CN104958306B - 化合物Hu‑17单独或联合铂类药物在制备治疗卵巢癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开化合物Hu‑17单独或联合铂类药物在制备治疗卵巢癌药物中的应用，为卵巢癌患者特别是耐药复发的卵巢癌患者提供了新的治疗方案，该治疗方案能克服含有P53突变或缺失的患者对铂类药物产生的耐药；本发明的药效作用机制清楚，实施的可行性较高，给耐药复发的卵巢癌患者带来新的治愈希望，具有很大的社会意义和应用价值。

Description

化合物Hu-17单独或联合铂类药物在制备治疗卵巢癌药物中 的应用

技术领域

本发明属于医药生物领域，更具体地讲，本发明涉及化合物Hu-17单独或联合铂类药物在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

背景技术

卵巢癌是一种严重威胁女性健康的恶性肿瘤，发病率位于妇科恶性肿瘤第三位，死亡率高居妇科恶性肿瘤第一位(Agarwal R,Kaye SB.Nat Rev Cancer,2003,3(7):502-516.)。卵巢癌的发生也是与激素水平密切相关的。尽管过去二十年卵巢癌的治疗得到很大的改善，但是当前其5年生存率仍然不超过30％(Bast RC,Hennessy B,Mills GB.NatureReviews Cancer,2009,9(6):415-428.)。临床上治疗卵巢癌采用的是手术切除并辅助化疗的综合治疗方法，紫杉醇与顺铂(或卡铂)联合化疗是卵巢癌治疗的标本化疗方案(JelovacD,Armstrong DK.CA Cancer J Clin,2011,61(3):183-203.)。

顺铂进入细胞后能与DNA、RNA以及蛋白结合，它的细胞毒性来源于与DNA结合后形成的DNA加合物，加合物的形成引起DNA损伤并激活下游一系列信号通路最终诱导肿瘤细胞凋亡或坏死。目前关于顺铂诱导细胞凋亡的确切机制还不完全清楚，但有研究表明顺铂介导的c-Abl和JNK/SAPK通路的激活参与了顺铂诱导的凋亡信号通路(Nehmé A,Baskaran R,Aebi S,et al.Cancer research,1997,57(15):3253-3257.)；此外，顺铂引起的DNA断裂能诱导P53的产生并激活凋亡的内源通路(Niedner H,Christen R,Lin X,et al.Molecularpharmacology,2001,60(6):1153-1160.)。紫杉醇的药效作用机制主要是它能与细胞内的微管蛋白(tubulin)结合，稳定了微管结构进而导致细胞发生G2/M期阻滞最终诱导细胞发生凋亡(Wang LG,Liu XM,Kreis W,et al.Cancer chemotherapy and pharmacology,1999,44(5):355-361.)。铂类药物(顺铂或卡铂)与紫杉醇药物的联合化疗在卵巢癌的治疗初期取得了较好的疗效(Covens A,Carey M,Bryson P,et al.Gynecol Oncol,2002,85(1):71-80.)，80％的卵巢癌患者对联合化疗有反应，但患者中位无进展生存期仍仅有18个月，并且20％-30％的卵巢癌患者对初始的联合化疗治疗无显著疗效(Judson PL,WatsonJM,Gehrig PA,et al.Cancer research,1999,59(10):2425-2432.)。

当前，对顺铂和紫杉醇的耐药机制已有大量研究和报道。顺铂的耐药机制主要包括：减弱的肿瘤血管流动、细胞外基质的影响、细胞内顺铂含量积累的减少(吸收减少或外泵增加、细胞内谷胱甘肽的减毒作用、增加的DNA修复、增强的DNA损伤耐受、促凋亡因子的减少、热休克蛋白含量的增加以及细胞信号通路的改变(Stewart DJ.Crit Rev OncolHematol,2007,63(1):12-31.)。顺铂与DNA结合能激活碱基错配修复通路，该通路的激活能启动顺铂引起的细胞凋亡，有研究报道错配修复机制发生缺陷与顺铂耐药密切相关(LinX,Howell SB.Molecular pharmacology,1999,56(2):390-395.)。P53作为抑癌基因，在肿瘤发生和发展过程中扮演重要的角色，DNA损伤时，P53被诱导表达进而引起细胞周期阻滞或诱导损伤的细胞发生凋亡。临床数据显示，60％-80％的卵巢癌中含有P53的突变或缺失(Bast RC,Hennessy B,Mills GB.Nature Reviews Cancer,2009,9(6):415-428.)，而P53的缺失或突变均能引起顺铂耐药(Perego P,Giarola M,Righetti SC,et al.Cancerresearch,1996,56(3):556-562.)。还有研究报道，在顺铂耐药卵巢癌细胞中，顺铂诱导的JNK激活以及P38激酶的活化均明显下降，刺激JNK通路能激活c-Jun使耐药细胞对顺铂敏感，说明削弱的JNK/c-Jun通路与顺铂的耐药相关(Brozovic A,Fritz G,Christmann M,etal.International journal of cancer,2004,112(6):974-985.)。

对于一线治疗方案失败的患者，拓扑替康、阿霉素、依托泊苷以及吉西他滨等作为二线治疗药物被用于耐药的卵巢癌患者的治疗(Markman M,Bookman MA.Oncologist,2000,5(1):26-35.)。

铂类药物(顺铂或卡铂)清除卵巢癌细胞的作用机制主要是通过P53及JNK等分子发挥作用，临床资料显示，约60％-80％的卵巢癌患者含有P53基因的突变或缺失，该基因的突变或缺失直接削弱了以铂类为基础的化疗疗效；另外，还有约30％的卵巢癌患者对铂类药物与紫杉醇类药物结合的治疗方法不敏感；同时，常规治疗方法在有效剂量范围内对机体能造成较大的伤害，如顺铂引起的较强的肾毒性和耳毒性。耐药复发问题是肿瘤治疗中常发生的问题，基于当前的治疗药物对耐药复发的卵巢癌的治疗效果并不显著，研发新型的化合物，特别是针对耐药复发的卵巢癌的药物仍然是医药卫生领域急需解决的问题。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供化合物Hu-17在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

本发明的第二个目的在于提供化合物Hu-17与铂类药物联合用药在制备治疗卵巢癌药物中的应用。

本发明的第三个目的在于提供化合物Hu-17在制备血管生成相关因子和金属蛋白酶抑制剂中的应用。

本发明的第四个目的在于提供化合物Hu-17与铂类药物联合用药在制备血管生成相关因子和金属蛋白酶抑制剂中的应用。

本发明的第五个目的在于提供化合物Hu-17在制备性激素抑制剂中的应用。

为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：化合物Hu-17在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述Hu-17分子式：C₆₃H₉₆N₄O₁₁，化学结构式如下：

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：化合物Hu-17与铂类药物联合用药在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述铂类是指顺铂或卡铂，所述Hu-17分子式：C₆₃H₉₆N₄O₁₁，化学结构式如下：

为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：化合物Hu-17在制备血管生成相关因子和金属蛋白酶抑制剂中的应用，所述血管生成相关因子和金属蛋白酶包括VEGFα、PDGFα、EGF-2和MMP2，所述Hu-17分子式：C₆₃H₉₆N₄O₁₁，化学结构式如下：

为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案：化合物Hu-17与铂类药物联合用药在制备血管生成相关因子和金属蛋白酶抑制剂中的应用，所述铂类是指顺铂或卡铂，所述血管生成相关因子和金属蛋白酶包括VEGFα、PDGFα、EGF-2和MMP2，所述Hu-17分子式：C₆₃H₉₆N₄O₁₁，化学结构式如下：

