CN113429460A - 一种用于细胞膜成像的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于细胞膜成像的荧光探针及其制备方法和应用。该荧光探针的结构式由三部分组成：多肽RGD、四苯乙烯衍生物MTY和修饰了棕榈酸的多肽Pal‑RRRR，通过配体–受体相互作用将RGD与细胞膜上的整合素蛋白结合，通过疏水相互作用将Pal插入细胞膜上的脂质中，通过静电相互作用将RRRR与带负电荷的细胞膜相结合，从而实现对细胞膜进行精准牢固成像。该荧光探针具有光稳定性高、荧光亮度高、非渗透性高等特点，可进行快速成像；而且在实际应用中表现出明显的聚集诱导发光现象和优异的抗光漂白性能，可实现长时间的荧光成像，还具有制备工艺简单、操作方便和成本低廉的特点，在生物医学成像领域中有着巨大的应用前景。

Description

一种用于细胞膜成像的荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及分子探针应用技术领域，尤其涉及一种用于细胞膜成像的荧光探针及其制备方法与应用。

背景技术

荧光成像具有成本低、生物相容性好和灵敏度高等优点而广泛应用于生物医学成像领域。细胞膜位于细胞的最外层，是保护细胞免受外部损伤的屏障。同时，细胞膜在许多生化过程中发挥着重要作用，如维持细胞内环境的稳定、控制细胞与周围环境之间的物质运输、协调能量转换、调节信号转导等。目前，细胞膜荧光标记是细胞膜研究中最简单和最重要的手段，它不仅可以直观地观察细胞膜的结构，还可以动态追踪其变化。

目前常用的荧光探针主要通过配受体相互作用、疏水相互作用、静电作用等标记细胞膜。例如，RGD可以与细胞膜整合素α_vβ₃通过配受体作用结合，常常用于药物的靶向运输，它也被用于细胞膜的标记。但是，利用核酸适配体或类似RGD的靶向多肽与细胞膜上的受体相互作用，虽然赋予了探针细胞膜成像的特异性，但是这些探针很容易被细胞内化和很难实现长时间成像观察。利用棕榈酸、胆固醇等疏水分子嵌入细胞膜，但是探针缺乏特异性。此外，由于细胞膜带负电，利用探针带正电的特性可以增强探针与细胞膜的结合力。然而，由于细胞膜的复杂和动态性质，导致仅利用一种或两种弱相互作用力的传统荧光探针在标记细胞膜时专一性差且稳定性差。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的上述不足，提出一种用于细胞膜成像的荧光探针及其制备方法和应用。

为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

本发明提供的一种用于细胞膜成像的荧光探针，所述荧光探针包括多肽聚集体，其化学结构式为：

本发明还提供上述用于细胞膜成像的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

步骤S1，将纯多肽RP-C和巯基还原剂三(2-羧乙基)膦用磷酸缓冲盐溶液溶解，然后在氮气保护下室温反应；

步骤S2，加入具有聚集诱导发光效应的分子四苯乙烯衍生物，搅拌反应；

步骤S3，通过纯化，得到多肽聚集体。

进一步的，步骤S1中的所述磷酸缓冲盐溶液的pH为7.4，反应时间为不低于1小时。

进一步的，步骤S2中的所述搅拌反应的时间为不低于24小时。

进一步的，步骤S3中的所述纯化的方法利用高效液相色谱仪进行纯化。

本发明还提供上述用于细胞膜成像的荧光探针的应用，所述荧光探针应用于pH6.5～7.4环境下的癌细胞膜的成像。

进一步的，所述癌细胞包括前列腺癌细胞。

本发明提供的技术方案带来的有益效果是：

(1)本发明提供的一种用于细胞膜成像的荧光探针，该荧光探针的结构式由三部分组成：与细胞膜特异性整合素α_vβ₃相结合的多肽RGD、用于荧光成像的具有聚集诱导发光性能的四苯乙烯衍生物MTY和修饰了棕榈酸的多肽Pal-RRRR，本发明的荧光探针通过配体–受体相互作用将RGD与细胞膜上的整合素αvβ3结合，通过疏水相互作用将Pal插入细胞膜上的脂质中，通过静电相互作用将RRRR与带负电荷的细胞膜相结合，从而实现整合素αvβ3高表达的癌细胞细胞膜的精准标记，进而对细胞膜进行精准牢固成像，解决了传统荧光探针标记细胞膜时专一性差且稳定性差的问题；该荧光探针还具有光稳定性高、荧光亮度高、非渗透性高等特点，可以进行快速成像；

