CN101011380A - 塔斯品碱用于制备抑制肿瘤血管生成药物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了塔斯品碱用于制备抑制肿瘤血管生成药物的应用，给出了塔斯品碱抗肿瘤作用的鸡胚尿囊膜非小细胞肺腺癌A549肿瘤移植瘤模型的建立方法。采用该实验模型，运用ELISA、免疫蛋白印记和Real Time RCR实验方法分别考察了塔斯品碱对CAM血管结构、肿瘤组织的生长情况、形态学变化及肿瘤组织内新生血管分布情况的影响，以及对VEGF、bFGF的蛋白表达、VEGF受体flt－1和flk－1/KDR的基因表达、AKT和Erk1/2的蛋白表达及其磷酸化水平的影响。证明了塔斯品碱有抑制肿瘤血管生成的作用。表明塔斯品碱具有明显的抗肿瘤血管生成的药理作用，能够作为制备用于治疗肿瘤疾病的潜在抗血管生成药物。

Description

塔斯品碱用于制备抑制肿瘤血管生成药物的应用

技术领域

本发明属于化合物药理作用和分子生物技术领域，具体涉塔斯品碱用于制备抑制肿瘤血管生成药物的应用。

背景技术

血管生成(angiogenesis)是指在原有的血管床上再生成新的血管，是一个复杂的多因素过程。血管生成在肿瘤的发生和转移过程中是必不可少的，研究发现一系列癌基因、肿瘤抑制基因及生长因子等在肿瘤血管生成中起重要调控作用。肿瘤血管生成表型的启动或转换取决于血管生成因子及其抑制因子的平衡和协调作用，由复杂的蛋白水解平衡系统来完成内皮细胞的游走、侵袭及增殖等过程，最终形成肿瘤新血管。阻断血管生成是一种新的治疗肿瘤的手段和途径。

血管生成模型的建立是筛选抗血管生成药物的前提，其中鸡胚尿囊膜(Chicken chorioallantoic membrane，CAM)模型因其简单、实用而被广泛地应用。利用CAM模型建立肿瘤移植瘤模型则是研究肿瘤血管生长机制必要的关键性步骤，因而有着十分重要的意义。

植入体内的实体肿瘤组织能吸引或诱发血管生成，实体肿瘤分泌一些可溶性血管生成因子，这些因子弥散于组织周围，诱导内皮细胞趋向性游走和增殖。体内实验研究发现，大多数因子具有诱导CAM血管生成的作用特性。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是第一个被发现并分离的、具有诱导内皮细胞增殖、体内具有血管生成作用活性的血管生成因子。血管内皮细胞生长因子(VEGF)具有血管生长因子所应具备的全部特性，已研究发现，VEGF具有诱导血管通透性增加，促进血管内皮细胞(HUVEC)增殖，诱导内皮细胞形成毛细血管及鸡胚尿囊膜血管生成的作用。目前，已分离出两种体外培养内皮细胞和胚胎发育过程中表达的VEGF受体，即Flt-1(VEGFR-1)和Flk-1/KDR(VEGFR-2)。研究证据提示，Flk-1/KDR与内皮细胞对VEGF的增生反应有关。

目前，研制血管生成抑制剂来阻断肿瘤新生血管的形成已是控制肿瘤生长和转移的关键措施之一，但血管生成抑制剂的研究都处于基础研究和临床研究阶段，除生物制剂Avastin外还没有肿瘤血管生成抑制剂药物面市。

塔斯品碱是一种阿朴菲类生物碱，其制备方法与在肿瘤治疗中的应用已申请发明专利，但根据申请人的资料检索，至今未发现塔斯品碱用于制备抑制肿瘤血管生成药物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供塔斯品碱用于制备抑制肿瘤血管生成药物的应用，为塔斯品碱制备抑制肿瘤血管生成药物提供实验依据。

为了实现上述任务，发明人利用鸡胚尿囊膜血管生成模型为基础建立了非小细胞肺腺癌A549肿瘤移植瘤模型，并考察塔斯品碱对肿瘤血管生成的抑制作用；ELISA实验中，观察塔斯品碱对VEGF、bFGF表达的影响；WesternBlotting实验中，观察塔斯品碱对AKT和Erk1/2表达及其磷酸化水平的影响；实时荧光定量RT-PCR实验中，观察塔斯品碱对血管内皮细胞生长因子受体flt-1和flk-1/KDR基因表达的影响。结果证明了塔斯品碱抗肿瘤的药理作用为抑制肿瘤血管生成，抗血管生成的作用方式为抑制VEGF、bFGF蛋白表达和VEGF受体flk-1/KDR的基因表达，以及降低AKT的表达和Erk1/2的磷酸化水平。

