CN108815537A - 一种肿瘤细胞靶向特异性荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种肿瘤细胞靶向特异性荧光探针及其制备方法与应用。该荧光探针含有多肽复合物和荧光分子相连接构成的部分；所述多肽复合物由靶向多肽、穿膜肽、含有键合基团的肽和核定位肽按任意顺序连接而成；所述多肽复合物通过所述键合基团与所述荧光分子共价连接；所述荧光分子为聚集诱导发光化合物。该荧光探针具有靶向定位于高表达αⅤβ3和/或CD13蛋白的肿瘤细胞，并将所携多肽、荧光分子定向转移至细胞内，具有核内荧光成像、良好的生物相容性、低毒等优点，可以实现对肿瘤等病理部位的靶向结合及荧光成像，也可用于药物载体。

Description

一种肿瘤细胞靶向特异性荧光探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学应用领域，更具体的，涉及一种肿瘤细胞靶向特异性荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
分子影像学是医学分子影像学领域中重要的组成部分，也是近年来医学研究的重点和热点。靶向成像剂是分子影像学的核心与基础，不仅能增强显影提高诊断，还能作为药物或基因载体。随着技术的发展，新型靶向载药成像试剂-即诊疗试剂的研制推动了分子成像和疾病治疗的发展，诊疗试剂的高效靶向运输不仅能让诊疗试剂精确定位于靶器官，还能使诊疗试剂在进入人体后，快速突破组织屏障达到相应的作用位点，有助于提高疾病的早期定性、定位诊断及靶向治疗监控等，尤其在肿瘤的早期识别、图像定位治疗、病变监控等方面具有极为广阔的应用前景。
靶向性和成像性是诊疗试剂的两大关键因素，其中靶向性多通过细胞膜表面的受体蛋白来实现。不同细胞系细胞膜上受体蛋白的种类和含量不尽相同是实现生物活性分子靶向的关键。靶向运输相当于在成像试剂和/或药物分子上安装智能导航系统，它让疾病诊断和治疗过程更准确、更高效、更安全。随着科学家们对癌症发病机制、侵袭和转移过程等方面的深入研究，越来越多的生物活性物质被用作靶向性配体，并成功被用于诊疗试剂的开发。常见的靶向配体有生物活性小分子、多肽、抗体、蛋白和核酸适配体等。与其他靶向分子相比，多肽配体具有可控性好、免疫反应少、肿瘤穿透性强和稳定性高等诸多优点。前期研究发现，多种多肽具有特异性靶向肿瘤细胞或肿瘤新生血管的特性，如RGD、cRGD、NGR、cNGQ、AP肽等。其中，cRGD和NGR(又称氨肽酶N)与内皮细胞及多种肿瘤细胞表面过量表达的αⅤβ3整合蛋白受体和CD13具有很强的结合能力，是抗癌药物载体较常用的两种靶向分子。
常见的分子成像技术主要有核素成像、磁共振成像和光学成像。其中，光学成像具有传统成像手段所没有的无创伤、实时、活体、特异、精细显像等优点，具有较高的时间/空间分辨率以及价格适中等特点。近年来，光学靶向分子探针的开发已经成为光学成像领域的研究热点，而荧光成像因操作方便、可标记靶点多、特异性强、灵敏度高、成像速度快、非侵入式的可视化成像等优点，逐渐成为光学靶向分子探针设计最常用的成像方式。在荧光检测和成像过程中，荧光探针的特异性、灵敏度、分辨率、光稳定性和标记效率等因素成为判断一个探针使用性能的标准。随着检测水平的上升和成像要求的提高，对高性能荧光探针的需求也越来越大。然而，传统的荧光材料在使用时受到聚集诱导淬灭效应(ACQ)的限制，它们的荧光强度会随着探针浓度和聚集程度的增加而逐渐减弱，当处于固态时其荧光几乎完全消失，因此，ACQ类型探针并不适用高浓度荧光检测与成像。2001年，香港科技大学唐本忠教授课题组开发了一类具有聚集诱导发光效应(AIE)的荧光探针，这类探针克服了传统ACQ类探针的劣势，在溶液状态时几乎没有荧光，但在不良溶剂或者聚集程度升高甚至固态时会发出很强的荧光。目前，AIE分子已被人们广泛应用于光电器件、功能材料、化学检测、生物传感和医学成像等领域，AIE探针在诊疗结合中的应用也得到飞快的发展，可以预见其将为癌症的精确诊断和高效治疗做出巨大的贡献。