为实现本发明第五个目的，本发明公开以下技术方案：化合物Hu-17在制备性激素抑制剂中的应用，所述Hu-17分子式：C₆₃H₉₆N₄O₁₁，化学结构式如下：

作为一个优选方案，所述性激素为孕酮和雌激素。

本发明的优点在于：本发明提供化合物Hu-17单独或联合铂类药物(顺铂或卡铂)在制备治疗卵巢癌药物中的应用，为卵巢癌患者特别是耐药复发的卵巢癌患者提供了新的治疗方案，该治疗方案能克服含有P53突变或缺失的患者对铂类药物产生的耐药；本发明的药效作用机制清楚，实施的可行性较高，给耐药复发的卵巢癌患者带来新的治愈希望，具有很大的社会意义和应用价值。

附图说明

图1化合物Hu-17抑制卵巢癌细胞：A)化合物Hu-17(1.25μM、2.5μM、3.75μM、5μM)处理A2780细胞24、48和72小时；B)化合物Hu-17(2.5μM、3.75μM、5μM)处理HO-8910细胞24、48和72小时；C)化合物Hu-17(2.5μM、3.75μM、5μM)处理HO-8910PM细胞24、48和72小时；D)化合物Hu-17(2.5μM、3.75μM、5μM)处理SK-OV-3细胞24、48和72小时。MTT比色法检测细胞相对活力，计算细胞生长抑制情况。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均值±标准差(mean±SD)展示。

图2化合物Hu-17能显著诱导卵巢癌细胞凋亡：A)(a)化合物Hu-17(2.5μM、3.75μM)处理A2780和SK-OV-3细胞42小时流式细胞仪检测的Annexin V阳性细胞(统计二四象限比例之和)的比例，(b)候选药物(3.75μM、5μM、6.25μM)处理HO-8910和HO-8910PM细胞48小时检测的Annexin V阳性细胞比例。B)选取的HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞在不同药物浓度处理后的凋亡散点图，横坐标代表FITC-Annexin V，纵坐标代表PI，红色散点(即第三象限)代表活细胞，蓝色散点(即第二象限)代表晚期凋亡的细胞，绿色散点(即第四象限)代表早期凋亡的细胞。C)5μM候选药物(Hu-17)处理HO-8910PM细胞48小时线粒体跨膜电位降低的细胞比例。D)线粒体跨膜电位变化的散点图，图中横坐标为Rh123，纵坐标为PI，第四象限表示罗丹明123阳性细胞，一三象限表示膜电位降低的细胞。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用双侧t检验法，其中**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图3化合物Hu-17扰乱卵巢癌细胞周期：A)(a)A2780细胞经候选药物(2.5μM)处理48小时后各周期比例的柱状图。(b)HO-8910细胞经候选药物(3.75μM)处理48小时候后各周期比例的柱状图。(c)HO-8910PM细胞经候选药物(3.75μM)处理48小时候后各周期比例的柱状图。B)A2780、HO-8910、HO-8910PM细胞加药前后的周期分布图，图中蓝色部分代表处于S期的细胞，其左右两侧红色部分分别代表处于G0/G1期和G2/M期的细胞。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用双侧t检验法，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示无统计学显著性差异。

图4化合物Hu-17在荷瘤小鼠上显著抑制卵巢癌细胞的生长：A)在裸鼠皮下移植A2780细胞2周后给药(腹腔注射给药，三天两次，5mg/kg/次)并动态监测肿瘤直径，通过公式V＝1/2×a×b2计算出肿瘤体积，并得出相对肿瘤体积(RTV＝Vt/V0，Vt表示实时测量的肿瘤体积，V0表示给药前肿瘤体积)，绘制肿瘤生长曲线，Candidate表示候选新药组，Control表示阴性对照组。B)给药结束3天后(Day31)，脱颈处死裸鼠，将两组瘤体剥离后称得的瘤重。C)给药期间动态监测裸鼠体重的变化绘制成的体重变化曲线。图中数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用t检验法，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，ns表示无统计学显著性差异。D)两组瘤体剥离后的照片。

图5体外实验证实化合物Hu-17显著增强顺铂对耐药的卵巢癌细胞的生长抑制和诱导凋亡效果：A)A2780、HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞经10μM和20μM的顺铂处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。B)HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞经20μM顺铂或2.5μMHu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。C)Western blot法检测HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞的蛋白P53的表达。D)流式技术检测HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞经20μM顺铂或2.5μM Hu-17单独或联合处理48小时后的凋亡细胞的比例，凋亡细胞以Annexin V阳性细胞的比例显示(统计二四象限)。E)SK-OV-3细胞在20μM顺铂或2.5μM Hu-17处理48小时后的凋亡散点图。F)SK-OV-3细胞在2.5μM Hu-17或20μM顺铂处理12小时后，抽提蛋白检测凋亡指示分子PARP及caspase 3的变化。G)HO-8910细胞经200μM卡铂(Carboplatin)或5μM Hu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。H)SK-OV-3细胞经80μM卡铂或5μM Hu-17单独或联合处理48小时，MTT法检测相对细胞活力。M表示候选新药，M+C(combination)表示候选新药与顺铂联合使用。M+carboplatin表示候选新药与卡铂联合使用。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用双侧t检验法，其中**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图6裸鼠体内实验显示Hu-17与顺铂联合使用显著抑制耐药的卵巢癌细胞的生长：A)裸鼠皮下移植SK-OV-3细胞第13天开始用药，期间动态监测肿瘤大小，通过公示V＝1/2×a×b2和RTV＝V_t/V₀分别计算肿瘤体积和相对肿瘤体积，绘制肿瘤生长曲线(图a和图c)，图b和图d显示的是最后一次给药时的肿瘤的体积和相对肿瘤体积。B)用药结束后，将各组瘤体剥离得到的瘤体照片及各组瘤重。C)用药期间各组裸鼠体重的变化。D)和E)瘤体剥离后，免疫组织化学方法检测各组肿瘤组织中Ki-67(20X物镜)和CD34(10X物镜)的表达情况，图D柱状图展示Ki-67阳性细胞的倍数变化(各组取三张不同的组织切片分别计数)。图中数据以平均数±标准误(mean±SEM)展示，M表示单用候选新药组，Cis表示单用顺铂组，M+Cis表示两药合用组，组间比较采用双侧t检验法，其中*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，ns表示无统计学差异。

图7化合物Hu-17与顺铂联合使用能下调AKT-mTOR信号通路以及激活JNK/c-Jun信号通路：A)Hu-17(2.5μM)和顺铂(20μM)作用于HO-8910PM和SK-OV-3细胞42小时，收集细胞裂解抽提总蛋白，检测p-mTOR、p-AKT以及XIAP的变化。B)2.5μM的Hu-17(M5)和20μM的顺铂(Cis20)分别处理HO-8910PM和SK-OV-3细胞6小时，以活性氧检测方法处理细胞并于流式细胞仪上检测胞内活性氧的含量。C)Hu-17(2.5μM)和顺铂(20μM)单独或联合处理HO-8910PM和SK-OV-3细胞12小时或15小时，蛋白免疫印迹(图a)以及荧光定量PCR(图b)的方法检测JNK和c-Jun的变化。柱状图数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，各组实验独立重复三次。

图8化合物Hu-17通过ROS-JNK-c-Jun通路增强顺铂对卵巢癌的细胞毒效应：A)(a)2.5μM候选新药处理HO-8910PM细胞(3小时、6小时、9小时)，以活性氧检测方法处理细胞并于流式细胞仪上检测胞内活性氧的含量。(b)、(c)2.5μM候选新药处理HO-8910PM和SK-OV-3细胞，NAC(10mM)能降低候选新药诱导细胞产生的活性氧。(d)、(e)活性氧清除剂NAC(10mM)能降低联合用药方案诱导细胞产生的活性氧。B)联合用药(2.5μM候选新药和20μM顺铂)处理细胞前，先以10mM NAC处理HO-8910和SK-OV-3细胞1小时，加药处理12小时后，抽提细胞总蛋白检测p-JNK、c-Jun以及p-c-Jun的含量。C)处理方法同(B)，药物处理48小时后，MTT法检测相对细胞活力。(b)以10mM NAC(提前1小时处理)和不同浓度的候选新药(2.5μM、5μM)处理HO-8910PM和SK-OV-3细胞48小时，MTT法检测细胞活力。(c)20pM寡聚核苷酸(siRNA)lipofectamine法转染HO-8910PM细胞36小时，再以2.5μM候选新药和20μM顺铂共同处理转染后的细胞48小时，MTT法检测细胞活力(NC为阴性对照组)。各组实验均独立重复三次，直方图数据以平均数±标准差(mean±SD)展示，组间比较采用双侧t检验法，其中**表示P<0.01，***表示P<0.001。

