状体的3D培养
分别用PBS洗涤前列腺癌高转移PC3-KQ细胞和低转移PC3-KR细胞,加入胰酶消化,在显微镜下检查细胞分离情况,当细胞变圆时用完全生长培养基中和胰酶。用P1000移液器把细胞吹打下来,以1200rpm离心细胞悬液3分钟。除去上清液,然后使用P1000移液管将细胞沉淀重悬于1mL的完全生长培养基中。用台盼蓝计数细胞并稀释细胞悬液,以获得0.5~2×104细胞/mL(需要确定每种细胞系的最佳细胞密度,以便在细胞接种后4天获得直径300~500μm的肿瘤球体)。将细胞悬液转移至无菌加样槽中,并使用电动多通道移液器吸取细胞悬液(80μL/孔)分配至超低附着(ULA)384孔圆形底板中。将ULA384孔板离心,320g离心4min,然后将384孔板转移到培养箱(37℃,5%CO2,95%湿度)中培养。4天后,目视确认肿瘤球状体形成,参阅图2,可以看出,在3D细胞培养系统中,PC3-KQ的侵袭能力明显比PC3-KR强。
2、第一次筛选
在冰上解冻基质胶。将用于P10,P200和P1000移液器和枪头-20℃冰箱保存。将装有4天年龄细胞球体的ULA384孔板放在冰上。使用多通道移液器,从球状板上轻轻移出40μL/孔的生长培养基。对于该步骤,将尖端倾斜到U型底部孔的内壁,避免与孔的底部和球体的位置接触以最小化干扰球体。使用冰冷的吸头将基质胶转移到冰冷的试管中。对于药剂评估研究,先用含1%FBS的培养基配置药剂(药剂选自FDA上市及药典收录化合物库),使药剂浓度达到40μM,然后使用冰冷的吸头将20μL/孔基质胶添加到含药培养基(20μL/孔)中,轻轻旋转使其充分混合,避免形成气泡。将40μL含药基质胶轻轻地分配到U形底部的孔中(最终药剂的浓度为10μM),将尖端对准孔的内壁(这一步是最关键的,因为要获得最佳图像分析,必须将球体保留在孔的中心)。使用显微镜,目视检查球体是否在中心位置。如果不是,则在4℃下离心3min。然后分别于24h,48h及72h观察3D肿瘤球侵袭程度并拍照,使用Image J软件计算细胞侵袭面积,筛选出侵袭面积小于50%的肿瘤球状体对应的药剂。
图3为第一次筛选结果图,请参阅图3,第一次筛选从1987个化合物中筛选出87个化合物。
3、第二次筛选
经过第一次筛选出的化合物,进行第二系药物筛选。首先将500个PC3-KQ细胞每孔铺于ULA384孔板中,生长4天后,384孔板去掉40μL培养基,将不同浓度含药培养基(10、1、0.1、0.01、0.001、0μM)与基质胶混匀,然后沿着孔壁缓慢加入细胞球中,孵育48h后观察药物在不同浓度下抑制细胞球侵袭面积,筛选出侵袭面积小于70%的7个药剂。
图4和图5分别为第二次筛选的三维结果图及统计视图,本次筛选从87个化合物中筛选出7个化合物,分别为Furagin(呋喃菌素)、Retapamulin(瑞他帕林)、Ronidazole(罗硝唑)、Nitazoxanide(硝唑尼特)、Nifuratel(硝呋太尔)、Bortezomib(硼替佐米)、Mitomycin_C(丝裂霉素C)。
7个化合物中,Bortezomib(硼替佐米)和Mitomycin_C(丝裂霉素C),有文献披露其有明确的抗癌转移效果,在临床上也是批准抗癌的,因此不予考虑,考察其他5个化合物,图6为不同浓度下7个化合物中5个的抑制细胞球侵袭面积图,可以看出,相比于其他四种药物,Nitazoxanide(硝唑尼特)对于细胞球侵袭面积的增加抑制作用明显,且最低在1μM抑制作用明显。
3、IC50的测定