理想的光学分子探针应具有如下特征：(1)与靶向分子受体有高特异性和亲和力；(2)分子量小，容易穿过机体内的生理屏障，并能反映体内靶向分子的数量及空间分布；(3)无不良及免疫排斥反应、性质稳定和血液清除速度快；(4)容易制备合成。小分子多肽类探针因其小分子量、低免疫性、高穿透性、高特异性、易合成和修饰等特点，可作为较理想的光学分子探针用于光学成像。在众多功能各异的小分子多肽中，穿膜肽和核定位肽是两类具有广泛应用前景的多肽。穿膜肽是一种具有强大运载潜能的短肽，可以将蛋白质、核酸片段等自身不易进入细胞内的生物活性物质通过无受体介导、无耗能的方式导入细胞，且在一定浓度范围内不会造成细胞损伤。目前，虽然对于穿膜肽进入活细胞的具体机制尚不完全清楚，但可以肯定其作为生物活性分子有效的细胞内转运工具，在细胞生物学、基因治疗、药物体内转运、临床药效评价以及细胞免疫学等研究领域，均具有诱人的应用前景。核定位多肽又称为核定位信号(nuclear localization signal，NLS)，是一类能够被细胞内核质转运蛋白所识别并与之特异性结合的具有特定氨基酸序列多肽，它们具有细胞核特异性转运、运载过程安全高效的优势，可以帮助实现在细胞质和细胞核之间进行物质运输，对于功能性生物分子进到细胞核发挥重要作用。众所周知，大部分临床抗癌药物通过损伤细胞核内DNA杀死癌细胞，因此，其作用靶点位于癌细胞的细胞核中。然而已有研究指出，由于细胞核膜强烈的屏蔽作用，细胞质中的药物分子只有不到1％能进入细胞核，并与DNA发生作用。因此，开发新型的直接细胞核靶向药物输运体系有望在亚细胞水平提高有效药物浓度，降低细胞微环境对药物活性的影响，为肿瘤的高效治疗提供更精确的靶向给药模式，展示出广阔的临床应用前景。
目前，荧光分子探针存在以下弊端：(1)由于传统荧光分子聚集诱导淬灭效应的存在，导致荧光穿透力有限，其穿透深度只能达到数毫米到数厘米，所以目前主要应用于小动物模型研究，临床应用主要限制在眼睛和表皮；(2)多采用单一靶标模式，不能准确反映和描述复杂生命现象，易出现假阳性或假阴性；(3)多没有细胞核靶向性，无法实现细胞核内成像。因此，从生物相容性和药物运输成本等方面综合考虑，多靶向性多肽和AIE分子用于荧光分子的开发和研究具有更大的应用前景和更高的实用价值。
发明内容
本发明解决了现有荧光成像技术中靶向特异性差、聚集导致的荧光淬灭及无法实现细胞核内成像的技术问题。
按照本发明的第一方面，提供了一种肿瘤细胞靶向特异性荧光探针，该荧光探针含有多肽复合物和荧光分子相连接构成的部分；所述多肽复合物由靶向多肽、穿膜肽、含有键合基团的肽和核定位肽按任意顺序连接而成；所述多肽复合物通过所述键合基团与所述荧光分子共价连接；所述荧光分子为聚集诱导发光化合物。
优选地，所述荧光分子为含有叠氮基团的聚集诱导发光化合物；所述键合基团为炔基；所述靶向多肽为氨基肽酶CD13的配体和整合素蛋白αⅤβ3的配体中的至少一种；所述氨基肽酶CD13的配体的氨基酸序列为SEQ ID No.1；所述整合素蛋白αⅤβ3的配体的氨基酸序列为RGD；所述穿膜肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2；所述核定位肽的氨基酸序列为SEQID No.3。
优选地，所述氨基肽酶CD13的配体、穿膜肽、含有键合基团的肽、核定位肽和整合素蛋白αⅤβ3的配体依次连接。
优选地，所述荧光分子为1-(4-叠氮丁基)-4-(2-四苯乙烯乙烯基)-吡啶，结构式如式I所示；
优选地，所述含有键合基团的肽为含有丙炔基的三聚甘氨酸。
按照本发明的另一方面，提供了一种肿瘤细胞靶向特异性荧光探针的制备方法，包含以下步骤：
(1)将多肽复合物和点击反应催化剂溶解后，得到混合溶液；
(2)向步骤(1)得到的混合溶液中加入含有叠氮基团的聚集诱导发光化合物，在惰性气体保护下，25℃-45℃下搅拌反应12h-48h；使所述聚集诱导发光化合物上的叠氮基团与所述多肽复合物上的炔基发生点击反应，生成肿瘤细胞靶向特异性荧光探针；所述多肽复合物由靶向多肽、穿膜肽、含有炔基基团的肽和核定位肽按任意顺序连接而成。
优选地，所述聚集诱导发光化合物为1-(4-叠氮丁基)-4-(2-四苯乙烯乙烯基)-吡啶，结构式如式I所示；
优选地，步骤(1)所述的催化剂为亚铜离子；所述亚铜离子的浓度为0.1μM-0.3μM；步骤(1)所述的多肽复合物的浓度为0.5μM-1μM；步骤(2)所述含有叠氮基团的聚集诱导发光化合物的浓度为2μM-3μM。