图9化合物Hu-17及其与顺铂联合使用能显著抑制与血管生成相关基因的表达：2.5μM候选新药和20μM顺铂单独或联合处理HO-8910PM细胞24小时或SK-OV-3细胞15小时，抽提细胞RNA，通过实时荧光定量PCR检测VEGFα、PDGFα、EGF-2和MMP2的表达。B)2.5μM或5μM候选新药处理HO-8010PM细胞24小时，抽提细胞RNA，实时荧光定量PCR检测VEGFα、PDGFα、EGF-2和MMP2的表达。

图10化合物Hu-17及其与顺铂联合作用于顺铂耐药细胞SK-OV-3的表达谱变化特征：A)2.5μM Hu-17和20μM顺铂单独或联合处理SK-OV-3细胞6h，12h，24h后抽提细胞RNA并通过基因芯片技术检测药物处理前后表达谱变化特征，改图采用CPP-SOM展示技术对表达变化的基因进行聚类。B)根据芯片所检测基因的表达变化趋势将每张SOM图划分为12个base，每个base代表表达变化趋势相近的一组基因集。C)对表达变化最明显的基因集(base)进行相关功能和信号通路的富集分析，其中Base4和Base10是Hu-17和顺铂合用组表达剧烈上调的基因集，Base1和Base7是联合处理后表达下调的基因集。

图11化合物Hu-17能显著抑制人卵巢癌颗粒细胞癌(KGN)细胞中孕酮的合成：化合物Hu-17(0.3125μM、0.625μM、1.25μM、1.875μM、2.5μM)处理KGN细胞72小时，利用电化学法发光的原理于Becman Unicel Dxl 800access immunoassay system仪器上检测培养液上清中孕酮的含量。

图12化合物Hu-17能显著抑制人卵巢癌颗粒细胞癌(KGN)细胞中芳香化酶的合成：A)分别用Hu-17(2.5μM和顺铂(20μM)处理KGN细胞24小时和48小时，MTT比色法检测细胞相对活力，计算细胞生长抑制情况。各组实验均独立重复三次，图中数据以平均值展示。B)分别用Hu-17(2.5μM)、紫杉醇(10^-4μM)和顺铂(20μM)处理KGN细胞24小时和48小时，Westernblot法检测KGN中芳香化酶的表达。芳香化酶是雌激素合成过程中的关键酶。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.化合物Hu-17的制备

化合物Hu-17的化学结构式如下：

分子式：C₆₃H₉₆N₄O₁₁，分子量：1084Da。

商陆皂苷元(phytolaccagenin)是从中药商陆中分离得到的一种活性成分，是商陆皂苷甲(Esculentoside A，EsA)的苷元部分，而本发明中的商陆皂苷元通过酸水解商陆皂苷甲而得到，其结构如下：

将商陆皂苷元(26.6mg,0.05mmol)溶于干燥的2ml DMF/THF(1:3,v/v)中，加入N,N-二环己基碳酰亚胺(DCC,20.7mg,0.1mmol)和N-羟基苯并三氮唑(HOBt,13.5mg,0.1mmol),室温搅拌3小时。反应完成后，减压浓缩至干，残留物用二氯甲烷(20ml)溶解、过滤，滤液浓缩至干，加入23mg硫酸氨基胍和5ml二甲亚砜，充N₂后密封，油浴(90～95℃)磁力搅拌反应8小时。反应液冷却后加2倍蒸馏水，过滤，沉淀用蒸馏水洗涤2次，50℃烘干，即得HU-17粗品。粗品再经硅胶柱层层析纯化，洗脱剂：二氯甲烷：甲醇(9.2：0.8)，得HU-17纯品3.5mg,白色粉末，得率：19.4％。mp 285～7℃；分子式：C63H₉₆N₄O₁₁；分子量：1084；ESI-MS高分辨质谱：m/z 1107.6879[M+Na]⁺,1083.6892[M-H]^-；红外光谱(IR)：max cm^-13427(OH),2948(CH3,CH₂),1729(C＝O),1577,1462,1213,1150,1051(C-O-C)。

实施例2.化合物Hu-17单独或联合铂类药物在制备治疗卵巢癌药物中的应用

实验材料及方法：

1实验材料

1.1实验用细胞系和裸鼠

实验过程中所用的人卵巢癌细胞系SK-OV-3购买于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。人卵巢癌细胞系A2780、HO8910以及HO8910PM由中国科学院上海生命科学研究院营养科学研究所方靖研究员友情馈赠。颗粒细胞癌细胞系KGN由本实验室提供。实验用裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。

1.2实验主要试剂及材料

1.3主要实验仪器设备

2实验方法

2.1药物的配制

细胞用化合物Hu-17和顺铂的配制：称取一定质量的Hu-17，常温条件以DMSO(Sigma)溶剂溶解，配成20mM母液置于-20℃保存。顺铂以无菌PSB缓冲液配制，配成10mM母液于-20℃保存。

动物用化合物Hu-17和顺铂的配制：称取一定质量的Hu-17，常温以DMSO(Sigma)溶液溶解，配成100mg/ml母液，小体积分装至小EP管中于-20℃保存。用时以含有2％吐温80的生理盐水稀释，稀释成2mg/ml，混匀后置37℃放置一段时间，待药物完全溶解后再注射给药；称取一定质量的顺铂，无菌PBS缓冲液溶解配成1.25mg/ml母液，用时以适量的生理盐水稀释。

2.2细胞培养

A2780、HO8910和HO8910PM卵巢癌细胞系培养于含有90％RPMI-1640培液和10％胎牛血清(FBS)的培养液中，SK-OV-3卵巢癌细胞系培养于含有90％McCOY’S5A培液和10％胎牛血清的培养液中。

所有细胞放置于含有5％二氧化碳的37℃培养箱中培养。根据细胞密度和增殖速度情况，A2780细胞一般每2～3天传代一次，HO8910、HO8910PM以及SK-OV-3细胞每3～4天传代一次。

2.3细胞活力的检测(MTT法)

卵巢癌细胞活力检测：48孔细胞培养板中接种3×10⁴cells/孔的单细胞悬液500μl，培养24小时待细胞完全贴壁后替换含有不同药物浓度或不同种类药物的新鲜培液。在各加药时间点(0，24，48，72小时)结束后，每孔加入50μl5mg/ml的thiazolyl bluetetrazolium bromide(噻唑兰)溶液，37℃培养箱孵育3h后，吸除上清溶液，加入500μlDMSO溶液，脱色摇床上摇晃充分溶解紫色结晶，酶标仪上570nm吸收波长检测样品吸光值，每个药物处理组设三复孔，最终结果为三次独立实验所得。

2.4细胞凋亡的磷脂酰丝氨酸外翻检测

卵巢癌细胞加药处理细胞凋亡的检测：联合使用FITC-Annexin V(激发波长488nm,最大发射波长525nm)和Propidium Iodide(激发波长488，最大发射波长617nm)双荧光染料可以检测凋亡的细胞并区分早期凋亡与晚期凋亡的细胞。提前一天于6孔板中接种2×10⁵个细胞，药物处理一定时间点后(48小时或42小时)，胰酶消化并收集全部细胞(包括收集上清)，每管收集1×10⁵以上的细胞，以2000rmp离心速度离心5分钟，离心结束后去除上清，加入500μl PBS缓冲液重悬一次，2000rmp离心5分钟，离心结束后弃上清，每管再加入500μl 1×AnnexinV binding buffer重复离心去上清步骤，最后每管加入200μl 1×AnnexinV binding buffer，5μl PI以及2.5μl FITC标记的AnnexinV抗体，混匀后室温避光标记15分钟，最后于流式细胞仪上检测。每次试验至少检测10000个细胞，各组实验均独立重复三次。

