CN113321610A - 一种用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药及其制备方法和应用，所述Cy5.5前药包括偶联型反式环辛烯醇轴向异构体改性的Cy5.5荧光化合物和/或偶联型反式环辛烯醇平面异构体改性的Cy5.5荧光化合物，其结构式分别如式Ⅰ、式Ⅱ所示。当肿瘤细胞预先富集含有四嗪的纳米组装体时，该Cy5.5前药会在肿瘤细胞中发生快速特异性的生物正交偶联反应，使得荧光化合物能够连接到纳米组装体进而标记肿瘤细胞。更重要的是，本发明所涉及的Cy5.5前药能够长期稳定地标记细胞，进而可以用于超分辨荧光成像。本发明所涉及的Cy5.5前药的制备方法操作简单，制备得到的Cy5.5前药具备高化学纯度以及较高的收率。
Description
技术领域
本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种Cy5.5前药及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药及其制备方法和应用。
背景技术
癌症严重威胁着人民生命健康，给家庭、社会、国家造成沉重负担。如何早期发现和预防恶性肿瘤的转移和扩散，一直是临床医学界的难题。高分辨荧光显微成像技术的发展，意味着能够更早、更灵敏地发现肿瘤，进而指导相关癌症治疗。相较于传统的显微成像技术，这种高分辨荧光成像技术不仅可以实现对活体组织微观结构、各种肿瘤细胞的显微成像，还为细胞组学、基因组学、蛋白组学、肿瘤学等研究提供了强大的技术支撑，是一项在生命科学领域有着不可替代优势的技术。
CN108610411A公开了一种肿瘤靶向性近红外荧光探针及其制备方法，所述荧光探针中包括花氰类荧光染料部分和靶向载体部分，花氰类荧光染料和靶向载体部分通过共价键偶联；其中，所述花氰类荧光染料部分为IDCC和ITCC；所述靶向载体部分包含EBP分子。本发明的肿瘤靶向性近红外荧光探针进入体内后，到达肿瘤组织并与细胞EGFR结合，表现出较强的靶向性荧光标记作用，不仅能明显提高肿瘤荧光成像的特异性和敏感性，而且能为肿瘤的分子分型和分子靶向药物疗效的评估提供重要信息，对于指导和监测分子靶向药物的应用具有很强的实用性。但其缺点是无法适用于超分辨成像技术。
目前高分辨荧光成像这一技术面临的关键问题仍是缺乏合适的荧光染料，尤其是缺乏特异性标记肿瘤细胞的荧光染料。因此，开发出一种满足高分辨荧光成像应用要求，生物相容性好，且具有肿瘤细胞靶向能力的荧光染料具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种Cy5.5前药及其制备方法和应用，尤其提供一种用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药，所述Cy5.5前药包括偶联型反式环辛烯醇轴向异构体改性的Cy5.5荧光化合物和/或偶联型反式环辛烯醇平面异构体改性的Cy5.5荧光化合物，其结构式分别如式Ⅰ、式Ⅱ所示。
为了方便叙述，在本发明中，式Ⅰ所示化合物和式Ⅱ所示化合物可以分别被命名为偶联型TCO轴向异构体-Cy5.5(TCOlax-Cy5.5)和偶联型TCO平面异构体-Cy5.5(TCOleq-Cy5.5)。
本发明所涉及的Cy5.5前药是由改性单元反式环辛烯醇(TCO)改性的Cy5.5荧光化合物，其结构明确。当肿瘤细胞预先富集含有四嗪的纳米组装体时，该Cy5.5前药会在肿瘤细胞中发生快速特异性的生物正交偶联反应，使得荧光化合物能够连接到纳米组装体进而标记肿瘤细胞。更重要的是，本发明所涉及的Cy5.5前药能够长期稳定地标记细胞，进而可以用于超分辨荧光成像。
另一方面，本发明提供一种如上所述的用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药的制备方法，所述制备方法包括：将反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式Ⅲ所示的Cy5.5荧光化合物在溶剂中进行避光反应，得到所述用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药；
本发明所涉及的Cy5.5前药的制备方法操作简单，制备得到的Cy5.5前药具备高化学纯度以及较高的收率。
优选地，所述溶剂包括二甲基甲酰胺。
优选地，所述反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式Ⅲ所示的Cy5.5荧光化合物的摩尔比小于1:1，优选为(0.5-0.9):1，例如0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1或0.9:1等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明中，所述避光反应的温度为20-35℃，例如20℃、22℃、25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、34℃或35℃等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述避光反应的时间为24-48h，例如24h、30h、36h、40h或48h等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述避光反应在碱存在的条件下进行，所述碱包括三乙胺、N,N二异丙基乙胺或哌啶中的任意一种或两种的组合；所述至少两种的组合例如三乙胺和N,N二异丙基乙胺的组合、N,N二异丙基乙胺和哌啶的组合、三乙胺和哌啶的组合等，其他任意的组合方式均不在此一一赘述。
