JP2023527149A - ポリペプチドの処理および分析のための方法、システムおよびキット - Google Patents

ポリペプチドの処理および分析のための方法、システムおよびキット Download PDF

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Abstract

ペプチドシーケンシングを含む、ペプチド分析のための組成物、システム、方法、およびキットが本明細書で提供される。本開示の局面は、アミノ酸へ選択的にカップリングし、かつ検出可能な化学種へ選択的にカップリングし得る、二官能性試薬を提供する。本開示の局面は、ペプチドをシーケンシングおよび分析するためにこれらの二官能性試薬を使用するための方法をさらに提供する。

Description

本出願は、2020年5月19日に出願された米国仮特許出願第63/027,219号の恩典を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に完全に組み入れられる。
本発明は、国立衛生研究所によって与えられた助成金番号R35 GM122480の下、政府支援によって行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
背景
遺伝的変異は検出可能なまたは単純な表現型の変化では現れないことが多いため、プロテオミクスは、生物およびシステムレベルの生物学および生化学を理解するために不可欠であり得る。プロテオミクスは、幅広い疾患の病因、発症、予防、治療を含む、臨床的および生化学的な関心対象の様々な領域に適用されている。タンパク質の同定およびより広範なプロテオミクスプロファイリングは、医薬品開発、タンパク質発見、生物学的調査、および分類学的分類に不可欠である。しかし、プロテオミクス解析の多くの従来の形態は低感度や低スループットに苦しんでいる。例えば、組織学は、特定のタンパク質を同定するための正確で高感度な手段をしばしば提供するが、多重化するまたはハイスループット解析を容易にする能力に制限があり得る。逆に、質量分析によるタンパク質解析は、検出についての限られた感度および狭いダイナミックレンジという犠牲を払って、ハイスループットのプロテオミクスプロファイリングをしばしば可能にする。
概要
本明細書で認識されるように、生体系の生物学を理解するためのプロテオミクス戦略の使用の増加は、タンパク質同定のためのより効果的かつ効率的かつ正確な方法に対する継続的な必要性を生じさせる。核酸シーケンシングは大きく進歩しており、高速でありかつ並列化されたゲノムおよびトランスクリプトームシーケンシングを含む、単一分子感度およびハイスループットのゲノムレベルの測定を可能にする多くの次世代技術がある。対照的に、プロテオミクス解析は遅れており、生物学的特性評価の多くの形態を妨げる。例えば、質量分析は、試料組成の事前知識をしばしば必要とし、複合試料からの細胞間変動を検出できない場合があり、また、低存在量および低コピー数のタンパク質に対してしばしば盲目である。さらに、質量分析検出は、検出についての限られたダイナミックレンジをしばしば提供し、最大4桁にわたってタンパク質をしばしば同定し、したがって、典型的に濃度の点で10桁超に及ぶ最も単純なプロテオームでさえ、その複雑さの大部分を見逃す。
プロテオーム中のタンパク質濃度の全範囲をカバーするダイナミックレンジを有する偏りのないタンパク質シーケンシング法は、遺伝子産物および細胞内複合体の改善された同定および特徴付けを可能にし得る。ペプチドのアミノ酸（複数可）上へ標識、レポーター、またはそれらの組み合わせをアセンブルするための技術を提供する光学的シーケンシングシステム、方法、およびキットは、ペプチドの迅速な単一分子シーケンシングの効率を改善し得る。
本開示の方法、システム、およびキットは、光学的技術を用いる現在のペプチドまたはタンパク質シーケンシング法を前進させ得る。本開示の方法およびシステムは、シーケンシング効率および正確度を高めることによって、他のペプチドシーケンシング法の欠点の少なくともいくつかを克服または軽減し得る。これは、例えば、癌診断、神経学的診断、および内分泌学的診断において使用され得る。
本開示の局面は、ペプチドを含むシステムであって、ペプチドが、少なくとも1つの支持体へ固定されており；かつ、ペプチドが、標識へカップリングされたアミノ酸を含み、標識が、(i)シグナルを発するように構成されたレポーター部分へカップリングされている第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基、または(ii)標識と第2反応基の間のカップリングを防止するように構成された保護基を含む、システムを提供する。
本開示のさらなる局面は、第1反応基へカップリングされたアミノ酸を含むペプチド；および、第2反応基へカップリングされた支持体を含む、ペプチドを処理または分析するためのシステムであって、第1反応基が、ペプチドを支持体に隣接して固定するために第2反応基へカップリングするように構成されている、システムを提供する。
いくつかの態様において、少なくとも1つの支持体は、ビーズ、ポリマーマトリクス、またはアレイである。いくつかの態様において、アレイは顕微鏡用スライドである。いくつかの態様において、ペプチドのN末端は、少なくとも1つの支持体へカップリングされている。いくつかの態様において、少なくとも1つの支持体はビーズである。
いくつかの態様において、ペプチドのN末端は、切断可能ユニットへカップリングされており、切断可能ユニットは、少なくとも1つの支持体へカップリングされている。いくつかの態様において、切断可能ユニットは、(i)切断可能部分、(ii)アルデヒド、(iii)少なくとも1つの支持体、または(iv)スペーサーのうちの少なくとも1つを含む。いくつかの態様において、切断可能ユニットは(i)～(iv)を含む。
いくつかの態様において、ペプチドのC末端は、少なくとも1つの支持体へカップリングされている。いくつかの態様において、少なくとも1つの支持体は顕微鏡用スライドである。いくつかの態様において、C末端は、アルキンまたはアジドを含む化合物で修飾されている。いくつかの態様において、アルキンまたはアジドは、少なくとも1つの支持体へカップリングするように構成されている。
いくつかの態様において、C末端は酸性アミノ酸であり、C末端は第1酸性残基および第2酸性残基を含む。いくつかの態様において、第1酸性残基はC末端カルボン酸である。いくつかの態様において、第2酸性残基は、アスパラギン酸側鎖またはグルタミン酸側鎖である。いくつかの態様において、第1酸性残基および第2酸性残基は、アルキンまたはアジドを含む化合物で修飾されている。いくつかの態様において、アルキンまたはアジドは、少なくとも1つの支持体へカップリングするように構成されている。
いくつかの態様において、ペプチドのN末端は、少なくとも1つの支持体のうちの第1支持体へカップリングされており、ここで、第1支持体はビーズであり、かつ、ペプチドのC末端は、少なくとも1つの支持体のうちの第2支持体へカップリングされており、ここで、第2支持体は顕微鏡用スライドである。
いくつかの態様において、レポーター部分は、励起されるとシグナルを発するように構成されている。いくつかの態様において、シグナルは検出可能なシグナルである。いくつかの態様において、検出可能なシグナルは光シグナルである。いくつかの態様において、レポーター部分は蛍光色素を含む。いくつかの態様において、レポーター部分はスペーサーを含む。いくつかの態様において、保護基は光学的に検出可能なシグナルを発しない。
いくつかの態様において、アミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択される。いくつかの態様において、アミノ酸は翻訳後修飾を含む。いくつかの態様において、翻訳後修飾は、グリコシル化、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、グルタミル化、グリコシル化、イソプレニル化、リン酸化、リポレーション（lipolation）、ホスホパンテテイニル化、硫酸化、セレネーション（selenation）、アミド化、ユビキチン化、ヒドロキシル化、ニトロ化、ニトロシル化、シトルリン化、N末端グルタミン環化、N末端グルタミン酸環化、およびSUMO化からなる群より選択される。
いくつかの態様において、ペプチドは、複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、複数のアミノ酸は、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸および第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含む。いくつかの態様において、複数のアミノ酸は、(i)複数の第1標識へカップリングされた複数の第1アミノ酸および(ii)複数の第2標識へカップリングされた複数の第2アミノ酸を含む。いくつかの態様において、第1標識は第1アミノ酸へのみカップリングし、第2標識は第2アミノ酸へのみカップリングする。いくつかの態様において、複数の標識のうちの少なくとも1つの標識は、複数のアミノ酸のうちの特定のアミノ酸タイプへカップリングされる。いくつかの態様において、複数の標識のうちの少なくとも1つの標識は、特異的レポーター部分へカップリングされた特異的第2反応基と反応するように構成されている。
いくつかの態様において、ペプチドは複数のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、複数のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギンおよびトリプトファンからなる群より選択される。いくつかの態様において、少なくとも1つのアミノ酸は標識へカップリングされている。
いくつかの態様において、第1反応基は、アジド、アルキン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、チオール、ジチオール、シクロオクテン、およびノルボルネンからなる群より選択される。いくつかの態様において、アルキンは歪みアルキンである。いくつかの態様において、第1反応基は、アジド、アルケン、アルデヒド、ケトン、およびテトラジンからなる群より選択される。いくつかの態様において、第2反応基は、アルキン、アジド、チオール、ジチオール、シクロオクテン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、およびノルボルネンからなる群より選択される。いくつかの態様において、第1反応基は、アルキン、チオール、ジチオール、およびシクロオクテンからなる群より選択される。いくつかの態様において、アルキンは歪みアルキンである。
本開示の別の局面は、以下の工程を含む、ペプチドを処理または分析するための方法を提供する：(a)標識へカップリングされたアミノ酸を含むペプチドを提供する工程であって、標識が、(i)シグナルを発するように構成されたレポーター部分へカップリングされている第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基、または(ii)標識と第2反応基の間のカップリングを防止するように構成された保護基を含む、工程；(b)ペプチドと、第2反応基を含む混合物とを接触させる工程；(c)ペプチドが少なくとも1つの支持体へ固定されている状態で、ペプチドからのシグナルを検出する工程；および(d)シグナルまたはシグナル変化を使用してペプチドのアミノ酸またはさらなるアミノ酸を同定する工程。
本開示の別の局面は、以下の工程を含む、ペプチドのアミノ酸を標識するための方法を提供する：アジドへカップリングされた内部アミノ酸およびアルキンへカップリングされたC末端を含むペプチドを提供する、工程；および、歪みアルキンを含む第1レポーターが該内部アミノ酸と反応するような条件下で、該ペプチドと該第1レポーターとを接触させる工程。いくつかの態様において、方法を銅(Cu)の非存在下で行う。いくつかの態様において、方法は、第1レポーターとは異なる第2レポーターをC末端と反応させる工程であって、第2レポーターが非歪み（non-strained）アルキンを含む、工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法を銅(Cu)の存在下で行う。いくつかの態様において、内部アミノ酸へカップリングされたアジドは、C末端へカップリングされたアルキンと反応しない。
いくつかの態様において、方法は、(c)の前にペプチドを固定する工程を含む。いくつかの態様において、(a)または(b)においてペプチドを少なくとも1つの支持体へ固定する。いくつかの態様において、方法は、(b)の後にペプチドを固定する工程を含む。いくつかの態様において、(a)において、標識は第1反応基を含み、かつ、(b)において、第2反応基は第1反応基と反応する。
いくつかの態様において、ペプチドを複数のペプチドとして提供する。いくつかの態様において、ペプチドは複数のペプチドのうちの少なくとも1つのペプチドを含む。いくつかの態様において、複数のペプチドを複数の支持体へ固定する。いくつかの態様において、複数のペプチドは第1ペプチドおよび第2ペプチドを含む。
いくつかの態様において、第1ペプチドは第1標識へカップリングされた第1アミノ酸を含み、第2ペプチドは第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含む。いくつかの態様において、第1標識は第2反応基と反応するように構成されており、第2標識は第2反応基とは異なる第2反応基と反応するように構成されている。いくつかの態様において、異なる第2反応基は、レポーター部分とは異なるシグナルを発するように構成された第2レポーター部分へカップリングされている。
いくつかの態様において、ペプチドは、複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、複数のアミノ酸は、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸および第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含む。いくつかの態様において、複数のアミノ酸は、複数の第1標識へカップリングされた複数の第1アミノ酸および複数の第2標識へカップリングされた複数の第2アミノ酸を含む。いくつかの態様において、第1標識は第1アミノ酸へのみカップリングし、第2標識は第2アミノ酸へのみカップリングする。いくつかの態様において、複数の標識のうちの少なくとも1つの標識は、複数のアミノ酸のうちの特定のアミノ酸タイプへカップリングされる。いくつかの態様において、複数の標識のうちの少なくとも1つの標識は、特異的レポーター部分へカップリングされた特異的第2反応基と反応するように構成されている。
いくつかの態様において、ペプチドは複数のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、複数のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択される。いくつかの態様において、少なくとも1つのアミノ酸は標識へカップリングされている。いくつかの態様において、複数のアミノ酸は、少なくとも2つのアミノ酸タイプを含む。いくつかの態様において、複数のアミノ酸のアミノ酸タイプの全てよりも少ないアミノ酸タイプが標識されている。
いくつかの態様において、少なくとも2つのアミノ酸タイプは、第1アミノ酸タイプおよび第2アミノ酸タイプを含む。いくつかの態様において、第1アミノ酸タイプは第1標識へカップリングされており、第2アミノ酸タイプは第2標識へカップリングされている。いくつかの態様において、第1標識および第2標識は、異なるレポーター部分へ各々カップリングされる。いくつかの態様において、少なくとも2つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。いくつかの態様において、ペプチドは少なくとも4つのアミノ酸タイプを含み、少なくとも4つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。いくつかの態様において、複数のアミノ酸の全てよりも少ないアミノ酸が標識されている。
いくつかの態様において、方法は、(e)少なくとも1つの支持体へ固定されたペプチドから少なくとも1つのアミノ酸を除去するために十分な条件へ該ペプチドを供する工程を含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのアミノ酸を除去するために十分な条件は、エドマン分解剤または有機リン含有剤を含む。いくつかの態様において、(e)の後に、標識へカップリングされたアミノ酸は、末端アミノ酸となる。いくつかの態様において、少なくとも1つのアミノ酸をペプチドのN末端から除去する。
いくつかの態様において、シグナルまたはシグナル変化は、ペプチドの配列の少なくとも一部を同定するために使用される。いくつかの態様において、方法は、(f)少なくとも1つの支持体へ固定されたペプチドからの少なくとも1つのさらなるシグナルまたはシグナル変化を検出するために(d)および(e)を繰り返す工程、ならびに(ii)該シグナルまたはシグナル変化および該さらなるシグナルまたはシグナル変化を使用して、該少なくとも1つの支持体へ固定された該ペプチドの配列の少なくとも一部を同定する工程を含む。
いくつかの態様において、少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化を、単一分子感度を有する光学検出器で検出する。いくつかの態様において、少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化は、異なる周波数または周波数範囲の複数のシグナルを含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化は、異なる強度の複数のシグナルを含む。いくつかの態様において、少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化は光シグナルである。
いくつかの態様において、レポーター部分は、少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化を発生させる。いくつかの態様において、レポーター部分は色素を含み、この色素は少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化を発生させる。いくつかの態様において、保護基は1つまたは複数の基を含み、各基は、アジド、アルキル、アルキレン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール-アルキル、およびアリール-アルキルからなる群より独立して選択される。
本開示の別の局面は、以下の工程を含む、ペプチドを処理または分析するための方法を提供する：(a)支持体へカップリングされた第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基へカップリングされたアミノ酸を含む該ペプチドを提供する工程；(b)該第1反応基を該第2反応基へカップリングさせるために該ペプチドを該第2反応基と接触させ、それによって該ペプチドを該支持体へ固定する工程；(c)該ペプチドが該支持体へ固定されている状態で、該ペプチドのアミノ酸へカップリングされた標識からのシグナルを検出する工程；ならびに(d)該シグナルまたはその変化を使用して該アミノ酸を同定する工程。
いくつかの態様において、第1反応基は、官能基を介してアミノ酸へカップリングされている。いくつかの態様において、官能基は、アミノ酸の反応性側鎖へカップリングされている。いくつかの態様において、(a)は、第1反応基へカップリングされた官能基へアミノ酸をカップリングすることをさらに含む。いくつかの態様において、官能基は、支持体へカップリングされた第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基へカップリグされたアミノ酸へのみカップリングする。
いくつかの態様において、アミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択される。いくつかの態様において、第1反応基は、アジド、アルキン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、チオール、ジチオール、エステル、シクロオクテン、およびノルボルネンまたは活性化エステルからなる群より選択される。いくつかの態様において、エステルは活性化エステルである。いくつかの態様において、活性化エステルはEDC-カルボジイミドである。
いくつかの態様において、第1反応基はアジドまたはアルキンである。いくつかの態様において、第2反応基は、アルキン、アジド、チオール、ジチオール、シクロオクテン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、およびノルボルネンからなる群より選択される。いくつかの態様において、第2反応基はアルキンまたはアジドである。いくつかの態様において、第1反応基および第2反応基はクリック反応を介してカップリングされる。いくつかの態様において、第2反応基はリンカーを介して支持体へカップリングされている。いくつかの態様において、リンカーは、結合であるか、または置換されていてもよいアルキレンもしくは置換されていてもよいヘテロアルキレンである。いくつかの態様において、支持体はアレイである。いくつかの態様において、支持体はビーズである。いくつかの態様において、第1反応基へカップリングされたアミノ酸は末端アミノ酸である。
いくつかの態様において、第1反応基へカップリングされたアミノ酸は内部アミノ酸である。いくつかの態様において、(a)におけるアミノ酸は、(c)における標識へカップリングされたアミノ酸と同じである。いくつかの態様において、(a)におけるアミノ酸は、(c)における標識へカップリングされたアミノ酸と異なる。いくつかの態様において、(c)は、(b)の前にペプチドのアミノ酸へ標識をカップリングすることをさらに含む。いくつかの態様において、(c)は、(b)の後にペプチドのアミノ酸へ標識をカップリングすることをさらに含む。
いくつかの態様において、標識をレポーター部分へカップリングする。いくつかの態様において、レポーター部分は第3反応基または抗体へカップリングされている。いくつかの態様において、第3反応基または抗体は、(c)においてペプチドのアミノ酸へカップリングするように構成されている。いくつかの態様において、(c)におけるペプチドのアミノ酸は、末端アミノ酸である。いくつかの態様において、(c)におけるペプチドのアミノ酸は、内部アミノ酸である。いくつかの態様において、レポーター部分がリンカーへカップリングされており、(c)において抗体がペプチドのアミノ酸へカップリングする。
本開示の別の局面は、以下を含む、試料中のペプチドの配列をアッセイするためのキットを提供する：レポーター；第1反応基および(i)第2反応基または(ii)保護基を含む標識であって、該第1反応基が、あるアミノ酸タイプのアミノ酸へカップリングするように構成されており、該第2反応基が、シグナルを発するように構成されたレポーター部分を含む該レポーターへカップリングするように構成されており、かつ、該保護基が、該標識と該レポーター部分の間のカップリングを防止するように構成されている、標識；ならびに、該標識へカップリングされた該アミノ酸を含むペプチドを提供するために該ペプチドを処理するために該標識を使用するための、説明書。
いくつかの態様において、レポーターは、第2反応基と反応するように構成された第3反応基へカップリングされている。いくつかの態様において、レポーターは、励起されるとシグナルを発するように構成されている。いくつかの態様において、レポーターは蛍光色素を含む。いくつかの態様において、レポーターはスペーサーを含む。いくつかの態様において、保護基は光学的に検出可能なシグナルを発しない。
いくつかの態様において、キットはタンパク質捕捉剤を含む。いくつかの態様において、タンパク質捕捉剤は、切断可能リンカーへカップリングされた固体支持体を含み、該切断可能リンカーがアルデヒドへカップリングされている。いくつかの態様において、タンパク質捕捉剤は、ペプチドのN末端へカップリングするように構成されている。いくつかの態様において、固体支持体はビーズである。いくつかの態様において、アルデヒドは、ピリジンカルバルデヒド(PCA)またはその誘導体である。
いくつかの態様において、キットは表面接着剤をさらに含む。いくつかの態様において、表面接着剤はアルキンまたはアジドを含む。いくつかの態様において、表面接着剤は、ペプチドのC末端へカップリングするように構成されている。いくつかの態様において、キットは、表面接着剤が接着する支持体をさらに含む。いくつかの態様において、支持体は顕微鏡用スライドである。いくつかの態様において、キットは、少なくとも1つのプロテアーゼ、少なくとも1つの消化試薬、および固体支持体ビーズをさらに含む。
いくつかの態様において、方法は、(c)の後に、ペプチドの末端からアミノ酸を除去するために十分な条件へ該ペプチドを供する工程をさらに含む。いくつかの態様において、条件はエドマン分解条件である。いくつかの態様において、方法は、ペプチドの複数のアミノ酸のシグナルパターンを同定するために(c)および(d)を1回または複数回繰り返す工程であって、複数のアミノ酸のシグナルパターンが(d)におけるシグナルまたはその変化を含む工程をさらに含む。いくつかの態様において、方法は、複数のアミノ酸のシグナルパターンを使用してペプチドの配列を得る工程をさらに含む。
本開示の別の局面は、1つまたは複数のコンピュータプロセッサによる実行時に、上記または本明細書の他の箇所での方法のいずれかを実施する機械実行可能コードを含む非一時的コンピュータ可読媒体を提供する。
本開示の別の局面は、1つまたは複数のコンピュータプロセッサおよびそれに連結されたコンピュータメモリを含むシステムを提供する。コンピュータメモリは、1つまたは複数のコンピュータプロセッサによる実行時に、上記または本明細書の他の箇所での方法のいずれかを実施する機械実行可能コードを含む。
本開示のさらなる局面および利点は、以下の詳細な説明から当業者に容易に明らかになり、ここで、本開示の例示的な態様のみが記載および説明される。理解されるように、本開示は、他の異なる態様が可能であり、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱することなく、様々な明白な点での改変が可能である。したがって、図面および説明は、本質的に例示的であり、限定的ではないとみなされるべきである。
参照による組み入れ
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み入れられることを具体的かつ個々に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。参照により組み入れられる刊行物および特許または特許出願が本明細書に含まれる開示と矛盾する限り、本明細書は、そのような矛盾する材料に優先しかつ／またはその上位にあるように意図される。
本発明の新規な特徴は特に添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の特徴および利点のよりよい理解は、本発明の原理が利用される例示的な態様を記載する以下の詳細な説明、および添付の図面(本明細書においてまた「図（Figure）」および「図（FIG.）」)を参照することによって得られる。
第1支持体と、第2支持体と、レポーター部分または保護基へカップリングするように構成された標識へカップリングするように構成されたペプチドの例を示す。 そのN末端を介して第1支持体へ、そのC末端を介して第2支持体へ、および内部アミノ酸を介して複数の標識へカップリングされたペプチドを図示する。 N末端アミノ酸を介して支持体上にペプチドを捕捉する工程、少なくとも1つの標識をペプチドへカップリングする工程、標識されたペプチドを支持体から放出する工程、および標識されたペプチドを表面へカップリングする工程を含む、ペプチドを分析するための方法の例を示す。 アレイ中に配置された複数のアミノ酸特異的標識を含むキットの例を提供する。 アミノ酸特異的標識ならびに様々なレポーター部分および保護基、ならびに標識およびアミノ酸の別個の組み合わせで配置されたアレイを含む、キットの例を示す。標識および標識の各組み合わせは、多数のレポーター部分とさらに組み合わせてもよい。 N末端アミノ酸結合剤(NAAB)を使用してペプチドをシーケンシングするための方法についての例を示す。 本明細書に提供される方法を実行するようにプログラミングされているかまたは別の方法で構成されているコンピュータシステムを示す。 ペプチドを標識および固定するための方法を図示する。 ペプチドをランタン上に捕捉するためのワークフローを図示する。 二官能性アミノ酸特異的標識でペプチドを標識するためのキットを概説する。 アミノ酸特異的標識でペプチドを選択的に標識するためのキットを提供する。 本開示の標識-フルオロフォアキットをコンピュータ的に設計し次いで使用するための例示的ワークフローを提供する。 図12A～Dは、エドマン分解(E1～E7)および非分解(M1～M4)ステップを伴うフルオロシーケンシング実験についての蛍光減少結果を提供する。各実験において標識されたアミノ酸のタイプを各図の左側に示す。図12Aは標識されたシステインを用いて行った。図12Bは標識されたグルタメートを用いて行った。図12Cは標識されたホスホセリンを用いて行った。図12Dは標識されたリジンを用いて行った。
詳細な説明
本発明の様々な態様が本明細書において記載および説明されたが、そのような態様が単なる例として提供されることは当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなく当業者に生じ得る。本明細書に記載される本発明の態様に対する様々な代替物が用いられ得ることが理解されるべきである。
用語「少なくとも」、「より大きい」、または「以上」が一連の2つ以上の数値における第1の数値の前にある場合はいつでも、用語「少なくとも」、「より大きい」または「以上」は、その一連の数値における数値の各々に適用される。例えば、1、2、または3以上は、1以上、2以上、または3以上と同等である。
用語「以下（no more than）」、「より小さい」、または「以下（less than or equal to）」が、一連の2つ以上の数値における第1の数値の前にある場合はいつでも、用語「以下」、「より小さい」、または「以下」は、その一連の数値における数値の各々に適用される。例えば、3、2、または1以下は、3以下、2以下、または1以下と同等である。
用語「分析物」は、本明細書で使用される場合、一般に、その存在または不在が測定または同定される物質(例えば、分子)を指す。分析物は、そのような物質の存在または不在を同定するために検出可能なプローブが使用され得る物質(例えば、分子)であり得る。非限定的な例として、分析物は、例えばペプチドまたはタンパク質などの高分子であり得る。分析物は、他の成分を含有するかもしくは含有が疑われる試料の一部であり得、または試料の唯一のもしくは主要な成分であり得る。分析物は、細胞もしくは組織全体の成分、細胞もしくは組織抽出物、分画されたライセートもしくは細胞もしくは組織、または実質的に精製された分子であり得る。いくつかの態様において、分析物はペプチドである。
用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、本明細書で互換的に使用される場合、一般に、アミノ酸がペプチド結合によって別のアミノ酸に結合され得るアミノ酸のポリマーを指す。いくつかの例では、ペプチドはタンパク質である。アミノ酸は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸(例えば、アミノ酸類似体)であり得る。ペプチドは、直鎖状または分岐状であり得る。ペプチドは、修飾アミノ酸を含むことができる。ペプチドは、非アミノ酸によって中断されてもよい。ペプチドは、一本鎖または会合鎖として存在し得る。ペプチドは、複数のアミノ酸を含んでいてもよい。ペプチドは、二次および三次構造を有し得る(例えば、ペプチドは、定義された二次、三次、および四次構造を含むタンパク質であり得る)。いくつかの例では、ペプチドは、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、1000、10,000、またはそれ以上のアミノ酸を含む。ペプチドは、より大きなポリマーの断片であってもよい。いくつかの例では、ペプチドは、タンパク質の断片などのより大きなペプチドの断片である。