优选地，所述含有炔基基团的肽为含有丙炔基的三聚甘氨酸；所述靶向多肽为氨基肽酶CD13的配体和整合素蛋白αⅤβ3的配体中的至少一种；所述氨基肽酶CD13的配体的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述氨基肽酶CD13的配体用于靶向新生的血管内皮细胞或癌细胞表面表达的氨基肽酶CD13蛋白；所述整合素蛋白αⅤβ3的配体的氨基酸序列为RGD，所述整合素蛋白αⅤβ3的配体用于靶向癌细胞表面表达的整合素蛋白αⅤβ3；所述穿膜肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2；所述核定位肽的氨基酸序列为SEQ ID No.3。
按照本发明的另一方面，提供了所述的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针在制备肿瘤细胞靶向荧光成像试剂、肿瘤细胞示踪试剂、肿瘤细胞核成像试剂或药物载体方面的应用。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的有益效果：
(1)本发明所得的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针具有靶向定位于高表达αⅤβ3和/或CD13蛋白的肿瘤细胞，并将所携多肽、荧光分子定向转移至细胞内，具有核内荧光成像、良好的生物相容性、低毒等优点，可以实现对肿瘤等病理部位的靶向结合及荧光成像，也可用于药物载体。
(2)本发明选用了生物兼容性较好的多肽作为靶标的配体及成像材料载体，具有靶标定位更精确的特性，同时具备核定位特性，穿膜肽的引入使得成像材料甚至药物类的运载更安全高效；相对市场同类产品，本发明成本低廉，靶向性体内代谢更快；本发明所述的荧光剂具有聚集诱导发光效应，更适合用于高浓度长时间的体内成像；同时对肿瘤细胞的生长具有低毒性。
附图说明
图1为肿瘤细胞靶向特异性荧光探针TCNTP合成路线图。
图2为多肽复合物TCNT高效液相色谱图。
图3为多肽复合物TCNT质谱图。
图4为聚集诱导发光化合物PyTPE和肿瘤细胞靶向特异性荧光探针TCNTP高效液相色谱图。
图5为肿瘤细胞靶向特异性荧光探针TCNTP质谱图。
图6为多肽复合物TCNT、聚集诱导发光化合物PyTPE和肿瘤细胞靶向特异性荧光探针TCNTP在不同测试条件下的光学性能表征图；其中图6(a)为TCNTP、PyTPE和TCNT的紫外可见吸收光谱图；图6(b)为不同浓度的TCNTP与10mg/mL整合素αⅤβ3孵育30min后的荧光强度变化图；图6(c)为TCNTP(10μM)与不同浓度整合素αⅤβ3孵育30min后的荧光光谱图；图6(d)为TCNTP(10μM)与不同浓度CD13孵育30min后的荧光光谱图；图6(e)TCNTP(10μM)与蛋白共孵育30min的荧光光谱图，处理方法由上至下分别如下：TCNTP(10μM)先加30μg/mL的CD13，再加30μg/mL的整合素αⅤβ3；TCNTP(10μM)先加30μg/mL的整合素αⅤβ3，再加30μg/mL的CD13；TCNTP(10μM)与30μg/mL的CD13单独孵育，TCNTP(10μM)与30μg/mL的整合素αⅤβ3单独孵育；图6(f)为TCNTP检测不同种类的蛋白质的荧光强度变化图。
图7为TCNTP和PyTPE处理细胞的原位、实时共聚焦显微镜观察；图7(a)、图7(b)、图7(c)和图7(d)分别为MDA-MB-231细胞(方框)和A375细胞(圆圈)与TCNTP(3.0μM)孵育0分钟、5分钟、15分钟和25分钟的荧光成像图；图7(e)、图7(f)、图7(g)和图7(h)分别为MDA-MB-231细胞(方框)和A375细胞(圆圈)与PyTPE(3.0μM)孵育0分钟、5分钟、15分钟和25分钟的荧光成像图；图7(i)、图7(j)、图7(k)和图(l)分别HT-1080细胞(方框)和A375细胞(圆圈)与TCNTP(3.0μM)孵育0分钟、5分钟、15分钟和25分钟的荧光成像图；图7(m)、图7(n)图7(o)和图7(p)分别为HT-1080细胞(方框)和A375细胞(圆圈)与PyTPE(3.0μM)孵育0分钟、5分钟、15分钟和25分钟的荧光成像图。
