CN101478978B - 使用δ-生育三烯酚治疗和预防胰腺癌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了使用生育三烯酚即γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚治疗肿瘤疾病例如胰腺癌的方法。使用几种人类胰腺癌细胞系和裸鼠中的MIA-PACA2人类胰腺癌细胞异体移植物，在体外和体内显示了这些化合物的抗肿瘤生成效应。还公开了通过测量潜在的化疗剂对替代性终点生物标志例如Ki-67和p27的影响，来测试它们的疗效的方法。还公开了相关的化合物。

Description

使用δ-生育三烯酚治疗和预防胰腺癌

与相关申请的交叉参考

本申请是2006年6月27日提交共同待决的美国临时申请No.60/805,916和2007年6月26日提交的共同待决的美国非临时申请No.11/768,373的非临时申请，前者在此完全引为参考。

政府利益的陈述

本发明是在国防部授予的批予号No.DAMD 17-01-1-04和NCI批予号No.3R01CA098473-03S1的政府资助下完成的。政府在本发明中有确定的权利。

发明背景

胰腺是发生早期赘生物-非浸润性克隆上皮增殖的极其常见的位置。在少部分人中，这些细胞克隆连续获得可以导致浸润性腺癌的遗传变化。胰腺癌，一旦具有浸润性，几乎一律是致死的。在该过程晚期的上皮细胞非常具有侵袭性，似乎具有天生的转移的能力，转移在它们越过导管结构侵入到周围组织中之后很快就表现出来。为了减轻与这种疾病有关的可怕预后，必须在浸润以前对胰腺的癌发生进行识别和治疗。化学预防是施用药剂(药物、生物制剂和营养物)对癌发生进行减缓进程、逆转或抑制，从而降低发展出浸润性或临床严重疾病的风险。因此，了解浸润性胰腺癌的前体病变的形态学和生物学，已经变成了至为重要的课题。在最近的十年中，在对这些前体病变的识别和适当分类方面已经取得了显著的进展。黏液性囊性肿瘤(MCN)、导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)以及胰腺上皮内瘤变(PanIN)涵盖了浸润性胰腺癌的三种已知的形态学上不同的前体。

大量的病例-对照和群组研究已经显示，在某些家族中存在胰腺癌的显著群集(clustering)。这些高风险的遗传胰腺癌据估计占胰腺癌的大约10％。5种熟知的具有已知基因缺陷的遗传性综合征占了有胰腺癌群集现象的家族的大约20％。这些综合征包括(1)BRCA2，(2)家族性非典型多发性痣黑素瘤(p16/CDKN2A)，(3)Peutz-Jeghers综合征，(4)HNPCC以及(5)家族性胰腺炎。大多数胰腺癌是散发的，并有普遍的染色体不稳定性迹象，包括高比率的易位和缺失。几乎所有的(>90％)浸润前病变在参与传导生长因子信号的K-Ras蛋白中有早期突变。在浸润前发展的中间阶段中，>90％的病变发生CDKN2A(p16)周期蛋白依赖性激酶抑制剂的失活。在晚期阶段中，大多数浸润前病变还包藏着在TP53(p53)和MADH4中的突变，后者是参与TGFβ和活化素信号转导的常见Smad蛋白。尽管化学预防药剂在胰腺瘤变中具有大量明显的好处，但针对化学预防性适应症的直接药物研究进展缓慢。关键的因素是确定和证实临床益处的实施研究是个难题。

胰腺癌的增殖通过畸变的致癌Ras信号传导及其对周期蛋白依赖性激酶抑制剂例如p27^kip1的影响来调控。以前的研究已经证实，对ras信号传导途径之一Raf-MEK-ERK途径的药理抑制，通过诱导p27的表达导致胰腺癌细胞周期的停滞(Cancer Res 2005；65(11)：4870-80)。生育三烯酚，维生素E的具有不饱和类异戊二烯侧链的化学形式，作为癌症预防和治疗的有希望的饮食添加剂，受到了注意。

生育三烯酚是维生素E在大多数单子叶植物例如棕榈和谷类例如水稻和小麦的种子中的主要形式。生育三烯酚和生育酚的生物合成仅仅发生在光合作用的生物中，并起于尿黑酸。生育三烯酚起于尿黑酸和香叶基香叶基二磷酸的缩合，而生育酚合成的关键步骤是尿黑酸和植基二磷酸的缩合。在结构上生育酚和生育三烯酚共有某些相似之处，这种相似由共同的色原烷醇头部和在C-2位置上的侧链组成，但是它们的侧链区分了生育酚和生育三烯酚。

生育酚具有饱和的植基尾部，而生育三烯酚具有不饱和的类异戊二烯侧链。生育酚和生育三烯酚还根据色原烷醇环上甲基取代的数量和位置进一步分成个体化合物，由希腊字母前缀命名(α、β、γ、δ)。作为它们结构相似性的反映，生育酚和生育三烯酚都以其抗氧化效应而著称。但是，生育三烯酚是天然维生素E化合物类别，具有明确一致的抗肿瘤活性。半合成的生育酚例如生育酚琥珀酸酯具有抗肿瘤活性，但是完整的化合物在口服后的生物利用度差，使它不适合用于化学预防性干预。维生素E化合物的促凋亡效应的结构活性研究已经清楚地证明了维生素E化合物的不饱和类异戊二烯尾部在它们的抗肿瘤生物活性中的重要性。此外，这些研究表明，减少色原烷醇环上甲基取代的数量与增加抗肿瘤效能有关。

发明概述

在一个实施方案中，本发明包括确定化疗药剂有效性的方法，在于测定分离的样品中替代性终点生物标志例如p27的第一水平。然后将样品与实验有效量的测试化疗药剂相接触。在施用了化疗药剂之后，获取替代性终点生物标志的第二水平，并与第一(治疗前)水平进行比较。当p27的第二(治疗后)水平增加到超过治疗前和/或对照水平达到统计显著性的程度时，候选化疗药剂的有效性得到了证实。

在另一个实施方案中，本发明提供了确定化疗药剂有效性的方法，在于进一步测定分离的样品中第二个替代性终点生物标志例如Ki-67和/或p-MAPK的第一水平。在施用化疗药剂之后，获取Ki-67和/或p-MAPK的第二水平，并与第一(治疗前)水平和/或对照进行比较。当Ki-67和/或p-MAPK的第二(治疗后)水平降低到低于治疗前和/或对照的水平达到统计显著性的程度时，候选化疗药剂的有效性得到了证实。

本发明的另一个实施方案包括通过在例如分离的样品中测定生物标志即p27的水平，在对象中筛查胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌的方法。然后将生物标志的水平与一个或多个对照样品中相应的对照水平进行比较。在优选的实施方案中，对照样品从已经被确定不患有胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌的个体获得。

确定对象中的生物标志水平与对照样品中的生物标志水平之间的相似性有统计学显著性，表明对象没有胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。对象中p27的水平与对照样品中生物标志的水平相比有统计学显著性的降低，表明对象中存在胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。

在可选的实施方案中，测定第二个生物标志即Ki-67和/或p-MAPK的水平，并与一个或多个对照样品中Ki-67和/或p-MAPK的对照水平进行比较。在对象和对照样品中Ki-67和/或p-MAPK的水平之间有统计学显著性增加，表明了对象的胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。对象中Ki-67和/或p-MAPK的水平与对照样品相比有统计学显著的相似性，表明了对象没有胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。

在对象和对照样品中测定生物标志的水平的方法对于普通执业人员是已知的。例如，在一个实施方案中，利用与生物标志结合的抗体来测定生物标志的水平。将含有生物标志的样品与抗体在允许生物标志与抗体结合的条件下相接触；然后可以对存在的生物标志进行定量。