用語「アミノ酸」は、本明細書で使用される場合、一般に、天然または非天然アミノ酸(例えば、アミノ酸類似体)を指す。非天然アミノ酸は、操作または合成されたアミノ酸であってもよい。アミノ酸は「側鎖」を含んでもよく、これはアミノ酸タイプを互いに区別し得る。
用語「アミノ酸配列」、「ペプチド配列」、および「ポリペプチド配列」は、本明細書で使用される場合、一般に、共有結合で(例えば、ペプチド(アミド)結合またはペプチド結合の類似体)によって結合されている少なくとも2つのアミノ酸またはアミノ酸類似体の配列を指す。ペプチド配列は、全配列または配列の一部を指し得る。例えば、ペプチド配列は、ギャップ、未知のアイデンティティーを有する位置、または異なる種を収容することができる位置を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「側鎖」は、一般に、各タイプのアミノ酸に固有であり得るアルファ炭素(アミノ酸のアミンおよびカルボン酸基を結合する)に結合した構造を指す。側鎖は、特定の形状、サイズ、電荷、反応性、またはそれらの組み合わせを有し得る。側鎖は、塩基性部分(例えば、アルギニン中のグアニジノ基)、酸性部分(例えば、アスパラギン酸中のカルボン酸)、極性部分(例えば、セリン、トレオニン、およびチロシン中のヒドロキシル基)、疎水性部分(例えば、ロイシン、イソロイシン、アラニン、およびバリン中のアルキル基)、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。場合によっては、アミノ酸は複数の側鎖を含む。側鎖は、水素、アルキル基、ヒドロキシル基、アリール基、ヘテロアリール基、カルボン酸、アミド、アミン、グアニジン、チオール、チオエーテル、セレノール、またはそれらの任意の組み合わせであり得るかまたはこれらを含み得る。いくつかの場合では、側鎖は水素である(水素側鎖を有するアミノ酸は、例えばグリシンであり得る)。
用語「切断可能ユニット」は、本明細書で使用される場合、一般に、分子を2つまたはそれ以上の他の分子に分割または解離するために使用することができる分子の部分を指す。切断可能ユニットは、切断条件下で分割することができる。切断条件の非限定的な例には、以下の使用が含まれる：酵素、求核性または塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子性または酸性試薬、有機金属または金属試薬、および酸化試薬。
用語「試料」は、本明細書で使用される場合、一般に、ペプチドを含有するかまたは含有することが疑われる化学的または生物学的試料を指す。例えば、試料は、1つまたは複数のペプチドを含有する生物学的試料であり得る。生物学的試料は、血液(例えば、全血)、血漿、血清、尿、唾液、粘膜排泄物、喀痰、便および涙から得ることができ(例えば、抽出または単離することができる)、またはこれらを含むことができる。生物学的試料は、流体または組織試料(例えば、皮膚試料)であり得る。いくつかの例では、試料は、ホモジナイズされた組織試料(例えば、脳ホモジネート、肝臓ホモジネート、腎臓ホモジネート)に由来する。いくつかの態様において、試料は、特定の種類の細胞(例えば、神経細胞、筋細胞、肝細胞、腎細胞)から採取される。試料は、罹患細胞または組織(例えば、腫瘍細胞、壊死細胞)から取得され得る。いくつかの例では、試料は、疾患関連封入体(例えば、プラーク、バイオフィルム、腫瘍、非癌性増殖)に由来する。いくつかの例では、試料は、全血、唾液、または尿などの無細胞体液から得られる。いくつかの例では、試料は循環腫瘍細胞を含むことができる。いくつかの例では、試料は、環境試料(例えば、土壌、廃棄物、周囲空気)、工業試料(例えば、任意の工業プロセスからの試料)、および食品試料(例えば、乳製品、野菜製品、および肉製品)である。試料は、マイクロ流体デバイスにロードする前に処理してもよい。例えば、試料は、ペプチドを精製するおよび／または試薬を含めるために、処理してもよい。
本明細書で使用される場合、用語「支持体」は、一般に、物質(例えば、分子構築物)が固定され得る実体を指す。固体（solid）は、固体または半固体(例えば、ゲル)支持体であり得る。非限定的な例として、支持体は、ビーズ、ポリマーマトリクス、アレイ、顕微鏡用スライド、ガラス表面、プラスチック表面、透明表面、金属表面、磁気表面、マルチウェルプレート、ナノ粒子、微粒子、ランタン、または官能化表面であり得る。支持体は平面であってもよい。代替として、支持体は、1つまたは複数のウェルを含むような非平面であってもよい。ビーズは、例えば、大理石、ポリマービーズ(例えば、多糖ビーズ、セルロースビーズ、合成ポリマービーズ、天然ポリマービーズ)、シリカビーズ、官能化ビーズ、活性化ビーズ、バーコード化ビーズ、標識されたビーズ、PCAビーズ、磁気ビーズ、またはそれらの組み合わせであり得る。ビーズは、官能性モチーフで官能化されてもよい。官能性モチーフのいくつかの非限定的な例には、捕捉試薬(例えば、ピリジンカルボキシアルデヒド(PCA))、ビオチン、ストレプトアビジン、Strep-tag II、リンカー、または分子と反応し得る官能基(例えば、アルデヒド、ホスフェート、シリケート、エステル、酸、アミド、アルキン、アジド、またはアルデヒドジチオラン)が含まれる。官能基は、ペプチドのN末端またはC末端へ特異的にカップリングし得る。官能基は、アミノ酸側鎖へ特異的にカップリングし得る。官能基は、アミノ酸の側鎖(例えば、グルタメートもしくはアスパルテートの酸、システインのチオール、リジンのアミン、またはグルタミンもしくはアスパラギンのアミド)へカップリングし得る。官能基は、標識などの特定の種上の反応基へ特異的にカップリングし得る。官能化ビーズのいくつかの例では、官能性モチーフを可逆的にカップリングおよび切断することができる。官能性モチーフは、分子へ不可逆的にカップリングすることもできる。
本明細書で使用される場合、用語「エドマン分解」は、一般に、イソチオシアネート(例えば、フェニルイソチオシアネート)を用いてペプチドのN末端からアミノ酸を除去する方法を指す。エドマン分解は、様々なペプチドシーケンシングおよび分析法と結合され得る。エドマン分解は逐次的に行ってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「アレイ」は、一般に、サイトの集団を指す。このようなサイトの集団は、相対的位置に従って互いに区別することができる。アレイの異なるサイトにある異なる分子は、アレイ内のサイトの位置に従って互いに区別することができる。アレイの個々のサイトは、特定のタイプの1つまたは複数の分子を含むことができる。例えば、サイトは、特定の配列を有する単一のペプチドを含むことができ、またはサイトは、同じ配列を有する複数のペプチドを含むことができる。アレイのサイトは、同じ基体上に配置された異なるフィーチャーであり得る。このようなフィーチャーは、非限定的に、基体内のウェル、基体内または基体上のビーズ(または他の粒子)、基体からの突起、基体上の隆起、または基体内のチャネルを含み得る。アレイのサイトは、それぞれが少なくとも1つの分子を有する別個の基体であり得る。別個の基体へ結合された異なる分子は、基体が結合されている表面上の基体の位置に従って、または液体またはゲル中の基体の位置に従って、識別することができる。そのような異なる分子は、同じまたは異なる配列を有し得る。アレイは1つまたは複数のウェルを含んでもよく、1つまたは複数のウェルのウェルは1つまたは複数のビーズを有してもよい。代替として、アレイは、例えば、その上に固定された分子、または、別の例として、その上に固定された1つまたは複数のビーズを有する、平面表面であってもよい。
本明細書で使用される場合、用語「標識」は、一般に、反応基へカップリングすることができる分子または高分子構築物を指す。標識は、少なくとも1つの反応基(例えば、第1反応基および第2反応基)を含み得る。少なくとも1つの反応基は、ペプチドへカップリングするように構成されていてもよい。少なくとも1つの反応基は、支持体へカップリングするように構成されていてもよい。少なくとも1つの反応基は、レポーター部分へカップリングするように構成されていてもよい。標識は、測定可能なシグナルを提供し得る。
本明細書で使用される場合、用語「ポリマーマトリクス」は、一般に、少なくとも1つのポリマーを含む(例えば、連続)相材料を指す。いくつかの態様において、ポリマーマトリクスは、少なくとも1つのポリマーならびにポリマーによって占有されていない間質空間を指す。ポリマーマトリクスは、1つまたは複数のタイプのポリマーから構成されてもよい。ポリマーマトリクスは、直鎖状、分岐状、および架橋状のポリマーユニットを含み得る。ポリマーマトリクスはまた、ポリマー鎖によって占有されていないその間質空間内に挿入された非ポリマー種を含有し得る。挿入された種は、固体、液体または気体の種であり得る。例えば、用語「ポリマーマトリクス」は、乾燥ヒドロゲル、水和ヒドロゲル、およびガラス繊維を含有するヒドロゲルを包含し得る。
用語「レポーター部分」は、本明細書で使用される場合、一般に、測定可能なシグナルを発生させる剤を指す。そのようなシグナルとしては、蛍光(例えば、色素)、可視光、運動(例えば、質量タグ)、放射線、または核酸配列(例えば、バーコード)が挙げられ得るが、これらに限定されない。そのようなシグナルとしては、蛍光、燐光、または放射線が挙げられ得るが、これらに限定されない。そのようなシグナルは光(または電磁放射線)であり得る。光は、電磁スペクトルの可視部分における周波数または周波数分布を含み得る。例えば、光は、赤外線または紫外線であり得る。シグナルは、静電シグナル、導電シグナル、またはインピーダンスシグナルであり得る。シグナルは電荷であってもよい。「レポーター」は「レポーター部分」を含み得る。レポーターは反応基を含み得る。反応基は、標識へカップリングするように構成されていてもよい。
単一分子ペプチドシーケンシングは、例えば、タンパク質工学、生物工学、およびシステム生物学などの、様々な用途において使用され得る。速度、正確度、汎用性、使いやすさが向上した単一分子タンパク質シーケンシングプラットフォームを提供することで、幅広い生物学および化学分野の研究を加速させることができる。単一分子ペプチドシーケンシングに関連する課題には、例えば、高いユーザー入力要件、対象ペプチドの複雑性または修飾(翻訳後修飾など)に対処することができないこと、ならびに速度および使いやすさがある。
ペプチド配列情報は、ペプチド分子から、またはペプチド分子の1つまたは複数の部分から得ることができる。ペプチドシーケンシングは、ペプチド配列またはペプチド配列の一部についての完全なまたは部分的なアミノ酸配列情報を提供し得る。ペプチド配列の少なくとも一部は、単一分子レベルで決定され得る。場合によっては、例えば、ペプチド内またはペプチドの部分内の特定のタイプのアミノ酸(例えばリジン)の相対位置を含む、部分的なアミノ酸配列情報は、個々のペプチド分子を一意的に同定するのに十分であり得る。例えば、個々のペプチド分子内のリジン分子の分布を示す、例えばX-X-X-Lys-X-X-X-X-Lys-X-Lys (SEQ ID NO: 1)などのアミノ酸のパターンを、所与の生物の既知のプロテオームに対して検索して、個々のペプチド分子を同定してもよい。そのような情報は、ペプチドが由来した高分子(例えば、タンパク質)を同定するために使用されてもよく、また、ペプチドのすべてのアミノ酸を同定する必要性を排除し得る。
ペプチドシーケンシングは、多様なペプチド分子の混合物中の個々のペプチド分子から情報(例えば、アミノ酸配列情報を含む)を取得するために使用され得る。本開示の方法は、固体表面(例えば、ガラススライド、または表面が化学修飾されたガラススライド、プラスチックスライド、マルチウェルプレート、カセットを含む)に固定されたペプチドまたは複数のペプチドのアミノ酸へカップリングされたレポーター部分を検出することを含み得る。場合によっては、検出は光学的(例えば、蛍光)検出を含む。場合によっては、レポーター部分は蛍光基を含む。場合によっては、レポーター部分は、ペプチドまたは複数のペプチドの複数のタイプのアミノ酸へカップリングされた複数のアミノ酸タイプ特異的標識を含む。場合によっては、検出は、単一分子(例えば、単一ペプチド)感度を含む。
多数の市販の光学装置をこの様式で適用することができる。例えば、全反射照明および増強電荷結合素子(CCD)検出器を備えた従来の顕微鏡は、本明細書に開示されるシーケンシング法に適合され得る。高感度CCDカメラは、表面全体に分布する複数の個々の(例えば、単一の)ペプチド分子の蛍光強度を同時に記録するように構成されてもよく、また、複数の異なる画像(例えば、第1の波長の光を含む第1の画像および第2の波長の光を含む第2の画像)の同時収集を容易にするために画像スプリッターへ連結されてもよい。自動フォーカス制御を備えた電動顕微鏡ステージを使用して、フローセル内の複数のステージ位置を画像化することで、1回の実験で数千、数万、数十万、数百万、またはそれ以上の個々の単一ペプチドを分析(例えばシーケンシング)することができる。
本開示は、ペプチドを分析するための幅広い好都合かつ容易な方法を提供する。さらに、本開示のいくつかの局面は、効果的なペプチド特徴付けおよび分析を容易にする組成物を提供する。さらに、いくつかの局面において、本開示は、効果的なペプチド分析を可能にするキットを提供する。
1．プロテオミクス
プロテオミクスは、生物、システム、または生物学的コンソーシアムに存在する大規模研究タンパク質である。タンパク質は生物にとって典型的であり、生命によって実行される化学的および物理的プロセスの大部分を促進する。したがって、細胞、生物、またはシステム内で発現されるタンパク質のセットは、健康、生物学的状態、生物学的活性、および物理的条件(例えば、熱ストレス、栄養枯渇、または刺激)をしばしば強く反映する。したがって、ペプチドシーケンシングは、プロテオミクスの分野における様々な用途に用いることができるツールである。
本開示は、ペプチド(例えば、タンパク質)分析(例えば、組成分析およびシーケンシング)のための方法およびシステムを提供する。本開示の方法は、例えば、(i)化学的に修飾されたN末端アミノ酸を含むタンパク質またはペプチドをシーケンシングすること(例えば、ADP-リボシル化、フルオロフォアなど)、(ii)非天然アミノ酸残基を含むタンパク質またはペプチドをシーケンシングすること(例えば、βアミノ酸、ペプトイド、PNAなど)、または(iii)色素の交差反応性を最小限に抑えることなどの、様々な非限定的な利益を提供する方法で、ペプチド(例えば、タンパク質)が分析される(例えば、シーケンシングされる)ことを可能にし得る。ペプチドシーケンシングは、がんおよび他の疾患の診断のための、または健康な細胞の機能の理解における、新しいバイオマーカーを明らかにするために使用され得る。細胞または組織によって産生されるペプチドは、固有のバイオマーカーとして作用し得る。ペプチドシーケンシングによるこれらのバイオマーカーの強化された検出は、疾患の早期でより正確な診断を提供し得る。
ペプチドを処理または分析することができる速度、効率、または正確度を合理化、最適化、またはそうでなければ改善することによってバイオマーカーの検出を強化するために使用することができるシステム、方法、およびキットを本明細書に提供する。
本開示の方法は、試料中の少なくとも2、少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、または少なくとも10桁の濃度に及ぶペプチドを分析するように構成され得る。例えば、本開示の方法は、7+桁の濃度差のために同時に検出することが伝統的に困難であるペプチドである、ヒト血清由来の免疫グロブリンとサイトカインの同時測定を可能にし得る。本開示の方法は、試料から少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも5000、少なくとも104、少なくとも5x104、少なくとも105、または少なくとも5x105の異なるタンパク質を同定するように構成され得る。本開示の方法は、試料(例えば、ヒト肺ホモジネート)から少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1200、少なくとも1500、少なくとも1800、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000、または少なくとも5000種類のタンパク質を同定するように構成され得る。本開示の方法は、試料(例えば、バフィーコートライセート)から少なくとも50、少なくとも100、少なくとも150、少なくとも200、少なくとも250、少なくとも300、少なくとも400、少なくとも500、少なくとも600、少なくとも700、少なくとも800、少なくとも900、少なくとも1000、少なくとも1200、少なくとも1500、少なくとも1800、少なくとも2000、少なくとも2500、少なくとも3000、少なくとも3500、少なくとも4000、または少なくとも5000種類のタンパク質を同時に(例えば、単一のアッセイ内で)同定するように構成され得る。本開示の方法は、生物学的試料(例えば、ヒト生物学的試料)中のペプチドの種類のうちの少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、または少なくとも95%を同定するように構成され得る。例えば、本開示の方法は、システイン特異的標識およびリジン特異的標識をヒト尿試料由来の複数のペプチドへカップリングする工程、約105のペプチドをガラススライドへ固定する工程、ペプチド上の標識検出およびN末端アミノ酸除去の逐次ラウンドを実施する工程、ならびに同定されたシステインおよびリジンペプチド配列を既知のヒト尿ペプチドのデータベースと比較し、それによって試料からの約105のペプチドのうちの少なくとも60%を同定する工程を含み得る。
2．アミノ酸選択的標識
本開示は、例えばペプチドシーケンシングのために、アミノ酸を選択的に標識するための幅広い組成物、システム、および方法を提供する。試料調製は、特定のアミノ酸タイプ(例えば、システイン、リジン、ヒスチジン、チロシン、トレオニン、セリン、アルギニン、グルタメート、アスパルテート、トリプトファン、またはそれらの任意の組み合わせ)およびアミノ酸位置(例えば、N末端またはC末端アミノ酸)を選択的に標識することによって改善され得る。標識は、特定のアミノ酸タイプ(例えば、アルギニン)またはアミノ酸タイプの集合(例えば、リジンおよびシステイン)へカップリングするように構成された第1反応基を含み得る。
本開示の組成物、システム、または方法は、システイン、リジン、チロシン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、トレオニン、セリン、アルギニン、N末端アミン、C末端カルボキシル基、またはその任意の組み合わせを選択的に標識し得る。組成物、システム、または方法は、アミノ酸の群を選択的に標識し得、例えば、特異的マレイミド試薬は、試料中に存在するリジンおよびシステイン残基へカップリングするように構成され得る。組成物、システム、または方法は、単一のアミノ酸を選択的に標識し得、例えば、特異的エポキシド試薬は、他のアミノ酸タイプと比べてヒスチジン残基へ選択的にカップリングするように構成され得る。
本開示は、特定のアミノ酸タイプ(例えば、システイン)およびアミノ酸の群(例えば、カルボキシレート側鎖含有アミノ酸、例えば、グルタメートおよびアスパルテート)を選択的に標識するための幅広い試薬を提供する。システイン特異的標識の非限定的な例には、ある種のヨードアセトアミド、チオール、ハロゲン化ベンジルおよびアリル、セレノシアネート、マレイミド、ならびにアルキン(例えば、ある種のアルキン酸アミド)が含まれ得る。場合によっては、マレイミドは、システインおよびリジンへカップリングするように構成され得る。システインチオールがヨードアセトアミドへ求核的にカップリングするシステインラベリングスキームの例を、以下のスキーム2に概説する。
スキーム2
Figure 2023527149000001
リジン特異的標識の非限定的な例には、ある種のチオシアネートおよびイソチオシアネート、マレイミド、アルデヒド、イサト酸無水物、およびNHSエステルが含まれ得る。例えば、リジルブチルアミン側鎖は、スキーム3に概説されるように、NHSエステルへ選択的にカップリングされ得る。
スキーム3
Figure 2023527149000002
ペプチドカルボキシレート(例えば、グルタメート、アスパルテート、およびC末端カルボキシレート)は、求核カップリングステップを通じて標識され得る。このようなカップリングプロセスの例をスキーム4に提供し、これはアミンベースの求核置換を介してのアミド変換へのカルボキシル変換を示す。
スキーム4
Figure 2023527149000003
チロシン特異的標識の非限定的な例には、ある種のアリールジアゾ化合物、マンニッヒ反応試薬(例えば、アミンおよびホルムアルデヒド)、およびイミンが含まれ得る。スキーム5は、アリールジアゾ化合物を含むチロシン特異的ラベリングスキームの例を提供する。
スキーム5
Figure 2023527149000004
ヒスチジン特異的標識の非限定的な例には、ある種のα，β-不飽和ケトンおよびエポキシドが含まれ得る。ヒスチジン特異的ラベリングスキームの例をスキーム6に提供し、これは2-シクロヘキセノン試薬によるヒスチジンラベリングを示す。
スキーム6
Figure 2023527149000005
アルギニンラベリングの非限定的な例は、グリオキサール標識によるアルギニングアニジニウムアシル化およびピリミジンへの誘導体化を含む。スキーム7は、バートン塩基の助けを借りたNHSエステルによるアルギニンラベリングの例を示す。
スキーム7
Figure 2023527149000006
アルギニン標識の非限定的な例には、スキーム8に概説されるオキサジリジンラベリングプロセスなどの、ベンゾフェノンおよびオキサジリジンが含まれる。
スキーム8
Figure 2023527149000007
トリプトファン標識の非限定的な例には、ジアゾプロパン酸エステルおよび光活性化可能なハロアルケンが含まれ得る。スキーム9は、アミン誘導体化トリプトファンを生成するためのジアゾプロパン酸エステルによるトリプトファンインドールラベリングの例を提供する。
スキーム9
Figure 2023527149000008
本開示はまた、翻訳後修飾アミノ酸を標識するための幅広い組成物、システム、および方法を提供する。標識され得る翻訳後修飾アミノ酸の非限定的な例には、リン酸化アミノ酸、グリコシル化アミノ酸、ニトロシル化アミノ酸、シトルリン化アミノ酸、スルフェニル化アミノ酸、およびトリメチル化アミノ酸が含まれる。例えば、スキーム10に示されるように、ホスホセリンまたはホスホトレオニンもまた、ホスホリルβ脱離とそれに続く標識コンジュゲート付加を介して選択的に標識され得る。
スキーム10
Figure 2023527149000009
フルオロシーケンシング
本開示の様々な局面は、ペプチドフルオロシーケンシングのための組成物、システム、および方法を提供する。本明細書に開示されるフルオロシーケンシング法は、単一分子レベルでペプチド配列情報を提供することができる。例えば、フルオロシーケンシング法は、ペプチドバーコードの配列を同定するために、または複数のペプチドバーコードの配列を同時に決定するために、使用され得る。例示的なフルオロシーケンシング法は、米国特許第9,625,469号、米国特許出願第16/709,903号、および米国特許出願第15/510,962号に提供されている。本開示と一致する方法は、ペプチドをフルオロシーケンシングおよび分析のさらなる形態へ供し得る。
多くのフルオロシーケンシング法の特徴は、シーケンシングされるペプチドへアミノ酸標識をカップリングすることである。標識は、アミノ酸特異的標識(例えば、特定のタイプのアミノ酸または特定のタイプのアミノ酸のセットへカップリングするように構成される)であってもよい。フルオロシーケンシング法は、複数のタイプのアミノ酸を別個のアミノ酸タイプ特異的標識で標識することを含み得る。フルオロシーケンシング法は、対象のペプチドまたはタンパク質中の1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれ以上の異なるタイプのアミノ酸残基を標識することを含み得る。ペプチドは、N末端アミノ酸、システイン、リジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、セリン、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、メチオニン、またはそれらの任意の組み合わせ上に標識を含み得る。ペプチドは、ホスホセリン／ホスホトレオニン、ピログルタミン酸、ヒドロキシプロリン、アジドリジン、デヒドロアラニン、またはそれらの任意の組み合わせなどの非標準アミノ酸上に標識を含み得る。これらのアミノ酸残基の各々は、異なる標識で標識されてもよい。(i)アスパラギン酸およびグルタミン酸または(ii)セリンおよびトレオニンなどの、複数のアミノ酸残基は、同じ標識で標識されてもよい。
標識は、レポーター部分を含み得る。レポーター部分は、光学的に検出可能であり得る(例えば、蛍光、燐光、発光、または光吸収)。レポーター部分は、電気化学的に検出可能であり得る(例えば、特徴的な酸化または還元電位を有する酸化還元活性部分)。レポーター部分は、質量タグを含み得る(例えば、質量分析による同定のため)。レポーター部分は、それが結合されている標識を同定することができる。複数の標識は、それらのタイプによって複数の標識の標識を同定する複数の検出可能な部分を含んでもよい。例えば、方法は、異なるアミノ酸へカップリングするように構成された複数のタイプの標識を含んでもよく、各々は、そのタイプによって標識を一意的に同定する異なるレポーター部分を含む。
標識は、反応基を含んでもよい。反応基は、レポーター部分、保護基、またはそれらの任意の組み合わせへカップリングするように構成され得る。方法は、標識をペプチドのアミノ酸へカップリングすること(例えば、標識を特定のタイプの各アミノ酸へカップリングすること)、次いでレポーター部分または保護基を標識へカップリングすることを含み得る。方法は、反応基を含む複数のタイプの標識をペプチドの複数のアミノ酸へカップリングすること、およびそれらのタイプに基づいて複数のレポーター部分、保護基、またはそれらの組み合わせを標識へカップリングすることを含み得る。方法は、複数のタイプの標識をペプチドの複数のアミノ酸へカップリングすることを含んでもよく、ここで、複数のタイプの標識は、反応基を有する標識、レポーター部分を有する標識(例えば、色素へカップリングされたシステイン反応性標識)、反応基およびレポーター部分を欠く標識、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
標識(例えば、レポーター部分または保護基へカップリングするように構成された反応基を含む標識)は、アミノ酸タイプへ可逆的または不可逆的に結合してもよく、したがって、標的ペプチドから化学的に(例えば、切断試薬の添加によって)または物理的に(例えば、熱または光の添加によって)脱カップリングされ得る。したがって、方法は、第1アミノ酸をブロックすること、第2アミノ酸タイプ(例えば、トレオニン)を標識すること、第1アミノ酸タイプのアンブロックすること、および第1アミノ酸タイプを標識することを含み得る。可逆標識の例としては、シラン(例えば、トリメチルシラン)、アセチル基、ベンゾイル基、不飽和ピランおよびフラン基、尿素形成基、カルバメート形成基、カーボネート形成基、チオ尿素形成基、チオカルバメート形成基、チオカーボネート形成基、およびそれらの誘導体が挙げられ得る。不可逆的標識の例としては、アルキル基、オキソ基、アミド形成基(例えば、アミンをアミドに変換するように構成された塩化アシル)、およびそれらの誘導体が挙げられ得る。
ラベリング特異性は、フルオロシーケンシング法にとって大きな課題となり得る。多くの場合、標識は、複数のアミノ酸タイプに対する反応性を含み得る。例えば、いくつかのマレイミド標識は、システイン、リジン、およびN末端アミンと反応することができる。このような交差反応性を利用または防止するために、多数の戦略が用いられ得る。方法は、例えば、多重特異的標識がカップリングするように構成されている1つまたは複数のアミノ酸タイプが化学的にブロックまたは標識され、したがって多重特異的標識と反応することができなくなった後に、多重特異的標識がシステムへ添加されることを確実にするために、逐次アミノ酸ラベリングを含み得る。
フルオロシーケンシングは、対象のペプチド検出に続いてまたは先行して、化学的切断、エドマン分解、または他の形態の酵素的切断などの技術を通じてペプチドを除去することを含んでもよい。逐次ペプチド除去は、配列または位置特異的情報を生成し得る。例えば、N末端アミノ酸除去ステップに続く蛍光の減少は、標識されたアミノ酸、したがって特定のタイプのアミノ酸がペプチドN末端に配置されたことを示し得る。各アミノ酸残基の除去は、エドマン分解およびタンパク質分解切断を含む様々な異なる技術を用いて行うことができる。これらの技術は、末端アミノ酸残基を除去するためにエドマン分解を使用することを含み得る。あるいは、これらの技術は、末端アミノ酸残基を除去するために酵素を使用することを伴い得る。これらの末端アミノ酸残基は、ペプチド鎖のC末端またはN末端のいずれかから除去され得る。エドマン分解が使用される状況では、ペプチド鎖のN末端のアミノ酸残基が除去される。
本開示の標識、レポーター部分、または保護基は、ペプチドから1つまたは複数のアミノ酸残基を除去するための条件に耐えるように構成され得る。本方法において使用され得る潜在的なレポーター部分のいくつかの非限定的な例としては、例えば、Alexa Fluor（登録商標）色素、Atto色素、Janelia Fluor（登録商標）色素、ローダミン色素、または他の類似の色素などの、赤色から赤外スペクトルにおいて蛍光シグナルを発するものが挙げられる。アミノ酸残基を除去する条件に耐えることができたこれら色素の各々の例は、Alexa Fluor（登録商標）405、ローダミンB、テトラメチルローダミン、Janelia Fluor（登録商標）549、Alexa Fluor（登録商標）555、Atto647N、および(5)6-ナフトフルオレセイン（(5)6-napthofluorescein）を含む。レポーター部分は、蛍光ペプチド(例えば、緑色蛍光タンパク質またはその変異体)または光学的に検出可能な材料、例えばカーボンナノチューブ、ナノロッド、もしくは量子ドットを含み得る。
ペプチドの検出または画像化は、表面上にペプチドを固定することを含んでもよい。ペプチドは、ペプチド由来のシステイン残基、ペプチドN末端、またはペプチドC末端を表面と、または表面へカップリングされた試薬とカップリングすることによって、表面へ固定され得る。ペプチドは、システイン残基を表面と、または表面へカップリングされた捕捉試薬と反応させることによって、固定され得る。ペプチドは、ペプチドC末端またはN末端と本明細書に記載される捕捉部分とをカップリングさせることによって、固定され得る。ペプチドは表面上に固定され得る。固定されたペプチドを検出することは、ペプチドを含む画像をキャプチャーすることを含み得る。画像は、ペプチドに特異的な空間アドレスを含み得る。複数のペプチドが単一の画像（imagine）において検出されてもよく、ここで、ペプチドのうちの1つまたは複数が画像内の空間アドレスを含んでもよい。表面は、可視スペクトルおよび／または赤外スペクトルにわたって光学的に透明であり得る。表面は、低屈折率(例えば、1.3～1.6の間の屈折率)を有し得る。表面は、厚さ10～50 nm、厚さ20～80 nm、厚さ50～200 nm、厚さ100～500 nm、厚さ200～800 nm、厚さ500 nm～1μm、厚さ1～5μm、厚さ2～10μm、厚さ5～20μm、厚さ20～50μm、厚さ50～200μm、厚さ200～500μm、または厚さ500μm超であり得る。表面は有機溶媒に対して化学的耐性があり得る。表面は、トリフルオロ酢酸または硫酸などの強酸に対して化学的耐性があり得る。幅広い基体(フルオロポリマー(Teflon-AF (Dupont)、Cytop（登録商標）(Asahi Glass, Japan))、芳香族ポリマー(ポリキシレン(Parylene, Kisco, Calif.)、ポリスチレン、ポリメタメチルアクリテート（polymethmethylacrytate）)および金属表面(金コーティング)など)、コーティングスキーム(スピンコーティング、浸漬コーティング、金属の電子ビーム蒸着、熱蒸着およびプラズマ強化化学蒸着)、ならびに官能化法(ポリアリルアミングラフト化、PECVDでのアンモニアガスの使用、長鎖末端官能化フルオロアルカンのドーピングなど)が、有用な表面として本明細書に記載される方法において使用され得る。Cytop（登録商標）で作られた厚さ20 nmの光学的に透明なフルオロポリマー表面を、本明細書に記載される方法で使用してもよい。本明細書で使用される表面は、シーケンシングのためのペプチドおよび選択のための修飾標的を隔離する様々なフルオロアルカンでさらに誘導体化され得る。あるいは、アミノシラン修飾表面を、本明細書に記載される方法で使用してもよい。方法は、ビーズ、樹脂、ゲル、石英粒子、ガラスビーズ、またはそれらの組み合わせの表面にペプチドを固定する工程を含み得る。いくつかの非限定的な例では、方法は、Tentagel（登録商標）ビーズ、Tentagel（登録商標）樹脂、または他の類似のビーズもしくは樹脂の表面に固定されたペプチドを使用することを企図している。本明細書で使用される表面は、ポリエチレングリコールなどのポリマーでコーティングされ得る。表面は、アミン官能化またはチオール官能化されてもよい。