图8为同时用TCNTP和Hoechst33258处理4小时后细胞核荧光成像图；其中图8(a)为同时用TCNTP和Hoechst33258处理MDA-MB-231细胞4小时后细胞核荧光成像图；图8(b)为同时用TCNTP和Hoechst33258处理HT-1080细胞4小时后细胞核荧光成像图；图8(c)为同时用TCNTP和Hoechst33258处理A375细胞4小时后细胞核荧光成像图。
图9为TCNTP和Hoechst33258处理12小时后细胞核成像观察；其中图9(a)为同时用TCNTP和Hoechst33258处理MDA-MB-231细胞12小时后细胞核荧光成像图；图9(b)为同时用TCNTP和Hoechst33258处理HT-1080细胞12小时后细胞核荧光成像图；图9(c)为同时用TCNTP和Hoechst33258处理A375细胞12小时后细胞核荧光成像图。
图10为TCNTP长时间稳定荧光成像图；图10(a)、图10(b)和图10(c)分别为用3.0MTNCTP与A375细胞在相同条件下孵育4h后，继续孵育1天、3天、5天后传代细胞的激光共聚焦成像图；图10(d)、图10(e)和图10(f)分别为用3.0M Hoechst33258分别与A375细胞在相同条件下孵育4h后，继续孵育1天、3天、5天后传代细胞的激光共聚焦成像图；图10(g)和(h)分别为荧光强度和细胞数量的统计结果。
图11为TCNTP具有细胞内荧光保留性图片；其中图11(a)为TCNTP染色的A375细胞与未染色细胞的实验示意图；图11(d)为Hoechst33258染色的A375细胞与未染色细胞的实验示意图；图11(b)和图11(c)分别为TCNTP染色后局部放大图中两种细胞的相对平均荧光强度；图11(e)和图11(f)分别为Hoechst33258染色后局部放大图中两种细胞的相对平均荧光强度；
图12(a)为不同浓度(1.0μM,5.0μM和10.0μM)的PyTPE、Hoechst33258和TCNTP处理48小时对MDA-MB-231细胞增殖的影响；图12(b)为不同浓度(1.0μM,5.0μM和10.0μM)的PyTPE、Hoechst33258和TCNTP处理48小时对HT-1080细胞增殖的影响；图12(c)为不同浓度(1.0μM,5.0μM和10.0μM)的PyTPE、Hoechst33258和TCNTP处理48小时对A375细胞增殖的影响；图12(d)为不同浓度(1.0μM,5.0μM和10.0μM)的PyTPE、Hoechst33258和TCNTP处理48小时对HLF细胞增殖的影响。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
本发明的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针制备及鉴定所采用的技术方案如下：首先将几种具有配体靶向性的功能性多肽通过合理的设计进行有序组合，形成功能性多肽复合物TCNT(氨基酸序列为CNGRC-RRRR-GPraG-RRRRK-RGD-NH2)，其中CNGRC肽是靶向氨基肽酶N的多肽片段，可以靶向新生的血管内皮细胞或癌细胞表面高表达的CD13蛋白；KRRRR肽是一种可以被核运输蛋白识别的最小多肽片段，可以实现大分子的核内运输；GPraG肽是一种含有丙炔基的三聚甘氨酸片段，可以提供炔基与聚集诱导发光化合物PyTPE上的叠氮基团发生“叠氮-炔基”点击反应，实现二者的有机结合；RRRR肽是穿膜肽片段，可以将细胞外大分子物质快速运输到细胞内；RGD肽是靶向整合素蛋白的最小多肽片段，可以靶向癌细胞表面高表达的整合素αⅤβ3。
接着，通过点击反应将功能性多肽复合物TCNT与聚集诱导发光化合物PyTPE有机结合，形成产物肿瘤细胞靶向特异性荧光探针TCNTP。进一步的，本发明提供肿瘤细胞靶向特异性荧光探针TCNTP的表征和性能测试方法。具体的，通过高分辨质谱图鉴定产物是否为理论产物，通过在溶液中将TNCTP与靶标蛋白结合测试其光学性能。根据实验设计原理，TCNTP在未与靶标结合时荧光较弱，一旦与靶标结合出现聚集，则荧光大大增强。具体的，在溶液中将TCNTP与靶标和/或非靶标物质结合，在不存在靶标分子或存在非靶标分子时，荧光较弱；当TCNTP与单靶标分子结合时，荧光增强；当TCNTP与双靶标分子结合时，荧光进一步增强。
