CN113321608A - 一种特异性标记肿瘤细胞的荧光前药及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种特异性标记肿瘤细胞的荧光前药，其特征在于，所述荧光前药包括式(Ⅰ)所示化合物和/或式(Ⅱ)所示化合物。所述制备方法包括：将反式环辛烯醇与式(Ⅲ)所示的Cy5.5荧光化合物进行避光反应，得到所述特异性标记肿瘤细胞的荧光前药；所述反式环辛烯醇为偶联型反式环辛烯醇轴向异构体和/或偶联型反式环辛烯醇平面异构体。当肿瘤细胞预先富集含有四嗪的纳米组装体时，该荧光前药会在肿瘤细胞中发生快速特异性的生物正交偶联反应，使得荧光化合物能够连接到纳米组装体进而长期稳定地标记肿瘤细胞，进而可以用于超分辨荧光成像。
Description
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种荧光前药及其制备方法和应用，尤其涉及一种特异性标记肿瘤细胞的荧光前药及其制备方法和应用。
背景技术
癌症严重威胁着人民生命健康，给家庭、社会、国家造成沉重负担。如何早期发现和预防恶性肿瘤的转移和扩散，一直是临床医学界的难题。高分辨荧光显微成像技术的发展，意味着能够更早、更灵敏地发现肿瘤，进而指导相关癌症治疗。相较于传统的显微成像技术，这种高分辨荧光成像技术不仅可以实现对活体组织微观结构、各种肿瘤细胞的显微成像，还为细胞组学、基因组学、蛋白组学、肿瘤学等研究提供了强大的技术支撑，是一项在生命科学领域有着不可替代优势的技术。
CN103330948A公开了一种稀土金属纳米簇的肿瘤靶向活体快速荧光成像方法。该发明将一定浓度的稀土金属盐溶液与不同种类肿瘤细胞在生理条件下孵育原位合成稀土金属纳米簇，实现了对肿瘤细胞的实时、高分辨的荧光成像。本发明的稀土金属纳米簇在移植肿瘤裸鼠模型上实现了快速、实时原位活体肿瘤靶向荧光成像。该发明的稀土金属纳米簇通过肿瘤细胞直接生物合成，具有很好的生物相容性；实现原位活体荧光成像方法的快速精准定位与肿瘤靶向成像分析，具有广阔的医学应用前景。
目前高分辨荧光成像这一技术面临的关键问题仍是缺乏合适的荧光染料，尤其是缺乏特异性标记肿瘤细胞的荧光染料。因此，开发出一种满足高分辨荧光成像应用要求，生物相容性好，且具有肿瘤细胞靶向能力的荧光染料具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种荧光前药及其制备方法和应用，尤其提供一种特异性标记肿瘤细胞的荧光前药及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种特异性标记肿瘤细胞的荧光前药，所述荧光前药包括式(Ⅰ)所示化合物和/或式(Ⅱ)所示化合物：
为了方便叙述，在本发明中，式(Ⅰ)所示化合物和式(Ⅱ)所示化合物可以分别被命名为偶联型TCO轴向异构体-Cy5.5(TCOlax-Cy5.5)和偶联型TCO平面异构体-Cy5.5(TCOleq-Cy5.5)。
本发明所涉及的荧光前药是由改性单元反式环辛烯醇(TCO)改性的Cy5.5荧光化合物，其结构明确。当肿瘤细胞预先富集含有四嗪的纳米组装体时，荧光前药会在肿瘤细胞中发生快速特异性的生物正交偶联反应，使得荧光化合物能够连接到纳米组装体进而标记肿瘤细胞。更重要的是，本发明所涉及的荧光前药能够长期稳定地标记细胞，进而可以用于超分辨荧光成像。
另一方面，本发明提供一种如上所述的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药的制备方法，所述制备方法包括：将反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式(Ⅲ)所示的Cy5.5荧光化合物进行避光反应，得到所述特异性标记肿瘤细胞的荧光前药；
本发明所涉及的荧光前药的制备方法操作简单，制备得到的荧光前药具备高化学纯度以及较高的收率。
优选地，所述避光反应的温度为20-35℃，例如20℃、22℃、25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、34℃或35℃等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。所述避光反应的时间为24-48h，例如24h、30h、36h、40h或48h等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述避光反应在碱存在的条件下进行，所述碱包括三乙胺、N,N二异丙基乙胺或哌啶中的任意一种或两种的组合；所述至少两种的组合例如三乙胺和N,N二异丙基乙胺的组合、N,N二异丙基乙胺和哌啶的组合、三乙胺和哌啶的组合等，其他任意的组合方式均不在此一一赘述。
优选地，所述碱与反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯的摩尔比为(0.5-0.9):1，例如0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1或0.9:1等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，其特征在于，所述避光反应在溶剂中进行。