优选地，所述碱与反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯的摩尔比小于1:1，优选为(0.5-0.9):1，例如0.5:1、0.6:1、0.7:1、0.8:1或0.9:1等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
在本发明中，所述反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯的制备方法包括：将4-硝基苯酚氯甲酯与反式环辛烯醇在溶剂中进行反应，即得；所述反式环辛烯醇为偶联型反式环辛烯醇轴向异构体和/或偶联型反式环辛烯醇平面异构体。
所述偶联型反式环辛烯醇轴向异构体(TCOlax)和偶联型反式环辛烯醇平面异构体(TCOleq)的分子结构分别如下所示：
优选地，所述溶剂包括四氢呋喃、乙醚或甲基叔丁基醚中的任意一种或至少两种的组合；所述至少两种的组合例如四氢呋喃和乙醚的组合、乙醚和甲基叔丁基醚的组合、四氢呋喃和甲基叔丁基醚的组合等，其他任意的组合方式均不在此一一赘述。
优选地，所述反式环辛烯醇与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1，例如1:1、1.2:1、1.4:1、1.5:1、1.8:1或2:1等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为1:1。
优选地，所述反应的温度为25-35℃，例如25℃、27℃、28℃、30℃、32℃、34℃或35℃等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述反应的时间为12-48h，例如12h、14h、18h、24h、30h、36h、40h或48h等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述反应在碱存在的条件下进行，所述碱包括三乙胺和/或吡啶。
优选地，所述碱与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1，例如1:1、1.2:1、1.4:1、1.5:1、1.8:1或2:1等，范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述，优选为1:1。
作为本发明的优选技术方案，所述用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药的制备方法具体包括以下步骤：
(1)将摩尔比为(1-2):1的反式环辛烯醇与4-硝基苯酚氯甲酯在溶剂中，碱存在下，25-35℃反应12-48h，得到反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯；其中碱与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1；
(2)将摩尔比小于1:1的反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式Ⅲ所示的Cy5.5荧光化合物在溶剂中，碱存在下，20-35℃避光反应24-48h，得到所述Cy5.5前药；其中碱与反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯的摩尔比小于1:1。
再一方面，本发明提供一种如上所述的用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药在荧光成像中的应用。尤其应用于肿瘤细胞的超分辨荧光成像。
优选地，所述Cy5.5前药为负载于载体上的Cy5.5前药。
为了使Cy5.5前药具有更好的稳定性和生物利用性，其可被进一步地负载于载体上进行应用。
优选地，所述载体包括纳米组装体、金颗粒、脂质体、胶束、树枝状大分子、微球或微囊。
优选地，所述Cy5.5前药为组合物中的Cy5.5前药。
为了满足应用的多样性需要，本发明所涉及的Cy5.5前药可以与其他辅料或者其他生物活性物质联合起来，作为组合物进行进一步的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的Cy5.5前药是由改性单元反式环辛烯醇(TCO)改性的Cy5.5荧光化合物，其结构明确。当肿瘤细胞预先富集含有四嗪的纳米组装体时，该Cy5.5前药会在肿瘤细胞中发生快速特异性的生物正交偶联反应，使得荧光化合物能够连接到纳米组装体进而标记肿瘤细胞。更重要的是，本发明所涉及的Cy5.5前药能够长期稳定地标记细胞，进而可以用于超分辨荧光成像。本发明所涉及的Cy5.5前药的制备方法操作简单，制备得到的Cy5.5前药具备高化学纯度以及较高的收率。