2.5线粒体跨膜电位的检测

在细胞凋亡发生过程中，由于线粒体内膜通透性发生变化，线粒体跨膜电位会降低。利用亲脂性阴离子染料罗丹明123和检测细胞存活的PI染料可用来检测线粒体膜电位的变化以研究药物诱导的细胞凋亡。加药前一天于6孔板中接种2×10⁵个细胞，加药处理48小时后，胰酶消化收集各组细胞，用吸出的上清终止消化过程，每管收集1×10⁵以上的细胞，2000rpm离心5分钟，弃上清，用500μl PBS缓冲液重悬细胞，再以2000rpm 5分钟离心，离心结束后弃上清，每管加入100μl PBS及100μl罗丹明123染料，37℃避光孵育30分钟，孵育结束后2000rpm离心5分钟并弃上清，用500μl PBS清洗一次并重复离心处理，最后每管加入300μl PBS，3μl 1mg/ml的PI，混匀并于流式细胞仪上检测，每次试验至少检测10000个细胞，各组实验均独立重复三次。

2.6细胞周期的检测

对于卵巢癌细胞系，在加药前一天于6孔板中接种2×10⁵个细胞，加药处理一定时间点后，胰酶消化收集细胞，每管收集2×10⁵个细胞，2000rpm离心5分钟，离心结束后弃掉上清，用1ml PBS缓冲液重悬为单细胞悬液，再以2000rpm 5分钟，弃上清，重复以上步骤，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，最后加入500μl含0.5％皂素，0.1mg/ml Rnase A，50μg/ml PI的PBS溶液(皂素用于细胞打孔)，混匀后将流式管置于37℃培养箱中避光标记10～15分钟，标记结束后上流式仪检测。每次试验至少检测10000个细胞，各组实验均独立重复三次。对于慢性粒细胞白血病细胞，加药当天6孔板中铺板2×10⁵个细胞，加药处理24或48小时后，收集细胞，其后处理方式同卵巢癌细胞一致。

2.7蛋白质水平的检测

2.7.1细胞总蛋白的裂解与提取

收集加药处理的不同时间点的细胞(5-10×10⁶)于15ml离心管中，4℃2000rpm离心5分钟，去掉上清，加入1ml预冷的PBS重悬细胞，将单细胞悬液转移至1.5ml EP管中，2000rpm离心5分钟，去掉上清后，加入适量含有蛋白酶体抑制剂以及磷酸化酶抑制剂的RIPA裂解液，涡旋混匀并于冰上孵育30分钟，期间间隔涡旋2次，12000rpm 4℃离心10分钟，吸取上清至新1.5ml EP管中。

2.7.2蛋白浓度的定量

蛋白定量采用DC protein assay试剂盒，根据Lowry法原理测定蛋白浓度。具体步骤：96孔板依次加入2μl蛋白样品，25μl A’试剂(A’试剂由试剂盒中1mlA试剂和20μlS试剂混合配得)，200μl B试剂，室温静置15分钟后，酶标仪吸收波长设置为750nm检测。蛋白标准曲线由BSA蛋白标准品分别配成0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/ml的不同浓度梯度的蛋白溶液测得，蛋白样品与标准品分别做三复孔以保证数据稳定可靠。

2.7.3SDS-PAGE及蛋白免疫印迹

将适量的5×蛋白loading buffer加入到定量后的蛋白样品中，涡旋混匀后置于100℃沸水中煮沸10分钟，煮好的样品可直接进行SDS-PAGE电泳或置于-80℃中保存。首先配备不同丙烯酰胺浓度的SDS-PAGE胶，待胶完全凝固后(可4℃过夜保存)，加入适当体积的蛋白样品(30μg)，于BIO-RAD蛋白电泳仪上电泳，电压设置为80～120V，电泳时间设置为120分钟；电泳结束后继续进行转膜(NC膜)实验，设置电流200mA，时间为120分钟，转膜结束后，蛋白样品将由PAGE胶迁移至NC膜上；待转膜实验结束后，将NC膜放在滤纸上风干，用含有5％脱脂牛奶或5％BSA的的TBST溶液室温封闭1小时；封闭完成后，一抗4℃过夜孵育；1×TBST洗5次，每次5分钟；用辣根过氧化酶(HRP)标记的二抗室温孵育1小时；二抗孵育结束后，1×TBST洗5次，每次5分钟；用ECL plus western blotting reagent试剂于暗室显色曝光X光片，将曝光后的X光片用高密扫描仪扫描成清晰数据图片。

2.8实时荧光定量多聚酶链式反应(Real time-PCR)

RNA提取：加药处理细胞一定时间点后，于6孔板中加入1ml Trizol，冰上放置5分钟，枪头用力吹打；将裂解液收集到1.5ml EP管中，加入0.2ml氯仿，漩涡震荡15秒。15～30℃下孵育2～3分钟，4℃12,000g离心15分钟，离心结束后，液体分三层(顶层为无色水样层含有RNA，中间层白色为DNA，底层是红色，为蛋白质)，小心吸取上层液体至新EP管中，加入等量体积的异丙醇，混匀，15～30℃下孵育10～30分钟，4℃12,000g离心10分钟。吸去上清，将EP管放在超净台中干燥5～10分钟。加入20μl RNase-free的水溶解，溶解后的RNA放-80℃冰箱保存。用琼脂糖凝胶电泳法检测提取的RNA质量，用NanoDrop仪器检测RNA浓度。使用QIAGEN RNeasy kit对提取的RNA进行纯化。

RNA纯化：取纯化后的RNA 2μg，加入1μl oligodT，补加sigma水至10μl，72℃变性5分钟，4℃迅速冷却，再加入MLV RT buffer 5μl，10mM dNTP 1.25μl，40u/μl的RNAseinhibitor 0.625μl，200u/μl的MLV酶1μl，7.125μl的RNase-free水，42℃反转录1小时。

Real time PCR：反应体系包括1μM的正向引物1μl，1μM反向引物1μl，SYBR MasterMix 5μl，cDNA模板2μl，1μl H₂O，总反应体系为10μl。384孔板加样完成后，4℃2000rmp离心10分钟。离心结束后，于ABI 7900HT实时定量PCR仪上按默认反应程序上机进行PCR反应。

实验所检测的基因及引物序列如下：

2.9 RNA干扰实验及MTT实验

转染前一天，于48孔板中接种500μl 6×10⁴cells/ml的单细胞悬液。转染当天，48孔板替换400μl新鲜的细胞培养液，按每孔20pM siRNA的浓度将母液溶解稀释于适当体积的无血清1640溶液中(按每孔50μl计)，混合均匀，室温静置；将Lipofectamine 2000混合均匀，按每孔1μl Lipofectamine 2000的量将其稀释于适当体积的无血清1640溶液中(按每孔50μl计)，混合均匀，室温静置5分钟；5分钟后将稀释的寡聚核苷酸(siRNA)和稀释的Lipofectamine2000混匀，于室温条件静置20分钟。将寡聚核苷酸-Lipofectamine 2000混合液100μl加入各组孔板。前后来回摇晃48孔板使孔内溶液混匀。转染一定时间点(36小时)后，转染后的细胞再用于药物处理及细胞活力检测。JNK siRNA寡分子核苷酸序列：5-AAAGAAUGUCCUACCUUCUTT-3。阴性对照组为通用寡聚核苷酸。