附图说明

图1是鸡胚尿囊膜A549移植瘤生长曲线。

图2是肿瘤诱发CAM血管生长。

图3是塔斯品碱对HUVEC细胞分泌VEGF、bFGF蛋白表达的影响。

图4是塔斯品碱对A549细胞分泌VEGF、bFGF蛋白表达的影响。

图5是塔斯品碱对SKOV3细胞分泌VEGF、bFGF蛋白表达的影响。

图6是塔斯品碱对HUVEC Akt及p-Akt蛋白表达的影响。

图7是塔斯品碱对HUVEC Erk1/2及p-Erk1/2蛋白表达的影响。

图8是塔斯品碱对HUVEC细胞分泌flt-1、flk-1/KDR基因表达的影响。

图9是塔斯品碱对A549细胞分泌flt-1、flk-1/KDR基因表达的影响。

图10是塔斯品碱对SKOV3细胞分泌的flt-1、flk-1/KDR基因表达的影响。

以下结合附图和发明人给出的研究塔斯品碱抗肿瘤作用方式的鸡胚尿囊膜移植瘤模型与实验方法对本发明作进一步详细说明。

具体实施方式

 一、鸡胚尿囊膜肿瘤移植瘤模型的建立

1.仪器与材料

解剖显微镜(上海光学仪器六厂)；CO₂恒温培养箱(SANYOMCO-17AC，日本)；超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)。

2.实验方法

2.1 CAM模型制备

取受精蛋用温水清洗2次后，于1∶1000苯扎溴铵溶液中浸泡5min，然后在温度37.8±0.2℃，湿度40％～60％的培养箱中进行孵育。在孵育的第6天，酒精消毒蛋壳表面2×3cm区域，用牙科钻在蛋壳表面划刻出凹痕，拨去鸡蛋外壳和壳膜，轻轻撕掉内壳膜，此时该处CAM下陷，形成假气室。

用无菌封口膜封贴假气室，形成透明观察窗，可供观察和加药操作。

2.1肿瘤细胞接种

制备假气室后的鸡胚继续放入培养箱中，24h后轻轻撕开无菌封口膜，选择CAM相对无血管区接种对数生长期A549细胞，每个鸡胚1×10⁷·20μL^-1，接种后立即用无菌封口膜封好放入培养箱中。接种24h后观察肿瘤生长情况，并分别于第2、3、4、5、6、7、8、9天计算肿瘤体积。

2.3血管形成观察

肿瘤细胞接种48h后，在肿瘤部位分别加入1、3、6μg/egg塔斯品碱，给药载体为硅胶环或甲基纤维素。24h后取部分标本揭开封口膜，向开窗处的CAM上加甲醇、丙酮混合液(比例为1∶1)固定15min，剪下长有肿瘤组织的鸡胚尿囊膜，放于盛有水的平皿中展开，阴干后封片照相观察。其余标本，取给药部位CAM，4％多聚甲醛固定。常规切片，HE染色，免疫组化染色测定CD34、VEGF蛋白表达，光镜下观察CAM血管结构和肿瘤组织的生长情况、形态学变化及肿瘤组织内新生血管分布情况。

2.4统计学处理方法

数据用均数±标准差(mean±SD)表示，方差分析进行统计学检验，显著性水平P＜0.05。图表绘制应用SPSS 10.0软件。

3实验结果

结果表明，每胚以1×10⁷·20μL^-1细胞数量接种后可以长成肿瘤组织，肿瘤的体积随着时间增加而增长(见图1)。与对照比较发现，瘤体在CAM上能够诱导血管呈放射状生长(见图2)并且增加血管生长的速度和数量。塔斯品碱可以抑制CAM肿瘤移植瘤的增长，降低肿瘤组织内的微血管密度、血管内皮细胞数量和血管内皮细胞生长因子的表达(见表1)。

表1塔斯品碱对鸡胚尿囊膜肿瘤移植瘤微血管密度和蛋白表达的影响

组别	对照组	TAS小剂量组	TAS中剂量组	TAS大剂量组
					剂量(μg/egg)	--	1	3	6
微血管密度(条)	21.5±3.00	14.5±4.51*	11.25±3.20**	8.75±2.22**

CD34表达	33.75±3.85	21.5±0.81**	14.00±1.63**	9.5±2.45**
					VEGF表达	16.50±2.94	10.00±4.32*	4.75±2.65**	3.00±2.16**

注：与对照组比较，^*P＜0.05 ^**P＜0.01

二、塔斯品碱抑制肿瘤血管生成的作用研究

1.仪器

电泳仪(Bio-RAD，美国)；酶标仪(BIO-BAD，美国)；96孔实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，美国)

2.实验方法

2.1塔斯品碱对HUVEC、A549、SKOV3细胞分泌VEGF、bFGF蛋白表达的影响。

取对数生长期的HUVEC、A549、SKOV3细胞，以每瓶1×10⁶接种于25ml的培养瓶中，在10％新生牛血清的RPMI 1640培养基中培养24h，换无血清的培养基继续培养24h，然后分对照组、塔斯品碱组(0.03，0.06，0.12，0.24，0.48μg/mL)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。分别收集细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书进行操作，在490nm波长下测定吸光度，测定上清液中的VEGF、bFGF蛋白含量。