附图说明
图1是实施例1制得的荧光前药的核磁表征图；
图2是实施例1制得的荧光前药的质谱表征图；
图3是实施例1制得的荧光前药的质谱表征图；
图4是荧光前药TCOlax-Cy5.5、含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz与宫颈癌细胞共培养后的超分辨荧光显微图(荧光图)；
图5是荧光前药TCOlax-Cy5.5、含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz与宫颈癌细胞共培养后的超分辨荧光显微图(软件重构图)；
图6是荧光化合物Cy5.5、含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz与宫颈癌细胞共培养后的超分辨荧光显微图(荧光图)；
图7是荧光化合物Cy5.5、含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz与宫颈癌细胞共培养后的超分辨荧光显微图(软件重构图)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药——偶联型TCO轴向异构体-Cy5.5(TCOlax-Cy5.5)，其结构如下所示：
制备过程如下所示：
(1)将摩尔比为1.6:1的偶联型TCO轴向异构体与4-硝基苯酚氯甲酯溶于四氢呋喃中，添加吡啶，其中吡啶与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为1:1，25℃反应12h得到偶联型TCO轴向异构体对硝基苯碳酸酯；
(2)将摩尔比为0.5:1的偶联型TCO轴向异构体对硝基苯碳酸酯与式Ⅲ所示的化合物在二甲基甲酰胺中，三乙胺(Et3N)存在下，其中三乙胺与偶联型TCO轴向异构体对硝基苯碳酸酯的摩尔比为0.8:1，35℃避光反应24h得到TCOlax-Cy5.5；
(3)将制得的TCOlax-Cy5.5进行提纯得到精制产品，产率为86.6％。
用1H-NMR法及电喷雾-质谱(ESI-MS)法分别对所制得的TCOlax-Cy5.5进行表征，结果如下：
1H-NMR表征结果为：1H NMR(CDCl3,400MHz)δ(ppm):7.88-7.73(m,2H),7.41-7.21(m,8H),7.16-7.05(m,2H),6.67-6.57(t,1H),6.27-6.10(q,2H),5.62-5.46(m,2H),4.98-4.77(m,2H),4.03-3.94(m,2H),3.61-3.51(s,3H),3.28-3.08(m,4H),2.37-2.19(m,4H),1.87-1.21(m,33H)。核磁表征图如图1所示。
高分辨ESI-MS表征结果为：C47H65N4O3，733.51；[M+H]+：734.50759。质谱图如图2和图3所示。
实施例2
本实施例提供一种用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药——偶联型TCO平面异构体-Cy5.5(TCOleq-Cy5.5)，其结构如下所示：
制备过程如下所示：
(1)将摩尔比为1.8:1的偶联型TCO平面异构体与4-硝基苯酚氯甲酯溶于四氢呋喃中，添加三乙胺，其中三乙胺与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为1.2:1，35℃反应12h得到偶联型TCO平面异构体对硝基苯碳酸酯；
(2)将摩尔比为0.9:1的偶联型TCO平面异构体对硝基苯碳酸酯与式Ⅲ所示的化合物在二甲基甲酰胺中，N,N二异丙基乙胺(DIPEA)存在下，其中N,N二异丙基乙胺与偶联型TCO平面异构体对硝基苯碳酸酯的摩尔比为0.8:1，25℃避光反应48h得到TCOleq-Cy5.5。
(3)将制得的TCOleq-Cy5.5进行提纯得到精制产品，产率为83.9％。
应用例1
本应用例所涉及的激活前药的激活开关四嗪化合物NapFFYpK-Tz能够特异性靶向进入肿瘤细胞，通过酶催化超分子自组装进行富集，能够在肿瘤内快速特异性激活本发明所涉及的前药，其可参照相关专利文献201910218267.0中涉及的方法进行制备，示例性地可以为：通过固相合成法合多肽NapFFYpK，将摩尔比为1.2:1的NapFFYpK与Tz-NHS溶于二甲基甲酰胺中，添加N,N-二异丙基乙胺，其中N,N二异丙基乙胺与Tz-NHS的摩尔比为2:1，25℃反应24h，得到NapFFYpK-Tz。将制得的NapFFYpK-Tz进行提纯得到精制产品，其结构如下所示：
将实施例1制得的TCOlax-Cy5.5与含四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz混合后，与宫颈癌细胞(HeLa细胞)共培养，进行超分辨荧光成像，得到HeLa细胞的超分辨荧光成像照片。具体方法为：