优选地，所述溶剂包括二甲基甲酰胺。
优选地，所述反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式(Ⅲ)所示的Cy5.5荧光化合物的摩尔比为(0.5-0.9):1，例如0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1或0.9:1等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯由4-硝基苯酚氯甲酯与反式环辛烯醇反应制备得到；所述反式环辛烯醇为偶联型反式环辛烯醇轴向异构体和/或偶联型反式环辛烯醇平面异构体。
所述偶联型反式环辛烯醇轴向异构体(TCOlax)和偶联型反式环辛烯醇平面异构体(TCOleq)的分子结构分别如下所示：
优选地，所述反应的温度为25-35℃，例如25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、34℃或35℃等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。所述反应的时间为12-48h，例如12h、14h、18h、24h、30h、36h、40h或48h等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述反应在碱存在的条件下进行，所述碱包括三乙胺和/或吡啶。
优选地，所述碱与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1，例如1:1、1.2:1、1.4:1、1.5:1、1.8:1或2:1等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为1:1。
优选地，所述反应在溶剂中进行。
优选地，所述溶剂包括四氢呋喃、乙醚或甲基叔丁基醚中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如四氢呋喃和乙醚的组合、乙醚和甲基叔丁基醚的组合、四氢呋喃和甲基叔丁基醚的组合等，其他任意的组合方式均不在此一一赘述。
优选地，所述反式环辛烯醇与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1，例如1:1、1.2:1、1.4:1、1.5:1、1.8:1或2:1等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为1:1。
作为本发明的优选技术方案，所述荧光前药的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将摩尔比为(1-2):1的反式环辛烯醇与4-硝基苯酚氯甲酯在溶剂中，碱存在下，25-35℃反应12-48h，得到反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯；其中碱与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1；
(2)将摩尔比为(0.5-0.9):1的反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式(Ⅲ)所示的Cy5.5荧光化合物在溶剂中，碱存在下，20-35℃避光反应24-48h，得到所述荧光前药；其中碱与反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯的摩尔比为(0.5-0.9):1。
再一方面，本发明提供一种如上所述的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药在超分辨荧光成像中的应用。尤其应用于肿瘤细胞的超分辨荧光成像。
优选地，所述荧光前药为负载于载体上的荧光前药。
为了使荧光前药具有更好的稳定性和生物利用性，其可被进一步地负载于载体上进行应用。
优选地，所述载体包括纳米组装体、金颗粒、脂质体、胶束、树枝状大分子、微球或微囊。
优选地，所述荧光前药为组合物中的荧光前药。为了满足应用的多样性需要，本发明所涉及的荧光前药可以与其他辅料或者其他生物活性物质联合起来，作为组合物进行进一步的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明所涉及的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药改性单元明确，当其进入预先富集含有四嗪功能纳米组装体的肿瘤细胞后，会发生快速特异性的生物正交偶联反应，能够快速标记肿瘤细胞，并可以用于超分辨荧光成像。
(2)本发明所涉及的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药的制备方法操作简单，制备得到的荧光前药具备高化学纯度以及较高的收率，收率可达到80％以上。