(2)本发明提供的一种用于细胞膜成像的荧光探针的制备方法，该方法具有工艺简单、操作方便和成本低廉等特点；

(3)本发明提供的多肽聚集体荧光探针表现出明显的聚集诱导发光现象，克服了传统荧光探针其本身所具有的聚集荧光淬灭效应；同时具有优异的抗光漂白性能，可以实现长时间的荧光成像，其合成步骤简单、原料廉价易得，在生物医学成像领域中有着巨大的应用前景。

附图说明

图1为本发明的一种用于细胞膜成像的荧光探针的合成路线图；

图2为本发明实施例1提供的多肽聚集体荧光探针的质谱表征图；

图3为本发明实施例1提供的多肽聚集体荧光探针在不同水含量的荧光光谱图；

图4为本发明实施例1提供的多肽聚集体荧光探针染色前列腺癌细胞PC3的共聚焦显微照片图；

图5为本发明实施例1提供的多肽聚集体荧光探针染色准确性试验的共聚焦显微照片图；

图6为本发明实施例1提供的多肽聚集体荧光探针染色牢固性试验的共聚焦显微照片图；

图7为本发明实施例1提供的多肽聚集体荧光探针生物兼容性试验的结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图和实施例对本发明实施方式作进一步地描述。

如图1所示，本发明提供的一种用于细胞膜成像的荧光探针，荧光探针包括多肽聚集体，其化学结构式为：

该多肽聚集体荧光探针的结构式由三部分组成：与细胞膜特异性整合素α_vβ₃相结合的多肽RGD、用于荧光成像的具有聚集诱导发光性能的四苯乙烯衍生物MTY和修饰了棕榈酸的多肽Pal-RRRR，本发明的荧光探针通过疏水相互作用将Pal插入细胞膜上的脂质中，通过静电相互作用将RRRR与带负电荷的细胞膜相结合，从而实现整合素α_vβ₃高表达的癌细胞细胞膜的精准标记，进而对细胞膜进行精准牢固成像，解决了传统荧光探针标记细胞膜时专一性差且稳定性差的问题；该荧光探针还具有光稳定性高、荧光亮度高、非渗透性高等特点，可以进行快速成像。

另外，本发明还提供了一种用于细胞膜成像的荧光探针的制备方法，包括下述步骤：

步骤S1：将纯多肽RP-C和巯基还原剂三(2-羧乙基)膦用磷酸缓冲盐溶液溶解，然后在氮气保护下室温反应；；

步骤S2：加入具有聚集诱导发光效应的分子四苯乙烯衍生物，搅拌反应；；

步骤S3：通过纯化，得到多肽聚集体。

步骤S1将纯多肽RP-C和巯基还原剂三(2-羧乙基)膦用磷酸缓冲盐溶液溶解，三(2-羧乙基)膦可以防止纯多肽RP-C的巯基氧化成二硫键，磷酸缓冲盐溶液可以防止后续加入的四苯乙烯衍生物的马来酰亚胺基团开环；然后为了更加有效地避免巯基被氧化，反应在氮气保护下反应；由于步骤对温度没有要求，室温反应即可，步骤S2的反应是利用巯基与马来酰亚胺的迈克尔加成来合成产物多肽聚集体的，由于步骤S2得到的是含有大量杂质的粗产物多肽聚集体，所以粗产物需要通过高效液相色谱纯化，得到高纯度的多肽聚集体。