本发明还包括用于执行相关方法的组合物。例如，本发明包括含有多种分离蛋白的组合物，这些蛋白与相关生物标志的蛋白产物，即Ki-67和/或p-MAPK以及p27，选择性地结合。在优选的实施方案中，分离蛋白选择性扩增互补的双链DNA。还包括含有多种生物标志特异性引物的组合物，其中每个生物标志特异性引物选择性扩增与独特的生物标志例如Ki-67、p-MAPK和p27互补的双链DNA。可选地，本发明包括含有多种分离蛋白的组合物，这些蛋白选择性结合至少两个独特的生物标志的蛋白产物，其中每个独特的生物标志选自Ki-67、p-MAPK和p27。

因此，本发明包括通过给对象施用含有治疗有效量的生育三烯酚的组合物来治疗癌症、例如胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌的方法。在优选的实施方案中，生育三烯酚是γ-生育三烯酚和/或δ-生育三烯酚，作为药物组合物施用。优选实施方案的组合物基本上不含有α-生育三烯酚、β-生育三烯酚和/或生育酚。尽管普通的专业人员了解确定适当剂量的方法，一个实施方案的组合物含有大约100mg到300mg之间的生育三烯酚，每日给药两次。

优选实施方案的生育三烯酚具有下式：

其中R选自H和CH₃。

附图简述

为了更全面地理解本发明的本质和目的，应该结合附图参考下面的具体说明，其中：

图1A是软琼脂中MIA PaCa2细胞的照片；当每周用δ-生育三烯酚处理时，与用介质处理相比，出现显著抑制细胞的贴壁不依赖性生长。

图1B是其中MIA PaCa2胰腺癌细胞(3 x 10³)被铺于96孔板中，并在第二天用δ-生育三烯酚处理的图。增殖以24小时间隔的MTT评估。结果显示了增殖的剂量依赖性抑制。对所有三种胰腺癌细胞系的IC₅₀在24小时为20-25μM。HPDE 6C7细胞也用浓度渐增的δ-生育三烯酚处理24小时。

图1C是其中SW1990胰腺癌细胞(3 x 10³)被铺于96孔板中，并在第二天用δ-生育三烯酚处理的图。增殖以24小时间隔的MTT评估。结果显示了增殖的剂量依赖性抑制。对所有三种胰腺癌细胞系的IC₅₀在24小时为20-25μM。HPDE 6C7细胞也用浓度渐增的δ-生育三烯酚处理24小时。

图1D是其中BXPC3胰腺癌细胞(3 x 10³)被铺于96孔板中，并在第二天用δ-生育三烯酚处理的图。增殖以24小时间隔的MTT评估。结果显示了增殖的剂量依赖性抑制。对所有三种胰腺癌细胞系的IC₅₀在24小时为20-25μM。HPDE 6C7细胞也用浓度渐增的δ-生育三烯酚处理24小时。

图1E是显示了δ-生育三烯酚在24小时时对胰腺癌细胞系增殖的选择性抑制图。HPDE 6C7细胞相对抗拒生育三烯酚的抗增殖效应，即使是在最高的浓度下。

图2A是显示了在用δ-生育三烯酚(25μM)处理的HPDE 6C7和SW1990胰腺癌细胞系中G1期细胞周期明显停滞的图。相反，在永生化的人类胰腺导管上皮细胞(HPDE 6C7)中，δ-生育三烯酚对细胞周期的各期没有影响。

图2B是显示了在用δ-生育三烯酚(20μM)处理的MaPaCa2和BXPC3胰腺癌细胞系中G1期细胞周期明显停滞的图。相反，在永生化的人类胰腺导管上皮细胞(HPDE 6C7)中，δ-生育三烯酚对细胞周期的各期没有影响。

图2C是一系列印迹，显示了在所有4种胰腺癌细胞系中p27^kip1表达的时间依赖性上调。相反，在用δ-生育三烯酚处理的HPDE 6C7细胞中观察到了p27^kip1的下调。

图2D是显示了在用δ-生育三烯酚处理的MIA PaCa2细胞中荧光素酶活性增加的图。

图2E是图和相关的印迹，显示出siRNAp27拯救了生育三烯酚对胰腺癌细胞生长的抑制。

图2F是一对图，显示出siRNAp27拯救了生育三烯酚在胰腺癌细胞中诱导的G1-S期周期停滞。

图3A是印迹系列，显示出δ-生育三烯酚对致癌的Ras p-cRaf、p-MEK和p-ERK的下游磷酸化靶的选择性抑制。HPDE 6C7细胞对抗δ-生育三烯酚的抑制效应。

图3B是印迹系列，显示了用δ-生育三烯酚(20μM)处理24和48小时的MIA PaCa2和SW1990细胞。将细胞裂解物通过SDS-PAGE运行，并针对p-AKT和AKT(细胞信号传导)进行免疫印迹。印迹显示了在24和48小时时p-AKT蛋白水平降低，但是AKT没有降低。

图4A是显示了胱天蛋白酶(caspase)级联的激活的图，由胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3和Parp以时间依赖性方式裂解所证实。

图4B是系列照片，显示了胱天蛋白酶级联的激活，由胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3和Parp以时间依赖性方式裂解所证实。

图4C是一系列印迹，显示了胱天蛋白酶级联的激活，由胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3和Parp以时间依赖性方式裂解所证实。

图4D是一系列印迹，显示了胱天蛋白酶级联的激活，由胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3和Parp以时间依赖性方式裂解所证实。

图5A显示了处理前和10天时对照和δ-生育三烯酚组的代表性荧光测量。生育三烯酚处理组处理10天时的生长速度较低。将带有荧光素酶的MIA PaCa2细胞的稳定转染子皮下注射到裸鼠中。用卡规每两天测量肿瘤的体积，通过使用IVIS 100 Xenogen系统测量肿瘤的荧光来每周测定生长速度。体积(100-150mm³)和基于荧光的生长速度相似的肿瘤，通过管饲法随机接受介质或δ-生育三烯酚(100mg/kg/天)，为期20天。

图5B是显示了在δ-生育三烯酚处理的异体移植物与介质相比，肿瘤的生长显著降低了50％的图。

图5C是δ-生育三烯酚对致癌的Ras信号传导靶的影响的系列免疫组化染色。增殖的抑制通过用δ-生育三烯酚处理的小鼠肿瘤与对照组的肿瘤相比Ki67减少和通过TUNEL测量的诱导凋亡来证实。

图6是SW1990胰腺癌细胞(Panc-1)在24和48小时的MTS分析图，显示在表I-II中。

图7是MiaPaCa2胰腺癌细胞在24和48小时的MTS分析图，显示在表IV-V中。

图8A是系列的照片，显示了δ-生育三烯酚处理的MIAPaCa2与介质处理的MIAPaCa2或处理过的HPDE 6C7细胞相比，凋亡细胞显著增加。

图8B是其中MIA PaCa-2胰腺癌细胞用不同浓度的δ-生育三烯酚或介质处理24小时的图。收集细胞并用膜联蛋白V-FITC染色，并通过流式细胞术分析凋亡。

图8C是其中BXPC3胰腺癌细胞用不同浓度的δ-生育三烯酚或介质处理24小时的图。收集细胞并用膜联蛋白V-FITC染色，并通过流式细胞术分析凋亡。

图8D是其中SW1990胰腺癌细胞用不同浓度的δ-生育三烯酚或介质处理24小时的图。收集细胞并用膜联蛋白V-FITC染色，并通过流式细胞术分析凋亡。

图9A显示了胱天蛋白酶级联的激活，由胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3和PARP以时间依赖性方式的裂解所证实。

图9B显示了用δ-生育三烯酚处理的MIA PaCa-2细胞对线粒体促凋亡蛋白没有显著的影响，表现为缺少细胞色素C的释放或胱天蛋白酶9裂解而。

图9C显示了在几种胰腺癌细胞系中选择性胱天蛋白酶8和3的裂解，但是在永生化的胰腺导管上皮细胞系HPDE-6C7细胞中没有这种裂解。胱天蛋白酶9在胰腺癌细胞中不裂解。

