CN112147114A - 一种利用荧光标记化合物确定化合物在活细胞中与靶标相互作用的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用荧光基团标记化合物确定化合物与靶标蛋白相互作用的方法。本发明的方法可以对化合物在细胞水平的靶点相互作用、靶向分布特异性、化合物透膜性以及潜在细胞学活性进行比较分析，为通过诸如DNA编码化合物库技术等方法获得的先导化合物提供了评价其在细胞内生理环境下的活性的新方法。
Description
技术领域
本发明属涉及一种利用荧光基团标记化合物确定化合物与靶标蛋白相互作用的方法。尤其适用于研究在药物研发阶段评价化合物与靶标蛋白在活细胞内相互作用的机制，可以对多个化合物在细胞水平的靶点相互作用、靶向分布特异性、化合物透膜性以及潜在细胞学活性进行比较分析，为通过诸如DNA编码化合物库技术等方法获得的先导化合物提供了评价其在细胞内生理环境下的活性的新方法。
背景技术
在新药物研发过程中常用能量共振转移、热位移分析、功能分析和信号通路的方法研究先导化合物与靶标之间的相互作用机制。能量共振转移是通过分析先导化合物与靶标由于相互结合而导致其所带的荧光供体和荧光受体之间发生能量转移导致的荧光信号变化，根据这种能量变化来研究先导化合物与靶标之间的相互作用；热位移分析是通过在变性的蛋白中所结合的染料分子的荧光特性发生改变，进而反应出蛋白的开环状态。信号通路和功能分析是通过检测样品中加入先导化合物后所引起的通路信号的改变来间接的研究先导化合物与靶标之间的相互作用。
DNA编码化合物库技术是一种新的药物发现技术，其基于化合物与靶标蛋白的亲和力筛选，该结合信号通过DNA序列扩增得到放大和结构对应关系。与目前已有的技术相比，DNA编码化合物库技术可以在一次筛选实验中获取针对不同生物靶点的多个不同活性分子，简化了流程，提高了效率。但是由于细胞内生理环境复杂以及靶标蛋白在细胞内外状态构象发生改变，往往导致通过该技术筛选出的部分先导化合物在体外检测活性较高，而在细胞正常生理条件下没有活性或活性较低。信号通路和功能分析可以确定先导化合物在细胞内的活性，但是无法确定化合物在细胞内没有活性的原因。能量共振转移和热位移分析只能用于研究先导化合物与靶标的体外相互作用。因此需要开发一种能够确定化合物在活细胞内与靶标蛋白相关作用的方法。
本发明将经过修饰的化合物与含有靶标的正常细胞孵育，然后通过点击化学反应和免疫荧光染色法分别对先导化合物和靶标进行定位，能够直观的观察化合物与靶标在正常细胞生理状态下的相互作用，确定化合物在细胞中的特异性和细胞毒性。本发明提供了一种新的确定先导化合物在活细胞内的分布、蛋白相互作用、靶向特异性、细胞膜通透性的方法。
发明内容
本发明提供了一种荧光标记化合物确定化合物在活细胞中与靶标相互作用的方法，包括以下步骤：
a.使用特殊基团R对化合物进行修饰；
b.将用R基团修饰的化合物与含有靶标蛋白的活细胞共同孵育；
c.将细胞进行洗脱、固定、通透以及用封闭缓冲液封闭；
d.加入与R基团对应的荧光化合物和催化剂，反应生成带有荧光标记的化合物；
e.加入能与靶标蛋白特异性结合的第一抗体孵育；
f.加入与步骤d中荧光不同的带有荧光的第二抗体并孵育；
g.通过荧光定位分析确定化合物与靶标蛋白的相互作用。
进一步地，步骤a中所述化合物的分子量为200～5000Da。
在本发明的一个具体实施方案中，所述化合物为布加替尼(Brigatinib)，结构式如下：
在本发明的一个具体实施方案中，R基团修饰的化合物结构式如下：
进一步地，步骤a中所述化合物与靶标蛋白的体外亲和力小于10μM。优选地，体外亲和力小于1μM。
进一步地，步骤a中特殊基团R修饰后的化合物与靶标蛋白的体外亲和力小于10μM。
进一步地，步骤a中所述特殊基团R为炔基，步骤d中与R基团对应的荧光化合物含有叠氮基团，步骤d中与R基团对应的催化剂含有亚铜离子。
在本发明的一个具体实施方案中，与R基团对应的荧光化合物为Picolyl Azide，结构式如下：
在本发明的一个具体实施方案中，与R基团对应的催化剂为硫酸铜和抗坏血酸。
进一步地，步骤c中的封闭缓冲液为BSA缓冲液。
进一步地，步骤e前再加入封闭缓冲液进行封闭。
进一步地，步骤g前加入细胞核染色液并孵育，使细胞核带上不同的荧光。
进一步地，步骤g采用高内涵细胞成像系统或荧光显微镜确定化合物与靶标蛋白的相互作用。
进一步地，步骤g中采用高内涵细胞成像系统对化合物荧光强度进行定量分析。
本发明中，特殊基团R包括但不限于点击化学常见的反应基团，例如当R为炔基、
时，与R基团对应的荧光化合物含有叠氮基团；R基团为烯基、炔基、
其中X为卤素时，与R基团对应的荧光化合物含有巯基。R基团为
其中X为烷基、芳基时，与R基团对应的荧光化合物含有
R基团为
与R基团对应的荧光化合物含有醛基、羰基。R基团为
时，与R基团对应的荧光化合物含有
R基团为
时，与R基团对应的荧光化合物含有
本发明中，特殊基团R和荧光化合物中的对应基团可以互换。
本发明中“体外亲和力”是指化合物与靶标蛋白组成的复合物分离成组分时的平衡常数(Kd)。本发明中平衡常数(Kd)的单位μM是指μmol/L。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步地详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为布加替尼(Brigatinib)经炔基修饰前后的活性数据图。
图2为荧光标记化合物的荧光定位图。其中图2A为细胞核荧光定位图；图2B为图2A、图2C、图2D合并后的图像；图2C为靶标蛋白的荧光定位图；图2D为荧光标记化合物的荧光定位图。