为了防止四苯乙烯衍生物的马来酰亚胺基团开环，步骤S1中的磷酸缓冲盐溶液的pH可以为7.4，反应时间为不低于1小时，目的是充分保证巯基不被氧化成二硫键，使得步骤S2的反应顺利进行。

为了进一步保证步骤S2的反应充分进行，反应过程中伴随的搅拌时间不低于24小时。

对步骤S2得到的粗产物多肽聚集体纯化的方法有多种，在这里不做限定，在本实施例中，选用色谱仪进行纯化，这样做可以保证所得到的多肽聚集体是单一化合物，从而保证后续实验结果的可靠性。

本发明提供的制备方法工艺简单、操作方便且成本低廉。

进一步的，本发明还提供了一种用于细胞膜成像的荧光探针的应用，该荧光探针可应用于pH 6.5～7.4环境下的癌细胞膜的成像，在本实施例中，该荧光探针应用于前列腺癌细胞的细胞膜成像，该荧光探针表现很好的生物兼容性，明显的聚集诱导发光现象和优异的抗光漂白性能，对前列腺癌细胞的细胞膜的牢固标记长达4小时。

下面结合实施例对本发明提供一种用于细胞膜成像的荧光探针及其制备方法与应用进行详细说明。

实施例1：

1、多肽聚集体荧光探针的合成：

在100mL圆底烧瓶中加入MTY(9.0mg,20μmol),RP-C(17.4mg,10μmol),三(2-羧乙基)膦(1.4mg,5μmol)，二甲基亚砜2mL，PBS缓冲液2mL，在氮气氛围保护下，室温搅拌反应24小时，得到粗产物，经高效液相色谱纯化后冷冻干燥，得到产物多肽聚集体荧光探针(17.5mg,产率:80％)。

上述制得的多肽聚集体荧光探针经高分辨质谱表征，证实了该探针的结构，其质谱表征如图2所示。

HRMS(ESI)m/z:[M+3H]³⁺计算值：730.7507，实测值：731.0847；[M+4H]⁴⁺计算值：548.3149，实测值：548.5655；[M+5H]⁵⁺计算值：438.8533，实测值：439.0538；[M+6H]⁶⁺计算值：365.8790，实测值：366.0458。

2、聚集诱导发光实验：

将实施例1制备的多肽聚集体荧光探针在DMSO/H₂O体系中的聚集诱导发光现象：

配制浓度为10μM且含有水的体积百分比依次为10％、30％、50％、70％、90％和99％的多肽聚集体荧光探针的DMSO/H₂O溶液，然后分别测试各溶液的荧光发射光谱，测试结果如图3所示，发现当水的比例增加到70％以上时，多肽聚集体荧光探针的荧光强度大大提高，表明多肽聚集体荧光探针具有明显的聚集诱导发光特征。

3、细胞膜标记示踪实验：

3.1前列腺癌细胞PC3和正常细胞HLF的共培养：

前列腺癌细胞PC3和正常细胞HLF均在37℃，并含有5％二氧化碳的培养箱中培养。前列腺癌细胞PC3在含10％胎牛血清和1％双抗的1640培养基中贴壁培养，正常细胞HLF在含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F-12培养基中贴壁培养。等到细胞生长满培养皿即进行传代：首先用PBS对培养皿中的细胞洗涤3次，再加入1mL 0.25％胰酶消化60秒，消化结束后小心吸出胰酶，加入2mL培养基吹打均匀，细胞计数后留下合适密度的细胞,最后加入5mL培养基放入培养箱中继续培养。

3.2实施例1制备的多肽聚集体荧光探针染色前列腺癌细胞PC3的荧光共聚焦显微镜成像：

对于共聚焦显微镜成像，首先，将前列腺癌细胞PC3以1×10⁵密度传代到含有生长培养基的玻璃底细胞培养皿中。24小时培养后，用PBS洗涤细胞两次。然后在玻璃底细胞培养皿中加入20μM多肽聚集体荧光探针，并在37℃、5％二氧化碳培养箱中共同培养30分钟。待培养结束后，取出培养玻底皿，去除上清液，之后用PBS轻轻洗涤细胞两次，并在光学成像前浸没在生长介质中，并使培养玻底皿进行荧光共聚焦成像，结果如图4所示。细胞荧光成像仪器所用为Zeiss LSM 880共聚焦显微镜，激发波长为405nm。