将细胞按2x105个细胞的密度接种在激光共聚焦皿中。加入1mL含500μM四嗪的组装多肽NapFFYpK-Tz的DMEM培养基，在37℃以及5％CO2的条件下孵育6h，用于富集含有四嗪的纳米组装体。然后用PBS清洗，再加入1mL含0.05μM实施例1制得的前药TCOlax-Cy5.5的DMEM培养基，继续在37℃以及5％CO2的条件下孵育0.5h，然后用超分辨荧光显微镜进行成像，结果如图4所示。而对照组在富集含有四嗪的纳米组装体的细胞中，加入1mL含0.05μM式Ⅲ所示的化合物的DMEM培养基，在37℃以及5％CO2的条件下孵育24h，然后用超分辨荧光显微镜成像，结果如图6所示。
由图4可以看出：本发明所涉及的Cy5.5前药可以实现对癌细胞的标记，能够检测到较强的Cy5.5荧光，利用SNSMIL软件对荧光数据进一步重构得到细胞内纳米组装体的精细结构，如图5所示：纳米组装体的半峰高宽为48.5nm。结果表明所述Cy5.5前药适用于超分辨荧光成像。而在图6中，虽然能够在细胞内看到Cy5.5的荧光，但超分辨荧光成像中细胞被固定后荧光信号消失，所得到的软件重构图(如图7)很难看到细胞被标记，说明荧光分子是非特异性吸附到细胞上，表明未改性的Cy5.5荧光化合物不适于标记癌细胞，不适于超分辨荧光成像。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.一种用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药，其特征在于，所述Cy5.5前药包括偶联型反式环辛烯醇轴向异构体改性的Cy5.5荧光化合物和/或偶联型反式环辛烯醇平面异构体改性的Cy5.5荧光化合物，其结构式分别如式Ⅰ、式Ⅱ所示：
2.如权利要求1所述的用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式Ⅲ所示的Cy5.5荧光化合物在溶剂中进行避光反应，得到所述用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药；
3.如权利要求2所述的用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药的制备方法，其特征在于，所述溶剂包括二甲基甲酰胺；
优选地，所述反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯与式Ⅲ所示的Cy5.5荧光化合物的摩尔比小于1:1，优选为(0.5-0.9):1。
4.如权利要求2或3所述的用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药的制备方法，其特征在于，所述避光反应的温度为20-35℃；
优选地，所述避光反应的时间为24-48h；
优选地，所述避光反应在碱存在的条件下进行，所述碱包括三乙胺、N,N二异丙基乙胺或哌啶中的任意一种或两种的组合；
优选地，所述碱与反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯的摩尔比小于1:1，优选为(0.5-0.9):1。
5.如权利要求2-4中任一项所述的用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药的制备方法，其特征在于，所述反式环辛烯醇对硝基苯碳酸酯的制备方法包括：将4-硝基苯酚氯甲酯与反式环辛烯醇在溶剂中进行反应，即得；所述反式环辛烯醇为偶联型反式环辛烯醇轴向异构体和/或偶联型反式环辛烯醇平面异构体。
6.如权利要求5所述的用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药的制备方法，其特征在于，所述溶剂包括四氢呋喃、乙醚或甲基叔丁基醚中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述反式环辛烯醇与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1，优选为1:1。
7.如权利要求5或6所述的用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药的制备方法，其特征在于，所述反应的温度为25-35℃；
优选地，所述反应的时间为12-48h；
优选地，所述反应在碱存在的条件下进行，所述碱包括三乙胺和/或吡啶；
优选地，所述碱与4-硝基苯酚氯甲酯的摩尔比为(1-2):1，优选为1:1。
8.如权利要求1所述的用于超分辨荧光成像的Cy5.5前药在荧光成像中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述Cy5.5前药为负载于载体上的Cy5.5前药；
优选地，所述载体包括纳米组装体、金颗粒、脂质体、胶束、树枝状大分子、微球或微囊。
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述Cy5.5前药为组合物中的Cy5.5前药。
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