CN110760564A - 细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒 - Google Patents

细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒。所述方法包括：使用浓度为0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。该方法可以显著缩短检测时间，最快约10分钟左右即可完成检测，且检测准确度好，效率高。

Description

细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种细胞周期检测方法及其所用试剂与试剂盒。
背景技术
真核细胞分裂通过高度受控的包括称为G1、S、G2和M的连续阶段的细胞周期来进行。细胞周期进展是通过许多细胞周期调节相关的信号通路(特别是周期蛋白相关通路)在规定时间和空间激活或关闭来严格控制的，它们在细胞周期期间呈现高度的动态性。例如，在特定的细胞周期阶段，一些蛋白质从细胞核转移到细胞质，或者相反，以及一些蛋白质被迅速降解等。
细胞周期状态的准确确定是研究影响细胞周期或依赖于细胞周期位置的细胞过程的关键要求。这些测定在药物筛选应用中是特别至关重要的。
目前细胞周期检测方法通常有以下几种：
1.同位素标记法测定细胞周期
标记有丝分裂百分率法(percentage labeled mitoses，PLM)是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。
2.基于成像的荧光检测法
FUCCI(fluorescent ubiquitination-based cell-cycle indicator,FUCCI)小球能鉴别细胞处在细胞周期的哪一时期，因此可以用来研究癌症细胞周期的进程。FUCCI技术建立在鉴定过表达的两种调节细胞周期的蛋白geminin和Cdt1水平上，其中geminin融合的是绿色荧光基团AmCyan，而Cdt1融合的是红色荧光基团mCherry。Cdt1和geminin的水平随着细胞周期的变化而不断波动：Cdt1蛋白水平在G1阶段达到峰值，而geminin蛋白水平在S、G2和M期不断升高。这一结果体现为表达FUCCI细胞核在G1期为红色而在S、G2和M期则呈现绿色。
3.流式细胞术PI(Propidium Iodide，碘化丙啶)染色法
由于细胞周期各时相的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体和四倍体之间。PI可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0期、S期和G2/M期，获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。主要方法简述如下：收集细胞；加入75％乙醇；放置过夜(大于24小时)；洗涤后RNase I(RNA酶I，10mg/ml，无DNA酶活性)消化并PI(1mg/ml)染色；上机检测。
然而方法1放射性污染严重，设备要求极高。
方法2操做复杂且设备要求高，单次实验成本高。
方法3流式细胞术PI染色法是主流检测方法。然而整个检测从细胞准备好后，加入75％乙醇作用，细胞固定同时被打孔，至少需要花费24小时才能上机检测，对于药企研发和科研研究来说造成了很大的时间损耗。且方法3中，乙醇固定、PI染色与RNA消化是分三步进行的，耗时耗力。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种细胞周期检测方法，包括：使用0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。
该方法可以显著缩短检测时间，最快约10分钟左右即可完成检测，且检测准确度好，效率高。
本发明的第二目的在于提供一种用于细胞周期检测的试剂，其组成及工作浓度在以下范围内：
种类和使用量为如上所定义的皂素、DNA结合染料与核糖核酸酶。
本发明的第三目的在于提供一种试剂盒，其包含如上所述的试剂，或用于配置所述试剂的各组分。
所述试剂和试剂盒用于执行上述方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1：本发明一个实施例中75％乙醇处理(阳性对照)的实验结果；
图2：本发明一个实施例中1％saponin+1％多聚甲醛的实验结果；
图3：本发明一个实施例中0.5％saponin+1％多聚甲醛的实验结果；
图4：本发明一个实施例中0.1％saponin+1％多聚甲醛的实验结果；
图5：本发明一个实施例中0.1-0.25％saponin+0.1％Tween20的实验结果；
图6：本发明一个实施例中0.1-0.25％saponin+0.1％Triton X-100的实验结果；