进一步的，本发明提供上述方法制备的荧光剂在肿瘤细胞中的应用。具体的，选用三种不同的肿瘤细胞系A375，HT1080，MDA-MB-231，其中A375细胞是αⅤβ3和CD13双高表达细胞系，MDA-MB-231是αⅤβ3高表达细胞系，HT1080细胞则是CD13高表达细胞系，在TCNTP处理后用共聚焦显微镜观察细胞内的荧光强度、定位、荧光稳定性等特质。更具体的，TCNTP的使用浓度是3.0μM，通过单独或者两种靶标细胞共培养(如将A375和HT1080共培养)的方式，证明TCNTP对双靶标细胞系的选择性、核定位性(与商业核染料Hoechst33258共染确定)、荧光稳定性。在肿瘤细胞中的具体测定方法为：
(1)在共聚焦培养皿中接种1×105个细胞，过夜使其贴壁；
(2)加入PyTPE和Hoechst33258为一组、加入TCNTP(3.0μM)和Hoechst33258作为一组处理细胞；
(3)处理结束后PBS洗涤细胞3次，共聚焦显微镜观察。
实施例1：肿瘤细胞双靶向特异性荧光探针TCNTP的合成及纯化
TNCTP的合成路线图如图1所示，具体实施方案如下：
(1)称取3mg PyTPE，溶于0.5mL二甲基亚砜，PyTPE终浓度6.0μM；
(2)称取10.0mg TCNT、2.4mg抗坏血酸钠和1.0mg溴化亚铜，溶于0.5mL纯水，形成混合溶液；
(3)将(2)加入(1)中，在氮气保护下反复脱气三次，35℃下搅拌反应48h。
反应完成后用半制备液相色谱分离，产物经冷冻干燥得到红色固体粉末7.5mg，产率70.0％。
原料TCNT的高效液相色谱和质谱图分别见图2和图3。由图3可以得知，TCNT带3个电荷、4个电荷、5个电荷和6个电荷的理论分子量分别为821.7839、616.5899、493.4735和411.3959，采用正离子模式高分辨质谱实测的分子量分别为822.1171、616.5899、493.6774和411.5652，即TCNT带四种不同电荷模式的理论值与测定值相近，证明TCNT被成功合成出来。
TCNTP纯化：将TCNTP反应液溶入乙腈/水溶液进行倍数稀释，进样体积为1.0mL，检测波长为254nm，以含0.1％三氟乙酸的纯水溶液为流动相A，含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液为流动相B，流动相B以20％到95％的比例变化进行梯度洗脱，洗脱速度为2.0mL/min，分离时间为40min。
产物经分析型液相色谱仪分析纯度为96％。高效液相色谱结果见图5。HRMS(ESI)m/z:[M+3H]3+/3calcd for 999.5407；found,999.5478.[M+4H]4+/4calcd for 749.9075；found,749.9139；[M+5H]5+/5calcd for 600.1276；found,600.1340；[M+6H]6+/6calcd for500.2743；found,500.4466。
TCNTP带2个电荷、3个电荷、4个电荷、5个电荷和6个电荷的理论分子量分别为1498.8072、999.5407、749.9075、600.1276和500.2743，采用正离子模式高分辨质谱实测的分子量分别为11498.8122、999.5478、749.9139、600.1340和500.4466(图5)，即TCNTP带五种不同电荷模式的理论值与测定值相近，证明TCNTP合成成功。
图4为聚集诱导发光化合物PyTPE和肿瘤细胞靶向特异性荧光探针TCNTP高效液相色谱图。从图4可以得知，PyTPE和TCNTP出峰单一，说明均为纯态。此外，TCNTP的出峰时间比PyTPE的出峰时间明显减小，证明TCNT与PyTPE成功偶联。
实施例2：肿瘤细胞双靶向特异性荧光探针TCNTP紫外可见吸收光谱和荧光光谱
将TCNTP溶于含1％DMSO的水溶液中，测试前先将探针分子与靶标蛋白在37℃下孵育30min。测试的体积为200μL，测试终浓度为10μM，测试温度为25℃，激发波长为405nm。