本明細書に記載されるシーケンシング技術は、ペプチドへカップリングされた1つまたは複数の標識またはレポーター部分(例えば、アミノ酸標識)の存在を決定するために、ペプチドまたはタンパク質を画像化することを含み得る。シーケンシング技術は、複数のペプチドの中から個々のペプチド上の1つまたは複数の標識またはレポーター部分の存在を決定するために、複数のペプチドまたはタンパク質を画像化することを含み得る。シーケンシング技術は、少なくとも103、少なくとも104、少なくとも105、少なくとも106、少なくとも107、少なくとも108または以上のタンパク質またはペプチドを画像化すること(例えば、少なくとも103～少なくとも108のタンパク質またはペプチドを含む表面の一部を画像化すること)を含み得る。これらの画像は、アミノ酸残基の各除去後に撮影されてもよく、したがって、ペプチド配列中の特定のアミノ酸の位置の決定を可能にし得る。例えば、C末端固定化ペプチドは、KDDYAGGGAAGKDA (SEQ ID NO: 2、ここで、「K」はリジンを意味し、「D」はアスパルテートを意味し、「Y」はチロシンを意味し、「A」はアラニンを意味し、「G」はグリシンを意味する)の配列(N末端からC末端へ)を含んでもよく、リジンおよびチロシン残基のそれぞれへカップリングされた標識を含んでもよい。C末端固定化ペプチドを含む第1の画像は、ペプチド中に2つのリジンおよび1つのチロシンの存在を示し得る。N末端アミノ酸は(例えば、エドマン分解によって)除去されてもよく、その結果、C末端固定化ペプチドを含む第2の画像は、ペプチド中に1つのリジンおよび1つのチロシンの存在を示し得る。このプロセスは、ペプチドについてKXXYXXXXXXXKX (SEQ ID NO: 3)の配列が同定されるまで繰り返されてもよく、ここで、「X」は非リジン、非チロシンアミノ酸を示し、「K」はリジンを示し、「Y」はチロシンを示す。本開示の方法は、ペプチド配列中の特定のアミノ酸の位置を特定することができる。方法は、ペプチド配列中の特定のアミノ酸残基の場所を決定するために使用されてもよく、またはこれらの結果は、ペプチド配列中のアミノ酸残基の全リストを決定するために使用されてもよい。方法は、ペプチド配列中の1つまたは複数のアミノ酸残基の位置を決定し、これらの位置を既知のペプチド配列と比較することを含み得、これは、ペプチド配列中のアミノ酸残基の全リストを同定し得る。例えば、ヒトタンパク質の40アミノ酸断片中のリジンおよびシステインの位置を同定することは、タンパク質を一意的に同定し得る(例えば、1つのヒトタンパク質（protin）のみが、40アミノ酸断片中で同定されたリジンおよびシステイン残基の特異的パターンを含む)。
画像化法は、蛍光定量、拡散反射、干渉散乱、ラマン、共鳴増強ラマン、赤外吸光度、可視光吸光度、紫外吸光度、および蛍光などの、様々な異なる分光光度法および顕微鏡法を含み得る。蛍光法は、蛍光偏光、フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)、または時間分解蛍光などの蛍光技術を用い得る。分光光度法または顕微鏡法は、単一のペプチドへカップリングされた1つまたは複数のフルオロフォアの存在を決定するために使用され得る。そのような画像化法は、特定のペプチド配列上の標識の存在または非存在を決定するために使用され得る。アミノ酸残基を除去し、対象のペプチドを画像化するサイクルを繰り返した後、ペプチド中の標識アミノ酸残基の位置を決定することができる。
ペプチド分解
本開示は、穏やかかつ逐次的なタンパク質分解のための幅広い化学的および酵素的技術を提供する。分解は、例えば、フルオロシーケンシングアッセイにおいて特定のアミノ酸の順序またはアイデンティティーを決定するために、幅広いペプチドシーケンシングおよび分析法において用いることができる。ペプチドまたはタンパク質は、その配列の少なくとも一部の配列を決定するために、切断条件へ繰り返し供され得る。ペプチドの全配列は、本明細書に記載される方法および組成物を用いて決定され得る。制御されたアミノ酸除去(例えば、NまたはC末端アミノ酸除去)は、例えば、エドマン分解、有機リン分解、またはタンパク質分解切断を含む様々な技術を通じて実施され得る。いくつかの場合では、エドマン分解は、ペプチドNまたはC末端から単一末端アミノ酸残基を除去するために使用される。いくつかの場合では、N末端アミノ酸残基が、ペプチドから選択的に除去される。末端アミノ酸を除去するための化学的または酵素的手法は、規定された数(例えば、正確に1つ、正確に2つ、最大で2つ)のアミノ酸を除去し得る。したがって、ペプチドを分析するための方法は、1ステップ当たりN末端またはC末端からの規定された数のアミノ酸の除去が分析中に位置および配列特異的アミノ酸同定を提供するような、連続的な分解および分析ステップを含み得る。末端アミノ酸を除去するための化学的または酵素的手法は、規定された位置で(例えば、2つのアラニン残基の間でのみ、またはN末端アミノ酸をペプチドの残りの部分に接続するペプチド結合でのみ)ペプチドを切断することができる。
エドマン分解法は、ペプチドN末端またはC末端を化学的に官能化し(例えば、N末端アミンのチオ尿素またはグアニジニウム誘導体を形成するため)、次いで、官能化末端アミノ酸を試薬(例えば、ヒドラジン)、条件(例えば、高または低pHまたは温度)、または酵素(例えば、官能化末端アミノ酸に対する特異性を有するエドマナーゼ)と接触させて、官能化末端アミノ酸を除去することを含み得る
ジ活性化（diactivated）ホスフェートまたはホスホネートを、ペプチド切断のために使用してもよい。そのような方法は、官能化アミノ酸を除去するために酸を用い得る。ジ活性化ホスフェートまたはホスホネートは、ジハロリン酸エステルであってもよい。他の態様において、技術は、例えばエキソペプチダーゼまたはエドマナーゼなどの末端アミノ酸残基を除去するための酵素を使用することを含む。例えば、方法は、ペプチドのN末端アミノ酸をジ活性化ホスフェートで誘導体化し、ペプチドをホスフェート官能化N末端アミノ酸に対する切断活性を有するエドマナーゼと接触させることを含み得る。
切断法(例えば、シーケンシング法内で実施される切断法)は、酵素的切断を含み得る。切断法は、単一のプロテアーゼ、一連のプロテアーゼ(例えば、特定の順序で提供される)、またはプロテアーゼの組み合わせの使用を含み得る。例示的なプロテアーゼおよびそれらの関連する切断部位を表1に提供する。切断法は、ペプチドバーコードを分子から脱カップリングすることを含み得る。例えば、ペプチドバーコードは、表1に列挙されたプロテアーゼによって認識される切断部位を含む切断可能リンカーを含み得る。そのような場合、切断部位の配列が切断可能リンカー中に存在し、ペプチドバーコード中に存在しなくてもよい。切断法は、ペプチドバーコードを断片化すること(例えば、ペプチドバーコードシーケンシングの前に内部ペプチド結合を切断すること)を含み得る。
（表１）例示的なプロテアーゼ
Figure 2023527149000010
Figure 2023527149000011
ペプチド切断は、化学的切断を含んでもよい。本開示と一致する化学的切断試薬の例には、臭化シアン、BNPS-スカトール、ギ酸、ヒドロキシルアミン、および2-ニトロ-5-チオシアノ安息香酸が含まれる。ペプチドバーコードは、ジスルフィドなどの化学的に切断可能な部分を含み得る。ペプチドバーコードは、化学的に切断可能な部分を含むリンカーによって分子へカップリングされ得る。ペプチドバーコードは、化学的に切断可能な結合によって分子へカップリングされ得る。切断法は、化学的切断試薬および酵素的切断試薬の組み合わせ(例えば、並行または逐次使用)を含み得る。切断法は、化学的または酵素的切断のためにアミノ酸を活性化する(例えば、官能化する)ことを含み得る。例えば、方法は、ペプチドのN末端アミノ酸残基を誘導体化し、次いで、誘導体化N末端アミノ酸残基を除去するように構成された「エドマナーゼ」酵素とペプチドを接触させることを含み得る。
ペプチド切断条件は、溶媒を用いて達成され得る。溶媒は、水性溶媒、有機溶媒、またはそれらの組み合わせもしくは混合物であり得る。溶媒は有機溶媒であってもよい。有機溶媒は、水との混和性を含んでもよい。有機溶媒は無水であってもよい。溶媒は、非極性溶媒(例えば、ヘキサン、ジクロロメタン(DCM)、ジエチルエーテルなど)、極性非プロトン性溶媒(例えば、テトラヒドロフラン(THF)、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド(DMF)、アセトニトリル(MeCN)、ジメチルスルホキシド(DMSO)など)、または極性プロトン性溶媒(例えば、イソプロパノール(IPA)、エタノール、メタノール、酢酸、水など)であってもよい。溶媒はDMFであってもよい。溶媒は、C1-C12ハロアルカンであってもよい。C1-C12ハロアルカンはDCMであってもよい。溶媒は、2つ以上の溶媒の混合物であってもよい。2つ以上の溶媒の混合物は、極性非プロトン性溶媒とC1-C12ハロアルカンとの混合物であってもよい。2つ以上の溶媒の混合物は、DMFとDCMの混合物であってもよい。溶媒の混合物は、それらの任意の組み合わせであってもよい。
分解プロセスは複数のステップを含み得る。例えば、方法は、ペプチドの末端アミノ酸を誘導体化するための初期ステップと、誘導体化末端アミノ酸をペプチドから切断するための後続ステップとを含み得る。1つのそのような方法は、有機リン化合物媒介N末端官能化および除去を含み、したがって、いくつかのエドマン分解スキームのイソチオシアネート(例えば、フェニルイソチオシアネート)ベースのプロセスに代わるものを提供する。
有機リンベースの分解スキームは、有機塩基(例えば、トリエチルアミン、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)、1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン(DBU)、ピリジン、1,5-ジアザビシクロ(4.3.0)ノン-5-エン、2,6-ジ-tert-ブチルピリジン、イミダゾール、ヒスチジン、炭酸ナトリウムなど)の存在下で、ペプチドを有機溶媒または有機溶媒混合物(例えば、ジクロロメタンおよびジメチルホルムアミドの混合物)に溶解することを含み得る。次いで、ペプチドを少なくとも1つの有機リン化合物と接触させてもよい。ペプチドまたはタンパク質N末端の切断は、弱酸(例えば、水中のギ酸)の添加によって開始され得る。ペプチドまたはタンパク質N末端の切断はまた、水で開始され得る。結果として生じる生成物は、ホスホルアミドとしてペプチドから放出されたペプチドまたはタンパク質の末端アミノ酸と、末端アミノ酸残基によって短縮されたペプチドまたはタンパク質とを含み得、これは、その後の切断反応を行うために使用することができる遊離N末端を含む。
切断法は、所望の平均長の断片を生成するためにペプチドを消化することを含み得る。切断法は、少なくとも5アミノ酸、少なくとも8アミノ酸、少なくとも10アミノ酸、少なくとも12アミノ酸、少なくとも15アミノ酸、少なくとも20アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、少なくとも30アミノ酸、少なくとも40アミノ酸、または少なくとも50アミノ酸の平均長を有するペプチドを(例えば、細胞溶解物などの、ペプチドの複合混合物に作用することによって)生成し得る。切断法は、多くとも50アミノ酸、多くとも40アミノ酸、多くとも30アミノ酸、多くとも25アミノ酸、多くとも20アミノ酸、多くとも15アミノ酸、多くとも12アミノ酸、多くとも10アミノ酸、多くとも8アミノ酸、または多くとも5アミノ酸の平均長を有するペプチドを生成し得る。切断法は、5～20アミノ酸、5～30アミノ酸、10～20アミノ酸、10～30アミノ酸、12～18アミノ酸、15～30アミノ酸、20～40アミノ酸、または30～50アミノ酸の平均長を有するペプチド断片を生成し得る。
反応混合物は、(例えば、切断されるペプチドの濃度と比べて)化学量論的または過剰濃度の切断化合物を含み得る。反応混合物は、少なくとも約0.001% v/v、約0.01% v/v、約0.1% v/v、約1% v/v、約5% v/v、約10% v/v、約15% v/v、約20% v/v、約30% v/v、約40% v/v、約50% v/v、またはそれ以上の切断化合物を含み得る。反応混合物は、多くとも約50% v/v、約40% v/v、約30% v/v、約20% v/v、約15% v/v、約10% v/v、約5% v/v、約1% v/v、約0.1% v/v、約0.01% v/v、約0.001% v/v、またはそれ以下の切断化合物を含み得る。反応混合物は、約0.1% v/v～約20% v/v、約0.5% v/v～約10% v/v、または約1% v/v～約10% v/vの切断化合物を含み得る。反応混合物は、約5% v/vの切断化合物を含み得る。
反応は、少なくとも約0℃、少なくとも約5℃、少なくとも約10℃、少なくとも約15℃、少なくとも約20℃、少なくとも約25℃、少なくとも約30℃、少なくとも約40℃、少なくとも約50℃、少なくとも約60℃、少なくとも約70℃、少なくとも約80℃、または少なくとも約90℃の温度で行われ得る。反応は、多くとも約90℃、多くとも約80℃、多くとも約70℃、約60℃、約50℃、約40℃、約30℃、約25℃、約20℃、約15℃、約10℃、約5℃、約0℃、またはそれ以下の温度で行われ得る。反応は、約0℃～約70℃、約10℃～約50℃、約20℃～約40℃、または約20℃～約30℃の温度で行われ得る。反応は、室温(例えば、約22℃～約27℃)を超える温度で行われ得る。反応は室温で行われ得る。反応は、(例えば、不凍剤の存在下で)0℃付近または0℃未満で行われ得る。
ペプチドおよび切断化合物は、少なくとも約1分間、約5分間、約10分間、約20分間、約30分間、約40分間、約50分間、約60分間、約2時間、約3時間、約4時間、約6時間、約8時間、約10時間、約12時間、約16時間、約20時間、約24時間、またはそれ以上、混合またはインキュベートされ得る。ペプチドおよび切断化合物は、多くとも約24時間、約20時間、約16時間、約12時間、約10時間、約8時間、約6時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約50分間、約40分間、約30分間、約20分間、約10分間、約5分間、約1分間、またはそれ以下、混合またはインキュベートされ得る。ペプチドおよび切断化合物は、約1分間～約24時間、5分間～約6時間、5分間～約2時間、または5分間～約30分間、混合またはインキュベートされ得る。
複数の反応基を有する標識
本開示の局面は、アミノ酸(または、アミノ酸側鎖の反応性官能基などの、その一部)へカップリングするための第1反応基と、レポーター部分または保護基へカップリングするための第2反応基とを含むアミノ酸標識を提供する。このようなシステムは、「クリック-クラック」ラベリングシステムと呼ばれることがあり、ここで、「クリック」試薬は、アミノ酸へカップリングするように構成された標識を指し、「クラック」試薬は、「クリック」試薬へカップリングするように構成されたレポーター部分または保護基を指す。標識の第2反応基は、レポーター部分、保護基、またはそれらの任意の組み合わせへ可逆的にまたは不可逆的にカップリングするように構成され得る。第2反応基は、保護基へ可逆的にカップリングされ、保護基から脱カップリングされ、次いでレポーター部分へカップリングされ得る。例えば、標識は、その第1または第2反応基へカップリングされた保護基を備えていてもよい(例えば、標識のアルデヒド反応基へカップリングされたジオール)。このようなモジュール式ラベリングプロセスは、アミノ酸と標識タイプとの間の交差反応性を低下させたマルチアミノ酸ラベリングスキームを可能にし得る。このようなラベリングプロセスはまた、アミノ酸ラベリングステップに続くそれらの結合を可能にすることによって、化学的に感受性のレポーター部分(例えば、pH感受性または化学的に消光可能な色素)の使用を可能にし得る。例えば、方法は、ペプチドのシステイン残基を第1標識で選択的に標識すること、ペプチドのリジン残基を第2標識で選択的に標識すること、ペプチドのカルボキシレート含有残基(例えば、アスパルテートおよびグルタメート)を第3標識で選択的に標識すること、ペプチドのアルギニン残基を第4標識で選択的に標識すること、ペプチドのメチオニン残基を化学修飾すること(例えば、酸化すること)、ペプチドの化学修飾メチオニン残基を第5標識で選択的に標識すること、および異なるレポーター部分(例えば、異なる色の色素)を単一のステップで(例えば、全ての標識試薬を同時に添加して)第1、第2、第3、第4、および第5標識のそれぞれへカップリングすることを含み得る。また、1つまたは複数のレポーターフルオロフォアがペプチド鎖上のアミノ酸を直接標識することも考えられる。本開示の二官能性標識は、標識の第1反応基とレポーター部分との間の交差反応性を防止し得る。例えば、二官能性標識の使用は、ヨードアセトアミド反応性色素などの、標識の第1反応基と交差反応性であるレポーター部分と、システイン反応性ヨードアセトアミド基を含む標識との使用を可能にし得る。
本開示の標識は、2つの生物学的種、例えば2つのアミノ酸残基を架橋するために使用され得る。例えば、方法は、リジン選択的標識を第1ペプチドへ、システイン選択的標識を第2ペプチドへカップリングし、次いで、リジン選択的標識およびシステイン選択的標識を架橋することを含み得る。架橋は、リジン選択的標識およびシステイン選択的標識を直接(例えば、化学結合を介して)カップリングしてもよく、または、リジン選択的標識およびシステイン選択的標識上の第2反応基へカップリングするように構成された「クラック」試薬などの、リンカーを含んでもよい。
第2反応基を含むアミノ酸選択的標識の例、ならびにそれらの合成のための試薬対の例を、表2に提供する。システインおよびリジン選択的「クリック」標識は、第1反応基としてヨードアセトアミド(例えば、システインまたはリジンへカップリングするため)および第2反応基としてアジド(例えば、「クラック」レポーター部分または保護基へカップリングするため)を含み得る；例えば、表2の行Aに示されるヨードアセトアミドPEGアジド化合物。システイン選択的「クリック」標識は、第1反応基としてヨードアセトアミドを含み、第2反応基としてノルボルネンを含み得る；例えば、表2の行Bに示す反応物。そのような試薬は、ノルボルネンアミンをヨードアセトアミドN-ヒドロキシスクシンアミドエステルとカップリングすることによって合成することができる。システイン選択的「クリック」標識は、第1反応基としてヨードアセトアミドおよび第2反応基としてアルデヒドを含み得る；例えば、2-ヨード-N-(3-オキソプロピル)アセトアミド(表2の行Cに示される通り)。そのような化合物は、N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを、アルデヒドへ加水分解するように構成されたジェミナルジエーテルを含むアミンとカップリングすることによって生成され得る。システイン選択的標識は、システインへカップリングするための第1反応基を含むが、第2反応基を欠いていてもよく(例えば、標識は「ダミー」標識であり得る)、したがって「クラック」レポーター部分または保護基へカップリングすることができない場合がある)試薬。そのような試薬の一例は、表2行Dに示されるようなヨードアセトアミドであり得る。
リジン選択的「クリック」標識は、第1反応基としてN-ヒドロキシスクシンアミドエステルおよび第2反応基としてノルボルネンを含み得る；例えば、表2の行Fに示される試薬。リジン選択的「クリック」標識は、第1反応基としてN-ヒドロキシスクシンアミドエステルおよび第2反応基としてジェミナルジエーテルを含み得る；例えば、表2の行Gに示される試薬。そのような試薬は、ジェミナルジエーテルを含む化合物のカルボン酸へ1-ヒドロキシピロリジン-2,5-ジオンをカップリングすることによって生成され得る。リジン選択的標識は、リジンへカップリングするための第1反応基を含むが、「クラック」レポーター部分または保護基へカップリングするための第2反応基を欠いていてもよい。そのような試薬の一例は、表2の行Hに示される化合物などの、活性化エステルであり得る。
カルボキシレート選択的(例えば、アスパルテートおよびグルタメート側鎖カルボキシレートに選択的)「クリック」標識は、第1反応基としてアミンおよび第2反応基としてアジドを含み得る；例えば、表2の行Iに示される試薬。カルボキシレート選択的「クリック」標識は、第1反応基としてアミン、第2反応基としてのノルボルネンを含み得る；例えば、表2の行Jに示される試薬。カルボキシレート選択的「クリック」標識は、第1反応基としてアミン、第2反応基としてジェミナルジエーテルを含み得る；例えば、表2の行KおよびLに示される試薬。カルボキシレート選択的標識は、カルボキシレートへカップリングするための第1反応基を含むが、「クラック」レポーター部分または保護基へカップリングするための第2反応基を欠いていてもよい。そのような試薬の一例は、表2の行Mに示される化合物などの、アルキルアミンであり得る。
ホスホセリン、ホスホトレオニン、および／またはグリコシル化選択的「クリック」試薬は、表2の行N～Rに示されるように、第1反応基としてジスルフィド、および第2反応基としてアジド、ノルボルネン、ジェミナルジエーテル、またはアルデヒドを含み得る。ホスホセリン、ホスホトレオニン、および／またはグリコシル化選択的「クリック」試薬は、第1反応基としてジスルフィドを含み得、第2反応基を欠いていてもよい。
（表２）本開示と一致する例示的な「クリック」標識
Figure 2023527149000012
Figure 2023527149000013
試料調製は、一連の連続したステップを通じて複数のアミノ酸残基を標識することによって改善され得る。本開示は、複数のアミノタイプのラベリングを容易にする幅広いシステムを提供する。システムは、アミノ酸、レポーター部分(例えば、蛍光分子(例えば、色素))の交差反応性、または、例えば、感受性レポーター部分(例えば、蛍光分子(例えば、色素))の分解を最小化し得る。
別の局面において、ペプチドを含むシステムであって、該ペプチドが、少なくとも1つの支持体へ固定されており；かつ、該ペプチドが、標識へカップリングされたアミノ酸を含み、該標識が、(i)シグナルを発するように構成されたレポーター部分へカップリングされている第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基、または(ii)該標識と該第2反応基の間のカップリングを防止するように構成された保護基を含む、システムを本明細書に提供する。
別の局面において、第1反応基へカップリングされたアミノ酸を含むペプチド；および、第2反応基へカップリングされた支持体を含む、ペプチドを処理または分析するためのシステムであって、第1反応基が、ペプチドを支持体に隣接して固定するために第2反応基へカップリングするように構成されている、システムを本明細書に提供する。いくつかの態様において、システムは、ペプチドを支持体(例えば、表面)へカップリングするように構成されている。いくつかの態様において、システムは、ペプチドのアミノ酸残基を支持体(例えば、表面)へカップリングするように構成されている。支持体(例えば、表面)は、ペプチドのアミノ酸残基へカップリングされた官能基へカップリングするように構成された反応基を含んでもよい。
ペプチドは複数のアミノ酸を含んでもよい。ペプチドは、アミノ酸またはアミノ酸類似体を含むオリゴマーまたはポリマーであり得る。ペプチドは、Lアミノ酸またはDアミノ酸であるアミノ酸を含み得る。ペプチドは、合成、組換え、または天然に存在するものであり得る。合成ペプチドは、インビトロでの人工的アプローチによって産生されるペプチドであってもよい。複数のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギンおよびトリプトファンからなる群より選択され得る。複数のアミノ酸は1つまたは複数のアミノ酸を含み得、1つまたは複数のアミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギンおよびトリプトファンからなる群より選択される。ペプチドは、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギンおよびトリプトファンからなる群より選択される1つのアミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、非天然アミノ酸を含んでもよい。複数のアミノ酸は、Dアミノ酸を含んでもよい。
複数のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸は、標識へカップリングされてもよい。複数のアミノ酸は少なくとも2つまたはそれ以上のアミノ酸タイプを含んでもよい。少なくとも2つのアミノ酸またはそれ以上のタイプは、第1アミノ酸タイプおよび第2アミノ酸タイプを含んでもよい。第1アミノ酸タイプは第1標識へカップリングされてもよい。第2アミノ酸タイプは第2標識へカップリングされてもよい。第1アミノ酸タイプは第1標識へカップリングされてもよく、かつ、第2アミノ酸タイプは第2標識へカップリングされてもよい。第1標識および第2標識は、異なるレポーター部分へ各々カップリングされてもよい。複数のアミノ酸は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、またはそれ以上のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、2～20個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、4～18個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、6～16個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、8～14個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、9～11個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸のアミノ酸タイプの全てよりも少ないアミノ酸タイプが標識されていてもよい。少なくとも2つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされてもよい。ペプチドは少なくとも4つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも4つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。複数のアミノ酸の全てよりも少ないアミノ酸が標識されていてもよい。複数のアミノ酸の各々が標識されていてもよい。
複数のアミノ酸は少なくとも2つのアミノ酸タイプを含んでもよく、少なくとも2つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされてもよい。ペプチドは少なくとも3つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも3つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。ペプチドは少なくとも4つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも4つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。ペプチドは少なくとも5または6つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも5または6つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。ペプチドは少なくとも8つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも8つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。ペプチドは少なくとも10のアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも10のアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。異なるアミノ酸タイプへカップリングされた各標識は、各アミノ酸タイプに対応するシグナルを発するように構成されたレポーター部分へ独立してカップリングされ得る。場合によっては、複数のアミノ酸の大部分が標識されている。場合によっては、複数のアミノ酸の大部分が標識されていない。
標識へカップリングされ得るアミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。標識へカップリングされるアミノ酸は翻訳後修飾を含み得る。翻訳後修飾は、グリコシル化、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、グルタミル化、グリコシル化、イソプレニル化、リン酸化、リポレーション、ホスホパンテテイニル化、硫酸化、セレネーション、アミド化、ユビキチン化、ヒドロキシル化、ニトロ化、ニトロシル化、シトルリン化、環化(例えば、N末端グルタミン酸またはグルタミン環化)、およびSUMO化であり得る。
ペプチドは、複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸を含み得る。複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸は、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸、および第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、複数の第1標識へカップリングされた複数の第1アミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、複数の第2標識へカップリングされた複数の第2アミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、(i)複数の第1標識へカップリングされた複数の第1アミノ酸および(ii)複数の第2標識へカップリングされた複数の第2アミノ酸を含み得る。第1標識、またはその複数は、第1アミノ酸、またはその複数へのみカップリングし得る。第2標識、またはその複数は、第2アミノ酸、またはその複数へのみカップリングし得る。第1標識、またはその複数は、第1アミノ酸、またはその複数へのみカップリングし得、かつ、第2標識、またはその複数は、第2アミノ酸、またはその複数へのみカップリングする。複数の標識のうちの少なくとも1つの標識は、複数のアミノ酸のうちの特定のアミノ酸タイプへカップリングされ得る。例えば、複数の標識のうちの1つの標識は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギン、またはトリプトファンへカップリングされ得る。