图7：本发明一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS 0分钟的实验结果；
图8：本发明一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS 5分钟的实验结果；
图9：本发明一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS 10分钟的实验结果；
图10：本发明一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS 15分钟的实验结果；
图11：本发明一个实施例中0.1％-0.25％saponin+PBS+100ug/ml PI+1mg/mlRNase I 10分钟的实验结果。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
因此，旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述，而非意在限制本发明更广阔的方面。
本发明涉及一种细胞周期检测方法，包括：使用浓度为0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。
通过对所述DNA结合染料进行检测可以确定细胞所在周期，这对本领域技术人员是容易的。
0.06％～0.3％(g/ml)的皂素浓度是以分析纯级别皂素计。其浓度还可以选择(g/ml)0.07％、0.08％、0.09％、0.10％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％、0.15％、0.16％、0.17％、0.18％、0.19％、0.20％、0.21％、0.22％、0.23％、0.24％、0.25％、0.26％、0.27％、0.28％和0.29％；优选0.08％～0.12％(g/ml)或0.23％～0.27％(g/ml)；更优选0.09％～0.11％(g/ml)或0.24％～0.26％(g/ml)；最优选0.10％(g/ml)或0.25％(g/ml)。
皂素(saponin)在本申请中主要功能是作为破膜剂发挥作用。皂素是一类结构较为复杂的成分，由皂苷和糖、糖醛酸或其他有机酸所组成。皂素能提高细胞膜的透过性，与甾醇类、醇类、酚类可形成难溶性化合物。因此皂素能能移除细胞膜上的脂类物质，造成细胞膜的通透性增加，使得DNA结合染料能进入细胞内部，进而通过核膜孔进入细胞核，进行细胞的DNA染色。
在一些实施方式中，检测所用细胞可以是分离自活体的内源性细胞，优选是人细胞，也可以是常见的细胞系，例如HeLa细胞、Vera细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、U2OS、COS、BHK、HepG2、NIH 3T3MDCK、RIN、HEK293以及其它体外培养的哺乳动物细胞系。
在一个优选的实施方式中，所述皂素、所述DNA结合染料与所述核糖核酸酶与所述细胞共孵育。
一次性加入试剂，可以极大提高操作效率并避免了漏加/误加试剂的可能。
在一些实施方式中，所述DNA结合染料选自碘化丙啶、7-氨基放线菌素D、Hoechst33342、Hoechst 33258、Hoechst S769121、TO-PRO-3、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、DRAQ5TM和DRAQ7TM中的一种或多种。
在一些实施方式中，所述DNA结合染料为70μg/ml～130μg/ml的碘化丙啶；碘化丙啶的浓度还可以选择为80μg/ml、90μg/ml、100μg/ml、110μg/ml以及120μg/ml。
在一些实施方式中，所述核糖核酸酶选自RNase I、RNase III、RNase A、RNase B、RNase C、RNase D、RNase H、RNase L、RNase P、RNase PH、RNase PhyM、RNase R、RNase U2，RNaseN1、RNaseN2、RNase T1、RNase T2、RNase VI、RNase V、寡核糖核酸酶(Oligoribonuclease)、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II以及重组核糖核酸酶中的一种或多种。
所述核糖核酸酶优选DNase-free的RNase。
在一些实施方式中，所述核糖核酸酶为0.7mg/ml～1.3mg/ml的RNase I；核糖核酸酶的浓度还可以选择为0.8mg/ml、0.9mg/ml、1.0mg/ml、1.1mg/ml以及1.2mg/ml。
在一些实施方式中，所述皂素与细胞接触的时间为5min～15min，还可以选择6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min以及14min。接触的温度可以选择活细胞通常能够耐受的温度，优选为约37摄氏度；或者是不要求细胞存活，选择RNA酶活性较好或染色效率较高或DNA不易降解的温度。接触的过程可以将反应体系溶液进行在适当的速度下的震荡或摇晃以促进反应进行，例如在涡旋混合器或者摇床上进行。