2.10细胞活性氧水平的检测

Reactive Oxygen Species Assay Kit是利用荧光探针DCF-DA进行活性氧检测的试剂盒。DCF-DA自身不发荧光，能自由穿透细胞膜进入细胞内。进入细胞后，它能够被细胞内的酯酶水解成DCFH，DCFH因不能穿透细胞而被保留在细胞内。细胞内的活性氧基团能将DCFH氧化成能发荧光的DCF，通过检测DCF荧光强度可以间接检测细胞内活性氧的水平。

收集加药处理一定时间点的细胞，800rpm离心5分钟，弃上清，加入含有终浓度10μM DCFH-DA的无血清细胞培养液，37℃培养箱内孵育20分钟(细胞密度为2×10⁵cells/ml，期间颠倒混匀3次)，孵育完成后，用无血清细胞培养液(或PBS缓冲液)洗涤三次以充分洗去未进入胞内的DCF-DA，最后上流式仪分析操作，以488nm为激发光，FL1通道检测加药处理后胞内活性氧水平的变化，每次试验至少检测10000个细胞，各组实验均独立重复三次。

2.11裸鼠皮下卵巢癌异种转移模型的建立及给药方案

本模型全部采用6～8周龄雌性BALB/c品系来源的裸鼠。A2780或SK-OV-3细胞消化后，加入适当的培养液混合终止消化并制成单细胞悬液，再次离心，用无血清培养液重悬，离心反复洗涤2次，细胞密度控制在2×10⁷～4×10⁷cells/ml，用1ml无菌注射器吸取100μl单细胞悬液注射到裸鼠右侧腋窝或右侧脂肪垫处。

给药方案：A2780接种的裸鼠(7周龄雌性裸鼠)在接种15天后，随机成2组，(给)生理盐水组和化合物Hu-17给药组，每组3只老鼠，腹腔注射候选新药(化合物)Hu-17,3天给药2次，每次剂量为5mg/kg，给药时间为2周；生理盐水组以同样方式给以同等体积的生理盐水。SK-OV-3接种的裸鼠，待肿瘤长到约4～5mm后(第13天)，随机分为四组(生理盐水组，单给顺铂组，单给候选新药(化合物)组，两药合用组)，每组6只裸鼠，给药时间为4周，单给顺铂组通过腹腔注射方式给药，每2天给药一次，剂量为1.2mg/kg；单给候选新药组通过尾静脉注射的方式给药，每2天给药一次，剂量为3.75mg/kg；联合用药组给药方式及剂量同上，同一天给药，2天给药一次；生理盐水组给予注射同等体积的生理盐水。给药期间每周用游标卡尺测量肿瘤直径2次，每周测量小鼠体重一次。给药结束后，颈椎脱臼法处死裸鼠，将肿瘤剥离，称重，并用预冷的4％多聚甲醛固定。

肿瘤体积(tumor volume,TV)计算公式：V＝1/2×a×b²，其中a表示肿瘤长度，b表示肿瘤宽度。由测量得出肿瘤体积再计算相对肿瘤体积(relative tumor volume，RTV)，计算公式为：RTV＝V_t/V₀，V₀表示分组后开始给药当天测量所得的肿瘤体积，V_t为每次测量时的肿瘤体积。相对肿瘤增值率T/C(％)的计算：T/C％＝T_RTV/C_RTV×100％，其中T_RTV表示治疗组的相对肿瘤体积，C_RTV表示阴性对照组的相对肿瘤体积。肿瘤生长抑制率的计算：肿瘤生长抑制率＝(阴性对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/阴性对照组平均瘤重×100％。

2.12组织包埋、切片及免疫组织化学实验

石蜡包埋和切片：用梯度酒精脱水，二甲苯透明后，将组织放于蜡箱中浸蜡包埋，石蜡切片仪进行切片作业，切片厚度为4～6μm。

切片脱蜡及水化：依次将切片放入二甲苯Ⅰ，20分钟-二甲苯Ⅱ，20分钟-无水乙醇Ⅰ，10分钟-无水乙醇Ⅱ，10分钟-95％酒精，5分钟-80％酒精，5分钟-70％酒精，5分钟-蒸馏水冲洗。

抗原修复：采用微波修复法，将组织切片置于含有EDTA抗原修复缓冲液的修复盒中，并于微波炉内进行修复。中火8分钟，停火8分钟，中低火7分钟(此过程应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片)。自然冷却后将玻片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤三次，每次5分钟。

阻断内源性过氧化物酶：切片放入3％过氧化氢溶液中，室温避光孵育25分钟，孵育结束后将玻片放置PBS中于脱色摇床上晃动洗涤三次，每次5分钟。

抗体孵育：切片稍甩干后以组化笔在组织周围画圈以防抗体流失，在圈内滴加含有一定稀释比例一抗的5％BSA溶液，湿盒内4℃孵育过夜；一抗孵育完成后，玻片置于PBS中洗涤3次，每次5分钟，稍甩干后在圈内滴加相应的二抗溶液(辣根过氧化物酶标记)，室温孵育50分钟。

DAB显色：玻片置于PBS中洗涤3次，每次5分钟。稍甩干后圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水洗涤切片终止显色。

复染细胞核：Harris苏木素复染细胞核3分钟，自来水冲洗，1％的盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗。

脱水封片：将切片依次置于70％酒精，5分钟-80％酒精，5分钟-90％酒精，5分钟-95％酒精，5分钟-无水乙醇Ⅰ，5分钟-无水乙醇Ⅱ，5分钟-二甲苯Ⅰ，5分钟-二甲苯Ⅱ，5分钟，脱色透明，待切片稍晾干后，用中性树胶封片。

2.13基因芯片实验

本实验采用的芯片为Affymetrix Human Genome-U133Plus2.0。细胞在加药前一天铺板，10cm培养皿种植约2×10⁶个细胞，卵巢癌细胞分别经新化合物Hu-17和顺铂单独或联合处理6小时，12小时，24小时后，收集细胞抽提RNA并经试剂盒纯化(DNA-free kit；Ambion Applied Biosystems)，最后交由上海伯豪生物技术有限公司进行转录谱芯片检测。芯片处理完成后采用自组织图平面展示技术CPP-SOM(Component Plan Presentationintegrated Self-Organizing Map，Methods and system for analysis andvisualization of multidimensional data.US,Patent No:美国专利6897875)对芯片结果进行分析并进行相关基因的聚类及展示。具有共同调变趋势的基因模块会分类成相应的独立于其他模块的base，模块内部基因生物学功能(GO)以及信号通路(KEGG Pathway)的分析采用DAVID在线分析软件(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)完成。

2.14孕酮含量的测定

2×10⁴的KGN细胞提前一天铺板于48孔板中，24小时后，分别用不同浓度的Hu-17处理细胞72小时，吸取上清，于贝克曼仪器(Beckman DXI800化学发光仪)检测培养细胞上清中孕酮的含量。

2.15统计学分析

实验数据采用专业的GraphPad Prism5软件作图并做出相应统计学分析结果，两组间比较采用student t test(双侧t检验)检测组间有无统计学差异，多组之间比较采用单因素方差分析，图中ns表示无统计学差异，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。通过抑制细胞生长的能力、诱导细胞凋亡的能力、对细胞周期的影响以及体内用药抗卵巢癌的能力(药效体内试验)四个方面评价化合物Hu-17对卵巢癌细胞的毒性效应和杀伤作用。

我们选用四株卵巢癌细胞系(A2780、HO-8910、HO-8910PM、SK-OV-3)作为研究对象，已有文献报道，A2780是顺铂(cisplatin)敏感细胞株(Henkels KM,Turchi JJ.Cancerresearch,1997,57(20):4488-4492.)，SKOV3是对顺铂固有耐药的细胞株(Johnson SW,Swiggard PA,Handel LM,et al.Cancer research,1994,54(22):5911-5916.)。