標識は、第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基を含み得る。第1反応基は、アジド、アルキン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、チオール、ジチオール、シクロオクテン、およびノルボルネンからなる群より選択され得る。第2反応基は、アジド、アルキン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、チオール、ジチオール、シクロオクテン、およびノルボルネンからなる群より選択され得る。第1反応基は、アジド、アルケン、アルデヒド、ケトン、およびテトラジンからなる群より選択され得る。第1反応基は歪みアルキンであり得る。第2反応基は、アジド、チオール、ジチオール、シクロオクテン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、ノルボルネン、およびアルキンからなる群より選択され得る。第2反応基は歪みアルキンであり得る。
複数の標識のうちの少なくとも1つの標識は、特異的レポーター部分へカップリングされた特異的第2反応基と反応するように構成されていてもよい。第1反応基は、アルキン、チオール、ジチオール、およびシクロオクテンからなる群より選択され得、第2反応基は、アルキン、アジド、チオール、ジチオール、シクロオクテン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、およびノルボルネンからなる群より選択され得る。第1反応基は、特定の第2反応基に反応するように構成され得る。例えば、第1反応基はアジドであり得かつ第2反応基はアルキンであり得、第1反応基はアルキンであり得かつ第2反応基はアジドであり得、第1反応基はアルケンであり得かつ第2反応基はチオールであり得、第1反応基はカルボニル(例えば、ケトンまたはアルデヒド)を含み得かつ第2反応基はジチオールであり得、第1反応基はテトラジンであり得かつ第2反応基はシクロオクテン(例えば、trans-シクロオクテン)であり得る。
アミノ酸、またはその複数へカップリングする、少なくとも1つの標識は、レポーター部分へカップリングされ得る。レポーター部分は、励起されるとシグナルを発するように構成されてもよい。シグナルは検出可能なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、蛍光シグナルまたは燐光シグナルなどの、光シグナルであり得る。光シグナルは色素によって生成され得る。レポーター部分はまた、非光学的に検出可能なシグナルを生成し得る。例えば、レポーター部分は、電気信号、放射性信号、または化学信号を生成し得る。レポーター部分はスペーサーへカップリングされ得る。スペーサーは、レポーター部分および第2反応基に隣接していてもよい。レポーターは、標識と反応するように構成され得る。レポーターは、レポーター部分および反応基(例えば、第2反応基)を含み得る。レポーターは、レポーター部分、反応基(例えば、第2反応基)、およびスペーサーを含み得る。
少なくとも1つの支持体は、ビーズ、ポリマーマトリクス、アレイ、またはその任意の組み合わせであり得る。少なくとも1つの支持体は、ビーズ、ポリマーマトリクス、またはアレイであり得る。少なくとも1つの支持体はビーズおよびアレイであり得る。少なくとも1つの支持体はビーズであり得る。少なくとも1つの支持体はアレイであり得る。アレイは表面であり得る。アレイはスライドであり得る。スライドは顕微鏡用スライドであり得る。少なくとも1つの支持体は顕微鏡用スライドであり得る。少なくとも1つの支持体はポリマーマトリクスであり得る。
支持体は固体支持体または半固体支持体であり得る。固体支持体または半固体支持体はビーズであり得る。ビーズはゲルビーズであり得る。ビーズはポリマービーズであり得る。支持体は樹脂であり得る。非限定的な支持体は、例えば、アガロース、セファロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール(PEG)、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。支持体はポリスチレンビーズであってもよい。支持体は、官能基、例えば、アミン、スルフヒドリル、酸、アルコール、臭化物、マレアミド、スクシンイミジルエステル(NHS)、スルホスクシンイミジルエステル、ジスルフィド、アジド、アルキン、イソチオシアネート(ITC)、またはそれらの組み合わせを含み得る。支持体はPEGA樹脂であってもよい。支持体はアミノPEGA樹脂であってもよい。支持体はアミン基を含んでもよい。支持体は、保護された官能基、例えば、Boc、Fmoc、アルキルエステル、Cbz、またはそれらの組み合わせを含み得る。ビーズは金属コアを含んでもよい。ビーズはポリマー磁気ビーズであってもよい。ポリマー磁気ビーズは金属酸化物を含んでもよい。支持体は少なくとも1つの酸化鉄コアを含んでもよい。
ペプチドのN末端、C末端、内部アミノ酸、またはそれらの任意の組み合わせを、少なくとも1つの支持体へカップリングすることができる。ペプチドのN末端およびC末端を、少なくとも1つの支持体へカップリングすることができる。ペプチドのN末端を一方の支持体へカップリングすることができ、ペプチドのC末端を別の支持体へカップリングすることができる。ペプチドのN末端をビーズへカップリングしてもよい。ペプチドのC末端をスライドへカップリングしてもよい。ペプチドのN末端をビーズへカップリングしてもよく、かつ、C末端を支持体へカップリングしなくてもよい。ペプチドのC末端をスライドへカップリングしてもよく、かつ、ペプチドのN末端を支持体へカップリングしなくてもよい。ペプチドのN末端をビーズへカップリングしてもよく、かつ、ペプチドのC末端をスライドへカップリングしてもよい。
ペプチドのN末端は、少なくとも1つの支持体へカップリングされ得る。ペプチドのN末端は、切断可能ユニットへカップリングされ得る。切断可能ユニットは、少なくとも1つの支持体へカップリングされ得る。切断可能ユニットは、(i)切断可能部分、(ii)アルデヒド、(iii)前記少なくとも1つの支持体、または(iv)スペーサーのうちの少なくとも1つを含み得る。切断可能ユニットは切断可能部分を含み得る。切断可能部分はリンク基（rink group）を含み得る。切断可能ユニットはアルデヒドを含み得る。アルデヒドは、ピリジンカルボキシアルデヒド(PCA)、またはその任意の誘導体であり得る。切断可能ユニットはスペーサーを含み得る。切断可能ユニットは、(i)切断可能部分、(ii)アルデヒド、(iii)前記少なくとも1つの支持体、または(iv)スペーサーのうちの少なくとも2つを含み得る。切断可能ユニットは切断可能部分およびアルデヒドを含み得る。切断可能ユニットは少なくとも1つの支持体およびアルデヒドを含み得る。切断可能ユニットは、(i)切断可能部分、(ii)アルデヒド、(iii)前記少なくとも1つの支持体、または(iv)スペーサーのうちの少なくとも3つを含み得る。切断可能ユニットは、アルデヒド、少なくとも1つの支持体、およびスペーサーを含み得る。切断可能ユニットは、アルデヒド、少なくとも1つの支持体、および切断可能部分を含み得る。切断可能ユニットは、スペーサー、少なくとも1つの支持体、および切断可能部分を含み得る。切断可能ユニットは、(i)切断可能部分、(ii)アルデヒド、(iii)前記少なくとも1つの支持体、および(iv)スペーサーを含み得る。切断可能は、WO2020072907A1に記載される通りであり得る。アルデヒド、スペーサー、切断可能部分、またはその任意の組み合わせは、WO2020072907A1に記載される通りであり得る。
ペプチドのC末端を、C末端を少なくとも1つの支持体へカップリングするように構成された剤で修飾することができる。剤は、アルキンまたはアジドを含んでもよく、これらのいずれかは少なくとも1つの支持体へカップリングするように構成され得る。C末端は酸性アミノ酸を含んでもよい。C末端は、第1酸性残基および第2酸性残基を含んでもよい。第1酸性残基は、C末端カルボン酸であってもよい。第2酸性残基は、アスパラギン酸側鎖またはグルタミン酸側鎖であってもよい。C末端の第1酸性残基および第2酸性残基は修飾されていてもよい。ペプチドのC末端が2つの酸性残基を含む場合、第1および第2酸性残基の両方が、アルキンまたはアジドを含む剤によって修飾されてもよく、これらのいずれかは少なくとも1つの支持体へカップリングするように構成され得る。
本システムにおいて使用するためのレポーター(またはレポーター部分)は、非限定的な例として、検出可能なシグナルまたは光シグナルを(例えば、蛍光色素から)発し得る。しかし、本明細書に記載されるような任意の数のレポーター(またはレポーター部分)が、それらの様々な有利な特徴のために使用され得る。追加の例として、レポーター(またはレポーター部分)は、特に、電離箱、ガス状イオン化検出器、ガイガーカウンター、光検出器、シンチレーションカウンター、または半導体検出器によって検出され得る放射測定シグナルを発し得る。逆に、レポーター(またはレポーター部分)は、まったくシグナルを発しない場合がある。レポーター(およびレポーター部分)は、それらの側鎖と反応することによって特定のアミノ酸を選択的に標識してもよく、またはアミノ酸への翻訳後修飾を検出してもよい。いくつかの例では、複数のアミノ酸がペプチド中に含まれ、その多くまたはすべてが標識および／またはレポーター(もしくはレポーター部分)へカップリングされ得る。
2つ以上のアミノ酸から構成される、ペプチドは、N末端およびC末端を有し得る。これらの末端は、1つまたは複数のアミノ酸によって分離されていてもよい。N末端は末端アミノ酸であり、末端アミンを含んでいてもよい。末端アミンは、非置換であってもよく、置換されていてもよい。いくつかの場合では、アミンは、切断、ブロック、官能化、または他の方法で修飾され得る。天然に存在するペプチドは、一般に、N末端位置に非置換アミンを含む。いずれのアミノ酸も、結合切断事象の後にN末端になることができる。同様に、C末端は末端アミノ酸であり、末端カルボン酸を含んでいてもよい。末端カルボン酸は、非置換でもあっても置換されていてもよい。いくつかの場合では、カルボン酸は、切断、ブロック、官能化、または他の方法で修飾され得る。天然に存在するペプチドは、一般に、C末端位置に非置換カルボン酸を含む。いずれのアミノ酸も、結合切断事象の後にC末端になることができる。いくつかの例では、本明細書に提供されるように、C末端は任意のアミノ酸であり得る。他の例では、C末端は酸性アミノ酸(例えば、グルタメートまたはアスパルテート)である。本開示は、特定の(例えば、所望の)C末端アミノ酸残基を有する第2ペプチドを生じさせるために、既知の部位における第1ペプチドの特異的切断を提供する。C末端アミノ酸は、切断後、酸性残基であり得る。C末端アミノ酸は、切断後、非酸性残基であり得る。同様に、特定の(例えば、所望の)N末端アミノ酸残基を有する第2ペプチドを生じさせるために、第1ペプチドを意図的に切断することができる。
ペプチドは非線形構造を有し得る。場合によっては、ペプチドは分岐していてもよい。場合によっては、ペプチドは環状であり得る。場合によっては、2つ以上のペプチドが架橋されていてもよい。場合によっては、2つ以上のペプチドが共有結合で架橋されてもよい。場合によっては、2つ以上のペプチドが非共有結合で会合していてもよい。
システムは、図1Aに示されるように構成され得る。システムは、少なくとも1つのアミノ酸(例えば、111、112、119)を含むペプチド100を含み得る。ペプチドはN末端アミノ酸119、C末端アミノ酸111、および内部アミノ酸112を含み得る。N末端アミノ酸は、N末端捕捉剤103へカップリングされ得る。N末端捕捉剤は、N末端アミノ酸へカップリングするための第1反応性ハンドル120を含み得る。N末端捕捉剤は、ビーズなどの支持体104へカップリングするように構成された第2反応性ハンドル125を含む。支持体104および第1反応性ハンドル120は、切断可能リンカー122および123の切断がペプチド102を支持体104から解放するように、第1連結基121、切断可能リンカー122および123、ならびに第2連結基124から構成された切断可能リンカーによって接続され得る。C末端アミノ酸は、ペプチドC末端111へカップリングするための反応性ハンドル110、リンカー109、および表面100へカップリングするように構成された反応性ハンドル108を含み得る、表面接着剤101へカップリングされ得る。標識107は、ペプチド102の少なくとも1つのアミノ酸(例えば、内部アミノ酸112)へカップリングされ得る。標識は、アミノ酸112へカップリングされた第1反応基112、リンカー113、および第2反応基114を含み得る。示される構成において、第2反応基は、レポーター部分106 検出可能部分118（例えば、フルオロフォア）の反応基116へカップリングされる。検出可能部分118は、反応基116へ直接カップリングされてもよく、リンカー117によって反応基へカップリングされてもよい。代替の構成において、標識の第2反応基115は、保護基105の反応基126へカップリングされてもよい。保護基は、反応基126へ直接カップリングされ得るか、またはリンカー127によって反応基へカップリングされ得る、化学的不活性部分128を含み得る。
図1Bは、複数の標識113a、113b、および113cが複数の内部アミノ酸112a、112b、112cへカップリングされている、図1Aのシステムの構成を提供する。ある構成において、複数の標識は、異なるアミノ酸へカップリングされた多様なタイプの標識を含む。ある構成において、複数の標識は、単一のタイプのものである。複数の標識は、複数のレポーター部分、保護基、またはその組み合わせへカップリングされてもよい。
3．方法
別の局面において、ペプチドを分析するための試料調製を改善するための方法を本明細書に提供する。方法は、ペプチドシーケンシング(例えば、フルオロシーケンシング)のための試料調製を改善し得る。試料調製は、N末端アミノ酸、C末端アミノ酸、および内部アミノ酸のものを含む、少なくとも1つのアミノ酸側鎖を選択的に標識することによって改善され得る。試料調製は、第1反応基と第2反応基の間の定量的反応を通じて少なくとも1つのアミノ酸側鎖を効率的に標識することによって改善され得る。複数のアミノ酸またはアミノ酸タイプを標識するための方法を本明細書に提供し得る。方法は、アミノ酸、レポーター部分(例えば、蛍光分子(例えば、色素))の交差反応性、または、例えば、感受性レポーター部分(例えば、蛍光分子(例えば、色素))の分解を最小化し得る。
別の局面において、ペプチドのアミノ酸を標識するための方法であって、アジドへカップリングされた内部アミノ酸およびアルキンへカップリングされたC末端を含むペプチドを提供する工程；ならびに、第1レポーターが該内部アミノ酸と反応するような条件下で、該ペプチドと該第1レポーターとを接触させる工程を含む、方法を提供する。第1レポーターはアルキンを含み得る。アルキンは歪みアルキンであり得る。第1レポーターが内部アミノ酸と反応することを可能にする条件は、銅を含まない条件であり得る。例えば、(b)は、第1レポーターが歪みアルキンを含む場合、銅(Cu)の非存在下で行われ得る。方法は、第1レポーターとは異なる第2レポーターをペプチドのC末端と反応させる工程をさらに含み得る。第2レポーターはアルキンを含み得る。第2レポーターは非歪みアルキンを含み得る。第2レポーターとペプチドのC末端との反応は、銅の存在下で行われ得る(例えば、アルキンが非歪みアルキンである場合)。場合によっては、第1レポーターは第2レポーターと反応しない。場合によっては、内部アミノ酸は、ペプチドのC末端へカップリングされたアルキンと反応しないアジドへカップリングされている。
別の局面において、ペプチドを処理または分析するための方法であって：(a)標識へカップリングされたアミノ酸を含むペプチドを提供する工程であって、標識が、(i)シグナルを発するように構成されたレポーター部分へカップリングされている第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基、または(ii)標識と第2反応基の間のカップリングを防止するように構成された保護基を含む、工程；(b)ペプチドと、第2反応基を含む混合物とを接触させる工程；(c)ペプチドが少なくとも1つの支持体へ固定されている状態で、ペプチドからのシグナルを検出する工程；および、(d)該シグナルまたはシグナル変化を使用して、該ペプチドの該アミノ酸またはさらなるアミノ酸を同定する工程を含む、方法を本明細書に提供する。シグナルまたはシグナル変化は、前記ペプチドの配列の少なくとも一部を同定するために使用することができる。シグナルまたはシグナル変化は、ペプチドの全配列を同定するために使用することができる。ペプチドのアミノ酸またはさらなるアミノ酸を同定するためのシグナルまたはシグナル変化の使用は、(a)～(c)の後に行われ得る。標識は、(b)において第2反応基と反応する第1反応基を含み得る。
標識は第1反応基を含み得る。レポーター部分は第2反応基を含み得る。第2反応基は第1反応基と反応し得る。(a)において、標識は第1反応基を含み得る。(b)において、第2反応基は第1反応基と反応し得る。(a)において、標識は第1反応基を含み得、かつ、(b)において、第2反応基は第1反応基と反応し得る。
ペプチドを複数のペプチドとして提供してもよい。ペプチドは複数のペプチドのうちの少なくとも1つのペプチドを含み得る。複数のペプチドは、第1ペプチドおよび第2ペプチドを含み得る。ペプチドは、複数のペプチドのうちの第1ペプチドまたは第2ペプチドであり得る。第1ペプチドは、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸を含み得る。第2ペプチドは、第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含み得る。第1ペプチドは、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸、および第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含み得る。第2ペプチドは、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸、および第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含み得る。第1ペプチドは、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸を含み得、かつ、第2ペプチドは、第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含む。第1標識は、第2反応基と反応するように構成され得る。第2標識は、第2反応基と反応するように構成され得る。第1標識は第2反応基と反応するように構成されていてもよく、第2標識は該第2反応基とは異なる第2反応基と反応するように構成されていてもよい。第1標識および第2標識のそれぞれへカップリングするように構成された第2反応基の差異は、第1アミノ酸への第1標識および第2アミノ酸への第2標識の選択的カップリングを可能にし得る。各第2反応基は、シグナルを発するように独立して構成されたレポーター部分へカップリングされ得る。例えば、異なる第2反応基は、前記レポーター部分とは異なるシグナルを発するように構成された第2レポーター部分へカップリングされ得る。
ペプチドは、(a)または(b)において少なくとも1つの支持体へ固定されてもよい。(a)において、ペプチドは少なくとも1つの支持体へ固定されてもよい。(b)において、ペプチドは少なくとも1つの支持体へ固定されてもよい。(a)および(b)において、ペプチドは少なくとも1つの支持体へ固定されてもよい。方法は、(c)の前にペプチドを固定する工程をさらに含み得る。方法は、(b)の後にペプチドを固定する工程をさらに含み得る。ペプチドは、ペプチドからのシグナルの検出の前に少なくとも1つの支持体へ固定され得る。ペプチドは、それと第2反応基を含む混合物とを接触させた後に少なくとも1つの支持体へ固定され得る。ペプチドは、第1の支持体へ固定され得る。ペプチドは、第2の支持体へ固定され得る。ペプチドは、第1の支持体へ固定され、次いで第2の支持体へ固定されてもよい。ペプチドは、第1の支持体へ固定され、第1の支持体から取り外され、次いで第2の支持体へ固定されてもよい。ペプチドは、(d)の前に1つまたは複数の異なる支持体へ固定されてもよい。
複数のペプチドは複数の支持体へ固定されてもよい。複数のペプチドは、同じ支持体へ固定された少なくとも1、10、100、1000、10,000、100,000、1,000,000またはそれ以上のペプチドを含み得る。少なくとも1つの支持体は、ビーズ、ポリマーマトリクス、アレイ、またはその任意の組み合わせであり得る。少なくとも1つの支持体は、ビーズ、ポリマーマトリクス、またはアレイであり得る。少なくとも1つの支持体はビーズおよびアレイであり得る。少なくとも1つの支持体はビーズであり得る。少なくとも1つの支持体はアレイであり得る。アレイは表面であり得る。アレイはスライドであり得る。スライドは顕微鏡用スライドであり得る。少なくとも1つの支持体は顕微鏡用スライドであり得る。少なくとも1つの支持体はポリマーマトリクスであり得る。
支持体は固体支持体または半固体支持体であり得る。固体支持体または半固体支持体はビーズであり得る。ビーズはゲルビーズであり得る。ビーズはポリマービーズであり得る。支持体は樹脂であり得る。非限定的な支持体は、例えば、アガロース、セファロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール(PEG)、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。支持体はポリスチレンビーズであってもよい。支持体は、官能基、例えば、アミン、スルフヒドリル、酸、アルコール、臭化物、マレアミド、スクシンイミジルエステル(NHS)、スルホスクシンイミジルエステル、ジスルフィド、アジド、アルキン、イソチオシアネート(ITC)、またはそれらの組み合わせを含み得る。支持体はPEGA樹脂であってもよい。支持体はアミノPEGA樹脂であってもよい。支持体はアミン基を含んでもよい。支持体は、保護された官能基、例えば、Boc、Fmoc、アルキルエステル、Cbz、またはそれらの組み合わせを含み得る。ビーズは金属コアを含んでもよい。ビーズはポリマー磁気ビーズであってもよい。ポリマー磁気ビーズは金属酸化物を含んでもよい。支持体は少なくとも1つの酸化鉄コアを含んでもよい。
ペプチドは複数のアミノ酸を含んでもよい。複数のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギンおよびトリプトファンからなる群より選択され得る。複数のアミノ酸は1つまたは複数のアミノ酸を含み得、1つまたは複数のアミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギンおよびトリプトファンからなる群より選択される。ペプチドは、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギンおよびトリプトファンからなる群より選択される1つのアミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、非天然アミノ酸を含んでもよい。複数のアミノ酸は、Dアミノ酸を含んでもよい。
複数のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸は、標識へカップリングされてもよい。複数のアミノ酸は少なくとも2つまたはそれ以上のアミノ酸タイプを含んでもよい。少なくとも2つのアミノ酸またはそれ以上のタイプは、第1アミノ酸タイプおよび第2アミノ酸タイプを含んでもよい。第1アミノ酸タイプは第1標識へカップリングされてもよい。第2アミノ酸タイプは第2標識へカップリングされてもよい。第1アミノ酸タイプは第1標識へカップリングされてもよく、かつ、第2アミノ酸タイプは第2標識へカップリングされてもよい。第1標識および第2標識は、異なるレポーター部分へ各々カップリングされてもよい。複数のアミノ酸は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、またはそれ以上のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、2～20個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、4～18個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、6～16個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、8～14個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸は、9～11個のアミノ酸タイプを含んでもよい。複数のアミノ酸のアミノ酸タイプの全てよりも少ないアミノ酸タイプが標識されていてもよい。少なくとも2つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされてもよい。ペプチドは少なくとも4つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも4つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。複数のアミノ酸の全てよりも少ないアミノ酸が標識されていてもよい。複数のアミノ酸の各々が標識されていてもよい。
アミノ酸は、グリシン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、アスパラギン、システイン、グルタミン、メチオニン、セリン、トレオニン、アルギニン、ヒスチジン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン酸、およびプロリンからなる群より選択され得る。アミノ酸は、本明細書中で提供される任意のアミノ酸の誘導体(例えば、ピロリジン、セレノシステイン、またはN-ホルミルメチオニン)であり得る。アミノ酸は、極性、非荷電、荷電(例えば、負または正荷電)、脂肪族、芳香族、中性(例えば、両性イオン)、疎水性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。アミノ酸は天然または非天然アミノ酸であり得る。アミノ酸はDまたはLアミノ酸であり得る。アミノ酸はαまたはβアミノ酸であり得る。
複数のアミノ酸は少なくとも2つのアミノ酸タイプを含んでもよく、少なくとも2つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされてもよい。ペプチドは少なくとも3つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも3つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。ペプチドは少なくとも4つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも4つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。ペプチドは少なくとも5または6つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも5または6つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。ペプチドは少なくとも8つのアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも8つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。ペプチドは少なくとも10のアミノ酸タイプを含んでもよく、ここで、該少なくとも10のアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプは、異なる標識へカップリングされている。異なるアミノ酸タイプへカップリングされた各標識は、各アミノ酸タイプに対応するシグナルを発するように構成されたレポーター部分へ独立してカップリングされ得る。場合によっては、複数のアミノ酸の大部分が標識されている。場合によっては、複数のアミノ酸の大部分が標識されていない。
標識へカップリングされ得るアミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択されるアミノ酸であり得る。標識へカップリングされるアミノ酸は翻訳後修飾を含み得る。翻訳後修飾は、グリコシル化、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、グルタミル化、グリコシル化、イソプレニル化、リン酸化、リポレーション、ホスホパンテテイニル化、硫酸化、セレネーション、アミド化、ユビキチン化、ヒドロキシル化、ニトロ化、ニトロシル化、シトルリン化、環化(例えば、N末端グルタミン酸またはグルタミン環化)、およびSUMO化であり得る。場合によっては、標識は、特定の翻訳後修飾を有する特定のアミノ酸について特異性を有し得る。
ペプチドは、複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸を含み得る。複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸は、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸、および第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、複数の第1標識へカップリングされた複数の第1アミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、複数の第2標識へカップリングされた複数の第2アミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、(i)複数の第1標識へカップリングされた複数の第1アミノ酸および(ii)複数の第2標識へカップリングされた複数の第2アミノ酸を含み得る。複数のアミノ酸は、(i)複数の第1標識へカップリングされた複数の第1アミノ酸および(ii)複数の第2標識へカップリングされた複数の第2アミノ酸を含み得る。第1標識、またはその複数は、第1アミノ酸、またはその複数へのみカップリングし得る。第2標識、またはその複数は、第2アミノ酸、またはその複数へのみカップリングし得る。第1標識、またはその複数は、第1アミノ酸、またはその複数へのみカップリングし得、かつ、第2標識、またはその複数は、第2アミノ酸、またはその複数へのみカップリングする。複数の標識のうちの少なくとも1つの標識は、複数のアミノ酸のうちの特定のアミノ酸タイプへカップリングされ得る。例えば、複数の標識のうちの1つの標識は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギン、またはトリプトファンへカップリングされ得る。
標識は、第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基を含み得る。第1反応基は、アジド、アルキン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、チオール、ジチオール、シクロオクテン、およびノルボルネンからなる群より選択され得る。第2反応基は、アジド、アルキン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、チオール、ジチオール、シクロオクテン、およびノルボルネンからなる群より選択され得る。第1反応基は、アジド、アルケン、アルデヒド、ケトン、およびテトラジンからなる群より選択され得る。第1反応基は歪みアルキンであり得る。第2反応基は、アジド、チオール、ジチオール、シクロオクテン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、ノルボルネン、およびアルキンからなる群より選択され得る。第2反応基は歪みアルキンであり得る。