图10显示了在胰腺癌细胞系中磷酸-AKT(而不是总AKT)的时间依赖性的减少，但是在HPDE细胞中没有。

图11A是其中MIA PaCa-2细胞(pZWL载体和myrAKT)不加血清介质或δ-生育三烯酚(50μM)处理24小时的图，进行或未进行10小时的胱天蛋白酶8/3抑制剂预处理。细胞也用TRAIL处理作为阳性对照。然后收获细胞，固定，通透化并用锥虫蓝染色。图显示了载体处理的细胞与介质、myr-AKT或胱天蛋白酶8/3抑制剂处理的细胞相比，凋亡细胞显著增加。

图11B是其中MIA PaCa-2细胞(pZWL载体和myrAKT)不加血清介质或δ-生育三烯酚(40μM)处理24小时的图，进行或未进行10小时的胱天蛋白酶8/3抑制剂预处理。然后收获细胞，固定，通透化并染色用于Tunel。图显示了载体处理的细胞与介质、myr-AKT或胱天蛋白酶8/3抑制剂处理的细胞相比，凋亡细胞显著增加。

图12A对于肿瘤生长，每隔一天测量裸鼠中的MIA PaCa2异体移植物。通过管饲法每周5次用米糠油(介质)或δ-生育三烯酚(100mg/kg/天)处理小鼠。结果证实了在用δ-生育三烯酚处理的小鼠中胰腺肿瘤生长显著抑制。

图12B免疫组化染色证实了δ-生育三烯酚诱导的凋亡，通过TUNEL染色测定，以及p-AKT表达降低。

图13A是一系列印迹，证实了用编码豆蔻酸化AKT的pWZL逆转录病毒载体感染Mia-PaCa2胰腺癌细胞后，对δ-生育三烯酚抑制PI3K-AKT信号传导的拯救。

图13B是pAKT的密度计量图，证实了用编码豆蔻酸化AKT的pWZL逆转录病毒载体感染Mia-PaCa2胰腺癌细胞后，对δ-生育三烯酚抑制PI3K-AKT信号传导的拯救。

图13C是一系列印迹，显示了δ-生育三烯酚调节AKT信号传导。Mia-PaCa2胰腺癌细胞带有编码豆蔻酸化AKT的pWZL逆转录病毒。

图13D是显示(p-AKT/总)/β-肌动蛋白密度计量图。

图13E是显示％FLIP(长，55kda)/β-肌动蛋白密度计量图。

图13F是显示％FLIP(短，28kda)/β-肌动蛋白密度计量图。

图13G是体内结果的饱和发光照片，显示出δ-生育三烯酚抑制了胰腺癌转移。照片显示了介质与100MPK的比较。

图13H是按照小鼠组称重的肿瘤转移定量的图。

图13I是显示了PBS、介质、50MPK(T3)、100MPK(T3)的相对强度(p/s)/时间的图。

图13J是小鼠胰腺中生育三烯酚累积的饱和的光致发光照片。

图13K是在沉淀和抽提后空白血浆相对于掺δ-生育三烯酚的血浆的色谱图对比。

图13L是显示了δ-生育三烯酚组织水平的图。

图14A是以浸润程度和肿瘤分级显示增殖速度增加的图。这通过针对Ki-67的染色阳性细胞的平均百分率进行性增加而指明。

图14B是显示了用TUNEL染色的凋亡细胞数量的进行性减少与肿瘤浸润程度负相关的图。

图15是非肿瘤胰腺导管组织、反应性组织、前体病变(PanIN 1-3)以及低和高度浸润性癌的一系列代表性玻片。每个代表性区域用苏木精和曙红、以及针对Ki-67、p27、p-MAPK和TUNEL染色。结果显示出当胰腺导管从非肿瘤发展到PanIN到浸润性癌时，Ki-67和p-MAPK染色增加。最高程度的染色是在高级别肿瘤中。相反，p27和TUNEL染色随着肿瘤的浸润性和发展而降低。表明失去了细胞周期抑制和凋亡的诱导。

优选实施方案的具体说明

在下面的优选实施方案的详细描述中，参考了构成本发明一部分的附图，而其内显示的内容可用于说明可以实践本发明的特定实施方案。应该理解的是，可以使用其它的实施方案，并且可以作出结构上的改变而不背离本发明的范围。

δ-生育三烯酚体外抑制胰腺癌细胞

在一个实施方案中，本发明包括一种方法，通过该方法δ-生育三烯酚体外抑制胰腺肿瘤的生长，阻断恶性转化并诱导凋亡。在这里，本发明人显示了δ-生育三烯酚的体外抗瘤变性质。从美国典型培养物保藏中心(ATTC，Rockville，MD)获得人类胰腺导管癌细胞系(MIAPaCa2、SW1990、BXPC3)，按照方案培养至70％铺满，并用δ-生育三烯酚处理。将永生化的人类胰腺导管上皮细胞HPDE 6C7在同样的条件下进行处理，以研究δ-生育三烯酚对胰腺癌细胞的选择性效应。结果显示，δ-生育三烯酚选择性抑制转化和增殖。

用浓度渐增的δ-生育三烯酚处理MIA PaCa2、SW1990、BXPC3和HPDE 6C7细胞。图1A显示了当每周用δ-生育三烯酚处理时，与用介质处理相比，在软琼脂中显著抑制MIA PaCa2细胞的贴壁不依赖性生长的。只在推荐培养基中生长的HPDE 6C7细胞在软琼脂中不经历转化，正如对该肿瘤前细胞系所预计的那样，并用作我们的阴性对照。

将胰腺癌细胞(3 x 10³)铺在96孔板中，并在第二天用δ-生育三烯酚处理。以24小时间隔的MTT评估增殖。结果显示出增殖的剂量依赖性抑制(图1B-1D)。所有三种胰腺癌细胞系的IC₅₀在24小时时为20-25μM。HPDE 6C7细胞也用浓度渐增的δ-生育三烯酚处理24小时。图1E显示δ-生育三烯酚在24小时时对胰腺癌细胞系增殖的选择性抑制。HPDE 6C7细胞相对对抗生育三烯酚的抗增殖效应，即使是在最高的浓度下。

观察到的δ-生育三烯酚对胰腺癌细胞的抗增殖效应可能是通过调节细胞周期而发生的。结果也显示出δ-生育三烯酚引起了选择性的G1期细胞周期停滞，并与周期蛋白激酶抑制剂p27^kip1的上调相关。将MIAPaCa2、SW1990、BXPC3和HPDE 6C7细胞用20μM δ-生育三烯酚或介质处理24小时。收获细胞，用PBS洗两次，并在乙醇中固定过夜。在第二天用PBS清洗沉淀，用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术对细胞周期的期进行分析。

图2A和2B显示了在用δ-生育三烯酚处理的所有三个胰腺癌细胞系中G1期细胞周期的显著停滞。相反，在永生化的胰腺导管上皮细胞(HPDE 6C7)中，δ-生育三烯酚对细胞周期的各期没有影响。G1细胞周期各期的重要调节物包括周期蛋白激酶抑制剂家族的成员。这些成员之一，p27^kip1，看来在胰腺癌的发展中是重要的。图2F显示在胰腺癌细胞中siRNAp27拯救生育三烯酚诱导的G1-S细胞周期停滞。

δ-生育三烯酚对细胞周期的抑制与p27^kip1蛋白表达的改变有关。这4个细胞系用δ-生育三烯酚(20μM)进行处理，并在逐渐增加的时间间隔下收集。将细胞沉淀在PBS中清洗两次并在M-PER(哺乳动物蛋白提取试剂，Pierce)中裂解，制成全细胞裂解物。来自裂解物的蛋白通过SDS-PAGE进行分离，并针对p27^kip1(BD Biosciences)进行免疫印迹。图2C显示了在所有3个胰腺癌细胞系中p27^kip1表达的时间依赖性的上调。相反，在用δ-生育三烯酚处理的HPDE 6C7细胞中，观察到了p27^kip1的下调。