将6×103个/孔PC3-KQ细胞接种于96孔板,100μL/孔,置于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养24h,细胞贴壁后加入100μL含药培养基。细胞中加入药物的终浓度为0μmol/L、0.015μmol/L、0.045μmol/L、0.137μmol/L、0.41μmol/L、1.2μmol/L、3.7μmol/L、11.1μmol/L、33.3μmol/L、100μmol/L,同时设对照组(加入等量培养液)和空白调零组,每孔6个复孔,置于CO2培养箱中继续培养48h,吸去培养液,后每孔加入CCK8工作液100μL,培养箱孵育1.5h,将孔板置于酶标仪450nm处测量OD值。
以空白组调零,实验重复3次,计算细胞存活率,并得出IC50,其中,细胞存活率=(药物处理组OD值/对照组OD值)×100%。
请参阅表1,为5个化合物的IC50。
表1 5个化合物的IC50
IC50(μM) | |
Furagin | 27.93 |
Nifuratel | 18.89 |
Nitazoxanide | 5.518 |
Retapamulin | 12.17 |
Ronidazole | >100 |
可以看出,Nitazoxanide(硝唑尼特)的IC50最低,诱导能力最强。
实施例2前列腺癌骨转移模型建立
一、慢病毒感染构建荧光素酶细胞
1、探索puromycin(嘌呤霉素)的最适浓度
在筛选之前,需要摸索能够杀死空细胞的最低puromycin浓度:可将细胞铺板24孔板,每孔密度为5×104个细胞,24h后更换不同浓度puromycin的完全培养基,puromycin浓度可设置为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/mL处理48h,选取能够杀死90%以上空细胞的最低浓度进行后续实验。
2、慢病毒感染细胞
Day1:待细胞汇合度为80~90%,收集细胞铺于6孔板,每孔1.5×105个细胞;一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于30%~50%之间,铺板时不加抗生素;
Day2:感染细胞之前,从-80度冰箱取出病毒并在冰上慢慢融化,吸去细胞原有培养基,加入二分之一体积新鲜培养基(培养基可不含双抗和不含血清);
根据MOI值(multiplicity of infection,感染复数),加入病毒进行感染;每孔加病毒体积(μL)=MOI×细胞数/病毒滴度(TU/mL)×1000
需要加入Polybrane的细胞,可同时加入Polybrane(1:1000)
感染4h后用含血清培养基补足至完全培养体积;
Day3:感染后第二天(约24h),吸去含有病毒的培养液,换上新鲜的完全培养液,继续培养24h;
Day4:换上适当浓度puromycin的新鲜完全培养液,筛选稳定表达luc的细胞株;筛选时,需要设置未感染病毒的细胞对照实验组,并加入等量的浓度是2.0ug/mL的puromycin;
Day6:加puromycin 48h,观察对照组未转染细胞的死亡情况,若对照组组细胞死亡率达90%以上,撤掉puromycin换新鲜的培养基培养。
Puromycin筛选后,待细胞长满可适当比列传代培养,后面可用五分之一puromycin维持抗性。
二、小鼠前列腺癌骨转移模型的建立
细胞悬液制备:取汇合度为80~90%的PC3-KQ细胞,胰酶消化,完全培养基终止消化,1200rpm离心3min,弃上清。加一定量PBS制备成细胞悬液,混匀后细胞计数,按照1×106个/只小鼠准备细胞,稀释后制成细胞悬液,保存于冰上,待用。
尾动脉注射细胞:用2.5%Avertin(每10g注射120~150μL)对小鼠实行麻醉,待小鼠完全麻醉后,将小鼠腹部朝上放于无菌操作台上,用酒精棉球对其尾动脉进行消毒;从小鼠尾部三分之一处用胰岛素针迅速注射入100μL准备好的细胞悬液(1×106个),注射入动脉的时间要求小于3秒,旋转出针,然后用干的棉球按压注射点约1min,防止出血。