实验结果见图1，图1说明：化合物Hu-17抑制卵巢癌细胞活力表现为剂量-时间依赖型。

化合物Hu-17处理卵巢癌细胞A2780、HO-8910、HO-8910PM以及SK-OV-3细胞24、48、72小时后，MTT法检测细胞相对活力(以各时间点0μM浓度组(即DMSO组)为对照组，相对细胞活力＝各药物浓度组OD值/对照组OD值)，以相对细胞活力为指标绘制不同细胞在各药物浓度处理下的生长曲线(图1)。从图中数据可得知Hu-17对四株卵巢癌细胞生长抑制作用强弱依次为：A2780>HO-8910>HO-8910PM>SK-OV-3；在5μM剂量下，Hu-17均能显著抑制卵巢癌细胞生长和增殖。

图2说明：化合物Hu-17能显著诱导细胞凋亡。以FITC-Annexin V和P I双荧光染料标记不同药物浓度处理一定时间点的卵巢细胞A2780、HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3检测候选新药诱导卵巢癌细胞凋亡的能力，流式细胞仪检测各标记阳性细胞群比例，结果如图2。对于A2780和SK-OV-3细胞(图2A-a)，候选新药3.75μM处理42小时能显著诱导细胞发生凋亡，候选新药对顺铂耐药细胞株SK-OV-3细胞清除强于对顺铂敏感株A2780细胞的清除；对于HO-8910和HO-8910PM细胞(图2A-b)，候选新药3.75μM浓度处理48小时均能显著诱导细胞凋亡，随着药物浓度增加，凋亡细胞的比例也逐步增加。此外，我们检测了化合物Hu-17处理HO-8910PM 48小时后线粒体跨膜电位的变化，发现Hu-17处理后线粒体膜电位变化明显(图2C)，这些结果与细胞凋亡检测结果具有一致性。

图3说明：化合物Hu-17处能扰乱卵巢癌细胞周期。我们利用皂素打孔和PI标记DNA的周期检测方法检测卵巢癌细胞在候选药物处理后各细胞周期的变化(如图3)。对于A2780细胞，在2.5μM浓度的候选药物处理48小时后，细胞周期发生很大的变化。G0/G1期和S期细胞比例变化较大，表现为G0/G1期比例上升，S期细胞比例下降，变化均具有统计学显著性差异(P<0.001)，细胞周期的明显阻滞与A2780细胞对候选药物较高的敏感性相关。对于HO-8910和HO-8910PM细胞，候选药物对其周期阻滞效果相对不明显；HO-8910细胞G0/G1期比例未有明显变化，S期细胞比例有所下降，G2/M期细胞比例略微上升。HO-8910PM细胞G0/G1细胞比例略微下降，G2/M期细胞增加。

以上细胞周期数据说明，候选药物能显著改变卵巢癌的细胞周期，尤其对A2780细胞周期阻滞作用最明显，细胞周期阻滞方式及强弱与细胞类型有一定关系。候选药物引起卵巢癌细胞周期阻滞结果和诱导细胞凋亡结果与药物抑制细胞活力的结果相对应，显示了体外实验中候选药物对卵巢癌细胞的毒性效应。

图4说明：化合物Hu-17能抑制荷瘤小鼠中卵巢癌细胞的生长。我们利用裸鼠皮下移植瘤模型评价候选新药治疗卵巢癌的效果。A2780细胞皮下接种6～8周龄的雌性裸鼠，每只裸鼠接种2×10⁶个细胞，接种15天(肿瘤大小肉眼可见)后随机分组(生理盐水组和候选新药组，每组各4只裸鼠)，给药方案为3天2次腹腔注射给药，候选新药剂量为5mg/kg/次。我们根据测量的肿瘤直径(长和宽)计算得到肿瘤的体积(V＝1/2×a×b²，其中a表示肿瘤长度，b表示肿瘤宽度)，计算得到相对肿瘤体积(RTV＝V_t/V₀)，根据相对肿瘤体积绘制肿瘤生长曲线(如图4A)。给药结束后处死小鼠，并称量肿瘤质量，发现给化合物Hu-17组肿瘤质量明显减少(P<0.05)，且该剂量下，化合物Hu-17对小鼠的体重影响较小，显示一定的低毒副作用(图4C)。

图5说明：化合物Hu-17显著增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的清除作用。如上文所述，A2780细胞是顺铂敏感的细胞株，SK-OV-3细胞是对顺铂耐药的细胞株。我们分别检测了A2780、HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞对顺铂药物的敏感性，如图5-A，结果表明，相比于顺铂敏感细胞株A2780，HO-8910、HO-8910PM和SK-OV-3细胞对顺铂的作用均不敏感。我们选择对细胞毒性较小的候选新药的剂量(2.5μM)与较低的顺铂浓度(20μM)合用，检测联合用药48小时对顺铂不敏感的卵巢癌细胞的生长抑制情况(图5-B)。我们发现两药联合能显著抑制三株卵巢癌细胞的生长和增殖，其中，联合用药对耐药的SK-OV-3细胞的协同抑制效果最明显。我们检测了HO-8910、HO-8910PM及SK-OV-3细胞的P53的表达(已有报道顺铂敏感细胞株A2780的P53为野生型，HO-8910P53为野生型，SK-OV-3细胞缺失P53细胞的表达)，结果P53表达情况与文献报道一致(图5C)。我们同时检测了两药单用及合用药方案对卵巢癌细胞诱导凋亡能力的影响(图5D)，结果表明，联合用药在三株细胞上均表现出明显的细胞凋亡(图5E)，合用效果强于任何单一用药组，其中诱导凋亡的效果在顺铂耐药的SK-OV-3细胞中表现更明显，该结果与联合用药抑制细胞活力的结果一致。同时，我们检测了加药处理12小时后，凋亡指示蛋白分子PARP及Caspase3的变化，完整的Caspase3前体减少且剪切形式的PARP分子增多，显示在联合用药组细胞凋亡通路明显激活(图5F)。此外，我们发现化合物Hu-17与卡铂(Carboplatin)联合使用能显著抑制对卡铂耐药的HO-8910和SK-OV-3的细胞活力。综上所述，体外细胞学实验表明，候选新药与铂类药物联合使用能增强卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性，特别是显著增强对铂类药物耐药的卵巢癌细胞的清除。

图6：体内实验显示化合物Hu-17与顺铂联合使用显著抑制耐药的卵巢癌细胞的生长。我们应用裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型评价候选新药和顺铂联合使用对卵巢癌的治效果。治疗方案如“实验材料与方法”所述，卵巢癌细胞皮下移植裸鼠13天时给药，连续给药四周。我们通过用药期间动态测量肿瘤直径计算得到肿瘤体积(V＝1/2×a×b²)及相对肿瘤体积(RTV＝V_t/V₀)，并根据结果绘制肿瘤生长曲线(图6A-a，6A-c)。我们发现联合用药组肿瘤生长曲线斜率明显小于单独用顺铂组及单独用候选新药组，用药4周后，联合用药组与单独用药组相比，无论肿瘤体积(图6A-b)还是相对肿瘤体积(图6A-d)均具有统计学显著性差异。用药4周结束后，脱颈处死裸鼠，将肿瘤剥离、拍照并称重，如图6B所示，我们可以看出联合用药组的肿瘤体积明显小于阴性对照组以及单用药组。用药期间裸鼠体重变化如图6C，联合用药组裸鼠体重略微下降，但与对照组无统计学差异。对各组剥离得到的肿瘤经固定和石蜡包埋、切片后进行相关免疫组化分析。Ki-67存在于细胞核内，是临床上普遍采用的监测肿瘤细胞增殖情况的标记物，CD34可标记肿瘤组织中的造血干细胞，可用于监测肿瘤组织内部微血管的生成情况，我们采用针对人源Ki-67和鼠源CD34抗体对石蜡切片进行组化标记并显色。如图6E所示，联合用药组Ki-67和CD34染色明显少于单用药组和阴性对照组。其中，联合用药组Ki67染色细胞仅为阴性对照组的40％(如图6D)。以上结果表明，候选药物与顺铂联合使用能显著抑制卵巢癌细胞的生长，联合用药除能抑制肿瘤细胞增殖外还能抑制肿瘤组织内部微血管生成。