使用荧光素酶报告基因分析研究了δ-生育三烯酚上调p27^kip1蛋白表达的机制。用p27^kip1荧光素酶报告基因(由Pledger博士赠予，MoffittCancer Center，Tampa)转染的Mia PaCa2细胞用δ-生育三烯酚(20μM)或介质处理24小时。然后使用光度计测量荧光素酶的活性。图2D显示了在δ-生育三烯酚处理的MIA PaCa2细胞中荧光素酶活性增加。这表明δ-生育三烯酚通过上调转录增加了p27^kip1蛋白的表达。这种动态被siRNAp27拯救生育三烯酚对MiaPaCa-2细胞的抑制所进一步证实(图2E)。

δ-生育三烯酚也显示出了对致癌Ras信号传导的下游效应子的选择性抑制。超过80％的胰腺癌被证实具有异常的致癌Ras信号传导。Ras效应子途径Raf-MEK-ERK和PI3激酶-AKT分别对于细胞增殖和存活是重要的。数据表明，δ-生育三烯酚对致癌Ras信号传导有抑制效应。

将胰腺癌细胞系(MIA PaCa2、SW1990、BXPC3)和HPDE 6C7细胞用δ-生育三烯酚(20μM)进行处理，并按照上面的描述以逐渐增加的时间间隔收集和制备细胞裂解物。来自裂解物的蛋白以SDS PAGE跑电泳，用下面的抗体进行免疫印迹：Ras、p-cRaf(ser 338)、p-MEK1/2、MEK1/2、pERK 44/42、ERK 44/42(细胞信号传导)和c-Raf(BDTransduction Laboratories)。图3A显示了δ-生育三烯酚对致癌Ras、p-cRaf、p-MEK和p-ERK的下游磷酸化靶的选择性抑制。

HPDE 6C7细胞对δ-生育三烯酚的抑制效应有抗性。然后将MIAPaCa2和SW 1990细胞用δ-生育三烯酚(20μM)处理24和48小时。将细胞裂解物以SDS-PAGE跑电泳，并针对p-AKT和AKT(细胞信号传导)进行免疫印迹。图3B证实了在24和48小时时p-AKT蛋白水平降低，但是AKT没有降低。总的来说，δ-生育三烯酚抑制致癌Ras信号传导的下游效应子而不影响Ras蛋白的水平，可以表明δ-生育三烯酚对致癌Ras的功能的负调控作用。

除了其化学预防性效应之外，δ-生育三烯酚在胰腺癌中还诱导凋亡。将MIA PaCa2细胞用δ-生育三烯酚或介质处理24小时。收集细胞并用膜联蛋白V-FITC染色，通过流式细胞术对凋亡进行分析。图4A显示了在δ-生育三烯酚处理的MIA PaCa2细胞中对早期凋亡的剂量依赖性诱导。在胰腺癌细胞中δ-生育三烯酚选择性诱导凋亡。

将MIA PaCa2细胞和HPDE 6C7细胞用介质或δ-生育三烯酚(20μM)处理24小时。收集细胞并TUNEL染色。图4B显示了δ-生育三烯酚处理的MIA PaCa2细胞与介质处理的MIA PaCa2细胞或处理的HPDE 6C7细胞相比，TUNEL染色显著。这个发现表明在胰腺癌细胞中选择性诱导凋亡。接下来，按照上面的描述在逐渐增加的时间间期从δ-生育三烯酚(20μM)处理的MIA PaCa2细胞制备细胞裂解物。来自裂解物的蛋白以SDS PAGE跑电泳，并对凋亡的生物标志进行免疫印迹。图4C显示了胱天蛋白酶级联的激活，由胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3和Parp的时间依赖性方式裂解所证实。有趣的是，用δ-生育三烯酚处理的MIA PaCa2细胞对线粒体促凋亡蛋白没有显著的影响，表现为缺少细胞色素C的释放或胱天蛋白酶9的裂解。总的来说，这些数据显示在胰腺癌细胞中δ-生育三烯酚对凋亡的诱导是通过激活外源凋亡途径而发生的。

δ-生育三烯酚也体内抑制胰腺癌的生长

对胰腺癌细胞系的处理在体外和体内导致了对凋亡的诱导。δ-生育三烯酚的凋亡效应对于肿瘤细胞是选择性的，因为永生化的人类胰腺导管上皮细胞对δ-生育三烯酚不敏感。对胰腺癌细胞系的处理导致激活了诱导凋亡的外源途径的胱天蛋白酶级联，由胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶3裂解但胱天蛋白酶9不裂解所证实。在δ-生育三烯酚诱导的胰腺癌细胞的凋亡中，缺少线粒体介导的凋亡的进一步证据被缺少细胞色素C释放以及不存在δ-生育三烯酚对线粒体相关蛋白例如Bcl-2和Bad的调节所证实。

将带有荧光素酶的MIA PaCa2细胞稳定转染体皮下注射到裸鼠中。用卡规每两天测量肿瘤的体积，通过使用IVIS 100 Xenogen系统测量肿瘤的发光来每周测定生长速度。体积(100-150mm³)和基于发光的生长速度相似的肿瘤，通过管饲法随机接受介质或δ-生育三烯酚(100mg/kg/天)，为期20天。图5A显示了对照和δ-生育三烯酚组在处理前和第10天时的代表性发光测量。生育三烯酚处理组中处理第10天的生长速度较低。

图5B显示了在δ-生育三烯酚处理的异体移植物与介质处理的相比，肿瘤的生长显著降低了50％。在处理的最后一天取出肿瘤，并包埋在石蜡中。进行免疫组化染色以测定δ-生育三烯酚对致癌Ras信号传导靶的影响。图5C显示了对增殖的抑制，通过δ-生育三烯酚处理的小鼠肿瘤与对照组的肿瘤相比，Ki67减少和以TUNEL测量的诱导凋亡来证实。此外，在δ-生育三烯酚处理的肿瘤中，生物标志蛋白p-MAPK和p-AKT降低，而p27^kip1表达增加。这些体内发现证实了上面体外显示的细胞传导蛋白中可复制的变化。

实施例I

将SW1990胰腺癌细胞(Panc-1)培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素和1％ L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基中。将BxPc-3胰腺癌细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素、1％ HEPES缓冲液、1％丙酮酸钠和1％ L-谷氨酰胺的完全RPMI培养基中。将HPDE6-C7细胞培养在无血清的角化细胞SFM培养基中。所有细胞在含有5％ CO₂的加湿培养箱中被维持在37℃。

表I(24小时)、II(48小时)和III(72小时)显示了有关的结果。每个表的列是不同的处理，包括下列的单一剂量(50μM)：对照(未处理)，介质(只有介质，可以是溶剂)，T3 α(α-生育三烯酚)，T3 β(β-生育三烯酚)，T3 γ(γ-生育三烯酚)，T3 δ(δ-生育三烯酚)，T α(α-生育酚)，T β(β-生育酚)，TS(生育酚琥珀酸酯)，GG(香叶基香叶醇)，SA(琥珀酸)。每列的单元格中的数字是MTS分析的结果；只有最后一列例外，代表了平行结果的平均值除以对照值的平均值(对照总是100)。每一列代表9个平行结果。图6显示了24小时和48小时试验的结果。

                                表I.

                                 表II.

                                表III.