结果如图7、图8及图9所示,其中,图7为本发明实施例的NTZ(硝唑尼特)预防小鼠前列腺癌骨转移的模型设计图,在小鼠尾动脉接种PC3-KQ细胞后立即灌胃硝唑尼特治疗,Vehicle组给予1%甲基纤维素溶液,治疗组给予硝唑尼特(100mg/kg/day)治疗,然后每周进行小鼠活体成像和体重称量,连续给药5周,在给药终点行小鼠活体成像和micro-CT。图8为活体成像检验PC3-KQ-LUC构建的成功性检验图,为构建裸鼠骨转移模型,首先我们构建了稳定表达荧光素酶PC3-KQ-Luc细胞。对于小鼠骨转移预防模型,分别设置PC3-KQVehicle组,PC3-KQ nitazoxanide组。图9为活体成像检测NTZ预防前列腺癌骨转移效果图,在第35天时行小鼠活体成像,可以观察到PC3-KQ Vehicle组有明显生物发光,发光部位主要集中在小鼠下肢骨组织,可以看出,通过尾动脉注射成功建立骨转移模型。
实施例3硝唑尼特对前列腺癌骨转移的预防效果
一、小动物活体成像及microCT
小鼠体内活体成像:分别在注射PC3-KQ-LUC细胞后7天、14天、21天、28天、35天进行活体成像。具体操作如下:在成像前10min,启动活体成像系统,打开氧气开关和气体麻醉开关,然后对每组小鼠腹腔注射实验前准备好的荧光素酶底物(D-luciferin,SodiumSalt),D-荧光素工作液浓度为15mg/mL,每只小鼠的注射量取决于小鼠的体重:150mg/kg;注射入小鼠体内10min后,麻醉小鼠,进行成像分析。
此外,在注射PC3-KQ-LUC细胞后,立即给药硝唑尼特,给药方式为灌胃给药,每天一次,每次100mg/kg每只鼠,溶剂为1%CMC,给药量每只鼠100uL。
利用小动物活体成像系统检测癌细胞转移效果,每周观察1次,共观察6周。待实验结束,脱颈椎处死小鼠,行小动物microCT观察PC3-KQ细胞转移和骨组织破坏情况。
二、HE染色
(1)不同处理组小鼠颈椎脱臼处死后,分离股骨和胫骨,剪去周围多余的结缔组织和肌肉组织,固定于4%多聚甲醛中48h,之后用EDTA脱钙液脱钙14-21天;
(2)骨组织脱钙后,进行脱水,程序如下:
70%乙醇1h
80%乙醇1h
90%乙醇1h
95%乙醇1h
无水乙醇Ⅰ1h
无水乙醇Ⅱ1h
二甲苯Ⅰ1h
二甲苯Ⅱ1h
石蜡Ⅰ1h
石蜡Ⅱ1h
石蜡Ⅲ1.5h
(3)包埋:提前2h打开包埋机,预热融化石蜡;将包埋盒浸泡在液体石蜡中备用,不锈钢包埋盒底模放于另外一边石蜡中,取一不锈钢底模置于台上,挤入1/3的石蜡,然后将组织块放在中央;随后将载有组织的不锈钢底模具于冰冻台上,待其凝固变白,再次置于加热台上挤出石蜡至覆盖组织,取包埋盒地板于不锈钢模具上,再加入液体石蜡至超过底板高度,置于冷冻台上冷却,当石蜡块冷冻至可轻轻从模具中抠出蜡块时,抠出组织蜡块,然后通过包埋机加热台修去蜡块四周多去的石蜡。
(4)切片:预先将骨组织蜡块埋入冰里,然后在4℃冰箱内冷冻过夜以利于切片。从冰箱内取出蜡块,使用切片机对组织蜡块进行纵切,切片厚度为4μm。用42℃温水摊片,使切好的组织充分展开,随后固定于阳离子防脱玻片上。
(5)烤片:将组织切片放入62℃烤箱中烘片,时间为2~3h。
(6)脱蜡:程序如下:
二甲苯Ⅰ10min
二甲苯Ⅱ10min
二甲苯Ⅲ10min
二甲苯Ⅳ10min
无水乙醇Ⅰ10min
无水乙醇Ⅱ10min
95%乙醇10min
85%乙醇10min
75%乙醇10min
H2O 5min
(7)染色:苏木素染色1.5min,流水冲洗1min直至染色槽无色,PBS浸泡;5%醋酸分化3s,分化掉非特异性组织染色;流水冲洗一遍后,PBS浸泡,显微镜下观察染色效果,以核为天蓝色为宜;
(8)伊红染液染色2~3min;自来水快速洗2遍;