附图说明
图1是实施例1制得的荧光前药的核磁表征图；
图2是实施例1制得的荧光前药的质谱图；
图3是实施例1制得的荧光前药的质谱图；
图4是荧光前药TCOlax-Cy5.5、含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz与人成骨肉瘤细胞共培养0.5h后的超分辨荧光显微图；
图5是荧光前药TCOlax-Cy5.5、含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz与人成骨肉瘤细胞共培养1h后的超分辨荧光显微图；
图6是荧光前药TCOlax-Cy5.5、含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz与人成骨肉瘤细胞共培养3h后的超分辨荧光显微图；
图7是荧光前药TCOlax-Cy5.5、含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz与人成骨肉瘤细胞共培养9h后的超分辨荧光显微图；
图8是荧光前药TCOlax-Cy5.5、含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz与人成骨肉瘤细胞共培养12h后的超分辨荧光显微图；
图9是图4-8中超分辨荧光显微图中纳米结构的半峰高宽数据图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种特异性标记肿瘤细胞的荧光前药——偶联型TCO轴向异构体-Cy5.5(TCOlax-Cy5.5)，其结构如下所示：
具体反应式如下所示：
制备过程如下所示：
(1)将摩尔比为1.6:1的偶联型TCO轴向异构体与4-硝基苯酚氯甲酯溶于四氢呋喃中，添加吡啶，其中吡啶与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为1:1，25℃反应12h得到偶联型TCO轴向异构体对硝基苯碳酸酯；
(2)将摩尔比为0.9:1的偶联型TCO轴向异构体对硝基苯碳酸酯与如上所述的Cy5.5荧光化合物在二甲基甲酰胺中，三乙胺(Et3N)存在下，其中三乙胺与偶联型TCO轴向异构体对硝基苯碳酸酯的摩尔比为0.9:1，25℃避光反应24h得到TCOlax-Cy5.5；
(3)将制得的TCOlax-Cy5.5进行提纯得到精制产品，产率为92.8％。
用1H-NMR法及电喷雾-质谱(ESI-MS)法分别对所制得的TCOlax-Cy5.5进行表征，结果如下：
1H-NMR表征结果为：1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ(ppm):8.42-8.29(t,2H),7.88-7.76(s,2H),7.75-7.58(m,3H),7.36-7.26(m,2H),6.67-6.51(t,1H),6.34-6.24(d,2H),5.72-5.42(m,2H),4.76-4.63(m,1H),4.19-4.13(m,4H),3.06-2.81(m,4H),2.21-1.93(m,6H),1.84-1.10(m,36H)。核磁表征图如图1所示：
高分辨ESI-MS表征结果为：C48H66N4O9S2，906.43；[M-H]-：905.42058。
质谱图如图2和图3所示：
实施例2
本实施例提供一种特异性标记肿瘤细胞的荧光前药——偶联型TCO平面异构体-Cy5.5(TCOleq-Cy5.5)，其结构如下所示：
具体反应式如下所示：
制备过程如下所示：
(1)将摩尔比为1.8:1的偶联型TCO平面异构体与4-硝基苯酚氯甲酯溶于四氢呋喃中，添加三乙胺，其中三乙胺与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为1.2:1，35℃反应12h得到偶联型TCO平面异构体对硝基苯碳酸酯；
(2)将摩尔比为0.5:1的偶联型TCO平面异构体对硝基苯碳酸酯与Cy5.5在二甲基甲酰胺中，N,N二异丙基乙胺(DIPEA)存在下，其中N,N二异丙基乙胺与偶联型TCO平面异构体对硝基苯碳酸酯的摩尔比为0.5:1，35℃避光反应48h得到TCOleq-Cy5.5；
(3)将制得的TCOleq-Cy5.5进行提纯得到精制产品，产率为90.9％。
应用例1
本应用例所涉及的激活前药的激活开关四嗪化合物NapFFYpK-Tz能够特异性靶向进入肿瘤细胞，通过酶催化超分子自组装进行富集，能够在肿瘤内快速特异性激活本发明所涉及的前药，其可参照相关专利文献201910218267.0中涉及的方法进行制备，示例性地可以为：通过固相合成法合多肽NapFFYpK，将摩尔比为1.2:1的NapFFYpK与Tz-NHS溶于二甲基甲酰胺中，添加N,N-二异丙基乙胺，其中N,N-二异丙基乙胺与Tz-NHS的摩尔比为2:1，25℃反应24h，得到NapFFYpK-Tz。将制得的NapFFYpK-Tz进行提纯得到精制产品，其结构如下所示：