实施例II

将MiaPaCa-2细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素和1％ L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基中。将BxPc-3胰腺癌细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素、1％ HEPES缓冲液、1％丙酮酸钠和1％ L-谷氨酰胺的完全RPMI培养基中。将HPDE6-C7细胞培养在无血清的角化细胞SFM培养基中。所有细胞在含有5％ CO₂的加湿培养箱中被维持在37℃。

表IV(24小时)、V(48小时)和VI(72小时)显示了有关的结果。每个表的列是不同的处理，包括下列的单一剂量(50μM)：对照(未处理)，介质(只有介质，可以是溶剂)，T3 α(α-生育三烯酚)，T3 β(β-生育三烯酚)，T3 γ(γ-生育三烯酚)，T3 δ(δ-生育三烯酚)，T α(α-生育酚)，T β(β-生育酚)，TS(生育酚琥珀酸酯)，GG(香叶基香叶醇)，SA(琥珀酸)。每列的单元格中的数字是MTS分析的结果；只有最后一列例外，代表了平行结果的平均值除以对照值的平均值(对照总是100)。每一列代表9个平行结果。图7显示了24小时和48小时试验的结果。

                             表VI

实施例III

将MiaPaCa-2细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素和1％ L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基中。将BxPc-3胰腺癌细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素、1％ HEPES缓冲液、1％丙酮酸钠和1％L-谷氨酰胺的完全RPMI培养基中。将HPDE6-C7细胞培养在无血清的角化细胞SFM培养基中。所有细胞在含有5％ CO₂的加湿培养箱中被维持在37℃下。

表VII(48小时)和表VIII(5天)显示了有关的结果。每个表的列是不同的处理，包括下列的单一剂量(50μM)：对照(未处理)，介质(只有介质，可以是溶剂)，T3 α(α-生育三烯酚)，T3 β(β-生育三烯酚)，T3 γ(γ-生育三烯酚)，T3 δ(δ-生育三烯酚)，T α(α-生育酚)，T β(β-生育酚)，TS(生育酚琥珀酸酯)，GG(香叶基香叶醇)，SA(琥珀酸)。每列代表7个平行结果和一个空白。每列的单元格中的数字是MTS分析的结果；只有底部的三行例外，分别代表了平行结果的平均值、包括空白的平行结果的平均值，以及平行结果的平均值除以对照值的平均值(对照总是100)。

                           表VII.

                                   表VIII.

实施例IV

将BXPC3细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素和1％ L-谷氨酰胺的完全DMEM培养基中。将BxPc-3胰腺癌细胞培养在含有10％胎牛血清(FBS)和1％青霉素-链霉素、1％ HEPES缓冲液、1％丙酮酸钠和1％ L-谷氨酰胺的完全RPMI培养基中。将HPDE6-C7细胞培养在无血清的角化细胞SFM培养基中。所有细胞在含有5％CO₂的加湿培养箱中被维持在37℃下。

表IX(48小时)和表X(5天)显示了有关的结果。每个表的列是不同的处理，包括下列的单一剂量(50μM)：对照(未处理)，介质(只有介质，可以是溶剂)，T3 α(α-生育三烯酚)，T3 β(β-生育三烯酚)，T3 γ(γ-生育三烯酚)，T3 δ(δ-生育三烯酚)，T α(α-生育酚)，T β(β-生育酚)，TS(生育酚琥珀酸酯)，GG(香叶基香叶醇)，SA(琥珀酸)。每列代表7个平行结果和一个空白。每列的单元格中的数字是MTS分析的结果；只有底部的三行例外，分别代表了平行结果的平均值、包括空白的平行结果的平均值，以及平行结果的平均值除以对照值的平均值(对照总是100)。

                                    表IX.

                            表X.

图8A显示了用δ-生育三烯酚处理的MIAPaCa2与介质处理的MIAPaCa2或处理过的HPDE 6C7细胞相比，其中凋亡细胞显著增加。图8B-8D.MIA PaCa-2、BxPc-3和SW1990胰腺癌细胞也用不同浓度的δ-生育三烯酚或介质处理24小时。收集细胞，用膜联蛋白V-FITC染色，通过流式细胞术对凋亡进行分析。图8B、8C和8D显示了用δ-生育三烯酚处理的MIA PaCa-2细胞与介质处理的相比，对凋亡的剂量依赖性诱导。

图9A显示了胱天蛋白酶级联的激活，由胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3和PARP以时间依赖性方式裂解所证实。有趣的是，用δ-生育三烯酚处理的MIA PaCa-2细胞对于线粒体促凋亡蛋白没有显著的影响，这通过缺少细胞色素C释放和胱天蛋白酶9的裂解所显示(9B)。图9C显示了在几种胰腺癌细胞系中的选择性的胱天蛋白酶8和3的裂解，但是在永生化的胰腺导管上皮细胞系HPDE-6C7细胞中则没有。胱天蛋白酶9在胰腺癌细胞中没有裂解。图10显示了在胰腺癌细胞系中磷酸化AKT(而不是总AKT)的时间依赖性减少，但是在HPDE细胞中则没有。

CA-AKT的功能过表达证实了AKT信号传导和胱天蛋白酶8在δ-生育三烯酚诱导的细胞死亡中的作用(图11A)。MIA PaCa-2细胞(pZWL载体和myrAKT)不加血清介质或δ-生育三烯酚(40或50μM)处理24小时，其中进行或未进行10小时的胱天蛋白酶8抑制剂预处理。细胞也用TRAIL处理作为阳性对照。然后收获细胞，固定，通透化并用锥虫蓝染色。来自图11A的细胞裂解物的Western印迹(图11B)证实了用用50μM生育三烯酚处理后，空载体转染的MiaPaca2亲本细胞与过表达组成性活化(constitutively active)AKT的细胞相比，pAKT降低了。

每两天测量裸鼠的MIA PaCa2异体移植物的肿瘤生长。通过管饲法每周5次用米糠油(介质)或δ-生育三烯酚(100mg/kg/天)处理小鼠。结果(图12A)证实了在用δ-生育三烯酚处理的小鼠中胰腺肿瘤生长显著受抑。免疫组化染色(图12B)证实了δ-生育三烯酚诱导凋亡，这通过TUNEL染色测定，以及p-AKT表达降低。

此外，用编码豆蔻酸化AKT的pWZL逆转录病毒载体感染Mia-PaCa2胰腺癌细胞，证实了对δ-生育三烯酚抑制PI3K-AKT信号传导的拯救。使用表达组成性活化豆蔻酸化AKT的逆转录病毒pWZL载体构建物，稳定地转染MiaPaCa-2亲本细胞系，以产生MiaPaCa-2_AKT细胞。图13A和13B证实了对δ-生育三烯酚下调p-AKT能力的拯救。

图13C到13F显示了AKT和胱天蛋白酶8/3途径参与了生育三烯酚诱导细胞死亡的机制。与介质相比，用生育三烯酚处理在载体细胞中比myr-AKT细胞中诱导了更多的细胞死亡。TRAIL诱导的细胞死亡与介质相当。最后，用胱天蛋白酶3、8和9抑制剂进行预处理拯救了生育三烯酚诱导的细胞死亡。

如图13G-13J所示，δ-生育三烯酚抑制了胰腺癌转移。与介质/PBS相比，在最高剂量下生育三烯酚导致了肿瘤的退化。因此，生育三烯酚抑制了胰腺肿瘤的体内生长。

通过HPLC-UV检测的血浆和小鼠组织中借助于维生素E和δ-生育三烯酚推定的癌症化学预防作用显示在图13K和13L中。生育三烯酚可以在血浆中检测到，并且在胰腺中明显集中。令人吃惊的是，与肝脏和肿瘤中的水平相比，胰腺中生育三烯酚的水平是其10倍。这些结果表明了生育三烯酚作用的机制。

总的来说，这些发现显示出δ-生育三烯酚在胰腺癌细胞中通过外源凋亡途径选择性诱导凋亡。在体内，δ-生育三烯酚选择性抑制PI3-K/AKT途径并诱导凋亡，这与抑制AKT信号传导靶有关。此外，在胰腺癌细胞中过表达myr AKT在体外和体内拯救了δ-生育三烯酚诱导凋亡的效应。此外，生育三烯酚对胰腺癌细胞生长的抑制可以被组成性活化的myrAKT所拯救。这表明在胰腺癌中，生育三烯酚在pAKT的水平下诱导凋亡。

可以看出，δ-生育三烯酚诱导胰腺癌细胞的凋亡可能涉及Akt信号传导途径的调节，因为Akt生存信号传导途径通常在胰腺癌中过表达并牵涉非线粒体相关的凋亡。δ-生育三烯酚在体外和体内抑制丝氨酸/苏氨酸激酶Akt的磷酸化水平。此外，组成性活化的Akt的过表达保护了胰腺癌细胞在与δ-生育三烯酚温育后不经历凋亡。总之，这些数据表明δ-生育三烯酚在胰腺癌细胞中通过激活胱天蛋白酶8级联和抑制Akt生存途径来诱导凋亡，并显示出这种微量营养元素对于体内胰腺癌化学预防和治疗是有用的。