图6表明，本发明所述荧光剂在溶液中具有以下特点：
(1)由图6(a)可知，TCNTP(10μM)在溶液中呈淡黄色且基本无荧光，吸收光谱在小于300nm的紫外区和405nm处有吸收带。由图6(b)可知，10μM的TCNTP与10mg/mL的整合素αⅤβ3具有最强的荧光强度，因此被选为后续实验的最佳浓度。
(2)由图6(c)可知，随着靶标分子αⅤβ3的加入及浓度的增加，荧光光谱在560nm处荧光逐渐增加。由图6(d)可知，随着靶标分子CD13的加入及浓度的增加，荧光光谱在560nm处荧光逐渐增加。由图6(e)可知，TCNTP与CD13结合后的荧光强度增加幅度比αⅤβ3更大。当将αⅤβ3和CD13按照不同的顺序加入TCNTP溶液中时，先加CD13组荧光更强，证明TCNTP对CD13靶向性更强。
(3)由图6(f)可知，当用相同浓度的TCNTP与不同种类的蛋白质孵育时，只有整合素αⅤβ3和CD13可以使TCNTP的荧光强度明显增加，即TCNTP靶向性明确。
实施例3：肿瘤细胞双靶向特异性荧光探针TCNTP在活体细胞系中的应用
如上所述的制备方法所得荧光探针的应用均采用共聚焦成像技术检测，并与聚集诱导发光化合物PyTPE的效果对比。本发明所述TCNTP在活体细胞胞系中具有以下特点：
(1)TCNTP在具有双靶标的肿瘤细胞系中选择性快速成像。
将肿瘤细胞A375&HT1080、A375&MDA-MB-231以1×105/孔的密度两两配比接种于共聚焦培养皿中，贴壁过夜后将用培养基配制成3.0μM的TCNTP或3.0μM的PyTPE溶液分别加入到各孔中，于试剂加入后的5，15，25分钟共聚焦原位观察细胞荧光强度的变化。黄色通道的激发波长为405nm，发射波长收光范围是490-575nm。
结果如图7所示，图7(a)、图7(b)、图7(c)和图7(d)分别为MDA-MB-231细胞(方框)和A375细胞(圆圈)与TCNTP(3.0μM)孵育0分钟、5分钟、15分钟和25分钟的荧光成像图；图7(e)、图7(f)、图7(g)和图7(h)分别为MDA-MB-231细胞(方框)和A375细胞(圆圈)与PyTPE(3.0μM)孵育0分钟、5分钟、15分钟和25分钟的荧光成像图；图7(i)、图7(j)、图7(k)和图(l)分别HT-1080细胞(方框)和A375细胞(圆圈)与TCNTP(3.0μM)孵育0分钟、5分钟、15分钟和25分钟的荧光成像图；图7(m)、图7(n)图7(o)和图7(p)分别为HT-1080细胞(方框)和A375细胞(圆圈)与PyTPE(3.0μM)孵育0分钟、5分钟、15分钟和25分钟的荧光成像图。由图7(a)、图7(b)、图7(c)和图7(d)可以得出，共培养的MDA-MB-231&A375细胞中，MDA-MB-231细胞(方框)只有很微弱的黄色荧光其荧光强度增长非常缓慢；但是A375细胞(圆圈)在5min内就有很强的黄色荧光出现，其荧光强度随着孵育时间的延长而快速增强，说明TCNTP对整合素αⅤβ3和CD13双高表达的A375细胞系具有更强的选择性。同样地，图7(i)、图7(j)、图7(k)和图(l)可以得出，共培养的HT1080&A375细胞中，HT1080细胞(方框)只有很微弱的黄色荧光，其荧光强度增长非常缓慢；但是A375细胞(圆圈)在5min内就有很强的黄色荧光出现，其荧光强度随着孵育时间的延长而快速增强，说明TCNTP对整合素αⅤβ3和CD13双高表达的A375细胞系具有更强的选择性。作为对照实验，由图7(e)、图7(f)、图7(g)和图7(h)可以得出，3.0μM的PyTPE对共培养的MDA-MB-231&A375细胞中的细胞并没有选择性差异。同样地，由图7(m)、图7(n)图7(o)和图7(p)可知，3.0μM的PyTPE对共培养的HT1080&A375细胞中的细胞并没有选择性差异。
(2)TNCTP对双靶标细胞系具有细胞核内成像功能