複数の標識のうちの少なくとも1つの標識は、特異的レポーター部分へカップリングされた特異的第2反応基と反応するように構成されていてもよい。第1反応基は、アルキン、チオール、ジチオール、およびシクロオクテンからなる群より選択され得、第2反応基は、アルキン、アジド、チオール、ジチオール、シクロオクテン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、およびノルボルネンからなる群より選択され得る。第1反応基は、特定の第2反応基に反応するように構成され得る。例えば、第1反応基はアジドであり得かつ第2反応基はアルキンであり得、第1反応基はアルキンであり得かつ第2反応基はアジドであり得、第1反応基はアルケンであり得かつ第2反応基はチオールであり得、第1反応基はカルボニル(例えば、ケトンまたはアルデヒド)を含み得かつ第2反応基はジチオールであり得、第1反応基はテトラジンであり得かつ第2反応基はシクロオクテン(例えば、trans-シクロオクテン)であり得る。
アミノ酸、またはその複数へカップリングする、少なくとも1つの標識は、レポーター部分へカップリングされ得る。レポーター部分はシグナルを発するように構成され得る。レポーター部分は、励起されるとシグナルを発するように構成されてもよい。シグナルは検出可能なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、蛍光シグナルまたは燐光シグナルなどの、光シグナルであり得る。光シグナルは色素によって生成され得る。レポーター部分はまた、非光学的に検出可能なシグナルを生成し得る。例えば、レポーター部分は、電気信号、放射性信号、または化学信号を生成し得る。レポーター部分はスペーサーへカップリングされ得る。スペーサーは、レポーター部分および第2反応基に隣接していてもよい。レポーターは、標識と反応するように構成され得る。レポーターは、レポーター部分および反応基(例えば、第2反応基)を含み得る。レポーターは、レポーター部分、反応基(例えば、第2反応基)、およびスペーサーを含み得る。
方法は、少なくとも1つの支持体へ固定されたペプチドから少なくとも1つのアミノ酸を除去するために十分な条件へ該ペプチドを供する工程を含み得る。少なくとも1つのアミノ酸は前記ペプチドのN末端から除去され得る。少なくとも1つの支持体へ固定されたペプチドから少なくとも1つのアミノ酸を除去するために十分な条件は、エドマン分解条件であり得る。少なくとも1つのアミノ酸を除去するために十分な条件は、エドマン分解剤または有機リン含有剤を含み得る。(e)の後に、標識へカップリングされたアミノ酸は、末端アミノ酸となり得る。
方法は、(f)前記少なくとも1つの支持体へ固定された前記ペプチドからの少なくとも1つのさらなるシグナルまたはシグナル変化を検出するためにステップ(d)および(e)を繰り返す工程、ならびに(ii)該シグナルまたはシグナル変化および該さらなるシグナルまたはシグナル変化を使用して、該少なくとも1つの支持体へ固定された該ペプチドの配列の少なくとも一部を同定する工程をさらに含み得る。
ペプチドのアミノ酸またはさらなるアミノ酸は、(a)～(c)の後に同定され得る。少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化を光学検出器で検出してもよい。光学検出器はイメージングシステムを含み得る。光学検出器は単一分子感度を含み得る。少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化は光シグナルを含み得る。少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化は光シグナルであり得る。少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化は、複数のシグナルを含み得る。少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化は、異なる周波数または周波数範囲の複数のシグナルを含み得る。少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化は、異なる強度の複数のシグナルを含み得る。複数のシグナル中からの2つのシグナルは、少なくとも1つの局面において異なり得る。複数のシグナル中からの2つのシグナルは、異なる周波数または周波数範囲を有し得る。複数のシグナル中からの2つのシグナルは、異なる寿命を有し得る。複数のシグナル中からの2つのシグナルは、異なる強度を有し得る。
少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化は、レポーター部分によって発生され得る。レポーター部分は色素を含み得る。色素は、少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化を発生させ得る。色素は、蛍光色素、燐光色素、化学発光色素、顔料、および光切替性レポーター（photoswitchable reporter）からなる群より選択され得る。
保護基は、標識と第2反応基の間のカップリングを防止するように構成され得る。保護基を含む標識は、ダミー標識として作用し得る。ダミー標識は、反応基の反応性がアミノ酸と反応するのを阻止し得る。保護基は1つまたは複数の基を含み得る。1つまたは複数の基は、アジド、アルキル、アルキレン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール-アルキル、およびアリール-アルキルからなる群より独立して選択され得る。1つまたは複数の基は、アジド(例えば、N3または-CH2N3)を含み得る。1つまたは複数の基は、アルキル(例えば、メチル)またはアルキレンを含み得る。1つまたは複数の基は、アリール(例えば、フェニル)、ヘテロアリール、ヘテロアリール-アルキル、またはアリール-アルキル(例えば、ベンジル)を含み得る。
方法は、多くとも0.001ナノモル(nM)、0.01 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、またはそれ以上のペプチド濃度で実施され得る。方法は、少なくとも100 nM、10 nM、1 nM、0.1 nM、0.01 nM、0.001 nM、またはそれ以下のペプチド濃度で実施され得る。方法は、0.001 nM～100 nM、0.01 nM～100 nM、または0.1 nM～50 nMのペプチド濃度で実施され得る。
別の局面において、ペプチドを支持体(本明細書に記載される通り)へカップリングするための方法を本明細書に記載する。方法は、ペプチドへカップリングされた剤を支持体に反応させることを含んでもよい。支持体は、ペプチドへカップリングされた剤と反応するように構成されている基(例えば、アルキン、アジド、または本明細書に記載される任意の反応基)を含み得る。方法は、第1ペプチドが(例えば、第1基を介して)第1支持体へカップリングされ、第2ペプチドが(例えば、第2基を介して)第2支持体へカップリングされることを可能にし得る。
方法は、ペプチドをビーズへカップリングすること、ペプチドを標識すること、およびペプチドを表面へカップリングすることを含み得る。場合によっては、ペプチドは、表面へのそのカップリングの前にビーズから放出される。場合によっては、ペプチドはビーズおよび表面の両方へカップリングされる。場合によっては、ペプチドは切断可能リンカーによってビーズへカップリングされる。そのような場合、ペプチドは、表面へカップリングされる前に切断可能リンカーの切断によってビーズから放出され得る。逆に、ペプチドは、表面へカップリングされた後にビーズから放出され得る。
図2は本開示と一致する方法を概説する。方法は、複数のペプチド204を複数のビーズ205上に捕捉する工程200を含み得る。ビーズは、複数のペプチド204へカップリングするように構成された捕捉試薬206を含み得る。捕捉試薬は、N末端捕捉試薬、C末端捕捉試薬、アミノ酸タイプ特異的捕捉試薬であってもよく、またはある程度の結合非特異性を含んでもよい。方法は、複数のペプチドを標識する工程201を含み得る。そのようなステップは、アミノ酸タイプ特異的標識207を複数のペプチドへカップリングする工程を含み得る。そのようなステップは、複数の標識を複数のペプチドへカップリングする工程を含み得る。標識工程の後に、複数のペプチドは複数のビーズから放出され得る202。ペプチドは表面208へカップリングされ203、分析へ供され得る。
図7は、本開示と一致するペプチドを標識および固定するための方法を図示する。方法は、複数のペプチドを収集、任意で測定、および任意で可溶化すること(例えば、尿素などのカオトロピック剤の添加による)を含み得る710。複数のペプチド断片を生成するために、複数のペプチドを消化してもよい720。複数のペプチド断片は、次いで、ビーズ(例えば、複数のビーズ)上に固定し730、任意で洗浄または精製し(例えば、ビーズ結合されていないペプチドをビーズから分離するため)、標識(例えば、「クリック」試薬)へカップリングしてもよい740。精製は、溶液からのビーズの磁気分離を含み得る。場合によっては、複数のペプチド断片は、複数の異なる標識(例えば、異なるタイプのアミノ酸へカップリングするように構成された標識)へカップリングされる。そのような場合、標識付け（labeling）ステップからの過剰な(例えば、未反応の)標識試薬または副生成物を除去するための洗浄ステップ741によって散りばめられた、異なる時点で、2つの標識を複数のペプチド断片へ接触させてもよい。場合によっては、ただ1つの標識だけを、各カップリングステップ中に複数のペプチド断片へ接触させる。場合によっては、多数の標識を単一のカップリングステップ中に複数のペプチド断片へ接触させる。標識をレポーター部分、保護基、またはその任意の組み合わせへカップリングさせてもよい750。場合によっては、多数の標識を単一のステップでレポーター部分へカップリングさせる750。場合によっては、多数の標識を複数のステップにわたってレポーター部分へカップリングさせる750(例えば、各ステップにおいて1つのレポーター部分および標識をカップリングさせる)。過剰な標識試薬を除去するためにビーズを洗浄し760、次いで、ガラススライドまたはランタンなどの基体へカップリングさせてもよく770、ここで、複数のペプチド断片を、フルオロシーケンシングなどの分析へ供してもよい。ペプチドは、基体へのカップリング770の前または後に、ビーズから任意で放出され得る。
別の局面において、以下の工程を含む、ペプチドを処理または分析するための方法を本明細書に記載する：支持体へカップリングされた第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基へカップリングされたアミノ酸を含む該ペプチドを提供する工程；第1反応基を第2反応基へカップリングさせるために該ペプチドを第2反応基と接触させ、それによって該ペプチドを該支持体へ固定する工程；該ペプチドが該支持体へ固定されている状態で、該ペプチドのアミノ酸へカップリングされた標識からのシグナルを検出する工程；ならびに、該シグナルまたはその変化を使用して該アミノ酸を同定する工程。
方法は、支持体へ固定されたペプチドのアミノ酸へカップリングされた標識からのシグナルを検出する工程をさらに含むことができる。シグナルまたはその変化は、アミノ酸を同定するために使用することができる。検出され得る標識へカップリングされ得るアミノ酸と、第1反応基へカップリングされたアミノ酸とは、同じアミノ酸であり得る。検出される標識へカップリングされるアミノ酸と、第1反応基へカップリングされたアミノ酸とは、異なり得る。
第1反応基は、官能基を介してアミノ酸へカップリングされていてもよい。官能基は、アミノ酸の反応性側鎖へカップリングされていてもよい。(a)は、第1反応基へカップリングされた官能基へアミノ酸をカップリングすることをさらに含み得る。(a)において、官能基はアミノ酸へのみカップリングし得る。(a)におけるアミノ酸は、(c)における前記標識へカップリングされた前記アミノ酸と同じであり得る。(a)におけるアミノ酸は、(c)における前記標識へカップリングされた前記アミノ酸と異なり得る。(c)は、(b)の前に前記ペプチドの前記アミノ酸へ前記標識をカップリングすることをさらに含み得る。(c)は、(b)の後に前記ペプチドの前記アミノ酸へ前記標識をカップリングすることをさらに含み得る。
第1反応基へカップリングされたアミノ酸は、末端アミノ酸であり得る。第1反応基へカップリングされたアミノ酸は、内部アミノ酸であり得る。アミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択され得る。アミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、トレオニン、セリン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択され得る。
第1反応基は、アジド、アルキン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、チオール、ジチオール、エステル、シクロオクテン、およびノルボルネンまたは活性化エステル(例えば、EDC-カルボジイミド)からなる群より選択され得る。第1反応基はアジドまたはアルキンであり得る。第1反応基はアジドであり得る。第1反応基はアルキンであり得る。エステルは活性化エステルであり得る。活性化エステルはEDC-カルボジイミドであり得る。
第2反応基は、アルキン、アジド、チオール、ジチオール、シクロオクテン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、およびノルボルネンからなる群より選択され得る。第2反応基はアジドまたはアルキンであり得る。第2反応基はアジドであり得る。第2反応基はアルキンであり得る。エステルは活性化エステルであり得る。活性化エステルはEDC-カルボジイミドであり得る。第1反応基および前記第2反応基は、クリック反応を介してカップリングされ得る。第2反応基は、スペーサー(本明細書に記載される通り)またはリンカーを介して前記支持体へカップリングされ得る。リンカーは、結合であるか、または置換されていてもよいアルキレンもしくは置換されていてもよいヘテロアルキレンであり得る。
少なくとも1つの支持体は、ビーズ、ポリマーマトリクス、アレイ、またはその任意の組み合わせであり得る。少なくとも1つの支持体は、ビーズ、ポリマーマトリクス、またはアレイであり得る。少なくとも1つの支持体はビーズおよびアレイであり得る。少なくとも1つの支持体はビーズであり得る。少なくとも1つの支持体はアレイであり得る。アレイは表面であり得る。アレイはスライドであり得る。スライドは顕微鏡用スライドであり得る。少なくとも1つの支持体は顕微鏡用スライドであり得る。少なくとも1つの支持体はポリマーマトリクスであり得る。
標識はレポーター部分へカップリングされ得る。レポーター部分はシグナルを発するように構成され得る。レポーター部分は、励起されるとシグナルを発するように構成されてもよい。レポーター部分は、特定の波長の光を吸収するように構成されてもよい。シグナルは検出可能なシグナルであり得る。例えば、シグナルは、蛍光シグナルまたは燐光シグナルなどの、光シグナルであり得る。光シグナルは色素によって生成され得る。レポーター部分はまた、非光学的に検出可能なシグナルを生成し得る。例えば、レポーター部分は、電気信号、放射性信号、または化学信号を生成し得る。シグナルは核酸からであり得る。核酸はバーコードであり得る。バーコードはDNAバーコードまたはRNAバーコードであり得る。レポーター部分はスペーサーへカップリングされ得る。
レポーター部分は第3反応基または抗体へカップリングされ得る。レポーターは、レポーター部分および反応基(例えば、第3反応基または抗体)を含み得る。レポーターは、レポーター部分、反応基(例えば、第3反応基または抗体)、およびスペーサーを含み得る。第3反応基または抗体は、標識へカップリングされるアミノ酸へカップリングするように構成され得る。アミノ酸は、末端アミノ酸または内部アミノ酸であり得る。レポーター部分は、リンカーによって第3反応基または抗体へカップリングされ得る。シグナルは、アミノ酸へカップリングされた標識から検出することができ、ここで、標識は抗体へカップリングされる。
方法は、前記ペプチドの末端からアミノ酸を除去するために十分な条件へ該ペプチドを供する工程をさらに含み得る。アミノ酸の除去は、(c)の後に行われ得る。少なくとも1つのアミノ酸は前記ペプチドのN末端から除去され得る。少なくとも1つの支持体へ固定されたペプチドから少なくとも1つのアミノ酸を除去するために十分な条件は、エドマン分解条件であり得る。少なくとも1つのアミノ酸を除去するために十分な条件は、エドマン分解剤または有機リン含有剤を含み得る。(b)の後に、標識へカップリングされたアミノ酸は、末端アミノ酸となり得る。
方法は、前記ペプチドの複数のアミノ酸のシグナルパターンを同定するために(c)および(d)を1回または複数回繰り返す工程であって、該複数のアミノ酸の該シグナルパターンが(d)における前記シグナルまたはその変化を含む工程をさらに含み得る。方法は、前記複数のアミノ酸の前記シグナルパターンを使用して、前記ペプチドの配列、または前記ペプチドの配列の一部を得る工程をさらに含み得る。
あるいは、方法は、図5に示されるように実施されてもよい。方法は、少なくとも1つの第2ペプチド502へ消化される501、第1ペプチド500を含み得る。少なくとも1つの第2ペプチドのC末端は、標識509で官能化することができる503。少なくとも1つの第2ペプチドは、例えば、支持体512へカップリングされている捕捉剤511へ標識509をカップリングすることによって、支持体512(例えば、表面、スライド、またはビーズ)へ固定され得る504。少なくとも1つの第2ペプチドのN末端アミノ酸は、次いで、N末端結合剤へカップリングされ得505、これは、シーケンシングによる検出用のバーコード化核酸506または光学検出用のフルオロフォア507などの、レポーター部分へカップリングされ得る。N末端結合剤は、リジンなどのN末端アミノ酸タイプについて、または芳香族基を含む側鎖を有するアミノ酸などのアミノ酸の群について、特異性を含み得る。バーコードまたはフルオロフォアは、N末端結合剤がカップリングされている少なくとも1つの第2ペプチドのN末端アミノ酸タイプを同定し得る。任意で、少なくとも1つの第2ペプチドのN末端アミノ酸を除去して、新しいN末端アミノ酸を露出させてもよく、これをさらなるN末端結合剤によって接触させてもよい。そのようなN末端アミノ酸同定および除去は、少なくとも1つの第2ペプチドの配列を同定するために多数のサイクルにわたって繰り返され得る。場合によっては、N末端アミノ酸は、N末端アミノ酸結合剤へのそのカップリングの前に官能化される。例えば、N末端アミノ酸を、第2反応基を含む標識へカップリングし、続いてN末端結合剤認識基を標識の第2反応基へカップリングし、続いてN末端結合剤を、N末端結合剤認識基を含むN末端アミノ酸へカップリングしてもよい。そのようなN末端結合剤認識基は、N末端結合剤に対する親和性を含み得る。
4．キット
別の局面において、ペプチドを分析するためのキットを本明細書に提供する。いくつかの局面において、ペプチドの配列をアッセイするためのものである。キットは、核酸をシーケンシングすることができるデバイスにおいて使用され得る。キットは、核酸をシーケンシングすることができるデバイスにおいて使用されるように構成されたカートリッジ中に包装され得る。
別の局面において、試料中のペプチドの配列をアッセイするためのキットであって、第1反応基および(i)第2反応基または(ii)保護基を含む標識であって、ここで、該第1反応基が、アミノ酸タイプのアミノ酸へカップリングするように構成されており、ここで、該第2反応基が、シグナルを発するように構成されたレポーター部分を含む、レポーター部分へカップリングするように構成されており、かつ、該保護基が、該標識と該レポーター部分の間のカップリングを防止するように構成されている、標識；ならびに、該ペプチドを処理して、該標識へカップリングされた該アミノ酸を含む該ペプチドを提供するための、該標識の使用説明書を含む、キットを本明細書に提供する。第1反応基は、アミノ酸タイプのアミノ酸へカップリングするように構成されていてもよい。第2反応基は、レポーターへカップリングするように構成されていてもよい。レポーターは、第2反応基へ構成された第3反応基へカップリングされ得る。レポーターはスペーサーを含み得る。レポーターは、励起されるとシグナルを発するように構成されてもよい。レポーターは蛍光色素を含み得る。保護基は、標識とレポーターの間のカップリングを防止するように構成され得る。保護基は光学的に検出可能なシグナルを発してはならない。
キットはタンパク質捕捉剤を含み得る。タンパク質捕捉剤は、ペプチドのN末端へカップリングするように構成されていてもよい。タンパク質捕捉剤は、切断可能リンカーへカップリングされた固体支持体を含み得る。タンパク質捕捉剤は、切断可能リンカーによって固体支持体へカップリングされ得る。固体支持体は、ビーズ、アレイ、スライド、ポリマーマトリクス、またはその任意の組み合わせを含み得る。切断可能リンカーは酵素によって切断可能であり得る。切断可能リンカーは化学的切断可能リンカーであり得る。切断可能リンカーは光切断可能リンカーであり得る。切断可能リンカーは、pHの変化によって切断可能であり得る。切断可能リンカーはアルデヒドを含み得る。アルデヒドは、ピリジンカルバルデヒド(PCA)またはPCAの誘導体であり得る。
捕捉試薬は、少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質と反応し得る。捕捉試薬は、少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質のN末端と反応し得る。捕捉試薬は、少なくとも1つのペプチドまたはタンパク質のC末端と反応し得る。捕捉試薬は、1つのペプチドまたはタンパク質と反応し得る。捕捉試薬は、1つのペプチドまたはタンパク質のN末端と反応し得る。捕捉試薬は、1つのペプチドまたはタンパク質のC末端と反応し得る。細胞の各ペプチドまたはタンパク質は、複数の捕捉試薬によって捕捉されてもよい。支持体は、ペプチドまたはタンパク質ではない分子を捕捉することができる捕捉試薬をさらに含んでもよい。支持体は、核酸分子を捕捉することができる捕捉試薬をさらに含んでもよい。支持体は、リボ核酸分子を捕捉することができる捕捉試薬をさらに含んでもよい。
レポーター(またはレポーター部分)はシグナルを発するように構成されてもよい。レポーター(またはレポーター部分)は色素を含み得る。色素は、蛍光色素、燐光色素、化学発光色素、顔料、および光切替性レポーターからなる群より選択され得る。レポーター(またはレポーター部分)は蛍光色素を含み得る。レポーターは、励起されるとシグナルを発するように構成されてもよい。レポーターは蛍光タンパク質分子であり得る。
キットは表面接着剤を含み得る。表面接着剤はアルキンまたはアジドを含み得る。表面接着剤は、ペプチドのC末端へカップリングするように構成されていてもよい。キットは、表面接着剤が接着する支持体を含み得る。場合によっては、支持体はスライドである。スライドはガラススライドであり得る。スライドは顕微鏡用スライドであり得る。
キットは、反応の実施、ペプチドもしくは本明細書に記載される試薬のいずれかの取り扱い、または分析の実施に有用な、さらなる剤を含み得る。キットは、プロテアーゼ、消化試薬、固体支持体ビーズ、またはそれらの任意の組み合わせからなる群からの1つまたは複数の種を含み得る。キットはまた、反応を行うために有用な小分子、バッファー、および溶媒を含み得る。キットは、容器セット中にプレパッケージされている場合がある。プレパッケージングは、任意のシーケンシングプラットフォームにおいて使用されるように構成されたカセットであってもよい。
図3は本開示と一致するキットを図示する。キットは、複数のボリューム302を含む基体301(例えば、複数のウェルを含むウェルプレート)を含み得る。基体の各ボリュームは試薬について指定され得る。例えば、基体はボリュームのアレイを含み得、ここで、各行は異なるレポーター部分に対応し得、各列は異なる標的アミノ酸タイプに対応し得る。キットは、レポーター部分を有する既成の標識を含む、ペプチドを取り扱う、標識するおよび検出するための一連の試薬300を含み得る。したがって、アミノ酸標識タイプおよびレポーター部分タイプのあらゆる組み合わせが、キットの別個の容器またはボリューム中に含まれる必要がある。例えば、キットが6タイプのレポーター部分とコンビナトリアルに組み合わされた6タイプのアミノ酸標識を含有する場合、キットは、少なくとも36個の別個の容器またはボリューム(各標識-レポーター部分組み合わせについて少なくとも1つ)を含む必要がある。
本開示のキットは、図4に示されるように構成され得る。試薬400はセットとして提供され得、「クリック」試薬410(例えば、標的へカップリングするための第1反応基と「クラック」試薬へカップリングするための第2反応基とを含む標識)、「クラック」試薬411(例えば、「クリック」試薬の第2反応基へカップリングするように構成されたレポーター部分または保護基)、溶媒およびバッファー412、ダミー標識413(例えば、標的へカップリングするための第1反応基を含むが「クラック」試薬へカップリングするための第2反応基を欠いている標識)、ビーズ414(例えば、N末端またはC末端ペプチド捕捉用の捕捉剤を含むビーズ)、ならびに洗浄ステップ用の試薬415を含み得る。キットは、キットの使用方法を概説するマニュアル416を含み得る。キットは、ウェル402を含むウェルプレート401を含み得、ここで、「クリック」および「ダミー」標識はペプチドへカップリングされ得、「クリック」標識は「クラック」試薬へカップリングされ得る。いくつかの構成において、ウェルプレートのウェルは、プレートの各行および列が「クリック」および「クラック」対を指定するように、検出可能な標識を構築する(例えば、「クリック」標識を「クラック」試薬へカップリングする)ために使用され得る。ウェルプレートは、標識タイプ404に対応する行および標的アミノ酸タイプ405に対応する列を含み得る。クラック試薬は、異なった色の色素などの、幅広いレポーター部分403を含み得る。このキット設計は、試薬の比較的小さなセットから標識-レポーター部分組み合わせの大きなライブラリーの作製を可能にし得る。例えば、図4と一致するキットは、6タイプのレポーター部分および6タイプのアミノ酸特異的標識を含み得、それによって、36個の別個の標識-レポーター部分コンジュゲートの作製を可能にする。
図9は、本開示と一致するキット設計を図示する。キットは、複数のボリュームを含む基体900を含み得る。ボリュームは、特定のアミノ酸タイプへカップリングするように構成された標識、ならびに標識へのカップリング用の幅広い「クラック」試薬を含み得る。基体の異なる行は異なるアミノ酸タイプに対応し得る(示されるキットにおいて、行A～Hは、それぞれ、システイン、リジン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、ホスホセリン、ホスホトレオニン、およびC末端アミノ酸に対応する)。このキットにおいて、システイン「クリック」標識は、アジド第2反応基を有するヨードアセトアミド標識、ヨードアセトアミド標識 ノルボルネノン第2反応基（iodoacetamide label norbornenone second reactive group）、アルデヒド第2反応基を有するヨードアセトアミド標識、および第2反応基を欠くヨードアセトアミド「ダミー」標識を含む。リジン「クリック」標識は、アジド第2反応基を有するNHSエステル標識、ノルボルネノン第2反応基を有するNHSエステル標識、アルデヒド第2反応基を有するNHSエステル標識、および第2反応基を欠くNHSエステル「ダミー」標識を含む。チロシン「クリック」標識は、アジド第2反応基を有するアリールジアゾニウム標識、ノルボルネノン第2反応基を有するアリールジアゾニウム標識、アルデヒド第2反応基を有するアリールジアゾニウム標識、およびアリールジアゾニウム「ダミー」標識を含む。アスパラギン酸およびグルタミン酸「クリック」標識は、アジド第2反応基を有するアミン標識、ノルボルネノン第2反応基を有するアミン標識、アルデヒド第2反応基を有するアミン標識、およびアミン「ダミー」標識を含む。ホスホセリンおよびホスホトレオニン標識は、試薬、例えば、水酸化バリウム、TCEPおよび標識、例えば、反応性チオールを含む試薬(例えば、シスタミン)を含む。キットは、「クリック」標識をペプチドへカップリングするための試薬、例えば、ヒューニッヒ塩基、2-(6-クロロ-1-H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)、TCEPおよびBa(OH)2を含む。キットはまた、幅広いフルオロフォア-PEG4、Atto425-PEG4、JFX554-PEG4、およびAtto647N-PEG4「クラック」試薬を含む、様々な「クリック」標識へカップリングするための4つの異なる色の「クラック」検出可能部分を含有し、4つの色と任意の「クリック」試薬との任意の組み合わせを可能にする。Atto495、Janelia fluor 525およびJanelia Fluor 579などの、他のフルオロフォアもまた、これらの「クラック」試薬をレポーター分子とするために使用され得る。
図10は、本開示と一致するさらなるキット設計を図示する。キットは、ペプチドを処理するための試薬の複数のセット1030、1040～1043、1050～1053、1060、1070を含む、複数の行1001～1007および列1010～1020を有する基体を含み得る。試薬の各セットは各行において異なる試薬を含み得る。基体は、ペプチド固定用の試薬1030、ペプチドへカップリングするための標識1040～1043(例えば、「クリック」標識)、標識へカップリングするための試薬1050～1053(例えば、「クラック」レポーター部分または保護基)、洗浄試薬1060、ならびに固体支持体からペプチドをカップリングおよび脱カップリングするための試薬1070を含み得る。基体は、各行および列対について少なくとも1つのボリューム(例えば、少なくとも1つのウェル)を含み得る。
方法は、特定の方法、試料タイプ、または所望の性能レベル(例えば、感度)のためにキットまたは組成物を調整することを含み得る。試薬(例えば、標識、レポーター部分、溶媒、バッファー、プロテアーゼ)の組み合わせは、特定の実験または問い合わせに対して最適化するために選択され得る。キットは、サブセットが選択され得る複数の試薬を提供することによって、そのような最適化を可能にし得る。
単一分子シーケンシングワークフローのための最適な標識組み合わせは、研究される生物のタイプおよび同定される分子の濃度に応じて変化し得る。アミノ酸組成は生物間で異なるため、第1の生物におけるペプチド識別に適した標識選択(例えば、システイン標識、リジン標識、およびトリプトファン標識)は、第2の生物におけるペプチド識別には最適ではない場合がある。したがって、本開示の方法は、照会される試料(例えば、ヒト血清)または生物(例えば、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）)のタイプに基づいて標識のセットを選択することを含み得る。
試薬は試料適合性のために最適化され得る。方法は、試料内で低い交差反応性を有する試薬を選択することを含み得る。例えば、一部のフルオロフォアは核酸にインターカレートすることが知られており(例えば、フラボノイドベースの色素は、多くの試料中に存在するB-DNAに急速にインターカレートすることができる)、したがって、核酸含有試料を利用する方法から除外され得る。方法は、分析物が由来した試料中で25℃にて少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、少なくとも16時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも60時間、少なくとも72時間、少なくとも90時間、または少なくとも120時間の半減期を含む試薬(例えば、レポーター部分)を選択することを含み得る。方法は、分析物が調べられる試料(例えば、フルオロシーケンシング用のバッファー)中で25℃にて少なくとも1時間、少なくとも2時間、少なくとも4時間、少なくとも6時間、少なくとも8時間、少なくとも12時間、少なくとも16時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも60時間、少なくとも72時間、少なくとも90時間、または少なくとも120時間の半減期を含む試薬(例えば、レポーター部分)を選択することを含み得る。方法は、試料のpH、温度、塩分、または反応性種に対する耐性を含む試薬を選択するすることを含み得る。