2.2塔斯品碱对HUVEC Akt、磷酸化Akt、Erk1/2、磷酸化Erk1/2蛋白表达的影响。

取对数生长期的HUVEC细胞，以每瓶1×10⁶接种于25ml的培养瓶中，在10％新生牛血清的RPMI 1640培养基中培养24h，换无血清的培养基继续培养24h，然后分对照组、塔斯品碱组(0.4μg/mL)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养0、0.5、3、6、12、24、48h。裂解细胞提取蛋白，每组取30μg蛋白行SDS-PAGE。转膜、封闭后，用小鼠抗人Akt(1∶1000)、小鼠抗人磷酸化Akt(1∶1000)，兔抗人Erk1/2(1∶1000)，兔抗人磷酸化Erk1/2(1∶1000)，兔抗人β-action(1∶1000)，37℃孵育2h。洗膜后加入相应的HRP二抗  (1∶1000)，37℃孵育2h，洗膜后ECL发光显色，图像分析系统分析。以各组条带OD值与对应的β-action组条带OD值的比值来计算目标蛋白的表达量。

2.3塔斯品碱对HUVEC、A549、SKOV3细胞分泌flt-1、flk-1/KDR基因表达的影响。

取对数生长期的HUVEC细胞，以每瓶1×10⁶接种于25ml的培养瓶中，在10％新生牛血清的RPMI 1640培养基中培养24h，换无血清的培养基继续培养24h，然后分对照组、塔斯品碱组(0.03，0.06，0.12，0.24，0.48μg/mL)，在37℃，5％CO₂培养箱中培养24h。去除培养液，用TRIZOL法提取mRNA，进行RT-PCR反应。合成cDNA后进行Real Time RCR反应进行含量测定。

引物为：

Human GAPDH

sense：5-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3，

antisense：5-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3；

Human FLT1

sense：5-TGAGTGATGTTGAGGAAGAGG-3，

antisense：5-CCAGGTCCCGATGAATGC-3；

Human FLK-1/KDR

sense：5-CTGTATGGAGGAGGAGGAAG-3，

antisense：5-CCGTCTGGTTGTCATCTGG-3。

3.实验结果

塔斯品碱能够抑制HUVEC、A549、SKOV3细胞分泌的VEGF、bFGF蛋白表达(见图3，4，5)，降低HUVEC Akt、磷酸化Erk1/2的蛋白表达(见图6，7)，抑制HUVEC、A549、SKOV3细胞分泌的flk-1/KDR的基因表达(见图8，9，10)。

三、结论

1.A549细胞以1×10⁷·20μL^-1数量接种后在鸡胚尿囊膜上可以长成肿瘤组织，肿瘤体积随着时间增加而增长。瘤体能够改变CAM血管生长体系，表现出诱导血管呈放射状生长，加快血管生长的速度，增加血管数量，因此该模型可以作为研究抑制血管生成药物的主要方法。

2.塔斯品碱可以抑制CAM A549肿瘤移植瘤的增长，降低肿瘤组织内的微血管密度、血管内皮细胞数量和血管内皮细胞生长因子的表达。

3.塔斯品碱明显抑制血管内皮细胞、肿瘤细胞中VEGF、bFGF的蛋白表达和VEGF受体flk-1/KDR的基因表达，以及降低血管内皮细胞AKT蛋白表达和Erk1/2的磷酸化水平。

通过塔斯品碱抗肿瘤作用研究，进一步表明其能够用于制备抗肿瘤药物的应用。

Claims (4)

1.塔斯品碱用于制备抑制肿瘤血管生成药物的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，以鸡胚尿囊膜非小细胞肿腺癌A549肿瘤移植瘤模型考察塔斯品碱抑制CAM A549肿瘤移植瘤的增长，降低肿瘤组织内的微血管密度、血管内皮细胞数量和血管内皮细胞生长因子的表达。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述鸡胚尿囊膜非小细胞肺腺癌A549肿瘤移植瘤模型的建立包括下列步骤：

第一步，接种的鸡胚尿囊膜在孵育的第6-8天之间；

第二步，取20μL以上的A549细胞悬液，其中A549细胞浓度为1×10⁷/mL以上，接种在鸡胚尿囊膜表面相对无血管区；

第三步，接种的细胞在尿囊膜上必须成一个液滴，不能扩散开，以保证接种区域的细胞数量满足成瘤的需要；

第四步，接种24小时后观察肿瘤瘤体生长情况，并于接种后第2天在肿瘤部位加入塔斯品碱，给药载体为硅胶环或甲基纤维素，并分别于第2、3、4、5、6、7、8、9天计算肿瘤体积，制作肿瘤生长曲线；

第五步，通过对肿瘤进行切片，HE，免疫组化染色测定CD34、VEGF蛋白表达实验，确定塔斯品碱对CAM血管结构和肿瘤组织的生长情况、形态学变化及肿瘤区内部新生血管分布情况的影响。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的塔斯品碱对于抑制肿瘤血管生成的作用方式为：

A.抑制血管内皮细胞、A549和SKOV3细胞分泌的VEGF、bFGF蛋白表达；

B.抑制血管内皮细胞Akt和磷酸化Erk1/2的蛋白表达；

C.抑制血管内皮细胞、A549和SKOV3细胞分泌的flk-1/KDR的基因表达。

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