将1×105个HT1080、MDA-MB-231或A375细胞接种于共聚焦培养皿中，过夜培养后加入3.0μM TCNTP，处理4小时后在共聚焦显微镜上检测荧光。Hoechst 33258(商业染核试剂)在荧光TCNTP处理结束前30min加入共聚焦皿中。黄色通道通道的激发波长为405nm，发射波长收光范围是490-575nm，蓝色通道通道的激发波长为405nm，发射波长收光范围是425-485nm。结果如图8所示，由图8(c)可以得知，双靶向的A375细胞中出现了明显的TCNTP荧光，该荧光与Hoechst 33258基本完全重合；由图8(a)和图8(b)可知，单靶向的细胞无论在荧光强度还是在于Hoechst33258荧光的共定位上都要弱很多。当作用时间延长至12h，虽然MDA-MB-231细胞(图9a)和HT-1080细胞(图9b)中细胞核区域的黄色荧光有所增强，但与蓝色荧光的共定位较少。只有A375细胞的细胞核内二者的荧光完全重合(图9c)。利用分析软件分析三种细胞中蓝色荧光和黄色荧光的共定位系数发现，A375细胞共定位最多，证明TCNTP进入A375细胞的细胞核效率更高。
(3)TCNTP在活细胞中具有的长时间标记能力
常用的细胞核染料，如Hoechst33258等需要与DNA结合才能产生荧光，因此会一定程度上干扰DNA复制和表达，具有一定的细胞毒性。将TCNTP(3.0μM)或者Hoechst33258(3.0μM)染色的A375细胞染色4小时后，PBS洗涤去除多余的染料，再继续培养1，3，5天(在培养的第2，4和6天进行传代)后用共聚焦显微镜观察荧光。结果如图10所示，由图10(a)、图10(b)、图10(c)和图10(g)可以得知，经3天和5天培养后，TCNTP染色的细胞仍具有很强的荧光，约为初始荧光强度的81％；由图10(d)、图10(e)、图10(f)和图10(g)可以得知，经3天和5天培养后，Hoechst33258染色的细胞荧光强度随传代次数的增加逐渐减弱，5天后荧光强度只有初始荧光强度的6％，说明TCNTP荧光非常稳定，可长时间稳定标记细胞，并可以随分裂分配至子代细胞中。此外，由图10(h)可以得知，与Hoechst33258相比，TCNTP处理后的细胞数量明显较多，即其细胞毒性较小。
(4)TCNTP的活细胞内荧光保留性
将经3.0μM TCNTP或3.0μM Hoechst33258染色4小时的A375细胞消化后分别与MDA-MB-231或者HLF细胞系共同培养24小时后共聚焦显微镜观察细胞染色情况，结果如图11所示。由图11(a)、图11(b)和图11(c)可以得知，24小时培养后，TCNTP染色的A375细胞仍有很强的荧光，MDA-MB-231和人胚肺成纤维细胞(HLF细胞)仅出现微弱的荧光；由图11(d)、图11(e)和图11(f)可以得知，Hoechst33258染色的A375细胞会使邻近的MDA-MB-231和HLF细胞强染色，说明TNCTP具有很好的细胞内荧光保留性。
(5)TCNTP具有较低的细胞毒性
将A375、MDA-MB-231、HT1080细胞以及HLF细胞以3×104细胞/孔的密度接种在96孔板中，过夜培养后分别加入PyTPE(1.0μM、5.0μM、10.0μM)、Hoechst 33258(1.0μM、5.0μM、10.0μM)和TCNTP(1.0μM、5.0μM、10.0μM)，处理48h小时候加入MTT试剂，在570nm下检测细胞吸光值。结果如图12所示，PyTPE和TCNTP在10.0μM的高浓度下仍有80％以上的细胞存活率，而Hoechst33258随着浓度的升高细胞存活率明显降低，证明TCNTP细胞毒性较小。
综上，本发明所构思的肿瘤双靶向特异性荧光探针综合运用了新型的聚集诱导发光化合物、双靶向性多肽以及具有大分子膜内和核内运载能力的穿膜肽，该探针能够靶向定位到相应细胞，并依序被运输到细胞质和核内，实现对高表达CD13和/或αⅤβ3癌症标志分子的细胞定位和成像功能。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
<120> 一种肿瘤细胞靶向特异性荧光探针及其制备方法与应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Asn Gly Arg Cys
1 5
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Arg Arg Arg Arg