本開示の方法において使用されるかまたはキット中で提供されるフルオロフォアの組み合わせは、幅広い方法に対して最適化することができる。方法について選択されるかまたはキット中で提供されるフルオロフォアのタイプは、(i)消光を減少させ、(ii)スペクトルのオーバーラップ(励起および／または発光スペクトルのオーバーラップ)を減少させるように、選択され得る。例えば、4色フルオロシーケンシング法についてのフルオロフォアの最適なタイプは、2色細胞イメージング染色についてのフルオロフォアの最適なタイプとは異なる場合がある。フルオロシーケンシング法は、単一のペプチドへのマルチフルオロフォアカップリングのために比較的短いフルオロフォア間距離を生成し得、したがって、低消光活性のフルオロフォア対を必要とし得る一方、染色法は、光学活性細胞物質の環境のためにより高いバックグラウンドシグナルを含み得、したがって、より高い消光という犠牲を払ってより高い量子効率を優先し得る。
試薬のセットまたはキットも、複数の反応が単一のステップで実施され得るように最適化され得る。本開示のキットは、反応基対が単一ステップカップリング反応に適している、複数の「クリック」標識および対応の「クラック」レポーター部分または保護基を含み得る。例えば、キットは、試料中に存在するシステイン残基が第1標識へカップリングされ、試料中に存在するリジン残基が第2標識へカップリングされ、試料中に存在するトリプトファン残基が第3標識へカップリングされ、次いで、3つの標識全てが1つのステップで別個の「クラック」レポーター部分へカップリングされる方法(例えば、シスチン（cystine）標識は青色レポーター部分へカップリングされ、リジン標識は赤色レポーター部分へカップリングされ、トリプトファン標識は緑色レポーター部分へカップリングされる)について構成されていてもよい。方法は、単一のステップで、少なくとも2つの「クラック」レポーター部分または保護基を少なくとも2つの「クリック」標識へカップリングすることを含み得る。方法は、単一のステップで、少なくとも3つの「クラック」レポーター部分または保護基を少なくとも3つの「クリック」標識へカップリングすることを含み得る。方法は、単一のステップで、少なくとも4つの「クラック」レポーター部分または保護基を少なくとも4つの「クリック」標識へカップリングすることを含み得る。方法は、単一のステップで、少なくとも5つの「クラック」レポーター部分または保護基を少なくとも5つの「クリック」標識へカップリングすることを含み得る。単一のステップは、全ての「クラック」レポーター部分が同時に添加される、同時に標識と反応する、またはそれらの任意の組み合わせである、ステップであり得る。
方法は、本開示と一致するキットまたは試薬のセットをコンピュータ的に設計することを含み得る。ユーザーは、方法のタイプ、必要な感度、試料条件(例えば、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ；pH、温度、標的濃度など)を、試薬のセットを最適化するように構成されたプログラムに入力することができる。プログラムは、最適な試薬セットを作製するために、複数の試料および生物についての、既知のプロテオーム、反応性種(例えば、グルタチオン濃度)、および細胞質条件のデータベースを検索し得る。例えば、プログラムは、標的生物のアミノ酸存在量に基づいてプロテアーゼおよびアミノ酸特異的標識のセットを選択し得る。
図11は、本開示と一致するキットを設計するための方法を図示する。方法は、スマートフォンなどの処理デバイスにおいて実施され得る。ユーザーは、タンパク質情報(例えば、照会される試料中に存在するタンパク質のタイプ)、方法によって標的とされていないバックグラウンド種(例えば、タンパク質)のリスト、試料および実験パラメータ、光退色速度、化学またはプロセス効率(例えば、フルオロシーケンシング法において実施されるエドマン反応の予想される効率)、および色素失敗率などの、意図される方法に関する情報を入力し得る1101。処理デバイスは、次いで、ユーザー提供情報を計算モデルに入力し1102、ユーザーが実施しようとする所与の方法についての試薬(例えば、標識およびレポーター部分の組み合わせ)の最適な選択を入力情報に基づいて出力する1103。出力1103は、(例えば、単一分子シーケンシングワークフローの並列クラウド実行を通じて)実験プロトコル、例えば、タンパク質フルオロシーケンシング実験からの予想されるタンパク質同定の数、測定するスポットの数、含める反復の数、および定量における予想される信頼性をさらに含み得る。ユーザーは、次いで、出力試薬を含む推奨試薬セット(例えば、キット)を作製し得る1104。場合によっては、ユーザーは、「クリック」標識と「クラック」レポーター部分および保護基とをカップリングすることによって、推奨試薬セットを作製し得る。場合によっては、ユーザーは、使用のために標識および他の試薬(例えば、プロテアーゼ)を注文し得る。ユーザーは、試薬を用いて方法を実施してもよく1105、そして任意で、意図される実験に基づいてデータをワークアップまたは分析してもよい1106。
4.1 アミノ酸特異的剤
本明細書に記載されるアミノ酸特異的剤は、「標識」とも呼ばれる、アミノ酸特異的二機能性リンカーであり得る。標識は、2つ以上の反応基(例えば、標識の部分または領域)を含有し得る。第1反応基は、特定のアミノ酸タイプまたは特定のアミノ酸タイプのセットへカップリングするように構成されてもよい。いくつかの場合では、第1反応基は、2つの類似したアミノ酸(例えば、チロシンおよびセリン)を区別することができ、また、1つのタイプのアミノ酸または特定の数のタイプのアミノ酸へカップリングするように構成され得る。他の例では、第1反応基は、複数のアミノ酸タイプへカップリングするように構成され得る(例えば、第1反応基は、グルタメート、アスパルテート、およびC末端アミノ酸を含む、カルボキシレート含有アミノ酸へカップリングするように構成され得る)。特定の場合では、第1官能基は任意のアミノ酸へカップリングすることができる。
第1反応基はアミノ酸の側鎖へカップリングし得る。あるいは、標識はアミノ酸の骨格へカップリングし得る。場合によっては、標識は、ペプチド内の位置に選択的である(例えば、末端残基、内部残基、特定のアミノ酸に隣接する残基)。いくつかの標識は、アミノ酸上の翻訳後修飾部位へカップリングする(例えば、選択的にカップリングする)。標識へカップリングされ得る(アミノ酸への)翻訳後修飾のいくつかの非限定的な例には、グリコシル化、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、グルタミル化、グリシル化、イソプレニル化、リン酸化、リポレーション、ホスホパンテテイニル化、硫酸化、セレネーション、アミド化、ユビキチン化、ヒドロキシル化、ニトロシル化、スクシニル化、カルボキシル化、酸化、グルタチオン化、ハロゲン化、N末端アミノ酸環化、翻訳後誘導補因子形成(例えば、緑色蛍光タンパク質発色団およびチロシン-システイン架橋)、およびSUMO化が含まれる。
場合によっては、第1反応基は、特定のアミノ酸側鎖へカップリングする官能基を含む。官能基のいくつかの非限定的な例には、ヨードアセトアミド、スクシンイミジルエステル、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、アルキルアミン、ジアゾ化合物、チオール、メタクリル酸、およびプロパルギルアミンが含まれる。
いくつかの例では、第2反応基は非反応性または不活性である。非反応性第2反応基は、システム内の他のエンティティーと反応してはならない。いくつかの例では、非反応性第2反応基は保護基として役立つ。保護基は、例えば、レポーター(またはレポーター部分)へのカップリングを防止し得る。保護基は検出可能なシグナルを発してはならない。いくつかの場合では、不活性または非反応性第2反応基を有する標識は、「ダミー標識」と呼ばれる。本開示はさらに、ダミー標識を反応性標識へ変換してもよいことを提供する。ダミー標識を反応性標識へ変換することは、酵素プロセス、酸化的もしくは還元的プロセス、光触媒プロセス、金属触媒プロセス、酸性もしくは塩基性プロセス、またはラジカルプロセスによって実行され得る。
第2反応基は反応性であり得る。第1反応基は、レポーターへカップリングするように構成されてもよい。第1反応基は、第2反応基へカップリング可能であってもよい。いくつかの例では、第2反応基はレポーター上に配置され、それによって標識をレポーターへカップリングする。そのような標識は、二官能性であり得、アミノ酸官能性およびレポーターカップリング官能性を有する。本明細書中に提供される標識は、2つ以上の反応性ドメインまたは反応基を有し得、したがって、2つ以上のレポーターへのカップリングを可能にする。複数の反応性ドメインまたは反応基を有する標識は、多官能性標識であり得る。
非限定的な例として、レポーター部分(または複数のレポーター部分)へのカップリングにおいて使用するための選択第2反応基は、アジド、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、アルキン、歪みアルキン(例えば、シクロアルキン、シクロオクチン、DBCO)、チオール、ジチオール、trans-シクロオクテン、ビシクロアルケン、ヨードベンゼン、シアノチアゾール、アセン、ジチオラン、ブロマン、アミノチオール、ピロールジオン、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。第2反応基-レポーター部分反応基対の非限定的な例は、アジドとアルキン、アジドとジベンゾシクロオクチン(DBCO)、アルケンとチオール、アルデヒドとジチオール、ケトンとジチオール、テトラジンとtrans-シクロオクテン、テトラジンとノボルネン-NHS-エステル（nobornen-NHS-ester）、ビシクロアルケンとテトラジン、アルデヒドとジチオラン、ヨードベンゼンとブロマン、シアノチアゾールとアミノチオール、およびアセンとピロールジオンを含む。反応性標識は、特定のレポーターへ選択的にカップリングし得る。選択的にカップリングするように構成され得る反応基の例を表3に示す。
（表３）選択的カップリング活性を有する反応基の例
Figure 2023527149000014
いくつかの場合では、反応性標識は、非選択的であり、複数のレポーターへカップリングすることができる。他の場合では、第2反応基は、レポーターへカップリングすることなく直接検出可能(例えば、蛍光性)であり得る。標識は、バーコードまたは同位体などの他の同定可能または検出可能な含有物を含み得る。いくつかの例では、バーコードは、反復単位(例えば、核酸)の同定可能な配列を含む分子バーコードである。第2反応基は、検出可能なシグナルを発しない非レポーター上に配置されてもよい。第2反応基は、実質的に非反応性または不活性である、保護基として機能する分子構築物上に配置されてもよい。
場合によっては、キットはバッファーを含み得る。バッファーは、バッファーが存在しない場合に生じるであろうpH変化と比べて組成物中のpH変化の程度を減少させることができる化学種を指し得る。バッファーの非限定的な例は含む。場合によっては、本発明のシステムは、リン酸ナトリウム、HEPES、MES、およびクエン酸塩からなる群より選択されるバッファーを含み得る。場合によっては、バッファーは固体の形態であり得る。場合によっては、バッファーは液体中に溶解され得る。場合によっては、バッファーは固体上へ吸着され得る。
本発明の溶液はバッファーを含み得る。バッファーは1 nMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。場合によっては、バッファーは10 nMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。場合によっては、バッファーは100 nMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。場合によっては、バッファーは1μMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。バッファーは10μMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。場合によっては、バッファーは100μMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。場合によっては、バッファーは1 mMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。場合によっては、バッファーは10 mMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。場合によっては、バッファーは100 mMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。場合によっては、バッファーは200 mMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。場合によっては、バッファーは500 mMまたはそれ以上の濃度で存在し得る。
場合によっては、バッファーを含む溶液は2～12のpHを有し得る。場合によっては、バッファーを含む溶液は2～6のpHを有し得る。場合によっては、バッファーを含む溶液は3～7のpHを有し得る。場合によっては、バッファーを含む溶液は4～8のpHを有し得る。場合によっては、バッファーを含む溶液は5～9のpHを有し得る。場合によっては、バッファーを含む溶液は6～10のpHを有し得る。場合によっては、バッファーを含む溶液は7～11のpHを有し得る。場合によっては、バッファーを含む溶液は8～12のpHを有し得る。場合によっては、バッファーを含む溶液は約7のpHを有し得る。
本開示のシステムは、リン酸ナトリウムを含み得る。場合によっては、溶液はリン酸ナトリウムを含み得る。場合によっては、リン酸ナトリウムはリン酸一ナトリウムであり得る。場合によっては、リン酸ナトリウムはリン酸二ナトリウムであり得る。場合によっては、リン酸ナトリウムはリン酸三ナトリウムであり得る。
レポーター
本開示のレポーターは、検出され(例えば、光学的に検出され、質量検出され、放射測定的に検出され、別のエンティティーとの反応によって化学的に検出され)かつ／または(例えば、色によって、質量によって、デコーディーングもしくはシーケンシングによって)同定され得る、構築物であり得る。本開示で使用するレポーターは、2つ以上のドメインを含み得る。例えば、レポーターは、相補的標識の反応性ドメインへカップリングすることができる反応性ドメインを含み得る。レポーターは、相補的標識の第1反応基へカップリングすることができる第2反応基を含有してもよい。いくつかの場合では、第2反応基は、特定の標識とのみカップリングする。他の例では、第2反応基は、任意の標識へカップリングすることができる。レポーターは2つ以上の標識へカップリングすることができる。レポーターは、(特異的または非特異的に)アミノ酸へ直接カップリングすることができる第2反応基を含有してもよい。この場合、レポーターは、アミノ酸の側鎖または翻訳後修飾側鎖へカップリングすることができる。非限定的な例として、レポーターにおいて使用するためのいくつかの第2反応基は、アジド、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、アルキン、歪みアルキン(例えば、シクロアルキン、シクロオクチン、DBCO)、チオール、ジチオール、またはtrans-シクロオクテンからなる群より選択され得る。本開示の有利な局面は、官能基が既知であり、既知のレポーターを既知の標識へ選択的にカップリングするようにカップリング条件が最適化される、標識とレポーターのペアリングである。アミノ酸は、レポーター内の検出可能または同定可能な部分によって同定され得る。
反応性カップリングドメインに加えて、本発明のレポーターは、レポーター部分も含み得る。レポーター部分は、同定可能ドメインを含むことができる。いくつかの例では、同定可能ドメインは、個別アドレス(例えば、バーコードまたは周波数)に関連付けられる。いくつかの例では、このようなレポーター部分は、励起時にシグナルを発するように構成される。いくつかの例では、このようなシグナルは光シグナルである。レポーターは、非検出可能ドメインを含んでもよく、ここで、レポーターは、光学的に検出可能なシグナルを発しない。レポーターはまた、不活性ドメインを含み得る。不活性ドメインは切断可能であり得る。不活性ドメインは、反応性を防止するために保護基として機能し得る。
レポーターは、励起時にシグナルを発することができる。励起は、電磁放射線(例えば、光)の形態で提供され得る。レポーターは、励起時にシグナルを減少させ得るかまたは失い得る。レポーター(またはその上に配置された検出可能ドメイン)から発せられるシグナルは、検出可能であり得る。シグナルは、光、化学、放射、電子、情報、またはそれらの組み合わせであり得る。光シグナルは、発光性(例えば、化学発光、生物発光、エレクトロルミネッセンス、ソノルミネッセンス、フォトルミネッセンス、ラジオルミネッセンス、または熱ルミネッセンスであり得る。フォトルミネッセンス光シグナルのいくつかの例には、蛍光または燐光シグナルが含まれる。光シグナルは発色団(例えば、フルオロフォア、蛍光色素)から来ることができる。光シグナルは、光子を放出することができる任意の分子、高分子、または分子構築物であり得る。光シグナルは、励起に応答して放射され得る。光シグナルは、色などによって互いに区別できる場合がある。いくつかの例では、単一のシステム、方法、またはキット内で複数の光シグナルを使用することが有利である。例えば、複数のフルオロフォアを提供することが有利であり得、その一部または全部が区別可能な光シグナルを発することができる。複数の光シグナルは、例えば、複数の色を含み得る。1色、2色、3色、4色、5色、またはそれ以上を生じさせる蛍光色素を提供することが有利であり得る。20色またはそれ以上を生じさせる蛍光色素を提供することが有利であり得る。フルオロフォアは、例えば、フルオロフォア-ヨードアセトアミド(例えば、Atto647N-ヨードアセトアミド)；フルオロフォア-スクシンイミジルエステル(例えば、Atto647N-NHS)、フルオロフォア-アミン(例えば、Atto647N-アミン)、ジチオラン-フルオロフォア(例えば、カスタム合成フルオロフォア、酸化ジチオラン-フルオロフォア、還元ジチオラン-フルオロフォア)、フルオロフォア-アジド(例えば、Atto647N-アジド)、オレゴングリーン(OG)-ヨードアセトアミド、OG488-NHS、OG488-アジド、OG488-テトラジン、OG514-NHS、Janelia Fluor (JF)-NHS、JF-遊離酸、JF-アジド、JF-ジチオラン、Atto647N-アルキン、Atto647N-遊離酸、Atto425-NHS、Atto425-遊離酸、Atto425-アミン、Atto425-アジド、Atto425-DBCO、SF554-NHS、またはテキサスレッド-NHSを含み得る。光シグナルはまた、光シグナルの不在もしくは喪失(例えば、光退色、光消光)または光シグナルの変化(例えば、FRET、BRET、ホモ-FRET、もしくは他のエネルギー移動発光)を含み得る。
レポーターはスペーサーを含むこともできる。いくつかの例では、スペーサーは、レポーターおよびシグナル放出エンティティーに隣接する。スペーサーは、2つのドメイン(例えば、カップリングドメインおよび検出可能ドメイン)に隣接し得る。レポーターは、直接的または間接的に、第2反応基および蛍光色素に隣接し得る。スペーサーは、官能性(例えば、FRETなど)を最適化するために、関心対象の2つのエンティティーを互いから特定の距離に配置することができる。スペーサーは、混雑または立体干渉を防止するために組み入れられてもよい。スペーサーは、シグナルの検出可能性を高めることができる。いくつかの例では、スペーサーは、第2反応基または反応性(例えば、カップリング)ドメインの反応性を高める。スペーサーは、ポリマー、生体ポリマー、または非ポリマー、ヘテロ原子鎖、ポリアミン鎖、ポリエステル鎖、ポリエーテル鎖、ポリアミド鎖から構成することができる。
切断可能ユニット
切断可能ユニットは、例えばジスルフィドなどの、官能基を含み得る。切断可能ユニットは、例えば、酵素、求核性もしくは塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子性もしくは酸性試薬、有機金属もしくは金属試薬、酸化試薬、またはそれらの組み合わせによって切断され得る。切断可能基は、酸切断可能アミノメチル基(例えば、リンクアミド、Sieber、ペプチドアミドリンカー(PAL))、ヒドロキシメチル(Wang型)、トリチルまたはクロロトリチル、アリール-ヒドラジドリンカーであり得る。切断可能基は、金属切断可能基、例えば、allocリンカー、ヒドラジン切断可能基、または光不安定性切断可能基、例えば、ニトロベンジル系(例えば、4-[4-(1-(Fmoc-アミノ)エチル)-2-メトキシ-5-ニトロフェノキシルブタン酸)またはカルボニル系リンカーであり得る。切断可能ユニットは、TFAで切断されてもよい。
試料タイプ
本明細書に記載される方法は、生物学的試料を分析することを含んでもよい。生物学的試料は、対象(例えば、患者または研究の参加者)、組織試料(例えば、操作された組織試料)、細胞培養物(例えば、ヒト細胞株または細菌コロニー)、細胞(例えば、単一細胞選別アッセイ中に単離された細胞)、またはその一部(例えば、細胞からの細胞小器官または血液試料からのエキソソーム)に由来し得る。生物学的試料は、化学的に合成されたペプチドを含む組成物などの合成であってもよい。試料は、単一種または種の混合物を含み得る。生物学的試料は、単一の生物からの、遺伝的にほぼ同一の生物のコロニーからの、または複数の生物からの(例えば、ヒト消化管からの腸細胞および微生物叢)、生体材料を含み得る。生物学的試料は、分画(例えば、全血から分離された血漿)、濾過、または枯渇(例えば、血漿から除去されたアルブミンおよびセルロプラスミンなどの高存在量のタンパク質)され得る。
試料は、対象、組織試料、細胞培養物、細胞、またはその一部からの生体分子の全てまたはサブセットを含み得る。例えば、対象由来の試料は、その対象に存在するタンパク質の大部分を含んでもよく、またはその対象由来のタンパク質の小さなサブセットを含んでもよい。生物学的試料は、脳脊髄液、唾液、尿、涙、血液、血漿、血清、乳房吸引液、前立腺液、精液、便、羊水、眼内液、粘液、またはそれらの任意の組み合わせなどの体液を含み得る。生物学的試料は、組織培養物、例えば腫瘍試料、または腎臓、肝臓、肺、膵臓、胃、腸、膀胱、卵巣、精巣、皮膚、結腸直腸、乳房、脳、食道、胎盤、もしくは前立腺からの組織を含み得る。
生物学的試料は、その存在または非存在が測定または同定され得る分子を含んでもよい。生物学的試料は、例えばポリペプチドまたはタンパク質などの高分子を含み得る。高分子は、単離(例えば、それが供給された他の成分から分離)または精製されてもよく、その結果、高分子は、重量で(例えば、乾燥重量で、または溶媒を含んで)、組成物の少なくとも0.5%、少なくとも1%、少なくとも2%、少なくとも3%、少なくとも4%、少なくとも5%、少なくとも7.5%、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%を構成する。生物学的試料は、複雑であってもよく、複数の成分(例えば、異なるポリペプチド、プロテオパチー患者のCSF由来の不均一な試料)を含んでもよい。生物学的試料は、細胞もしくは組織の成分、細胞もしくは組織抽出物、またはそれらの分画溶解物を含み得る。生物学的試料は、単一タイプの分子(ペプチド、核酸、脂質、小分子)を含有するように実質的に精製されてもよい。生物学的試料は、本開示の方法(例えば、消化、C末端ラベリング、またはフルオロシーケンシング)のために構成された複数のペプチドを含み得る。
本開示と一致する方法は、生物学的試料から生体分子、生体高分子構造物(例えば、細胞小器官またはリボソーム)、細胞、または組織を単離、濃縮、または精製することを含み得る。方法は、生物学的試料を関心対象の生物学的種についての供給源として利用し得る。例えば、アッセイは、アルファシヌクレインなどのタンパク質、循環腫瘍細胞(CTC)などの細胞、または無細胞DNAなどの核酸を血液または血漿試料から誘導することができる。方法は、2つの別々のタイプの細胞などの生物学的試料から複数の異なる生物学的種を誘導することができる。そのような場合、異なる生物学的種を異なる分析のために分離するか(例えば、CTCライセートおよびバフィーコートタンパク質を分配して別々に分析してもよい)、または共通の分析のためにプールすることができる。生物学的種は、分析前に均質化、断片化、または溶解してもよい。特定の場合、ホモジネートの中から種または複数の種、断片化生成物、または溶解物を、分析のために収集してもよい。例えば、方法は、リキッドバイオプシー中に循環腫瘍細胞を収集すること、任意で個々の循環腫瘍細胞を単離すること、循環腫瘍細胞を溶解すること、結果として生じる溶解物からペプチドを単離すること、および本開示のフルオロシーケンシング法によってペプチドを分析することを含み得る。方法は、C末端捕捉試薬を用いて試料からペプチドを捕捉すること、およびペプチドを分析すること(例えば、フルオロシーケンシング法による)を含み得る。
本開示と一致する方法は、核酸分析、例えば、シーケンシング、サザンブロット、またはエピジェネティック分析を含み得る。核酸分析は、本開示のフルオロシーケンシング法などの第2の分析法と並行して行ってもよい。第2の分析法の核酸および対象は、同一の対象または同一の試料に由来するものであってもよい。例えば、ヒト血漿試料から無細胞DNAおよびペプチドを収集すること、無細胞DNAをシーケンシングすること(例えば、癌マーカーを同定するため)、および血漿タンパク質についてプロテオーム解析を行うことを含み得る。
コンピュータシステム
本開示は、本開示の方法を実行するようにプログラミングされているコンピュータシステムを提供する。図6は、本明細書に提供される方法または方法の一部を実行するようにプログラミングされているかまたは別の方法で構成されているコンピュータシステム601を示す。コンピュータシステム601は、例えば、反応または反応サイクルの制御(例えば、試薬を添加すること、温度を調節することによる)、システムからのシグナルの分析(例えば、レポーター部分からの蛍光シグナル)などの、本開示の様々な局面を調節することができる。コンピュータシステム601は、ユーザーの電子デバイス、または電子デバイスに対して遠隔配置されるコンピュータシステムであり得る。電子デバイスは、モバイル電子デバイスであり得る。
コンピュータシステム601は、中央処理装置(CPU、本明細書では「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサ」とも)605を含み、これは、シングルコアもしくはマルチコアプロセッサ、または並列処理のための複数のプロセッサであり得る。コンピュータシステム601はまた、メモリまたはメモリ位置610(例えば、ランダムアクセスメモリ、読み取り専用メモリ、フラッシュメモリ)、電子記憶ユニット615(例えば、ハードディスク)、1つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インターフェース620(例えば、ネットワークアダプタ)、ならびにキャッシュ、他のメモリ、データ記憶および／または電子ディスプレイアダプタなどの周辺機器625を含む。メモリ610、記憶ユニット615、インターフェース620および周辺機器625は、マザーボードなどの通信バス(実線)を介してCPU 605と通信している。記憶ユニット615は、データを保存するためのデータ記憶ユニット(またはデータリポジトリ)であり得る。コンピュータシステム601は、通信インターフェース620の助けを借りて、コンピュータネットワーク(「ネットワーク」)630に動作可能に接続され得る。ネットワーク630は、インターネット、インターネットおよび／もしくはエクストラネット、またはインターネットと通信しているイントラネットおよび／もしくはエクストラネットであり得る。ネットワーク630は、場合によっては、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク630は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる、1つまたは複数のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク630は、場合によっては、コンピュータシステム601の助けを借りて、ピアツーピアネットワークを実行することができ、これは、コンピュータシステム601へ接続されたデバイスがクライアントまたはサーバとして動作することを可能にし得る。
CPU 605は、プログラムまたはソフトウェアで具体化され得る、一連の機械可読命令を実行することができる。命令は、メモリ610などのメモリ位置に保存されてもよい。命令はCPU 605へ向けられ得、これは、続いて、本開示の方法を実行するようにCPU 605をプログラムするかまたは別の方法で構成することができる。CPU 605によって実行される動作の例には、フェッチ、デコード、実行、およびライトバックが含まれ得る。
CPU 605は、集積回路などの回路の一部であり得る。システム601の1つまたは複数の他の構成要素を回路に含めることができる。場合によっては、回路は特定用途向け集積回路(ASIC)である。
記憶ユニット615は、ドライバ、ライブラリーおよび保存されたプログラムなどのファイルを記憶することができる。記憶ユニット615は、ユーザーデータ、例えば、ユーザープリファレンスおよびユーザープログラムを記憶することができる。コンピュータシステム601は、場合によっては、イントラネットまたはインターネットを介してコンピュータシステム601と通信しているリモートサーバ上など、コンピュータシステム601の外部にある1つまたは複数の追加のデータ記憶ユニットを含むことができる。
コンピュータシステム601は、ネットワーク630を介して1つまたは複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。例えば、コンピュータシステム601は、ユーザーのリモートコンピュータシステム(例えば、蛍光分光計)と通信することができる。リモートコンピュータシステムの例としては、パーソナルコンピュータ(例えば、ポータブルPC)、スレートまたはタブレットPC(例えば、Apple（登録商標）iPad、Samsung（登録商標）Galaxy Tab)、電話、スマートフォン(例えば、Apple（登録商標）iPhone、Android対応デバイス、Blackberry（登録商標）)、またはパーソナルデジタルアシスタントが含まれる。ユーザーは、ネットワーク630を介してコンピュータシステム1101にアクセスすることができる。
本明細書に記載されるような方法は、例えば、メモリ610または電子記憶ユニット615上などの、コンピュータシステム601の電子記憶場所に記憶された機械(例えば、コンピュータプロセッサ)実行可能コードによって実行することができる。機械実行可能または機械可読コードは、ソフトウェアの形態で提供することができる。使用中、コードはプロセッサ605によって実行され得る。場合によっては、コードが記憶ユニット615から取り出され、プロセッサ605によるアクセス準備のためにメモリ610に格納され得る。状況によっては、電子記憶ユニット615は排除され得、機械実行可能命令はメモリ610に格納される。
コードは、コードを実行するように適合されたプロセッサを有する機械で使用するためにプリコンパイルおよび構成され得、または、実行時にコンパイルされ得る。コードは、プリコンパイルまたはアズコンパイルされた（as-compiled）様式でコードを実行できるように選択され得るプログラミング言語で提供できる。