在一些实施方式中，所述方法中不使用额外的细胞透膜剂。
额外的细胞透膜剂是指除皂素以外的细胞透膜剂，例如本领域常用的Triton X-100、Tween-20、Np-40、SaponiruDigitonin和Leucoperm等。
在一些实施方式中，所述方法中不使用细胞固定剂。
常见的细胞固定剂例如多聚甲醛、丙酮、甲醇和乙醇等。
根据本发明的一方面，本发明还涉及用于细胞周期检测的试剂，其组成及工作浓度在以下范围内：
种类和使用量为如上所定义的皂素、DNA结合染料与核糖核酸酶。
所述试剂中的成分的浓度为“工作浓度”，或能够稀释为该浓度的母液(例如经过本领域常规浓缩方法得到的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍浓缩的母液)。
在一些优选的实施方式中，所述用于细胞周期检测的试剂，其组成及工作浓度在以下范围内：
0.06％～0.3％(g/ml)的皂素、70μg/ml～130μg/ml的碘化丙啶以及0.7mg/ml～1.3mg/ml的RNase I。
在一些优选的实施方式中，所述用于细胞周期检测的试剂，其组成及工作浓度在以下范围内：
0.08％～0.12％(g/ml)或0.23％～0.27％(g/ml)的皂素、70μg/ml～130μg/ml的碘化丙啶以及0.7mg/ml～1.3mg/ml的RNase I。
在一些优选的实施方式中，所述用于细胞周期检测的试剂，其组成及工作浓度在以下范围内：
0.09％～0.11％(g/ml)或0.24％～0.26％(g/ml)的皂素、80μg/ml～120μg/ml的碘化丙啶以及0.8mg/ml～1.2mg/ml的RNase I。
在一些优选的实施方式中，所述用于细胞周期检测的试剂，其组成及工作浓度在以下范围内：
0.10％(g/ml)或0.25％(g/ml)的皂素、90μg/ml～110μg/ml的碘化丙啶以及0.9mg/ml～1.1mg/ml的RNase I。
在一些实施方式中，所述组合物中还包含缓冲组分。
如本文使用的术语“缓冲组分”指水溶液组合物，当酸或碱加入该溶液或组合物中时，所述水溶液或组合物抵抗pH中的变化。这种对pH变化的抗性是由于此类溶液的缓冲性质。因此，显示出缓冲活性的溶液或组合物被称为缓冲液或缓冲溶液。缓冲液一般不具有无限的维持溶液或组合物的pH的能力。相反，它们一般能够维持在特定范围内的pH，例如pH 7～pH 9。一般地，缓冲液能够维持在其pKa上和下一个对数内的pH(参见例如，Mohan，Buffers，A guide for the preparation and use of buffers in biological systems，CALBIOCHEM，1999)。可以在本发明的方法中使用的缓冲组分优选选自磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水缓冲液(PBS)、2-氨基-2羟甲基-1,3-丙二醇(TRIS)缓冲液、TRIS缓冲盐水溶液(TBS)和TRIS/EDTA(TE)。
本发明还提供试剂盒，其包含如上所述的试剂，或用于配置所述试剂的各组分。
当所述试剂盒包含用于配置所述试剂的各组分时，为保证原料活性，原料(特别是RNA酶)通常为冻干的干粉状；也可以为各原料的浓缩液，通常与低温下保存。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
附录下述实施例部分所用试剂以及设备和软件信息：
皂素(Saponin)
商品名：Saponin from Quillaja bark
厂家：BBI Life Sciences
批号:EC10BA0017
储存条件:2～8℃
过期期限:12/2021
货号：8047-15-2
分子量：414.63
分子式：C27H42O3
纯度级别：Pract Grade
磷酸盐缓冲液(PBS)
商品名：PBS Tablets
厂家：Gibco
目录号：18912-014
批号：1991601
过期期限:2023-03
碘化丙啶(PI)
商品名：Propidium iodide
厂家：BBI Life Sciences
纯度级别：BC Grade
货号：255325-16-4
存储条件：-20℃
批号：F213BA0027
过期期限：02/2021
分子式：C27H3412N4
分子量：MW668.39
RNA酶I(RNase I)
商品名：RNase I(又名RNase A)
目录号：B100675-0500
批号：F620BA0028
过期期限：2021/06/20
存储条件：-20℃
浓度：10mg/ml
流式设备：Invitrogen Attune NxT流式细胞仪
供应商：Thermo Fisher
周期拟合软件：ModFit LT 5.0