胰腺癌的替代性终点生物标志

从历史上看，药剂的化学预防效益只能够通过降低癌症的发生率或死亡率来显示。使用发生率或死亡率降低作为终点，使得化学预防试验时间长、规模大、花费高，因此除了对于事件率高的癌症之外，是不实用的。事实上，对于胰腺癌化学预防试验的仅有的报告来自于为其它适应症进行的化学预防试验的亚组分析。这种方法获得了对药剂价值的非结论性观察结果，这些药剂例如α-生育酚、β-胡萝卜素、阿司匹林以及非甾体类抗炎药物(NSAID)。

开发化学预防药剂的“早期”临床试验方法学类似于传统癌症疗法的I期和II期研究，这是在推进胰腺癌化学预防药物开发之前的重要研究。理想情况下，这些研究不仅应该证实化学预防的潜力，而且能够回答有关最适剂量和安排的问题。为了应对这些挑战，几位研究人员已经提出并开始了研究，这些研究集中在靶病变病理生理学的候选替代性终点生物标志(SEB)，而不是长期癌症预防上。

在SEB试验中，肿瘤发生率降低被逆转肿瘤表现型的一个或几个要素的证据所代替，这些要素例如异常的增殖、细胞存活性或异常的基因表达。具体来说，这些策略集中在药剂对重要的癌症前病变、上皮内瘤样病变(IEN)的影响。IEN在大多数上皮组织中是被确证的前癌，而黏液性囊性肿瘤(MCN)、导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMN)和胰腺上皮内瘤变(PanIN)是胰腺组织中表征得最好的IEN。这些病变到浸润性癌症的发展过程已经被很好地表征，并且这些病变的外科摘除已经成为防止胰腺癌的推荐的医疗操作。

尽管SEB研究已经很好地建立在不需要外科手术干预的IEN例如口腔粘膜白斑病或巴雷特(Barrett’s)食管的情况下，但在需要立即进行外科手术干预的恶性前病变中进行这样的研究要更为困难，因为标记性病变已经被切除，不能进行后续的跟踪。但是，对诊断和切除浸润性或浸润前胰腺病变的序贯步骤的需求，为短期SEB研究提供了机会。在大多数实践中，标准的间隔是2到4周，因此提供了时间窗，在该时间窗内施用化学预防药剂评估药剂对SEB调节的影响。本发明人的实验显示了在这些病变中受早期遗传变化调节的标准SEB的值，例如增殖速度、凋亡指数和蛋白的表达(在下文讨论)。

在一个实施方案中，本发明包括在经历了浸润性胰腺导管腺癌(IPMN)切除的患者的外科样品中普遍存在的替代性终点生物标志。生育三烯酚，例如来自胭脂树豆的δ-生育三烯酚，证实了选择性抑制人类胰腺癌细胞。数据显示，δ-生育三烯酚影响了许多分子过程，包括诱导凋亡和抑制肿瘤生长，并且δ-生育三烯酚在胰腺肿瘤细胞中抑制致癌信号转导途径。具体来说，δ-生育三烯酚降低了人类胰腺癌细胞中的磷酸化Raf、磷酸化MEK、磷酸化ERK和磷酸化AKT的水平。此外，δ-生育三烯酚诱导生长抑制介导物例如p27^Kip1的表达，并激活凋亡介导物胱天蛋白酶8和胱天蛋白酶3。

从Moffitt癌症中心肿瘤登记和病理(Moffitt Cacer Center TumorRegistry and Pathology)信息系统收集1986年到2006年切除胰腺导管癌的病例。每个病例的载片由单个病理学家对组织学肿瘤类型、级别以及导管的前体病变进行检查。组织类型和级别根据目前的W.H.O.命名法进行分配。胰腺癌前体病变，术语称为胰腺上皮内瘤变(PanIN)按照已发表的标准(Hruban，2001)分级为Ia、Ib、2和3。根据对载片检查，从10个连续切除样品中选择了10个代表性的组织块。优选为显示出癌症(优选超过1级的癌症)、非肿瘤性导管和前体病变的切片。所有的病例都是导管腺癌、NOS，或分化良好到分化差。

图14A到15中显示的数据证实了测定这些中间体生物标志的精确性。注意到Ki67是增殖的可靠标志，在正常到居间到浸润性癌症的核中，阳性反应进行性增加。对TUNEL染色来说，注意到了相反的进展状况，表示在瘤性胰腺导管细胞中凋亡的致癌性抑制。在p27周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白的表达中，观察到了同样的相反进展状况。反之，活化的致癌Ras信号传导的下游调节物例如磷酸化MAPK和磷酸化AKT增加了。显然，所有患有浸润性胰腺导管癌和IPMN的患者在其外科样本中都具有非浸润性的前体病变。

在本探索性研究中没有选择未分化癌或导管腺癌变异体的病例。从每块上切下一张切片，进行常规的苏木精和曙红染色。被切下用于免疫组化的切片被放置在聚L-赖氨酸包被的载玻片上。使用的抗体包括Ki-67、p27和p-MAPK。使用TUNEL分析来评估凋亡。免疫组化研究使用标准的免疫组化技术来进行。然后将载玻片扫描到AppliedImaging的Ariol SL-50(3.0.70版)中，用于准确的、可重复的和客观的高通量分析。由一个病理学家检查图片中癌、PanIN、反应性导管和非瘤性导管的代表性区域。出于本研究的目的，良好分化的和中度分化的癌被分组到一个低级别门类中。分化差的癌被分类为高级别的癌。其它的神经周围浸润区域，如果存在于载玻片上，也将被选择用于分析。

图14A显示了随着浸润程度和肿瘤级别增加，增殖速度增加。这由对Ki-67阳性染色细胞的平均百分率的进行性增加来指示。相反，图14B显示了用TUNEL染色的凋亡细胞的数量进行性降低，与肿瘤浸润的程度负相关。

图15显示了非瘤性胰腺导管组织、反应性组织、前体病变(PanIN1-3)以及低和高级别浸润性癌的代表性载片。每个代表性区域用苏木精和曙红、以及针对Ki-67、p27、p-MAPK和TUNEL染色。

结果显示出Ki-67和p-MAPK染色随着胰腺导管从非瘤性发展到PanIN到浸润性癌而增加。最高程度的染色是在高级别肿瘤中。相反，p27和TUNEL染色随着肿瘤的浸润性和发展而降低。表明失去了对细胞周期的抑制和对凋亡的诱导。

本发明的另一个实施方案包括通过在例如分离的样品中测定生物标志、即p27的水平，在对象中筛查胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌的方法。然后将生物标志的水平与一个或多个对照样品中的相应对照水平进行比较。在优选实施方案中，对照样品从已经被确定没有胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌的个体中获得。

确定对象中生物标志水平和对照样品中生物标志水平之间有统计学显著性的增加，表明对象不存在胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。对象中p27水平与对照样品中生物标志的水平相比有统计学显著性的降低，表明在对象中存在胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。

在可选的实施方案中，测定第二个生物标志即Ki-67和/或p-MAPK的水平，并与一个或多个对照样品中Ki-67和/或p-MAPK的对照水平进行比较。在对象和对照样品中Ki-67和/或p-MAPK的水平之间的统计学显著性增加，表明对象中的胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。对象中Ki-67和/或p-MAPK的水平与对照样品相比有统计学显著性减少，表明了对象中缺少胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。

在对象和对照样品中测定生物标志水平的方法对于普通的专业人员来说是已知的。例如，在一个实施方案中，利用与生物标志结合的抗体来测定生物标志的水平。将含有生物标志的样品与抗体在允许生物标志与抗体结合的条件下相接触；然后可以对存在的生物标志进行定量。