コンピュータシステム1101などの、本明細書中で提供されるシステムおよび方法の局面を、プログラミングにおいて具現化することができる。技術の様々な局面は、典型的には、機械(またはプロセッサ)実行可能コードおよび／または機械可読媒体の一種に運ばれるかまたは具体化される関連データの形態の「製品」または「製造品」と考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ(例えば、読み取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ)またはハードディスクなどの電子記憶ユニットに格納することができる。「ストレージ」タイプの媒体は、コンピュータ、プロセッサなどの有形メモリのいずれかまたはすべて、またはそれらの関連モジュール、例えば、様々な半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどを含むことができ、これらは、ソフトウェアプログラミングのためにいつでも非一時的なストレージを提供し得る。ソフトウェアの全部または一部は、インターネットまたは様々な他の通信ネットワークを介して通信され得る。そのような通信は、例えば、あるコンピュータまたはプロセッサから別のものへの、例えば、管理サーバまたはホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームへのソフトウェアのローディングを可能にし得る。したがって、ソフトウェア要素を有し得る別のタイプの媒体は、ローカルデバイス間の物理的インターフェースを介して、有線および光固定電話ネットワークを介して、ならびに様々なエアーリンクを介して使用されるような、光、電気および電磁波を含む。このような波を運ぶ物理的要素、例えば有線または無線リンク、光リンクなども、ソフトウェアを運ぶ媒体と見なすことができる。本明細書で使用される場合、非一時的で有形の「記憶」媒体に限定されない限り、コンピュータまたは機械「可読媒体」などの用語は、実行のためにプロセッサに命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。
したがって、コンピュータ実行可能コードなどの機械可読媒体は、有形記憶媒体、搬送波媒体または物理的伝送媒体を含むが、これらに限定されない多くの形態をとり得る。不揮発性記憶媒体は、例えば、光ディスクまたは磁気ディスク、例えば、図面に示されるデータベース等を実装するために使用され得るような任意のコンピュータ等における任意の記憶装置を含む。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどの動的メモリを含む。有形の伝送媒体には、同軸ケーブル；コンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含む、銅線および光ファイバーが含まれる。搬送波伝送媒体は、電気信号または電磁信号、または無線周波数(RF)および赤外線(IR)データ通信中に生成されるような音響波または光波の形態をとることができる。したがって、コンピュータ可読媒体の一般的な形態には、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、任意の他の磁気媒体、CD-ROM、DVDまたはDVD-ROM、任意の他の光学媒体、パンチカード紙テープ、穴のパターンを有する任意の他の物理的記憶媒体、RAM、ROM、PROMおよびEPROM、FLASH-EPROM、任意の他のメモリチップまたはカートリッジ、データまたは命令を輸送する搬送波、そのような搬送波を輸送するケーブルまたはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取り得る任意の他の媒体が含まれる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くが、1つまたは複数の命令の1つまたは複数のシーケンスを実行のためにプロセッサに運ぶことに関与し得る。
コンピュータシステム601は、例えば、リアクターシステムを操作するためのオプションを提供するために、ユーザーインターフェース(UI)640を含む電子ディスプレイ635を含むか、または、それと通信することができる。UIの例には、グラフィカルユーザーインターフェース(GUI)およびウェブベースのユーザーインターフェースが含まれるが、これらに限定されない。
本開示の方法およびシステムは、1つまたは複数のアルゴリズムを介して実行することができる。アルゴリズムは、中央処理装置605による実行時にソフトウェアを介して実行され得る。アルゴリズムは、例えば、本明細書に記載される方法の一部を実行することができる。
実施例1：ペプチド試料調製
支持体へのペプチドのN末端固定化
本明細書に提供されるシステム、方法、およびキットは、処理または分析される、ペプチドを支持体へ結合する様々な局面を記載する。この実施例において、ペプチドは、ペプチドの分析を促進するためにビーズへ結合される。この実施例におけるビーズは、切断可能リンカーおよび捕捉試薬が付加された、官能化ビーズであり得る。捕捉試薬はピリジンカルボキシアルデヒド(PCA)であり得、これはペプチドのN末端へ共有結合することができる。手順の最後に、誘導体化ヒドラジン試薬を使用してペプチドを傷なしに取り出すことができる。誘導体化ヒドラジン試薬は、2-(ジメチルアミノ)エチルヒドラジン二塩酸塩(CAS番号57659-80-0)である。より小さなサイズのペプチドを単離するために、GluCやトリプシンなどのプロテアーゼを使用してより大きなペプチドまたはタンパク質を消化することが有利であり得、これは、迅速、効率的、かつ正確な処理および分析(例えば、シーケンシング)を容易にする。しかし、大きなまたは完全長のペプチド(例えば、タンパク質)も処理および分析され得る。緩衝溶液(例えば、HEPESバッファー、pH 8.0)中にペプチドを提供することも有利であり得る。
図2に図示されるように、第1のステップは、ペプチドを固定するために、PCA官能化ビーズ上にペプチド(例えば、流体試料中の複数のペプチド)を捕捉することである。PCA部分は、ペプチド中のN末端アミンと特異的に反応する。隣接するアミド結合との分子内環化により、PCA捕捉剤はペプチド中の他のアミン(例えば、リジン)と比較してN末端と反応し、所望の結合を確実にする。後続のステップにおいて、固定化ペプチドを標識し、ビーズから切断し、フルオロシーケンシングによって分析する。PCAビーズは、直線的配置で連結されたポリマーPEGビーズ、スペーサー、リンク部分、および捕捉剤(PCA)を含む、誘導体化リンク樹脂である(スキーム1に示される通り)。固定化ペプチドを調製する際に有用なさらなる試薬には、HEPESバッファー(pH 8.0)、ジメチルホルムアミド(DMF)、水、ホウケイ酸ガラス培養試験管、およびバイオスピンクロマトグラフィーカラム(Biorad、カタログ番号732-6008)が含まれる。
スキーム1
Figure 2023527149000015
条件は、以下を含む：(i)およそ250マイクロリットル(μL)のビーズを、およそ1ミリグラム(mg)のペプチドに対して十分な量、バイオスピンクロマトグラフィーカラムへ添加し、(ii)カラムを試験管(13 mm x 100 mm)上に置き、(iii)洗浄し(下記プロトコル(A)を参照)；(iv)ペプチドを1ミリリットル(mL)HEPESバッファー(pH 8.0)中に可溶化し、(v)スピンカラムをキャップし、ペプチド溶液を添加し；(vi)カラムをシェーカー中37℃で一晩インキュベートし、(vii)洗浄する(下記プロトコル(B)を参照)。この手順により、ペプチドが支持体(例えば、ビーズ)に固定される。酸性pHでは固定反応が起こらない可能性があるため、7～9のpHが好ましい。
洗浄プロトコル
本明細書に記載されるシステム、方法、およびキットにおいて使用するために例示される固体支持体システムは、PEGベースのポリマービーズである。本明細書に開示される任意の支持体が使用され得るが、簡潔にするために、PEGベースのポリマービーズのみが記載されている。PEGビーズをPCAで官能化し、次いでペプチドをこれへ固定する。固相捕捉によって、ビーズの洗浄が(a)以前の試薬、色素、塩などを除去すること、および(b)基体を失わずにペプチドを標識するための環境を提供することを可能にする。これらのビーズはデリケートであり得、乾燥すると割れる可能性がある。ビーズはDMFおよびメタノールに保存されるため、ビーズの膨張および懸濁が容易になる。ビーズの洗浄は、有機条件から水性バッファーへ移動して、そしていくつかの条件では、水性バッファーから有機条件へ戻って、逐次的に行われる。洗浄ステップで使用される材料および試薬は、ジメチルホルムアミド(DMF)、アセトニトリル、メタノール、水、およびホウケイ酸ガラス培養試験管(100 mm x 13 mm)を含む。
洗浄ステップは、様々な例において必要とされ得るように、以下のように行われる：ホウケイ酸ガラス試験管に取り付けられたバイオスピンカラムを取り外す。次に、バイオスピンカラム内の試料を、(a)水性条件から有機条件に移行するか、または(b)有機条件から水性条件に移行するかのいずれかのプロトコルに従って洗浄する。
プロトコル(A) 水性から有機へ：カラムを(i)水で2回洗浄し、次いで(ii) (1:1 v/v)水/アセトニトリルで少なくとも1回洗浄し、続いて(iii) (1:1 v/v)アセトニトリル/DMFで少なくとも2回洗浄する。各洗浄の間に、ビーズを溶媒中でおよそ10分間インキュベートする。
プロトコル(B) 有機から水性へ：(0)メタノールを使用する場合、最初にカラムをメタノールで1回洗浄した後、続いて(i)DMFで2回洗浄し、続いて(ii)アセトニトリルで少なくとも1回洗浄し、続いて(iii) (1:1 v/v)アセトニトリル/水で少なくとも1回洗浄し、続いて(iv)水で2回洗浄する。各洗浄の間に、ビーズを溶媒中でおよそ10分間インキュベートする。
実施例2：ペプチド標識付け
C末端標識付け
スキーム2
Figure 2023527149000016
ペプチドが、pH 8消化バッファーの下でGluCを用いて、または十分に類似したプロテアーゼ/緩衝系を用いて消化される場合、切断部位は、酸性残基(例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸)のC末端上に生じる(スキーム2)。したがって、ペプチドのC末端にペプチドの全ての酸性残基を有するため、ペプチドはアミドカップリングに適している。C末端酸性残基は、支持体へのその後の固定のためにアルキンへ変換される。C末端カルボン酸、側鎖カルボン酸、または両方のいずれがアルキニル化されて支持体へ固定されても、本明細書に開示されるようなシステム、方法、およびキットの機能は影響をうけ得ない。代替の反応基をアルキンの代わりに使用することができる。しかし、簡潔にするために、アルキンの例のみを本明細書で論じる。
最初に、前述したペプチドを、第1支持体(例えば、官能化ビーズ)に固定し、1マイクロモル未満の量で提供する。C末端標識付けに有用な追加の試薬は、プロパルギルアミン(CAS番号2450-71-7)、O-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)(CAS番号330645-87-9)、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(ヒューニッヒ塩基、DIEA、またはDIPEA)(CAS番号7087-68-5)ストック濃度5.7 M、およびジメチルホルムアミド(DMF)(CAS番号68-12-2)を含む。
固定化ペプチドを、1カラム体積のDMFで洗浄する。次いで、以下の(または実質的に類似の)組成で反応を調製する：(a)HCTU - 20mg、50当量；(b)ヒューニッヒ塩基 - 8μL、50当量；(c)プロパルギルアミン - 3μL、50当量；(d)ジメチルホルムアミド - 500μL。バイオスピン反応器に蓋をし、混合物をペプチドに添加する。次いで、絶えず混合しながら内容物を周囲温度で1～4時間インキュベートする。次いで、内容物を、前述の洗浄ステップ(例えば、プロトコル(b)、次いでプロトコル(a))に従って洗浄し、次のステップが実行されるまで内容物をDMF中に保存する。得られた生成物は、そのN末端で支持体(例えば、PCA官能化ビーズ)へ固定されたペプチドであり、アルキニル化C末端および酸性C末端アミノ酸(例えば、アルキニル化グルタミン酸またはアスパラギン酸)を特徴とする。
官能化ガラススライド上に蛍光標識ペプチドを固定する方法については、クリックケミストリーが用いられる。およそ200 pMのペプチドを、標準的なCu(I)-クリックケミストリーを使用してアジド-シランスライド(PolyAn, Germany製のカスタムスライド)に固定した。簡単には、ペプチド(200 pM)、CuSO4/トリス-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチルアミン(THPTA)ミックス(1 mM/0.5 mM)、および新たに調製したL-アスコルビン酸ナトリウム(5 mM)を含む2 mL溶液を、アジド-シランスライド上で室温にて2時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、スライドを水ですすぎ、フルオロシーケンシングを、若干の変更を加えて以前に記載されたように実行した6。N末端PCAキャップを脱保護するために、スライドを60℃で16時間0.5 M DMAEH中に浸した。Fmoc基の脱保護は、DMF中の20%ピペリジン溶液と共にスライドを1時間インキュベートすることによって行った。画像は、カスタム開発されたスクリプトを使用して処理した。
システイン標識付け
スキーム3
Figure 2023527149000017
システイン側鎖の遊離チオール基は求核性であり、後のステップで副反応の危険性があり得る(スキーム3)。これを制御するために、側鎖チオールを第2の剤と反応させ、それによって副反応または交差反応性のリスクを低減させる。具体的には、チオールを、不活性標識(例えば、保護基)、機能性標識(例えば、別のエンティティーへカップリングし得る反応基を有するもの)、またはレポーター標識(例えば、シグナルを発する標識)と反応させる。
システインをヨードアセトアミド官能化フルオロフォア(励起時にシグナルを発することができるレポーター)で標識するために、以下の試薬が有用である：フルオロフォア-ヨードアセトアミド(例えば、Atto647N-ヨードアセトアミド) - 20μLのDMFストック溶液中200μg、DMF、水、およびヨードアセトアミド(例えば、非レポーター「ダミー」標識として)。
固定化ペプチドを、まず、1カラム体積の新たに蒸留したDMFで洗浄する。次いで、以下の(または実質的に類似の)組成で反応を調製する：(a)フルオロフォア-ヨードアセトアミドストック溶液20uL中200ug；500μL中0.05mM (50μM)；0.2umol；および(b)DMF - 500μL。バイオスピン反応器に蓋をし、混合物をペプチドに添加する。次いで、絶えず混合しながら内容物を周囲温度で2時間インキュベートする。次いで、内容物を、前述の洗浄ステップ(例えば、プロトコル(b)、次いでプロトコル(a))に従って洗浄し、次のステップが実行されるまで内容物をDMF中に保存する。得られた生成物は、任意でフルオロフォアカップリングされたヨードアセトアミド標識でシステイン残基が標識されている、ペプチドである。前述したように、代替の標識が、本明細書に記載されるのと同様の方法で使用され得る。
リジン標識付け
スキーム4
Figure 2023527149000018
リジンのアミンをNHSエステルで特異的に標識することができる(スキーム4)。N末端の第一級アミンは支持体へ事前にカップリングされているため、リジンアミノ酸は遊離の第一級アミンを有する唯一のエンティティーである。このステップは、交差反応性を防止するためにシステイン標識付け後に行ってもよい。
リジンをNHSエステル官能化フルオロフォア(励起時にシグナルを発することができるレポーター)で標識するために、以下の試薬が有用である：フルオロフォア-スクシンイミジルエステル(例えば、Atto647N-NHS) - 20μLのDMFストック溶液中200μg、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(ヒューニッヒ塩基)、無水DMF、およびスルホ-NHSアセテート(例えば、非レポーター「ダミー」標識として)。
固定化ペプチドを、1カラム体積のDMFで洗浄する。次いで、以下の(または実質的に類似の)組成で反応を調製する：(a)フルオロフォア-NHSストック溶液20uL中200ug；500μL中0.05mM (50μL)；0.2umol；(b)ヒューニッヒ塩基の1 mM溶液 - 1μL；(c)無水DMF - 500μL。バイオスピン反応器に蓋をし、混合物をペプチドに添加する。次いで、絶えず混合しながら内容物を周囲温度で2時間インキュベートする。内容物を、前述の洗浄ステップ(例えば、プロトコル(b)、次いでプロトコル(a))に従って洗浄し、次のステップが実行されるまで内容物をDMF中に保存する。得られた生成物は、任意でフルオロフォアカップリングされたNHSエステル標識でリジン残基が標識されている、ペプチドである。前述したように、代替の標識が、本明細書に記載されるのと同様の方法で使用され得る。
アスパラギン酸/グルタミン酸標識付け
スキーム5
Figure 2023527149000019
アスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボン酸は、アミン官能化試薬による直接アミドカップリングステップを通じて標識される(スキーム5)。このステップは内部酸性残基に適用できる。GluCをプロテアーゼとして使用する例では、すべての酸性残基はC末端であり、C末端標識付けセクションで前述したように前もってアルキニル化した。GluCの使用を除いて、内部酸性残基を、分子内環化または交差反応を防止するために、リジン残基の標識付けに続いて本明細書に記載されるように標識する。
アスパラギン酸またはグルタミン酸をアミン官能化フルオロフォア(励起時にシグナルを発することができるレポーター)で標識するために、以下の試薬が有用である：フルオロフォア-アミンエステル(例えば、Atto647N-アミン) - 20μLのDMFストック溶液中200μg、N,N-ジイソプロピルエチルアミン(ヒューニッヒ塩基)、O-(1H-6-クロロベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート(HCTU)、無水DMF、およびプロピルアミン(例えば、非レポーター「ダミー」標識として)。代替の塩基、カップリング試薬、または標識が、本明細書に記載される手順と同様に使用され得る。
固定化ペプチドを、1カラム体積の新たに蒸留したDMFで洗浄する。次いで、以下の(または実質的に類似の)組成で反応を調製する：(a)フルオロフォア-NH2ストック溶液20uL中200ug；500μL中0.05mM (50μL)；0.2umol；(b)ヒューニッヒ塩基の500 mM溶液 - 1μL；(c) HCTU - 2 mg、5当量；および(c)無水DMF - 500μL。バイオスピン反応器に蓋をし、混合物をペプチドに添加する。絶えず混合しながら内容物を周囲温度で2時間インキュベートする。内容物を、前述の洗浄ステップ(例えば、プロトコル(b)、次いでプロトコル(a))に従って洗浄し、次のステップが実行されるまで内容物をDMF中に保存する。得られた生成物は、任意でフルオロフォアカップリングされたアミン標識でアスパラギン酸およびグルタミン酸残基が標識されるであろう、ペプチドである。前述したように、代替の標識が、本明細書に記載されるのと同様の方法で使用され得る。
チロシン標識付け
スキーム6
Figure 2023527149000020
チロシンのフェノール部分に隣接する(例えばオルト位の)位置は、二官能性ジアゾニウム試薬を用いる二段階標識付けプロセスを通じて標識することができる(スキーム6)。ジアゾニウム塩は、調製後およそ3～4週間官能的にカップリングし得るが、その後は低下した活性を示し得る。新たに調製された試薬が、本明細書での使用に好ましい場合がある。第2の試薬であるジチオラン-フルオロフォア(またはジチオラン非フルオロフォア)は、ペプチド内の1つまたは複数のチロシン残基を標識するために提供される。いずれの試薬も、カスタム合成することも、利用可能な場合は適切な供給業者から注文することもできる。
チロシンを官能化ジチオランフルオロフォア(励起時にシグナルを発することができるレポーター)で標識するために、以下の試薬が有用である：リン酸ナトリウムバッファー - 150 mM以上、pH 7.5；トリフルオロ酢酸；メタノール；水；ジアゾニウム塩ストック(例えば、カスタム合成) - 新鮮な25μL DMF中1 mg；ジチオラン-フルオロフォア(例えば、カスタム合成) - 新鮮な20μL DMF中200μg；DMF；およびジチオラン-アルキル(例えば、非レポーター「ダミー」標識として)。この実施例で用いたジアゾニウム塩は、4-ホルミルベンゼンジアゾニウムヘキサフルオロホスフェートである。この標識付けステップの一部は、ペプチドを支持体に固定化する前に行われ得ることに留意すべきである。
反応を、まず、以下の(または実質的に類似の)組成で調製する：(a) 50～100μLリン酸ナトリウムバッファーに可溶化されたペプチド；(b)4-ホルミルベンゼンジアゾニウムヘキサフルオロホスフェート塩 - 25μL DMF中1 mg、4当量；および(c)150 mMリン酸ナトリウムバッファー、pH 7.5 - 50～100μL。反応容器に蓋をし、絶えず混合しながら混合物を周囲温度で2時間インキュベートする。試料をDMFで全体積1mLに希釈する。次に、「支持体へのペプチドの固定化」というタイトルのセクションで前述したように、ペプチドを支持体へ固定する。以下の試薬を含むメタノール酸性溶液を調製する：(i)475μLのメタノール；(ii)475μLの水；および(iii)50μLのトリフルオロ酢酸。ジチオラン-フルオロフォアまたはジチオラン-アルキルダミー(200μg、TCEPで還元)を500μLのメタノール酸性バッファーに可溶化し、固定化ペプチドと共に2時間インキュベートする。最後に、カラムを10カラム体積の水で洗浄し、続いて前述のように洗浄ステップ(プロトコル(a))を行い、次のステップが実行されるまで内容物をDMF中に保存する。得られた生成物は、任意でフルオロフォアカップリングされたジチオラン標識でチロシン残基が標識されるであろう、ペプチドである。前述したように、代替の標識が、本明細書に記載されるのと同様の方法で使用され得る。
ヒスチジン標識付け
スキーム7
Figure 2023527149000021
ヒスチジンの第二級アミンは、シクロヘキセノン試薬を用いた二段階標識付けプロセスを通じて選択的に標識することができる(スキーム7)。2-シクロヘキセノンを、求核付加反応においてヒスチジンと反応させ、その後、ケトンを反応させてレポーター(または非レポーター標識)を付加する。ケトンと反応し得る試薬の1つは、前述のようなジチオランである。チロシン標識付けについて記載されたものとは異なる蛍光部分を有する誘導体化バージョンは、さらなる有用性を提供し得、異なるレポーターに基づいて2つのアミノ酸を区別することを可能にする。逆に、どのジチオランがどのアミノ酸に対応するかを同定するために、標識化学の特異性(例えば、ジアゾニウム対シクロヘキサノンの反応性から)を使用することができる。
ヒスチジンを官能化ジチオランフルオロフォア(励起時にシグナルを発することができるレポーター)で標識するために、以下の試薬が有用である：リン酸バッファー - 50 mM以上、pH 7.5；2-シクロヘキセノン；トリフルオロ酢酸；メタノール；水；ジチオラン-フルオロフォア(例えば、カスタム合成) - 新鮮な20μL DMF中200μg；DMF；およびジチオラン-アルキル(例えば、非レポーター「ダミー」標識として)。
まず、支持体へ固定されたペプチドをリン酸バッファー中で平衡化し、必要に応じて上記のような洗浄ステップを先行する。次に、リン酸バッファー(500μL)とシクロヘキセノン(25μL;50当量)の溶液を、固定化ペプチドを含有するバイオスピンカラムへ添加する。反応容器に蓋をし、絶えず混合しながら混合物を周囲温度または30℃で12時間インキュベートする。反応の内容物を、上述のプロトコル(a)に従って洗浄し、最終的にメタノール中で平衡化する。以下の試薬を含むメタノール酸性溶液を調製する：(i)475μLのメタノール；(ii)475μLの水；および(iii)50μLのトリフルオロ酢酸。ジチオラン-フルオロフォアまたはジチオラン-アルキルダミー(200μg、TCEPで還元)を500μLのメタノール酸性バッファーに可溶化し、固定化ペプチドと共に2時間インキュベートする。最後に、カラムを10カラム体積の水で洗浄し、続いて前述のように洗浄ステップ(プロトコル(a))を行い、次のステップが実行されるまで内容物をDMF中に保存する。得られた生成物は、任意でフルオロフォアカップリングされたジチオラン標識でヒスチジン残基が標識されるであろう、ペプチドである。前述したように、代替の標識が、本明細書に記載されるのと同様の方法で使用され得る。
アルギニン標識付け
スキーム8
Figure 2023527149000022
アルギニン残基のアミンは、バートン塩基の助けを借りてNHSエステルで特異的に標識することができる(スキーム8)。本明細書に提供される反応は、第一級アミン(例えば、N末端、リジン)またはチオール(例えば、システイン)による交差反応性または干渉を示し得る。このステップは、交差反応性を防止するためにN末端支持体固定化ならびにシステインおよびリジン標識付けの後に行ってもよい。
アルギニンをNHSエステル官能化フルオロフォア(励起時にシグナルを発することができるレポーター)で標識するために、以下の試薬が有用である：フルオロフォア-スクシンイミジルエステル(例えば、Atto647N-NHS) - 20μLのDMFストック溶液中200μg、2-tert-ブチル-1,1,3,3-テトラメチルグアニジン(バートン塩基)、無水DMF、およびスルホ-NHSアセテート(例えば、非レポーター「ダミー」標識として)。
固定化ペプチドを、1カラム体積のDMFで洗浄する。以下の(または実質的に類似の)組成で反応を調製する：(a)バートン塩基 - 2μL；および(b)無水DMF - 200μL；続いて(c)フルオロフォア-NHSストック溶液20uL中200ug；500μL中0.05mM (50μM)；0.2umol。バイオスピン反応器に蓋をし、混合物をペプチドに添加する。絶えず混合しながら内容物を40℃で8時間インキュベートする。内容物を、前述の洗浄ステップ(例えば、プロトコル(b)、次いでプロトコル(a))に従って洗浄し、次のステップが実行されるまで内容物をDMF中に保存する。得られた生成物は、任意でフルオロフォアカップリングされたNHSエステル標識でアルギニン残基が標識されるであろう、ペプチドである。前述したように、代替の標識が、本明細書に記載されるのと同様の方法で使用され得る。
メチオニン標識付け
スキーム9
Figure 2023527149000023
メチオニンは弱い求核性を有し、システインと交差反応することなくオキサジリジン基がチオエーテルと特異的に反応するレドックスベースのスキームによって選択的に標識することができる(スキーム9)。形成された結合は、TCEPなどの還元剤に対して安定である。
メチオニンをアジド官能化フルオロフォア(励起時にシグナルを発することができるレポーター)で標識するために、以下の試薬が有用である：フルオロフォア-アジド(例えば、Atto647N-アジド) - 20μLのDMFストック溶液中200μg；L-アスコルビン酸ナトリウム - 250μLバッファー中の10 mg(200 mM)；トリス(ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル) (THPTA) - 200μL水中8.7 mg (200 mM)；硫酸銅 - 120μL水中4 mg (200 mM)；水；リン酸バッファー - pH 7 (50 mM)；および上記のスキームに図示されるような、オキサジリジン試薬。
まず、オキサジリジン試薬を、5μLの濃縮試薬を500μLのリン酸バッファー中に希釈することによって調製する。固定化ペプチドをオキサジリジン試薬と共に周囲温度で10分間インキュベートする。固定化ペプチドを、バッファーおよび水で、または必要に応じて、前述の洗浄ステップに従って洗浄する。硫酸銅試薬の100 mMストック溶液を、CuSO4 (50μL)、THPTA (25μL)、および水(25μL)を組み合わせることによって調製し；ペプチドと共に30分間インキュベートする。以下の(または実質的に類似の)組成で反応を調製する：(a)リン酸バッファー(400μL)；(b)アスコルビン酸ナトリウム(25μL) (c)CuSO4ストック溶液(50μL)；および(d)20μL中のフルオロフォア-アジドストック溶液20μL中200μg；500μL中0.05mM (50μM)；0.2μmol。反応物を固定化ペプチドと組み合わせ、次いで、絶えず混合しながら内容物を周囲温度で2～4時間インキュベートする。内容物を、前述の洗浄ステップ(例えば、プロトコル(a)、次いでプロトコル(b))に従って洗浄し、次のステップが実行されるまで内容物をDMF中に保存する。得られた生成物は、任意でフルオロフォアカップリングされたトリアゾール標識でメチオニン残基が標識されるであろう、ペプチドである。前述したように、代替の標識が、本明細書に記載されるのと同様の方法で使用され得る。
リン酸化残基の標識付け
スキーム10
Figure 2023527149000024
セリンおよびトレオニンなどのリン酸化アミノ酸は、β脱離とそれに続くコンジュゲート付加(例えば、マイケルアクセプター反応)を通じて標識することができる(スキーム10)。この一連の反応ステップは、チロシン(pTyr)などの他のリン酸化アミノ酸に優先してリン酸化セリン(pSer)およびトレオニン(pThr)の選択的標識を提供する。pTyrを標識するために、その後の汎ホスホ標識法を実施することができる。
官能化NHSエステルフルオロフォア(励起時にシグナルを発することができるレポーター)でpSerおよびpThrを標識するために、以下の試薬が有用である：可溶化ペプチド - 100μLの水または水/アセトニトリル(1:1 vv)中の1 umol；水酸化バリウム、八水和物(1mL水中46mg)；HEPESバッファー - pH 8.5(100 mM)；トリス(2-カルボイエチル)ホスフィン塩酸塩溶液(TCEP)(500 mM)；シスタミン二塩酸塩 - 1 mL水中152 mg (1 M)；フルオロフォア-スクシンイミジルエステル(例えば、Atto647N-NHS) - 20 uLのDMFストック溶液中の200 ug；ヒューニッヒ塩基(DMF中500 mM)；および無水DMF。
最初の反応は、100μLのペプチド溶液(1umol)と100μLの水酸化バリウム溶液を組み合わせることによって、微量遠心バイアル中で調製する。反応混合物を37℃で4時間インキュベートした後、5000 rpmで2分間遠心分離する。リン酸バリウムが溶液から沈殿する。内容物をHEPESバッファーで中和し、前述のように支持体へ固定化する。次に、以下の組成物で第2の反応を調製する：(a)1Mシスタミン溶液(50uL)；(b)500mM TCEP溶液(100uL)；(c)HEPESバッファー(100 uL)；および(d)水(250 uL)。絶えず混合しながら反応混合物を37℃で4～12時間インキュベートする。反応終了後、反応を10カラム体積の水で洗浄し、続いてプロトコル(a)の洗浄を行う。次に、第3の反応を以下の組成物で調製する:フルオロフォア-NHS、20 uL中200 ug、500μL中0.5mM (500μM)、0.2 u mol；500 mMストック溶液ヒューニッヒ塩基(1μL)；および無水DMF(500μL)。反応混合物を固定化ペプチドに添加し、反応容器をキャップし、絶えず混合しながら周囲温度で4時間インキュベートする。反応の完了後、ペプチドを、前述の洗浄ステップ(プロトコル(b)に続いてプロトコル(a))に従って洗浄し、次のステップが実行されるまで内容物をDMF中に保存する。得られた生成物は、任意でフルオロフォアカップリングされた標識でpSerおよびpThr残基が標識されるであろう、ペプチドである。前述したように、代替の標識が、本明細書に記載されるのと同様の方法で使用され得る。
実施例3：支持体からのペプチド切断
トリフルオロ酢酸(TFA)とそれに続くヒドラジンを含む二段階の手順に従って、ペプチドを支持体から切断する。支持体がビーズ、スペーサー、リンク部分、およびペプチドへ結合されたPCA部分を含むPCA樹脂である例では、PCA部分はTFAによる処理によってリンク部分から切断される。第2ステップにおいて、ペプチドをPCA部分から切断し、それによって無傷のN末端を有するペプチドを提供する。