图3为图2C靶标蛋白的荧光定位和图2D荧光标记化合物的荧光定位的信号强度-位置关系图。
图4为荧光标记化合物与不同浓度该化合物竞争剂共同孵育后的荧光定位图。
图5为荧光标记化合物与不同浓度该化合物竞争剂共同孵育后的荧光定量数据。
具体实施方式
本发明中具体实施方式所使用的试剂材料均来自商业购买。其中荧光试剂Picolyl Azide的结构如下：
实施例1：化合物的炔基修饰和体外活性测试
按照下述方法检测布加替尼(Brigatinib)的体外活性：用缓冲液(100mM HEPES,10mM MgCl2,2mM MnCl2,0.5mg/mL BSA,1mM TCEP,pH 7.4)溶解靶标蛋白EGFR(aa 668-1210，Sino Biological 10001-H20B2)、多聚谷氨酸酪氨酸钠盐底物、ATP和待测化合物。分别加入5μL的4X靶标蛋白溶液和化合物溶液至384孔板，混匀后在摇床上反应15分钟。加入10μL2X底物与ATP的混合液到上一步的板子中并混匀，在25℃反应60分钟。加入5μL的ADP-Glo试剂到一个新孔板中，加入5μL上一步的反应液到另一个新孔板中(终止反应板)，25℃反应40分钟。每孔加入5μL检测试剂，25℃反应40分钟。在酶标仪上读取荧光值，并计算出化合物的IC50。体外IC50在炔基修饰前后均小于1μM，引入炔基的结构修饰没有带来显著活性缺失(图1)。
实施例2：炔基修饰化合物的细胞内荧光定位
取人肺癌细胞株H3255细胞在96孔板上长满80-90％(培养基RPMI-1640加1％双抗和10％FBS)。倒掉培养基加入含有1～10μM化合物和该化合物竞争剂的培养基200μL，共同孵育1小时。倒掉培养基用PBST(含有0.1％tween-20的PBS)洗涤2次，每次3分钟。用3.7％的多聚甲醛固定10分钟，用PBST洗涤2次，每次3分钟。用0.1％Triton通透15分钟，然后PBST洗涤2次，并用3％的BSA常温下封闭30分钟。PBST洗一次，每次3分钟。加入100μL的0.2μM荧光试剂Picolyl Azide和100μL含4mM CuSO4 100m抗坏血酸的PBS溶液，混匀室温避光反应30分钟。倒去反应液，用PBST洗涤4次，每次3分钟。用3％的BSA室温封闭1小时。倒掉溶液，加入100μL的0.2μg/mL的一抗，4℃过夜。倒去未反应的一抗，用PBST洗5次，每次3分钟。加入100μL1μg/mL的带有荧光的二抗，室温反应45分钟。倒去未反应的二抗，用PBST洗涤5次。加入100μL用PBS按1:2000稀释的Hochest染液，室温避光反应10分钟。用PBST洗三次，每次3分钟。在荧光显微镜或高内涵下观察，并用高内涵对化合物的荧光强度进行定量。图2显示荧光标记化合物与靶标蛋白的荧光定位重合度较高。图3显示靶标蛋白荧光信号与化合物荧光信号的强弱和分布具有协同关系。图4显示荧光标记化合物可以被该化合物竞争剂竞争，并且呈浓度依赖关系。图5进一步对示荧光标记化合物被被该化合物竞争剂竞争作了定量分析。实验结果表明，该化合物与无修饰竞争剂能够靶向到细胞内，实现靶标相互作用。
综上所述，通过本发明的方法可以有效确定化合物在活细胞中与靶标蛋白的相互作用，可用于研究化合物在活细胞内的分布、蛋白相互作用、靶向特异性、细胞膜通透性等。
Claims (10)
1.一种荧光标记化合物确定化合物在活细胞中与靶标相互作用的方法，包括以下步骤：
a.使用特殊基团R对化合物进行修饰；
b.将用R基团修饰的化合物与含有靶标蛋白的活细胞共同孵育；
c.将细胞进行洗脱、固定、通透以及用封闭缓冲液封闭；
d.加入与R基团对应的荧光化合物和催化剂，反应生成带有荧光标记的化合物；
e.加入能与靶标蛋白特异性结合的第一抗体并孵育；
f.加入与步骤d中荧光不同的带有荧光的第二抗体并孵育；
g.通过荧光定位分析确定化合物与靶标蛋白的相互作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中所述化合物的分子量为200～5000Da。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中所述化合物与靶标蛋白的体外亲和力(Kd)小于10μM。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中特殊基团R修饰后的化合物与靶标蛋白的体外亲和力小于10μM。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤a中所述特殊基团R为炔基，步骤d中与R基团对应的荧光化合物含有叠氮基团，步骤d中与R基团对应的催化剂含有亚铜离子。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤c中的封闭缓冲液为BSA缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤e前再加入封闭缓冲液进行封闭。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤g前加入细胞核染色液并孵育，使细胞核带上不同的荧光。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤g采用高内涵细胞成像系统或荧光显微镜确定化合物与靶标蛋白的相互作用。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤g中采用高内涵细胞成像系统对化合物荧光强度进行定量分析。
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