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Arg Arg Arg Lys
1 5

Claims (10)

1.一种肿瘤细胞靶向特异性荧光探针，其特征在于，该荧光探针含有多肽复合物和荧光分子相连接构成的部分；所述多肽复合物由靶向多肽、穿膜肽、含有键合基团的肽和核定位肽按任意顺序连接而成；所述多肽复合物通过所述键合基团与所述荧光分子共价连接；所述荧光分子为聚集诱导发光化合物。
2.如权利要求1所述的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针，其特征在于，所述荧光分子为含有叠氮基团的聚集诱导发光化合物；所述键合基团为炔基；所述靶向多肽为氨基肽酶CD13的配体和整合素蛋白αⅤβ3的配体中的至少一种；所述氨基肽酶CD13的配体的氨基酸序列为SEQ ID No.1；所述整合素蛋白αⅤβ3的配体的氨基酸序列为RGD；所述穿膜肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2；所述核定位肽的氨基酸序列为SEQ ID No.3。
3.如权利要求2所述的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针，其特征在于，所述氨基肽酶CD13的配体、穿膜肽、含有键合基团的肽、核定位肽和整合素蛋白αⅤβ3的配体依次连接。
4.如权利要求1所述的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针，其特征在于，所述荧光分子为1-(4-叠氮丁基)-4-(2-四苯乙烯乙烯基)-吡啶，结构式如式I所示；
5.如权利要求1所述的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针，其特征在于，所述含有键合基团的肽为含有丙炔基的三聚甘氨酸。
6.一种肿瘤细胞靶向特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)将多肽复合物和点击反应催化剂溶解后，得到混合溶液；
(2)向步骤(1)得到的混合溶液中加入含有叠氮基团的聚集诱导发光化合物，在惰性气体保护下，25℃-45℃下搅拌反应12h-48h；使所述聚集诱导发光化合物上的叠氮基团与所述多肽复合物上的炔基发生点击反应，生成肿瘤细胞靶向特异性荧光探针；所述多肽复合物由靶向多肽、穿膜肽、含有炔基基团的肽和核定位肽按任意顺序连接而成。
7.如权利要求6所述的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，所述聚集诱导发光化合物为1-(4-叠氮丁基)-4-(2-四苯乙烯乙烯基)-吡啶，结构式如式I所示；
8.如权利要求6所述的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的催化剂为亚铜离子；所述亚铜离子的浓度为0.1μM-0.3μM；步骤(1)所述的多肽复合物的浓度为0.5μM-1μM；步骤(2)所述含有叠氮基团的聚集诱导发光化合物的浓度为2μM-3μM。
9.如权利要求6所述的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针的制备方法，其特征在于，所述含有炔基基团的肽为含有丙炔基的三聚甘氨酸；所述靶向多肽为氨基肽酶CD13的配体和整合素蛋白αⅤβ3的配体中的至少一种；所述氨基肽酶CD13的配体的氨基酸序列为SEQ ID No.1，所述氨基肽酶CD13的配体用于靶向新生的血管内皮细胞或癌细胞表面表达的氨基肽酶CD13蛋白；所述整合素蛋白αⅤβ3的配体的氨基酸序列为RGD，所述整合素蛋白αⅤβ3的配体用于靶向癌细胞表面表达的整合素蛋白αⅤβ3；所述穿膜肽的氨基酸序列为SEQ ID No.2；所述核定位肽的氨基酸序列为SEQ ID No.3。
10.如权利要求1-5所述的肿瘤细胞靶向特异性荧光探针在制备肿瘤细胞靶向荧光成像试剂、肿瘤细胞示踪试剂、肿瘤细胞核成像试剂或药物载体方面的应用。
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