PCA樹脂などの支持体からペプチドを切断するために、以下の試薬が有用である：固定化ペプチド、任意で標識された(例えば、1つまたは複数のフルオロフォア標識)；500 mMヒューニッヒ塩基；DMF；メタノール；水；100 mMジメチルアミノエチルヒドラジン二塩酸塩(DMEAE-ヒドラジン) - 25 mL PBS中440 mg；アセトニトリル;トリフルオロ酢酸；トリイソプロピルシラン；ジクロロメタン(DCM)；およびジエチルエーテル(Et2O)。
最初に、固定化ペプチドを、プロトコル(a)に従うか、または、以前に有機媒体中に保存された場合は、プロトコル(b)に続いてプロトコル(a)に従う前述の洗浄ステップに従って、洗浄する。ペプチドをDCMで広範囲に洗浄し、次いで真空下で乾燥させる。次に、以下の(または実質的に類似の)組成物でTFA溶液を調製する：(a)TFA(4.8mL)；(b)トリイソプロピルシラン(0.1 mL)；および(c)水(0.1mL)。TFA溶液(1mL)をペプチドに添加し、反応容器をキャップしてスピンさせる。反応物を周囲温度またはわずかに暖かい温度(例えば、30℃)で1～2時間インキュベートしてから、溶液を微量遠心チューブ中へ溶出する。TFAを、窒素パージの助けを借りて除去するか、または体積を大幅に減少させる。ペプチドをEt2Oに再懸濁し、-80℃に冷却する。微量遠心チューブを4℃、10,000rpmで10分間遠心分離する。上清を除去した後、ペレットを1:1 v/vメタノール/水で可溶化する。次に、可溶化ペプチドを、後述するように第2の支持体(例えば、ガラススライド)へ固定する。ペプチドが第2の支持体に固定化されると(例えば、ペプチドのC末端を介して)、PCA部分は、ヒドラジンの助けを借りてN末端から傷なしに切断することができる。上記の試薬リストに概説されているように、ヒドラジン溶液は、440 mgのDMEAE-ヒドラジンおよび25 mLのPBSバッファーを使用して調製される。第2支持体に固定化されたペプチドをヒドラジン溶液に浸し、溶液を60℃で12～16時間加熱する。ペプチドを水で洗浄する。最終結果は、そのC末端で第2の支持体に固定化された標識ペプチドであり、N末端からのフルオロシーケンシング(例えば、エドマン分解または関連技術を使用する)を容易にする。
実施例4：ペプチド捕捉手順
この実施例はペプチドをランタン上に選択的に捕捉するための方法をカバーする。本開示は、ペプチドを捕捉するための幅広い基体を提供する。1つのそのようなタイプの基体はランタンであり、これは、ペプチド捕捉剤を含む固体支持体、および固体支持体を試料中に配置するための棒を含み得る。ランタン棒は、使用者(例えば、使用者はランタン棒を手に持ってもよい)または機器によって操作可能であり得る。ランタン固体支持体は、システインまたはペプチドC末端に選択的な反応基などの、本開示の反応基を含み得る。
図8は、本開示と一致するランタンを使用するための方法を概説する。アンジオテンシン(陽性対照ペプチドとして提供)、配列AKGAGRY{PRA}N-ONH2 (SEQ ID NO: 4、ここで{PRA}はプロパルギルグリシンを意味する)を含むペプチド、捕捉陰性対照ペプチド、および関心対象のペプチドを含有するペプチド混合物を、水、3%アセトニトリル、および0.1%ギ酸を含む溶液およそ500μL中に溶解する。ペプチド捕捉剤を含む固体支持体である、ランタンを、試料中に配置し、37℃で24時間インキュベートし、アンジオテンシン、2Kペプチド、捕捉陰性対照ペプチド、および関心対象のペプチドがランタンのペプチド捕捉剤へカップリングするために十分な時間を提供する。未結合ペプチドを除去するために、ランタンを次いで新鮮な脱イオン水中で2分間2回洗浄する。ランタンを次いで空気中でまたはN2流を用いて乾燥させる。最後に、ランタンを保管または輸送のために清潔な遠心分離管中に置く。ランタンを溶液中に再懸濁させ、ペプチドをペプチド捕捉剤から脱カップリングするために切断剤を提供することによって、ランタンへカップリングされたペプチドを回収してもよい。
実施例4：フルオロシーケンシングアッセイ安定性および効率
この実施例は一連の例示的フルオロシーケンシングアッセイをカバーする。この実施例において、配列AXAGANGSNG{PRA}N (SEQ ID NO: 5)のペプチド；ここで、PRAはプロパルギルグリシンであり、Xは、図12A～Dに示されるように、アミノ酸 － Cys、Glu、pSer、またはLysである。X位のCys、Glu、pSer、またはLysを、標識と反応させ、アジド第2反応基(図12A～C)またはノルボルネン第2反応基(図12D)のいずれかを含む「クリック」標識と反応させる。次いで、「クラック」レポーター部分を「クリック」標識へカップリングする(フルオロフォアAtto647N-PEG4-DBCOをアジドクリックハンドルへカップリングし、フルオロフォアAtto647N-PEG4-mTETをノルボルネンクリックハンドルへカップリングする)。
図12A～Dは、各エドマンサイクル(E)後に消失する蛍光スポットのカウントを示す、ヒートマップとして描写される標識されたペプチドに対するフルオロシーケンシング結果を提供する。エドマン試薬を欠く対照サイクルはMとして表される。最大値はE2位においてカウントされる。システイン、グルタメート、およびリジン(図12A、B、およびD)について、最大の蛍光減少は第2エドマン分解ステップ後に生じる。結果は、ペプチドが「クリック」標識-「クラック」レポーター部分対で安定して標識され得ることを示している。
本発明の好ましい態様が本明細書において示され、説明されているが、そのような態様は単なる例として提供されることが当業者には明らかであろう。本発明は、本明細書中に提供される具体例によって限定されることは意図されない。本発明を前述の明細書を参照して説明したが、本明細書における態様の説明および例示は、限定的な意味で解釈されることを意味するものではない。多数の変形、変更、および置換が、本発明から逸脱することなくここで当業者に生じるであろう。さらに、本発明のすべての局面は、様々な条件および変数に依存する本明細書に記載される特定の描写、構成または相対的な比率に限定されないことが理解されるべきである。本明細書に記載される本発明の態様に対する様々な代替物が、本発明を実施する際に採用され得ることが理解されるべきである。したがって、本発明は、そのような代替、改変、変形または均等物も対象とすることが企図される。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等物がそれによってカバーされることが意図される。

Claims (146)

  1. ペプチドを含むシステムであって、
    該ペプチドが、少なくとも1つの支持体へ固定されており；かつ、
    該ペプチドが、標識へカップリングされたアミノ酸を含み、該標識が、
    (i)シグナルを発するように構成されたレポーター部分へカップリングされている第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基、または
    (ii)該標識と該第2反応基の間のカップリングを防止するように構成された保護基
    を含む、前記システム。
  2. 前記少なくとも1つの支持体が、ビーズ、ポリマーマトリクス、またはアレイを含む、請求項1記載のシステム。
  3. 前記アレイが顕微鏡用スライドである、請求項2記載のシステム。
  4. 前記ペプチドのN末端が、前記少なくとも1つの支持体へカップリングされている、請求項1記載のシステム。
  5. 前記少なくとも1つの支持体がビーズである、請求項4記載のシステム。
  6. 前記ペプチドの前記N末端が、切断可能ユニットへカップリングされており、該切断可能ユニットが前記少なくとも1つの支持体へカップリングされている、請求項4記載のシステム。
  7. 前記切断可能ユニットが、(i)切断可能部分、(ii)アルデヒド、(iii)前記少なくとも1つの支持体、または(iv)スペーサーのうちの少なくとも1つを含む、請求項6記載のシステム。
  8. 前記切断可能ユニットが(i)～(iv)を含む、請求項7記載のシステム。
  9. 前記ペプチドのC末端が、前記少なくとも1つの支持体へカップリングされている、請求項1記載のシステム。
  10. 前記少なくとも1つの支持体が顕微鏡用スライドである、請求項9記載のシステム。
  11. 前記C末端が、アルキンまたはアジドを含む化合物で修飾されている、請求項9記載のシステム。
  12. 前記アルキンまたは前記アジドが、前記少なくとも1つの支持体へカップリングするように構成されている、請求項11記載のシステム。
  13. 前記C末端が酸性アミノ酸であり、該C末端が第1酸性残基および第2酸性残基を含む、請求項9記載のシステム。
  14. 前記第1酸性残基がC末端カルボン酸である、請求項13記載のシステム。
  15. 前記第2酸性残基が、アスパラギン酸側鎖またはグルタミン酸側鎖である、請求項13記載のシステム。
  16. 前記第1酸性残基および前記第2酸性残基が、アルキンまたはアジドを含む化合物で修飾されている、請求項13記載のシステム。
  17. 前記アルキンまたは前記アジドが、前記少なくとも1つの支持体へカップリングするように構成されている、請求項16記載のシステム。
  18. 前記ペプチドのN末端が、前記少なくとも1つの支持体のうちの第1支持体へカップリングされており、ここで、該第1支持体がビーズであり、かつ、該ペプチドのC末端が該少なくとも1つの支持体のうちの第2支持体へカップリングされており、ここで、該第2支持体が顕微鏡用スライドである、請求項1記載のシステム。
  19. 前記レポーター部分が、励起されると前記シグナルを発するように構成されている、請求項1記載のシステム。
  20. 前記シグナルが検出可能なシグナルである、請求項1記載のシステム。
  21. 前記検出可能なシグナルが光シグナルである、請求項20記載のシステム。
  22. 前記レポーター部分が蛍光色素を含む、請求項1記載のシステム。
  23. 前記レポーター部分がスペーサーを含む、請求項1記載のシステム。
  24. 前記保護基が光学的に検出可能なシグナルを発しない、請求項1記載のシステム。
  25. 前記アミノ酸が、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択される、請求項1記載のシステム。
  26. 前記アミノ酸が翻訳後修飾を含む、請求項1記載のシステム。
  27. 前記翻訳後修飾が、グリコシル化、アセチル化、アルキル化、ビオチン化、グルタミル化、グリコシル化、イソプレニル化、リン酸化、リポレーション（lipolation）、ホスホパンテテイニル化、硫酸化、セレネーション（selenation）、アミド化、ユビキチン化、ヒドロキシル化、ニトロ化、ニトロシル化、シトルリン化、N末端グルタミン環化、N末端グルタミン酸環化、およびSUMO化からなる群より選択される、請求項26記載のシステム。
  28. 前記ペプチドが、複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸を含む、請求項1記載のシステム。
  29. 前記複数のアミノ酸が、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸および第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含む、請求項28記載のシステム。
  30. 前記複数のアミノ酸が、(i)複数の第1標識へカップリングされた複数の第1アミノ酸および(ii)複数の第2標識へカップリングされた複数の第2アミノ酸を含む、請求項29記載のシステム。
  31. 前記第1標識が前記第1アミノ酸へのみカップリングし、前記第2標識が前記第2アミノ酸へのみカップリングする、請求項29記載のシステム。
  32. 前記複数の標識のうちの少なくとも1つの標識が、前記複数のアミノ酸のうちの特定のアミノ酸タイプへカップリングされる、請求項28記載のシステム。
  33. 前記複数の標識のうちの少なくとも1つの標識が、特異的レポーター部分へカップリングされた特異的第2反応基と反応するように構成されている、請求項28記載のシステム。
  34. 前記ペプチドが複数のアミノ酸を含む、請求項1記載のシステム。
  35. 前記複数のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸が、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、グルタミン、アスパラギンおよびトリプトファンからなる群より選択される、請求項34記載のシステム。
  36. 前記少なくとも1つのアミノ酸が前記標識へカップリングされている、請求項35記載のシステム。
  37. 前記第1反応基が、アジド、アルキン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、チオール、ジチオール、シクロオクテン、およびノルボルネンからなる群より選択される、請求項1記載のシステム。
  38. 前記アルキンが歪みアルキンである、請求項37記載のシステム。
  39. 前記第1反応基が、前記アジド、前記アルケン、前記アルデヒド、前記ケトン、および前記テトラジンからなる群より選択される、請求項37記載のシステム。
  40. 前記第2反応基が、アルキン、アジド、チオール、ジチオール、シクロオクテン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、およびノルボルネンからなる群より選択される、請求項1記載のシステム。
  41. 前記第1反応基が、前記アルキン、前記チオール、前記ジチオール、および前記シクロオクテンからなる群より選択される、請求項40記載のシステム。
  42. 前記アルキンが歪みアルキンである、請求項40記載のシステム。
  43. 以下の工程を含む、ペプチドを処理または分析するための方法：
    (a)標識へカップリングされたアミノ酸を含む該ペプチドを提供する工程であって、該標識が、
    (i)シグナルを発するように構成されたレポーター部分へカップリングされている第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基、または
    (ii)該標識と該第2反応基の間のカップリングを防止するように構成された保護基
    を含む、工程；
    (b)該ペプチドと、該第2反応基を含む混合物とを接触させる工程；
    (c)該ペプチドが少なくとも1つの支持体へ固定されている状態で、該ペプチドからのシグナルを検出する工程；および
    (d)該シグナルまたはシグナル変化を使用して該ペプチドの該アミノ酸またはさらなるアミノ酸を同定する工程。
  44. (a)または(b)において、前記ペプチドを前記少なくとも1つの支持体へ固定する、請求項43記載の方法。
  45. (c)の前に前記ペプチドを固定する工程をさらに含む、請求項43記載の方法。
  46. (b)の後に前記ペプチドを固定する工程をさらに含む、請求項43記載の方法。
  47. (a)において、前記標識が前記第1反応基を含み、かつ、(b)において、前記第2反応基が該第1反応基と反応する、請求項43記載の方法。
  48. 前記ペプチドを複数のペプチドとして提供する、請求項43記載の方法。
  49. 前記ペプチドが、前記複数のペプチドのうちの少なくとも1つのペプチドを含む、請求項48記載の方法。
  50. 前記複数のペプチドを複数の支持体へ固定する、請求項48記載の方法。
  51. 前記複数のペプチドが第1ペプチドおよび第2ペプチドを含む、請求項48記載の方法。
  52. 前記第1ペプチドが、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸を含み、前記第2ペプチドが、第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含む、請求項51記載の方法。
  53. 前記第1標識が前記第2反応基と反応するように構成されており、前記第2標識が該第2反応基とは異なる第2反応基と反応するように構成されている、請求項52記載の方法。
  54. 前記異なる第2反応基が、前記レポーター部分とは異なるシグナルを発するように構成された第2レポーター部分へカップリングされている、請求項53記載の方法。
  55. 前記ペプチドが、複数の標識へカップリングされた複数のアミノ酸を含む、請求項43記載の方法。
  56. 前記複数のアミノ酸が、第1標識へカップリングされた第1アミノ酸および第2標識へカップリングされた第2アミノ酸を含む、請求項55記載の方法。
  57. 前記複数のアミノ酸が、複数の第1標識へカップリングされた複数の第1アミノ酸および複数の第2標識へカップリングされた複数の第2アミノ酸を含む、請求項56記載の方法。
  58. 前記第1標識が前記第1アミノ酸へのみカップリングし、前記第2標識が前記第2アミノ酸へのみカップリングする、請求項56記載の方法。
  59. 前記複数の標識のうちの少なくとも1つの標識が、前記複数のアミノ酸のうちの特定のアミノ酸タイプへカップリングされる、請求項55記載の方法。
  60. 前記複数の標識のうちの少なくとも1つの標識が、特異的レポーター部分へカップリングされた特異的第2反応基と反応するように構成されている、請求項55記載の方法。
  61. 前記ペプチドが複数のアミノ酸を含む、請求項43記載の方法。
  62. 前記複数のアミノ酸のうちの少なくとも1つのアミノ酸が、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、アスパラギン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択される、請求項61記載の方法。
  63. 前記少なくとも1つのアミノ酸が前記標識へカップリングされている、請求項61記載の方法。
  64. 前記複数のアミノ酸が少なくとも2つのアミノ酸タイプを含む、請求項61記載の方法。
  65. 前記複数のアミノ酸のアミノ酸タイプの全てよりも少ないアミノ酸タイプが標識されている、請求項64記載の方法。
  66. 前記少なくとも2つのアミノ酸タイプが、第1アミノ酸タイプおよび第2アミノ酸タイプを含む、請求項64記載の方法。
  67. 前記第1アミノ酸タイプが第1標識へカップリングされており、前記第2アミノ酸タイプが第2標識へカップリングされている、請求項66記載の方法。
  68. 前記第1標識および前記第2標識が、異なるレポーター部分へ各々カップリングされる、請求項67記載の方法。
  69. 前記少なくとも2つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプが、異なる標識へカップリングされている、請求項64記載の方法。
  70. 前記ペプチドが少なくとも4つのアミノ酸タイプを含み、該少なくとも4つのアミノ酸タイプの各アミノ酸タイプが、異なる標識へカップリングされている、請求項64記載の方法。
  71. 前記複数のアミノ酸の全てよりも少ないアミノ酸が標識されている、請求項61記載の方法。
  72. 前記シグナルまたはシグナル変化が、前記ペプチドの配列の少なくとも一部を同定するために使用される、請求項43記載の方法。
  73. (e)前記少なくとも1つの支持体へ固定された前記ペプチドから少なくとも1つのアミノ酸を除去するために十分な条件へ該ペプチドを供する工程
    をさらに含む、請求項43記載の方法。
  74. (f)前記少なくとも1つの支持体へ固定された前記ペプチドからの少なくとも1つのさらなるシグナルまたはシグナル変化を検出するために(d)および(e)を繰り返す工程、ならびに
    (ii)該シグナルまたはシグナル変化および該さらなるシグナルまたはシグナル変化を使用して、該少なくとも1つの支持体へ固定された該ペプチドの配列の少なくとも一部を同定する工程
    をさらに含む、請求項73記載の方法。
  75. 少なくとも1つのアミノ酸を除去するために十分な前記条件が、エドマン分解剤または有機リン含有剤を含む、請求項73記載の方法。
  76. 前記少なくとも1つのアミノ酸を前記ペプチドのN末端から除去する、請求項73記載の方法。
  77. (e)の後に、前記標識へカップリングされた前記アミノ酸が末端アミノ酸となる、請求項73記載の方法。
  78. (d)を(a)～(c)の後に行う、請求項43記載の方法。
  79. 前記少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化を、単一分子感度を有する光学検出器で検出する、請求項43記載の方法。
  80. 前記少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化が、異なる周波数または周波数範囲の複数のシグナルを含む、請求項43記載の方法。
  81. 前記少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化が、異なる強度の複数のシグナルを含む、請求項43記載の方法。
  82. 前記少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化が光シグナルである、請求項43記載の方法。
  83. 前記レポーター部分が、前記少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化を発生させる、請求項43記載の方法。
  84. 前記レポーター部分が色素を含み、この色素が前記少なくとも1つのシグナルまたはシグナル変化を発生させる、請求項43記載の方法。
  85. 前記保護基が1つまたは複数の基を含み、各基が、アジド、アルキル、アルキレン、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリール-アルキル、およびアリール-アルキルからなる群より独立して選択される、請求項43記載の方法。
  86. 以下の工程を含む、ペプチドのアミノ酸を標識するための方法：
    (a)アジドへカップリングされた内部アミノ酸およびアルキンへカップリングされたC末端を含む該ペプチドを提供する工程；ならびに
    (b)歪みアルキンを含む第1レポーターが該内部アミノ酸と反応するような条件下で、該ペプチドと該第1レポーターとを接触させる工程。
  87. (b)を銅(Cu)の非存在下で行う、請求項86記載の方法。
  88. (c)前記第1レポーターとは異なる第2レポーターを前記C末端と反応させる工程であって、該第2レポーターが非歪み（non-strained）アルキンを含む、工程
    をさらに含む、請求項86記載の方法。
  89. (c)を銅(Cu)の存在下で行う、請求項88記載の方法。
  90. 前記内部アミノ酸へカップリングされた前記アジドが、前記C末端へカップリングされた前記アルキンと反応しない、請求項86記載の方法。
  91. 以下を含む、試料中のペプチドの配列をアッセイするためのキット：
    レポーター；
    第1反応基および(i)第2反応基または(ii)保護基を含む標識であって、該第1反応基が、あるアミノ酸タイプのアミノ酸へカップリングするように構成されており、該第2反応基が、シグナルを発するように構成されたレポーター部分を含む該レポーターへカップリングするように構成されており、かつ、該保護基が、該標識と該レポーター部分の間のカップリングを防止するように構成されている、標識；ならびに
    該標識へカップリングされた該アミノ酸を含むペプチドを提供するために該ペプチドを処理するために該標識を使用するための、説明書。
  92. 前記レポーターが、前記第2反応基と反応するように構成された第3反応基へカップリングされている、請求項91記載のキット。
  93. 前記レポーターが、励起されると前記シグナルを発するように構成されている、請求項91記載のキット。
  94. 前記レポーターが蛍光色素を含む、請求項91記載のキット。
  95. 前記レポーターがスペーサーを含む、請求項91記載のキット。
  96. 前記保護基が光学的に検出可能なシグナルを発しない、請求項91記載のキット。
  97. (d)タンパク質捕捉剤をさらに含む、請求項91記載のキット。
  98. 前記タンパク質捕捉剤が、切断可能リンカーへカップリングされた固体支持体を含み、該切断可能リンカーがアルデヒドへカップリングされている、請求項97記載のキット。
  99. 前記タンパク質捕捉剤が、前記ペプチドのN末端へカップリングするように構成されている、請求項98記載のキット。
  100. 前記固体支持体がビーズである、請求項98記載のキット。
  101. 前記アルデヒドが、ピリジンカルバルデヒド(PCA)またはその誘導体である、請求項98記載のキット。
  102. (e)表面接着剤をさらに含む、請求項97記載のキット。
  103. 前記表面接着剤がアルキンまたはアジドを含む、請求項102記載のキット。
  104. 前記表面接着剤が、前記ペプチドのC末端へカップリングするように構成されている、請求項102記載のキット。
  105. 前記表面接着剤が接着する支持体をさらに含む、請求項102記載のキット。
  106. 前記支持体が顕微鏡用スライドである、請求項105記載のキット。
  107. 少なくとも1つのプロテアーゼ、少なくとも1つの消化試薬、および固体支持体ビーズをさらに含む、請求項91記載のキット。
  108. 以下の工程を含む、ペプチドを処理または分析するための方法：
    (a)支持体へカップリングされた第2反応基へカップリングするように構成されている第1反応基へカップリングされたアミノ酸を含む該ペプチドを提供する工程；
    (b)該第1反応基を該第2反応基へカップリングさせるために該ペプチドを該第2反応基と接触させ、それによって該ペプチドを該支持体へ固定する工程；
    (c)該ペプチドが該支持体へ固定されている状態で、該ペプチドのアミノ酸へカップリングされた標識からのシグナルを検出する工程；ならびに
    (d)該シグナルまたはその変化を使用して該アミノ酸を同定する工程。
  109. 前記第1反応基が、官能基を介して前記アミノ酸へカップリングされている、請求項108記載の方法。
  110. 前記官能基が、前記アミノ酸の反応性側鎖へカップリングされている、請求項109記載の方法。
  111. (a)が、前記第1反応基へカップリングされた官能基へ前記アミノ酸をカップリングすることをさらに含む、請求項108記載の方法。
  112. (a)において前記官能基が前記アミノ酸へのみカップリングする、請求項111記載の方法。
  113. 前記アミノ酸が、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、アルギニン、ヒスチジン、トレオニン、セリン、プロリン、グルタミン、およびトリプトファンからなる群より選択される、請求項108記載の方法。
  114. 前記第1反応基が、アジド、アルキン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、チオール、ジチオール、エステル、シクロオクテン、およびノルボルネンまたは活性化エステルからなる群より選択される、請求項108記載の方法。
  115. 前記エステルが活性化エステルである、請求項114記載の方法。
  116. 前記活性化エステルがEDC-カルボジイミドである、請求項115記載の方法。
  117. 前記第1反応基が、前記アジドまたは前記アルキンである、請求項114記載の方法。
  118. 前記第2反応基が、アルキン、アジド、チオール、ジチオール、シクロオクテン、アルケン、アルデヒド、ケトン、テトラジン、およびノルボルネンからなる群より選択される、請求項108記載の方法。
  119. 前記第2反応基が、前記アルキンまたは前記アジドである、請求項116記載の方法。
  120. 前記第1反応基および前記第2反応基がクリック反応を介してカップリングされる、請求項108記載の方法。
  121. 前記第2反応基がリンカーを介して前記支持体へカップリングされている、請求項108記載の方法。
  122. リンカーが、結合であるか、または置換されていてもよいアルキレンもしくは置換されていてもよいヘテロアルキレンである、請求項119記載の方法。
  123. 前記支持体がアレイである、請求項108記載の方法。
  124. 前記支持体がビーズである、請求項108記載の方法。
  125. 第1反応基へカップリングされた前記アミノ酸が、末端アミノ酸である、請求項108記載の方法。
  126. 第1反応基へカップリングされた前記アミノ酸が、内部アミノ酸である、請求項108記載の方法。
  127. (a)における前記アミノ酸が、(c)における前記標識へカップリングされた前記アミノ酸と同じである、請求項108記載の方法。
  128. (a)における前記アミノ酸が、(c)における前記標識へカップリングされた前記アミノ酸と異なる、請求項108記載の方法。
  129. (c)が、(b)の前に前記ペプチドの前記アミノ酸へ前記標識をカップリングすることをさらに含む、請求項108記載の方法。
  130. (c)が、(b)の後に前記ペプチドの前記アミノ酸へ前記標識をカップリングすることをさらに含む、請求項108記載の方法。
  131. 前記標識をレポーター部分へカップリングする、請求項108記載の方法。
  132. 前記レポーター部分が第3反応基または抗体へカップリングされている、請求項131記載の方法。
  133. 前記第3反応基または前記抗体が、(c)において前記ペプチドの前記アミノ酸へカップリングするように構成されている、請求項132記載の方法。
  134. (c)における前記ペプチドの前記アミノ酸が、末端アミノ酸である、請求項133記載の方法。
  135. (c)における前記ペプチドの前記アミノ酸が、内部アミノ酸である、請求項133記載の方法。
  136. 前記レポーター部分がリンカーへカップリングされており、(c)において前記抗体が前記ペプチドの前記アミノ酸へカップリングする、請求項131記載の方法。
  137. (c)の後に、前記ペプチドの末端からアミノ酸を除去するために十分な条件へ該ペプチドを供する工程
    をさらに含む、請求項108記載の方法。
  138. 前記条件がエドマン分解条件である、請求項137記載の方法。
  139. 前記ペプチドの複数のアミノ酸のシグナルパターンを同定するために(c)および(d)を1回または複数回繰り返す工程であって、該複数のアミノ酸の該シグナルパターンが(d)における前記シグナルまたはその変化を含む、工程
    をさらに含む、請求項108記載の方法。
  140. 前記複数のアミノ酸の前記シグナルパターンを使用して前記ペプチドの配列を得る工程
    をさらに含む、請求項139記載の方法。
  141. 第1反応基へカップリングされたアミノ酸を含むペプチド；および
    第2反応基へカップリングされた支持体
    を含む、ペプチドを処理または分析するためのシステムであって、
    該第1反応基が、該ペプチドを該支持体に隣接して固定するために該第2反応基へカップリングするように構成されている、前記システム。
  142. 前記ペプチドの配列に少なくとも部分的に基づいて前記標識を選択する工程
    をさらに含む、請求項43～85のいずれか一項記載の方法。
  143. 前記ペプチドが由来する生物のタイプに少なくとも部分的に基づいて前記標識を選択する工程
    をさらに含む、請求項43～85または142のいずれか一項記載の方法。
  144. 前記標識が、前記アミノ酸へカップリングするように構成されており、かつ、該アミノ酸のタイプが、前記生物のアミノ酸の少なくとも1%を含む、請求項143記載の方法。
  145. 前記標識が、前記アミノ酸へカップリングするように構成されており、かつ、該アミノ酸のタイプが、前記生物においてリジン、システイン、チロシン、ヒスチジン、グルタメート、アスパルテート、およびトリプトファンのうち最も豊富である、請求項143記載の方法。
  146. 前記レポーター部分が、前記ペプチドが由来した試料中で少なくとも12時間の25℃半減期を含む、請求項43～85および142～145のいずれか一項記載の方法。
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