本发明还包括用于执行相关方法的组合物。例如，本发明包括含有多种分离的蛋白的组合物，这些蛋白与相关生物标志的蛋白产物，即Ki-67和/或p-MAPK以及p27，选择性结合。在优选的实施方案中，分离的蛋白选择性扩增互补的双链DNA。还包括含有多种生物标志特异性引物的组合物，其中每个生物标志特异性引物选择性扩增与独特的生物标志例如Ki-67、p-MAPK和p27互补的双链DNA。可选地，本发明包括含有多种分离蛋白的组合物，这些蛋白选择性结合至少两个独特生物标志的蛋白产物，其中每个独特的生物标志选自Ki-67、p-MAPK和p27。

本文中使用的术语“生物标志”是指在患有癌症、包括胰腺癌或一定阶段的胰腺癌的个体中，与没患有癌症、包括胰腺癌或一定阶段的胰腺癌的个体相比，差异表达的基因。术语“生物标志”可以包括在患有浅表型胰腺癌的个体中与没患有胰腺癌的个体相比差异表达的基因。

本文中使用的术语“生物标志特异性引物”是指一组引物，其可以产生与本发明的生物标志的一种或多种RNA产物的一部分互补的双链DNA。例如，该引物可以包括其序列可以同与本发明的生物标志互补的RNA、cDNA或EST选择性杂交的第一个引物，用于产生延伸产物，以及能够与延伸产物选择性杂交的第二个引物，所述引物用于产生与本发明的生物标志互补的双链DNA。

本文中使用的术语“引物”是指寡核苷酸，无论是以纯化的限制性消化片段形式天然存在的或合成生产的，该寡核苷酸，当置于诱导合成与核酸链互补的引物延伸产物的条件下，即存在核苷酸和诱导试剂例如DNA聚合酶以及在适合的温度和pH下，能够作为合成的起始点。引物可以是单链的或双链的，并且必须足够长，以便在诱导试剂的存在下引发所需延伸产物的合成。引物的准确长度取决于许多因素，包括温度、引物的来源以及所用的方法。例如，对于诊断应用来说，取决于靶序列的复杂程度，寡核苷酸引物通常包含15-25个或更多的核苷酸，尽管它也可以含有更少的核苷酸。涉及确定引物的最适长度的因素对于本技术领域的专业人员来说是容易了解的。一般来说，本发明体现的引物的设计和选择是按照本技术领域中标准的和众所周知的方法，参见Dieffenbach，C.W.，Lowe，T.M.J.，Dveksler，G.S.(1995)《PCR引物设计的一般性概念》(General Concepts for PCR PrimerDesign.)，在《PCR引物，实验室手册》(PCR Primer，A LaboratoryManual)一书中(Dieffenbach，C.W和Dveksler，G.S.编著)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York，133-155；Innis，M.A.，和Gelfand，D.H.(1990)《PCR的优化》(Optimization of PCRs.)，在《PCR方案：方法与应用指导》一书中(PCR protocols，A Guide to Methods andApplications)(Innis，M.A.，Gelfand，D.H.，Sninsky，J.J；和White，T.J.编著)，Academic Press，San Diego，3-12；Sharrocks，A.D.(1994)《PCR引物的设计》(The design of primers for PCR.)，在《PCR技术：最新革新》一书中(PCR Technology，Current Innovations)(Griffin，H.G.和Griffin，A.M，编著)，CRC Press，London，5-11。

本文中使用的术语“生物标志特异性探针”是指与独特的生物标志的RNA产物选择性和特异性杂交的探针。在一个实施方案中，生物标志特异性探针可以是具有荧光团和淬灭剂的探针，例如TaqMan.RTM探针、分子信标(Molecular Beacons)探针。在另一个实施方案中，生物标志特异性探针是与阵列结合并且与独特的生物标志的一种或多种RNA产物(或对应于所述RNA产物的cDNA、EST或PCR产物)选择性和特异性杂交的探针。生物标志特异性探针可以包括寡核苷酸探针，也可以包括较长的探针(例如60、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500个核苷酸等)。

在本文中使用的术语“探针”是指寡核苷酸及其类似物，并且是指通过与靶序列的核苷酸碱基的氢键相互作用识别多核苷酸靶序列的化学物质范围。探针或靶序列可以是单链或双链RNA或单链或双链DNA，或DNA和RNA碱基的组合。探针至少为8个核苷酸长，并小于完整基因的长度。探针的长度可以是10、20、30、50、75、100、150、200、250、400、500和直至2000个核苷酸。探针可以包含修饰的寡核苷酸，以便具有可以通过荧光、化学发光等检测的标签。探针也可以被修饰以便同时具有可检测的标签和淬灭剂分子，例如Taqman.RTM.探针和Molecular Beacon.RTM.探针。

在本文中使用的术语“生物标志的产物”或“生物标志产物”是指对应于生物标志或由生物标志编码的RNA或蛋白(即从基因或遗传元件转录，或从基因或遗传元件转录的RNA翻译的)。例如，在某些实施方案中，从生物标志产生的RNA可以包含一种或多种下列物质：hnRNA、mRNA和或mRNA的一种或多种拼接变异体。在某些实施方案中，从分子标志产生的蛋白可以包括在血液中发现的与生物标志产生的RNA相对应的任何蛋白。

本文中使用的术语“对照”或“对照样品”在本发明的背景中，是指一个或多个组织核酸样品和/或血液核酸样品，和/或一个或多个个体，这些个体通过本技术领域的专业人员熟知的方法进行测定而被分类为：患有胰腺癌，患有一个或多个阶段的胰腺癌和/或浅表型膀胱癌；不患有胰腺癌，患有一个或多个阶段的胰腺癌和/或浅表型膀胱癌。术语对照或对照样品也可以指从被诊断为正常(不患有胰腺癌)、患有胰腺癌、或具有一定阶段的胰腺癌的一个或多个个体的样品获得的数据的汇编。正如本技术领域的专业人员所理解的那样，术语对照被用于实验的背景中，并将依赖于所需的比较。本文中使用的术语“对照”在筛查预防性或治疗性药剂的背景中，是指其它条件可以被比较的分析或方法的标准或参照。

本文中使用的术语“有效量”是指化合物的量足以减轻或缓解胰腺癌或其一种或多种症状的发展和/或严重性、防止胰腺癌或其一种或多种症状的发展、复发或发作、防止胰腺癌或其一种或多种症状的进展、或增加或改进另一种疗法的预防或治疗效果。

本文中使用的术语“化疗剂”是指任何能够用于胰腺癌或其一种或多种症状的治疗、管理或缓解的化合物。

本文中使用的术语“治疗有效量”是指疗法(例如化疗剂)的量足以导致胰腺癌或其一种或多种症状的缓解、防止膀胱癌发展引起膀胱癌退化、或增加或改进另一种疗法(例如化疗剂)的治疗效果。

本文中使用的术语“疗效”是指药物和/或的有效性。“化疗疗效”通常是通过已经或正在使用药物和/或药剂治疗的患者的临床反应来测量的。药物如果达到了所需的临床结果，例如在本说明书中描述的减轻了与胰腺癌、一定阶段的胰腺癌有关的症状、或阻止了胰腺癌的发展，就被认为具有高度的疗效。吸收的药量可以被用于预测患者的反应。通用的准则是，随着药物剂量增加，在患者中观察到了更大的效果，直到达到所需的最大的期望效果。

本文中使用的术语“表达水平”是指通过专业人员已知的方法测定，对应于基因的给定核酸或蛋白的量的确定。对于对应于本发明的生物标志的RNA、hnRNA、mRNA或mRNA的拼接变异体来说，表达水平可以通过杂交以及其它的测量方法来测定，例如使用了SYBR.RTM.绿的定量实时RT PCR、TaqMan.RTM.和分子信标技术。需要注意的是，在本文中使用时，差异表达水平的确定可以包括对给定核酸或蛋白的量之间的差异进行目测检查，例如通过分析northern印迹或western印迹。