(9)梯度乙醇脱水:切片经75%乙醇20s,85%乙醇20s,95%乙醇20s,100%乙醇10min,然后镜下观察伊红染色结果;接着继续100%乙醇10min,二甲苯10min2次。
(10)封片:上述处理好的盖玻片,取中性树胶滴入载玻片的组织上,取盖玻片从一端逐步盖下去,避免发生气泡。
结果如图9,图10,图11,图12及图13所示,其中,图9为活体成像检测NTZ预防前列腺癌骨转移效果图,在第35天时,PC3-KQ Vehicle组生物发光显著,而NTZ组生物发光减弱。图10为本发明实施例的生物发光分析图,通过统计分析,NTZ组与Vehicle相比,生物发光值明显降低,具有显著差异性(P<0.05)。图11为本发明实施例的Micro-CT检测NTZ抗前列腺癌骨转移效果图,在第35天时,分别对PC3-KQ Vehicle组和PC3-KQ nitazoxanide组行micro-CT和小鼠活体成像。如图11所示,在PC3-KQ Vehicle组可观察到裸鼠股骨远端和胫骨近端出现破骨行为,而硝唑尼特给药组没有观察到明显的破骨行为。图12为本发明实施例的在给药期间NTZ对小鼠体重影响图,在给药周期内(0~35天),我们对各组裸鼠进行了体重称量,每周称量一次,结果发现对照组和给药组小鼠体重随着年龄增加而增加,没有下降的趋势,这说明硝唑尼特对小鼠无明显毒性。图13为本发明实施例的HE染色分析NTZ对癌细胞转移骨组织影响图,Vehicle骨组织有明显的癌细胞侵袭,而NTZ组很少有癌细胞的侵袭。以上结果可以看出,在尾动脉注射细胞的第一天开始给予药物硝唑尼特,连续给药35天,在第35天行活体成像和microCT发现,硝唑尼特能明显预防前列腺癌细胞转移至骨组织,并且对照组和给药组体重无明显变化,都随着时间推移而增长。HE染色发现,硝唑尼特给药组骨组织几乎没有发现癌细胞侵入,而对照组癌细胞明显侵入骨组织。
综上所述,本发明提出的预防前列腺癌的药剂的筛选方法,筛选出了新的能够预防前列腺疾病的药剂,筛选出的硝唑尼特,能够有效预防前列腺癌骨转移,且硝唑尼特是FDA批准的药物,其药物安全性已被验证;硝唑尼特可从植物和动物来源大量获得,获取成本低,能够代替现有的药物,广泛应用于前列腺癌的预防中。
以上仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (6)
1.一种预防前列腺癌的药剂的筛选方法,其特征在于,包括以下步骤:
S10、将前列腺癌细胞进行3D细胞培养,得肿瘤球状体;
S20、将待筛选药剂配制成浓度为10μM的溶液,用所述溶液对所述肿瘤球状体进行细胞侵袭实验,并计算所述肿瘤球状体的侵袭面积,筛选出侵袭面积小于50%的肿瘤球状体对应的药剂,其中,所述待筛选药剂选自FDA上市及药典收录化合物库;
S30、将筛选出的所述药剂配制成0~10μM的多个不同浓度梯度的溶液,并分别加入肿瘤球状体中培养后,计算所述肿瘤球状体的侵袭面积,筛选出侵袭面积小于70%的7个药剂;
S40、测定所述7个药剂中至少部分药剂的IC50,筛选出IC50值小于28μM的药剂,即为预防前列腺癌的药剂。
2.如权利要求1所述的预防前列腺癌的药剂的筛选方法,其特征在于,步骤S10包括:
S11、用前列腺癌细胞PC3和连接体K369Q,构建前列腺癌高转移PC3-KQ细胞;
S12、将所述前列腺癌高转移PC3-KQ细胞进行3D细胞培养,得肿瘤球状体。
3.如权利要求1所述的预防前列腺癌的药剂的筛选方法,其特征在于,所述预防前列腺癌的药剂包括呋喃菌素、硝呋太尔、硝唑尼特和瑞他帕林。
4.硝唑尼特在制备预防前列腺疾病的药物中的应用。
5.硝唑尼特在制备预防前列腺癌的药物中的应用。
6.硝唑尼特在制备预防前列腺癌骨转移的药物中的应用。
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