实验结果可以看出，多肽聚集体荧光探针确实具有优异的细胞膜标记示踪效果。

3.3多肽聚集体荧光探针染色准确性的试验：

首先，将前列腺癌细胞PC3以1×10⁵密度传代到含有生长培养基的玻璃底细胞培养皿中，培养1小时后，往培养玻底皿中加入正常细胞HLF，使前列腺癌细胞PC3和正常细胞HLF共同培养24小时，之后加入20μM多肽聚集体荧光探针溶液，并在37℃、5％二氧化碳培养箱中共同培养30分钟。待培养结束后，取出培养玻底皿，去除上清液，之后用PBS轻轻洗涤细胞两次，并在光学成像前浸没在生长介质中，并使培养玻底皿进行荧光共聚焦成像，结果如图5所示。

从图5可以看出，多肽聚集体荧光探针仅标记前列腺癌细胞PC3的细胞膜，而在正常细胞HLF的细胞膜上无标记作用。实验结果证实，多肽聚集体荧光探针具有优异的细胞膜精准标记性能。

3.4多肽聚集体荧光探针染色牢固性的试验。

首先，将前列腺癌细胞PC3传以1×10⁵密度代到含有生长培养基的玻璃底细胞培养皿中，其中一皿前列腺癌细胞PC3中加入20μM多肽聚集体荧光探针溶液，不漂洗，4小时后进行共聚焦荧光成像；另外一皿前列腺癌细胞PC3中加入20μM多肽聚集体荧光探针溶液，用PBS洗涤两次后，加入新鲜的培养基，4小时后进行共聚焦荧光成像，结果如图6所示。

实验结果可以看出，多肽聚集体荧光探针确实具有优异的细胞膜标记牢固性。不论是否洗涤，在长达4小时后仍然在细胞膜上具有明显的荧光信号。

3.5多肽聚集体荧光探针生物兼容性的试验。

首先，将前列腺癌细胞PC3传以1×10⁴密度代到96孔板中，24小时后，分别将2μM、5μM、10μM、20μM的多肽聚集体荧光探针溶液加入96孔板中，每个浓度设置5个复孔；多肽聚集体荧光探针溶液孵育24小时，将MTT试剂(溶解在磷酸盐缓冲盐水中，5mg/mL)加入每个孔中。将细胞进一步培养4小时。然后除去每个孔中的培养基，并用150μL DMSO替换。将96孔板轻轻震荡15分钟，然后通过酶标仪记录570nm处的吸光度，结果如图7所示。

实验结果可以看出，多肽聚集体荧光探针确实具有很好的生物兼容性。在所设置的浓度条件下，前列腺癌细胞PC3都有90％以上的存活率。

在不冲突的情况下，本文中上述实施例及实施例中的特征可以相互结合。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于细胞膜成像的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针包括多肽聚集体，其化学结构式为：

2.一种如权利要求1所述的用于细胞膜成像的荧光探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、将纯多肽RP-C和巯基还原剂三(2-羧乙基)膦用磷酸缓冲盐溶液溶解，然后在氮气保护下室温反应；

S2、加入具有聚集诱导发光效应的分子四苯乙烯衍生物，搅拌反应；

S3、通过纯化，得到多肽聚集体。

3.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S1中的所述磷酸缓冲盐溶液的pH为7.4，反应时间为不低于1小时。

4.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S2中的所述搅拌反应的时间为不低于24小时。

5.如权利要求2所述的用于细胞膜成像的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤S3中的所述纯化的方法利用高效液相色谱仪进行纯化。

6.如权利要求1所述的用于细胞膜成像的荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针应用于pH 6.5～7.4环境下的癌细胞膜的成像。

7.如权利要求6所述的用于细胞膜成像的荧光探针的应用，其特征在于：所述癌细胞包括前列腺癌细胞。

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