本文中使用的术语“选择扩增”或“选择性扩增”是指从模板核酸选择性产生特定靶核酸序列的一个或多个拷贝的过程。选择扩增或选择性扩增是与普遍扩增相比较而言的，普遍扩增可以与例如随机引物和寡聚dT引物相结合用作扩增核酸序列(例如mRNA)群体的方法。选择性扩增优选通过聚合酶链反应方法(Mullis和Faloona，1987，Methods Enzymol.155：335)来进行。

本文中使用的术语“选择性结合”在用于本发明所包涵的蛋白的情况下，是指肽、蛋白、多肽和抗体的任何两种的特异性相互作用，其中相互作用当与任何其它的肽、蛋白、多肽和抗体相比时，倾向于发生在任何两种优选的肽、蛋白、多肽和抗体之间。例如，当两个分子是蛋白分子时，第一个分子上的结构识别并结合于第二个分子而不是其它蛋白上的结构。本文中使用的术语“选择性结合”是指分子与其特异性结合的配偶体结合的亲和性，比它与非特异性分子结合的亲和性高至少两倍，优选至少10倍、20倍、50倍、100倍或更高。

因此，在一个实施方案中，本发明包括通过在分离的样品中测定替代性终点生物标志例如p27的第一个水平来确定化疗剂的有效性的方法。然后将样品与实验有效量的测试化疗剂相接触。在施用化疗剂后，获取替代性终点生物标志的第二个水平，并与第一个(治疗前)水平相比较。当p27的第二个(治疗后)水平比治疗前和/或对照水平增加到有统计学显著性的程度时，候选的化疗剂的有效性得到了证实。

在另一个实施方案中，本发明提供了通过进一步测定分离的样品中第二个替代物终点生物标志例如Ki-67和/或p-MAPK的第一个水平来确定化疗剂的有效性的方法。在施用化疗剂之后，获取Ki-67和/或p-MAPK的第二个水平，并与第一个(治疗前)水平和/0或对照进行比较。当Ki-67和/或p-MAPK的第二个(治疗后)水平比治疗前和/或对照水平降低到有统计学显著性的程度时，候选的化疗剂的有效性得到了证实。

本发明的另一个实施方案包括通过测定例如分离的样品中生物标志即p27的水平，在对象中筛查胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌的方法。然后将生物标志的水平与一个或多个对照样品中的相应对照水平进行比较。在优选的实施方案中，对照样品从已经确定不患有胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌的个体获得。

测得对象中的生物标志水平与对照样品中的生物标志水平之间有统计学显著性的增加，表明对象没有胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。在对象中p27的水平与对照样品中生物标志的水平相比有统计学显著性降低，表明了在对象中存在胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。

在可选的实施方案中，测定第二个生物标志即Ki-67和/或p-MAPK的水平，并与一个或多个对照样品中Ki-67和/或p-MAPK的对照水平相比较。在对象和对照样品中Ki-67和/或p-MAPK水平之间的统计学显著性增加，指示了对象中的胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。对象中Ki-67和/或p-MAPK的水平与对照样品相比有统计学显著性降低，指示了对象中没有胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。

在对象和对照样品中测定生物标志水平的方法对于普通的专业人员来说是已知的。例如，在一个实施方案中，利用与生物标志结合的抗体来测定生物标志的水平。将含有生物标志的样品与抗体在允许生物标志与抗体结合的条件下相接触；然后可以对存在的生物标志进行定量。

本发明还包括用于执行相关方法的组合物。例如，本发明包括含有多种分离的蛋白的组合物，这些蛋白与相关生物标志的蛋白产物，即Ki-67和/或p-MAPK以及p27，选择性结合。在优选的实施方案中，分离的蛋白选择性扩增了互补的双链DNA。还包括含有多种生物标志特异性引物的组合物，其中每个生物标志特异性引物选择性扩增与独特的生物标志例如Ki-67、p-MAPK和p27互补的双链DNA。可选地，本发明包括含有多种分离的蛋白的组合物，这些蛋白选择性地结合至少两个独特的生物标志的蛋白产物，其中每个独特的生物标志选自Ki-67、p-MAPK和p27。

测定生物标志的水平(例如定量)的方法是普通的专业人员容易了解的，包括但不限于测定表达水平、RNA水平、PNA产物的水平、蛋白的水平和/或蛋白活性水平。

可以看出，上面提出的以及从上面的描述中所了然的本发明的优点，被有效地获得了，并且因为在上面的构造中可以进行某些改变而不背离本发明的范围，因此，宗旨在于上面说明书中包含的或附图中显示的所有主题应理解为是说明性的，而不具有限制的含义。

还应该理解，下面的权利要求书旨在涵盖本文描述的发明的所有通用的和具体的特点，以及就语言而言可以被说成是处于本发明范围内的所有陈述。现在，已经对本发明进行了描述

Claims (31)

1.有效量的生育三烯酚在制备用于治疗或防止胰腺癌或胰腺导管癌的组合物中的应用。

2.权利要求1的应用，其中所述生育三烯酚选自γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚。

3.权利要求1的应用，其中含有治疗有效量的生育三烯酚的组合物作为药物组合物施用。

4.权利要求1的应用，其中所述组合物基本上不含α-生育三烯酚和β-生育三烯酚。

5.权利要求1的应用，其中所述组合物基本上不含选自α-生育三烯酚、β-生育三烯酚和γ-生育三烯酚的至少一种生育三烯酚。

6.权利要求1的应用，其中所述组合物基本上不含生育酚。

7.权利要求1的应用，其中所述组合物含有100mg到300mg之间的生育三烯酚。

8.权利要求1的应用，其中所述组合物还含有治疗有效量的选自吉西他滨和5-FU的化疗剂。

9.在细胞中上调p27表达的体外方法，包括将细胞与含有有效量的生育三烯酚的组合物相接触的步骤。

10.权利要求9的方法，其中所述生育三烯酚选自γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚。

11.权利要求9的方法，其中所述含有治疗有效量的生育三烯酚的组合物作为药物组合物施用。

12.权利要求9的方法，其中所述组合物基本上不含α-生育三烯酚和β-生育三烯酚。

13.权利要求9的方法，其中所述组合物基本上不含选自α-生育三烯酚和β-生育三烯酚的至少一种生育三烯酚。

14.有效量的生育三烯酚在制备用于在对象中防止胰腺癌发展的药物中的应用。

15.权利要求14的应用，其中所述生育三烯酚选自γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚。

16.权利要求14的应用，其中所述对象选自对胰腺癌具有遗传体质的对象和患有瘤前病变的对象。

17.权利要求16的应用，其中所述瘤前病变选自PanIN、IPMN和MCN。

18.有效量的生育三烯酚在制备用于在术后对象中防止转移的药物中的应用，其中所述对象已经切除了胰腺癌。

19.权利要求18的应用，其中所述生育三烯酚选自γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚。

20.在癌症细胞中诱导凋亡的体外方法，包括将细胞与含有治疗有效量的生育三烯酚的组合物相接触。

21.权利要求20的方法，其中所述生育三烯酚选自γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚。

22.权利要求20的方法，其中所述组合物基本上不含α-生育三烯酚和β-生育三烯酚。

23.权利要求20的方法，其中所述组合物基本上不含选自α-生育三烯酚、β-生育三烯酚和γ-生育三烯酚的至少一种生育三烯酚。

24.权利要求20的方法，其中所述组合物基本上不含生育酚。

25.权利要求20的方法，其中所述癌症是胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。

26.在癌症细胞中抑制致癌PI3K-AKT信号转导途径的体外方法，包括将细胞与含有治疗有效量的生育三烯酚的组合物相接触。

27.权利要求26的方法，其中所述生育三烯酚选自γ-生育三烯酚和δ-生育三烯酚。

28.权利要求26的方法，其中所述组合物基本上不含α-生育三烯酚和β-生育三烯酚。

29.权利要求26的方法，其中所述组合物基本上不含选自α-生育三烯酚、β-生育三烯酚和γ-生育三烯酚的至少一种生育三烯酚。

30.权利要求26的方法，其中所述组合物基本上不含生育酚。

31.权利要求26的方法，其中所述癌症是胰腺导管癌或一定阶段的胰腺癌。

Images