图7说明：化合物Hu-17与顺铂联合使用能下调AKT-mTOR信号通路以及激活JNK/c-Jun信号通路。AKT是由一个含PH结构域的氨基末端，一个中心催化结构域和一个含有调节结构域的羧基末端组成的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。它由三个成员组成—AKT1、AKT2、AKT3，临床证据表明，约36％的卵巢癌病人标本中能检测到AKT2的活化(Yuan ZQ,Sun M,FeldmanRI,et al.Oncogene,2000,19(19).)。AKT的活化由双向机制调控，三磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(PDK1)和三磷酸肌醇依赖性蛋白激酶2(PDK2)分别在Thr308和Thr473位点激活AKT。AKT激酶位于在PI3K信号通路下游，AKT的激活与细胞生存(survival)，增殖(proliferation)和生长(increased cell size)密切相关。我们以2.5μM候选新药和20μM顺铂单独或联合处理HO-8910PM和SK-OV-3细胞42h(如图7A)，蛋白免疫印迹法检测与细胞凋亡相关的AKT、mTOR、XIAP等蛋白的表达变化。我们发现，联合用药组能显著抑制AKT及mTOR的激活(磷酸化的AKT及磷酸化的mTOR均减少)，联合用药后，抗凋亡蛋白XIAP含量也明显减少。

JNK(c-Jun N-terminal kinases，也叫stress activated protein kinase)是有丝分裂原蛋白(MAPK)超家族的重要组成部分，它由三个基因组成，能表达三种异构形式的蛋白，JNK1(MAPK8)，JNK2(MAPK9)，JNK3(MAPK10)。JNK1和JNK2几乎能在所有细胞中表达，JNK3主要在脑部表达。JNK蛋白的主要靶点是转录因子AP1，由Fos和Jun家族成员构成。活化的JNK能通过磷酸化Jun激活AP1，此外，JNKs能磷酸化BAX和BAD以及14-3-3行使促凋亡作用。我们发现20μM顺铂处理细胞6小时后并未能检测到胞内活性氧水平的变化，而候选新药2.5μM处理HO-8910PM和SK-OV-3细胞6小时能检测到胞内升高的活性氧(图7B)，对于SK-OV-3细胞，其ROS水平升高更明显。结果提示我们候选新药抗卵巢癌机制及其增强顺铂化疗效应机制可能与候选新药提高胞内活性氧水平相关。此外，我们发现候选新药和顺铂单独使用均能在mRNA水平和蛋白水平上调c-Jun的表达(图7C)并且联合用药组能显著增强c-Jun的表达；同时，尽管联合用药未能上调JNK的表达(图7C-b)但仍然能够强烈引起JNK的活化(图7C-a)。该结果潜在提示我们JNK/c-Jun信号通路的激活可能与候选新药增强顺铂化疗效果相关。

图8说明：Hu-17通过ROS-JNK-c-Jun通路增强顺铂对卵巢癌的细胞毒效应。NAC(N-乙酰基-L-半胱氨酸)能中和细胞产生的ROS，它作为ROS的清除剂被广泛用于ROS诱导细胞凋亡的研究中。我们以2.5μM候选新药处理HO-8910PM细胞发现，3小时后能检测到升高的活性氧，药物处理9小时后活性氧水平下降(图a)。以上结果表明，在候选新药作用于细胞的早期，有胞内活性氧先升高又降低的变化过程。在加药前1小时加入10mM的NAC处理HO-8910和SK-OV-3细胞后发现，NAC能降低候选新药单独或联合顺铂处理卵巢癌细胞产生的活性氧(图8A-b/c/d/e)，其中能较强的降低候选新药单独处理诱导产生的活性氧。此外，NAC能抑制JNK/c-Jun通路的激活。如图8B所示，候选新药与顺铂联合使用，能强烈活化p-JNK，p-c-Jun，并上调c-Jun的表达；在细胞培养液中，在加药前1小时加入10mM的NAC，JNK/c-Jun的通路的活化显著降低。此外，我们可以看到NAC能较强的下调HO-8910PM细胞JNK/c-Jun的活化，对SK-OV-3细胞联合用药引起的活化的JNK/c-Jun通路的抑制作用较弱。我们检测了活性氧清除剂NAC对联合用药抑制细胞活力作用的影响。如图8C-a，在加药(2.5μM候选新药和20μM顺铂)前1小时，在细胞培养液中先加入10mM的NAC处理HO-8910和SK-OV-3细胞，48小时后，MTT法检测细胞相对活力，我们发现NAC的引入能解除联合用药对细胞生长的抑制作用。对于候选新药单独处理的卵巢癌细胞，我们发现NAC不能抑制低浓度的候选新药(2.5μM)对卵巢癌细胞的影响(图8C-b)，但在5μM药物浓度下，NAC能在一定程度上抑制候选新药的作用。这部分数据说明，候选新药抗卵巢癌的机制不仅仅是通过升高细胞内活性氧来抑制卵巢癌细胞生长和诱导凋亡，但是在联合用药组，候选新药能通过提升细胞内的ROS，激活JNK-c-Jun通路，增强顺铂对卵巢癌细胞的毒性效应。另外，我们应用小分子干扰RNA敲低(knock down)HO-8910PM细胞中的JNK，发现联合用药对JNK RNAi的HO-8910PM细胞的抑制作用降低(图8C-c)。

综合以上数据，我们得出候选新药能促进卵巢癌细胞ROS的生成，ROS的增加能显著激活JNK-c-Jun信号通路；NAC能中和候选新药刺激卵巢癌细胞产生的ROS，抑制JNK通路的激活，并抑制联合用药对卵巢癌细胞的生长抑制作用。JNK-c-Jun通路的活化增强了联合用药方案对卵巢癌细胞的杀伤作用；此外，联合用药能显著协同上调c-Jun蛋白的表达，进一步促进了JNK-c-Jun通路的激活。因此，我们认为ROS介导的JNK-c-Jun通路的激活，是候选新药增强顺铂抗卵巢癌的主要作用机制。

图9说明：Hu-17及其与顺铂联合使用能显著抑制与血管生成相关基因的表达。促血管生成因子主要包括血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维生长因子(FGF)、血小板衍化生长因子(PDGF)、血小板衍化内皮生长因子、成纤维生长因子(FGF)、转化生长因子TGFβ等等。基于药物体内实验发现候选新药Hu-17单独使用或与顺铂联合能显著抑制肿瘤微血管的生成，我们检测了加药前后与血管生成相关的因子和金属蛋白酶(VEGFα、PDGFα、EGF-2、MMP2)的表达变化情况。如图9A所示，顺铂与候选药物联合使用后，能下调VEGFα、PDGFα以及MMP2，而EGF-2的表达有略微的上调。其中联合用药对PDGFα表达的抑制作用最明显。同时，较高浓度的候选药物能显著抑制VEGFα、PDGFα、EGF-2和MMP2的表达(图9B)。

上述实验结果表明，候选新药可能通过抑制VEGFα、PDGFα、EGF-2和MMP2的表达从而抑制肿瘤血管的生成，该结果进一步解释了，在上述裸鼠体内实验中，候选新药单独或与顺铂联合能显著抑制卵巢癌瘤体组织中血管的再生。