一、由于皂素的皂苷活性很强，因此本发明设置最高浓度为2％(质量体积比，2克皂素，100ml PBS)，设置浓度分别为：2％、1％、0.5％、0.25％和0.1％。考虑到细胞需要固定，我们在每个皂素浓度都加入了1％的多聚甲醛固定剂(固定细胞的常规浓度)，实验步骤(以下简称为方法A)如下：
1)1％的多聚甲醛固定剂过夜(大于24小时)；
2)准备细胞，数量为1×106cells；
3)用不同浓度的皂素PBS缓冲液150μl重悬细胞；
4)加入PI(100ug/ml)染料和RNase I酶(1mg/ml)；
5)涡旋孵育10min后立刻上机检测。
用75％乙醇过夜固定的细胞做阳性对比：
1收集细胞；2加入75％乙醇；3放置过夜(大于24小时)；4洗涤后RNase I(RNA酶I，10mg/ml，无DNA酶活性)消化并PI(1mg/ml)染色10min；5上机检测。
结果显示，乙醇阳性对照组结果很好(图1)，而皂素处理组效果都很差(图2为1％saponin+1％多聚甲醛10分钟；图3为0.5％saponin+1％多聚甲醛10分钟；图4为0.1％saponin+1％多聚甲醛10分钟)。
进一步的，发明人更换了不同浓度的多聚甲醛，从0.1％、1％、2％和4％，效果不理想；把固定剂换做相应浓度的甲醛，效果仍然很差。虽然结果很差，但是从图2-图4清晰的判断出低浓度的saponin比高浓度效果好很多，因此发明人把saponin的浓度锁定在0.1％-0.25％左右进行测试。
考虑到样品孵育时间短，细胞可能不需要固定，因此发明人撤掉了固定剂，换用低浓度的破膜试剂(Tween-20，Triton X-100)辅助saponin对细胞膜进行打孔，增强细胞膜的通透性，操作同方法A，结果见图5：0.1％-0.25％saponin+0.1％Tween-20和图6：0.1％-0.25％saponin+0.1％Triton X-100，发现效果仍然很差。
至此发明人判定，使用低浓度saponin大大优于高浓度；加入固定剂和破膜剂并不能带来收益，因此单独使用不同浓度的皂素处理细胞(将方法A中的步骤1)去除)，做了不同时间段的孵育，发现0分钟时间点结果不好(图7)，而5分钟(图8)到15分钟的结果很好(图10)，10分钟是最优时间点(图9)。
考虑到用户使用方便，本发明进一步把皂素和PI、RNase I做了混合：
1)准备细胞，数量为1×106cells；
2)用0.1％(g/ml)～0.25％(g/ml)的皂素、PI(100ug/ml)染料和RNase I酶(1mg/ml)的混合PBS缓冲液150μl重悬细胞；
3)涡旋孵育10min后立刻上机检测。
结果如图11所示，可以快速高效检测动物细胞周期。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.细胞周期检测方法，包括：使用浓度为0.06％～0.3％(g/ml)的皂素与细胞接触增强其细胞膜的通透性，以使得DNA结合染料与核糖核酸酶能够进入细胞内并发挥活性。
2.根据权利要求1所述的细胞周期检测方法，所述皂素的浓度为0.08％～0.12％(g/ml)或0.23％～0.27％(g/ml)。
3.根据权利要求1所述的细胞周期检测方法，将所述皂素、所述DNA结合染料和所述核糖核酸酶与所述细胞共孵育。
4.根据权利要求1所述的细胞周期检测方法，所述DNA结合染料选自碘化丙啶、7-氨基放线菌素D、Hoechst 33342、Hoechst 33258、Hoechst S769121、TO-PRO-3、4',6-二脒基-2-苯基吲哚、DRAQ5TM和DRAQ7TM中的一种或多种；
优选的，所述DNA结合染料为70μg/ml～130μg/ml的碘化丙啶。
5.根据权利要求1所述的细胞周期检测方法，所述核糖核酸酶选自RNase I、RNaseIII、RNase B、RNase D、RNase H、RNase L、RNase P、RNase PH、RNase PhyM、RNase R、RNaseU2，RNaseN1、RNaseN2、RNase T1、RNase T2、RNase VI、RNase V、寡核糖核酸酶、核糖核酸外切酶I、核糖核酸外切酶II以及重组核糖核酸酶中的一种或多种；
优选的，所述核糖核酸酶为0.7mg/ml～1.3mg/ml的RNase I。
6.根据权利要求1～5任一项所述的细胞周期检测方法，所述皂素与细胞接触的时间为5min～15min。
7.根据权利要求1～5任一项所述的细胞周期检测方法，所述方法中不使用额外的细胞透膜剂和/或细胞固定剂。
8.用于细胞周期检测的试剂，其组成及工作浓度在以下范围内：
种类和使用量为权利要求1～7任一项中所定义的皂素、DNA结合染料与核糖核酸酶。
9.根据权利要求8所述的试剂，其特征在于，所述试剂中还包含缓冲组分。
10.试剂盒，其包含权利要求8或9所述的试剂，或包含用于配置所述试剂的各组分。
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