将实施例1制得的TCOlax-Cy5.5与含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz混合后，与人成骨肉瘤细胞(Saos-2细胞)共培养，进行超分辨荧光成像，得到Saos-2细胞的超分辨荧光成像照片。具体方法为：
将细胞按2x105个细胞的密度接种在激光共聚焦皿中，将0.05μM实施例1制得的前药TCOlax-Cy5.5与500μM含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz混合，0.5h后加入到细胞中，在37℃以及5％CO2的条件下孵育0.5-12h，然后用超分辨荧光显微镜分别在0.5h、1h、3h、9h、12h时进行成像，结果如图4-图8所示。
由图4-图8可以看出能够检测到较强的Cy5.5荧光，实现对癌细胞的标记，且因为荧光化合物能够连接到纳米组装体，因此能够长期稳定地标记肿瘤细胞。利用SNSMIL软件对荧光数据进一步重构可以得到细胞内纳米组装体的精细结构，如图9所示：不同培养时间下，纳米组装体的半峰高宽在100-600nm，结果表明本发明所涉及的荧光前药适用于肿瘤细胞的超分辨荧光成像。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种特异性标记肿瘤细胞的荧光前药及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种特异性标记肿瘤细胞的荧光前药，其特征在于，所述荧光前药包括式(Ⅰ)所示化合物和/或式(Ⅱ)所示化合物：
2.如权利要求1所述的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式(Ⅲ)所示的Cy5.5荧光化合物进行避光反应，得到所述特异性标记肿瘤细胞的荧光前药；
3.如权利要求2所述的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药的制备方法，其特征在于，所述避光反应的温度为20-35℃，所述避光反应的时间为24-48h；
优选地，所述避光反应在碱存在的条件下进行，所述碱包括三乙胺、N,N二异丙基乙胺或哌啶中的任意一种或两种的组合；
优选地，所述碱与反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯的摩尔比为(0.5-0.9):1。
4.如权利要求2或3所述的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药的制备方法，其特征在于，所述避光反应在溶剂中进行；
优选地，所述溶剂包括二甲基甲酰胺；
优选地，所述反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式(Ⅲ)所示的Cy5.5荧光化合物的摩尔比为(0.5-0.9):1。
5.如权利要求2-4中任一项所述的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药的制备方法，其特征在于，所述反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯由4-硝基苯酚氯甲酯与反式环辛烯醇反应制备得到；所述反式环辛烯醇为偶联型反式环辛烯醇轴向异构体和/或偶联型反式环辛烯醇平面异构体。
6.如权利要求5所述的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为25-35℃，所述反应的时间为12-48h；
优选地，所述反应在碱存在的条件下进行，所述碱包括三乙胺和/或吡啶；
优选地，所述碱与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1，优选为1:1。
7.如权利要求5或6所述的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药的制备方法，其特征在于，所述反应在溶剂中进行；
优选地，所述溶剂包括四氢呋喃、乙醚或甲基叔丁基醚中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述反式环辛烯醇与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1，优选为1:1。
8.如权利要求1所述的特异性标记肿瘤细胞的荧光前药在超分辨荧光成像中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述荧光前药为负载于载体上的荧光前药；
优选地，所述载体包括纳米组装体、金颗粒、脂质体、胶束、树枝状大分子、微球或微囊。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述荧光前药为组合物中的荧光前药。
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