图10说明：基因芯片结果显示化合物Hu-17与顺铂联合使用显著富集与细胞凋亡、细胞周期阻滞等相关的生物学过程以及MAPK、活性氧调控等相关信号通路。运用基因芯片技术我们检测了低剂量的Hu-17(2.5μM)单独或联合顺铂(20μM)处理耐药的SK-OV-3细胞后的表达谱的变化。利用CPP-SOM聚类方法，我们得到了12个变化趋势相近的基因集(图10B)，从SOM图中(图10A)我们可以看到，base4和base10中的基因在联合用药组显著上调，且上调的时间和幅度均比单独用药组强，利用DAVID工具进行相关生物学功能及信号通路的分析，我们发现base4主要与细胞凋亡调控、激酶活性调控、细胞生长、MAP激酶活性调控、细胞周期阻滞、血管生成等生物学过程相关，这与我们试验中观察到的联合用药能显著诱导细胞凋亡，激活JNK分子(MAPKKK)以及抑制与血管生成相关因子的表达密切相关。此外，我们还从base4上调的基因群中富集得到MAPK及凋亡信号通路。与此同时，表达上调的基因集Base10中的基因主要参与了转录延伸、糖代谢、翻译、活性氧的调节、自噬、细胞对活性氧的反应等生物学过程，这与我们观察到的联合用药组活性氧的增多密切相关。

从表达显著下调的base1和base7基因里，我们富集得到的基因主要参与与转录、RNA产生、染色体修饰、细胞周期等相关的生物学过程，同时，我们发现富集得到的信号通路均参与泛素介导的蛋白水解、RNA降解、细胞周期、凋亡以及Wnt信号通路，该结果与试验结果进一步相对应。综合药物处理后的转录组数据，我们发现化合物与顺铂联合使用能显著改变与细胞凋亡相关的基因，引起细胞内活性氧水平的变化，引起染色体水平的变化，影响RNA的转录及剪切等过程，此外，信号通路的富集我们发现了联合用药能显著激活MAPK通路，激活凋亡通路并且可能抑制Wnt及mTOR等通路(图10C)。

图11说明：Hu-17能显著抑制人卵巢颗粒细胞癌细胞中孕酮的合成，Hu-17(0.3125μM、0.625μM、1.25μM和2.5μM)和cAMP(10^-4μM)共同处理KGN细胞，随着Hu-17处理浓度升高其抑制孕酮的合成能力增强，提示Hu-17可作为一种孕酮类激素合成的抑制剂。

图12说明：Hu-17能显著抑制人卵巢颗粒细胞癌细胞中芳香化酶的合成。分别用Hu-17(2.5μM)和顺铂(20μM)处理KGN细胞24小时和48小时，细胞生长抑制明显(图12A)；分别用Hu-17(2.5μM)、紫杉醇(10^-4μM)和顺铂(20μM)处理KGN细胞24小时和48小时，显示Hu-17能显著抑制KGN中芳香化酶的合成(图12B)。提示Hu-17可作为芳香化酶合成的抑制剂影响雌激素的合成，抑制肿瘤细胞生长，诱导卵巢癌细胞凋亡。

总结卵巢癌部分实验结果：

通过MTT比色法我们发现，新化合物Hu-17能显著抑制卵巢癌A2780、HO8910、HO8910PM以及SK-OV-3细胞的活力，该化合物抑制细胞活力的特征表现为时间剂量依赖特征(图1)。

通过磷酯酰丝氨酸外翻实验以及线粒体跨膜电位检测实验我们发现，化合物Hu-17单独使用能显著诱导卵巢癌细胞发生凋亡(图2)。

通过细胞周期检测实验，我们发现化合物Hu-17能显著扰乱卵巢癌细胞周期，尤其对A2780细胞周期阻滞作用最为明显(图3)。

裸鼠体内实验表明，化合物Hu-17能显著抑制卵巢癌细胞A2780在裸鼠体内的生长，且在有效剂量下对裸鼠的体重影响较小，显示一定的低毒副作用(图4)。

化合物Hu-17与卵巢癌一线治疗药物顺铂或卡铂联合使用能诱导卵巢癌细胞发生凋亡，联合用药对P53缺失的且顺铂耐药的SK-OV-3细胞诱导凋亡作用更明显，实验结果显示Hu-17与顺铂或卡铂联合使用能增强卵巢癌细胞对铂类药物的敏感性，特别是增强了对铂类药物耐药的卵巢癌细胞的清除作用(图5)。

化合物Hu-17与顺铂联合的体内实验表明，联合用药能显著抑制耐药的卵巢癌细胞SK-OV-3的生长，Hu-17与顺铂联合除能抑制肿瘤细胞增殖(细胞核增殖抗原Ki67表达减少)外，还能抑制肿瘤组织内部微血管的生成(CD34表达量减少)；此外，我们还观察到联合用药方案对裸鼠的体重影响较弱，显示出较低的毒性(图6)。

从分子水平我们观察到，与肿瘤细胞凋亡及生长相关的AKT-mTOR通路发生了变化，抑制肿瘤细胞凋亡的AKT分子磷酸化水平下降，促进细胞生长的磷酸化的mTOR分子也相应的减少，并且我们发现了JNK-c-Jun通路在联合用药组处于强烈激活状态，与此同时我们还发现了化合物Hu-17能显著诱导细胞活性氧(ROS)的生成(图7)。

我们通过实验进一步证实了化合物Hu-17能通过诱导细胞产生的活性氧ROS激活JNK-c-Jun信号通路进而增强顺铂对耐药卵巢癌细胞的杀伤作用。我们发现Hu-17诱导活性氧的产生在加药后6小时就能被检测到，利用活性氧清除NAC，我们发现NAC能降低细胞内活性氧的水平以及抑制联合用药组JNK-c-Jun通路的激活，同时NAC能抑制联合用药对卵巢细胞活力的抑制作用。我们利用JNK分子的小干扰RNA发现，JNK被敲低后，卵巢癌细胞对联合用药的敏感性降低(图8)。以上实验证实了，化合物Hu-17能通过提升细胞内ROS水平进而激活JNK-c-Jun通路并最终增强顺铂对耐药的卵巢癌细胞的杀伤作用。

此外，我们检测了Hu-17单独处理或联合顺铂处理HO8910PM细胞后与微血管生成相关因子的表达变化，我们发现Hu-17能通过抑制VEGFα、PDGFα、EGF-2和MMP2的表达从而可能抑制肿瘤血管的生成，该结果进一步解释了，在上述裸鼠体内实验中，候选新药单独或与顺铂联合能显著抑制卵巢癌瘤体组织中血管的再生(图9)。

我们还检测了Hu-17对激素合成的影响，发现其能显著抑制颗人卵巢癌粒细胞癌细胞中孕酮和芳香化酶的合成代谢。

对于卵巢癌的治疗，现有技术的不足主要包括因P53突变造成的对铂类药物的不敏感，以及JNK-c-Jun通路的异常导致的对铂类药物的耐药，同时，紫杉醇与顺铂联合化疗并不能对所有卵巢癌患者都起到很好的治疗效果。上述技术方案，即化合物Hu-17单独或与顺铂或卡铂等药物联合使用可以克服P53突变引起的顺铂类药物的不敏感。Hu-17通过产生活性氧激活JNK-c-Jun通路进而诱导耐药的卵巢癌细胞发生凋亡，该通路激活诱导的耐药的卵巢癌细胞的凋亡是不依赖于P53通路的。而且，Hu-17能够通过影响性激素的合成发挥诱导卵巢癌细胞凋亡的作用。因此对于耐药的卵巢癌患者，Hu-17单独使用或与顺铂(或卡铂)联合使用具有非常好的应用前景。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.化合物Hu-17在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述Hu-17分子式：C₆₃H₉₆N₄O₁₁，化学结构式如下：

2.化合物Hu-17与铂类药物联合用药在制备治疗卵巢癌药物中的应用，所述铂类是指顺铂或卡铂，所述Hu-17分子式：C₆₃H₉₆N₄O₁₁，化学结构式如下：

3.化合物Hu-17在制备性激素抑制剂中的应用，其特征在于，所述Hu-17分子式：C₆₃H₉₆N₄O₁₁，化学结构式如下：

所述性激素为卵巢癌中的孕酮或雌激素。