CN110927137B - 一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用 - Google Patents

一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用 Download PDF

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Abstract

一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用，属于生物成像技术领域。该荧光成像探针的结构式如下所示，其中R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基或环己基，其中以R为环己基的荧光成像探针Ph‑Red效果最好。本发明还公开了该荧光成像探针在特异性标记细胞中脂滴或可视化细胞中脂滴形态和分布中的应用。实验证实本发明的探针Ph‑Red是一种具有超高染色选择性、较高亮度、稳定性和细胞膜通透性，以及较低细胞毒性等特点的脂滴荧光探针，应用前景巨大。
Figure DDA0002347908340000011

Description

一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其应用
技术领域
本发明属于生物成像技术领域，具体涉及一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其在特异性标记细胞中脂滴或可视化细胞中脂滴形态和分布中的应用。
背景技术
脂滴是一种球形细胞器，其内部由中性脂质(甘油三酯和胆固醇酯)组成，外面包覆一层由蛋白固定的磷脂单分子层膜。脂滴存在于从原核生物到人类几乎所有的生物体中，并在脂质存储、膜转运和蛋白质存储等多种细胞活动中扮演重要角色。脂滴还与许多疾病息息相关，例如：神经退行性疾病、肥胖症、糖尿病、动脉粥样硬化和癌症等。
为了研究脂滴的结构和其多种多样的功能，荧光成像技术是最有力的工具之一。目前，BODIPY和Nile Red(Materials,2018,11,1768)是最常用的具有代表性的脂滴荧光成像探针，但是这两种探针都有着一定的不足。例如：BODIPY的斯托克斯位移比较小，这会造成激发光和发射光的交叉重叠；Nile Red染色选择性较低，染色脂滴的同时也会染色细胞中其它疏水性结构，导致较低的信噪比。因此，迫切地需要一种具有大斯托克斯位移和超高染色选择性的脂滴荧光探针，能够特异性地识别脂滴，实现高质量的脂滴成像。
发明内容
针对现有脂滴荧光探针的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针及其在特异性标记细胞中脂滴或可视化细胞中脂滴形态和分布中的应用。
本发明所述的一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针，其特征在于：分子结构简单有且仅有一个苯环，合成步骤简短，其化学结构通式如式(I)所示：
Figure BDA0002347908320000011
其中n为0、1、2、3、4、5六个整数，R可以是甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基和正己基，也可以是环己基。
本发明所述特异性标记细胞中脂滴性能最好的荧光探针化学名称为2,5-双(环己基氨基)对苯二甲酸二甲酯，简称Ph-Red，其制备方法如下：
Figure BDA0002347908320000021
其它六个化合物(化合物1-6)的制备方法与化合物Ph-Red的制备方法相同，只需将环己胺换成甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺或正己胺即可，这里不做赘述。其中化合物1、2和4是已报道的荧光分子(Angew.Chem.Int.Ed.2017,56,12543；Faming ZhuanliShenqing,107311879,03Nov 2017)，化合物3、5、6和Ph-Red是本发明合成的新的荧光分子。
针对现有脂滴荧光探针的不足，本发明在开发新型脂滴荧光探针方面选择了基于单苯环骨架分子结构简单合成步骤简短的荧光分子。本发明中制备的单苯环荧光分子具有较大的斯托克斯位移，避免了激发光和发射光的交叉，并且以单苯环结构实现了较强的红光发射，这是非常难得的，因为绝大多数红光发射的荧光分子都具有较大的π共轭骨架，至少含有三四个苯环，而本发明制备的单苯环红光分子除了可以有效降低细胞自荧光背景信号，还具有较高的细胞膜通透性，更适合于生物成像应用。此外，荧光探针Ph-Red最大吸收波长在490nm处，与共聚焦显微镜通常配备的488nm激发光源非常匹配。正是由于上述优点，荧光探针Ph-Red能够做为脂滴荧光探针实现高质量共聚焦成像。
本发明所述特异性识别细胞中脂滴的荧光探针Ph-Red在特异性标记细胞中脂滴或可视化细胞中脂滴形态和分布(实施例5)中的应用。
本发明所述细胞为HeLa细胞。
本发明制备的特异性标记细胞中脂滴的荧光探针Ph-Red是具有超高染色选择性的可用于3D共聚焦成像和多色共聚焦成像的荧光探针。
实验结果证实，本发明所述的探针Ph-Red具有超高的染色选择性，能够特异性地标记细胞中的脂滴，其成像效果远远强于商业化的BODIPY和Nile Red。同时，由于其分子骨架只有一个苯环，较小的空间体积使得本发明的探针具有更高的细胞膜通透性。此外，Ph-Red探针还具有很好的光稳定性，可用于脂滴的动态跟踪成像。同时它的细胞毒性很低，并且可与其它探针兼容。它的亮度较高，在相同的染色和成像条件下亮度明显高于BODIPY和Nile Red。因此Ph-Red探针能有望成为可视化脂滴结构研究脂滴多种多样功能的一个强有力的工具，甚至代替BODIPY和Nile Red成为新一代商用化脂滴荧光探针，更重要的是该探针的设计思路能够为其它细胞器的新型荧光探针的设计提供一个通用的指导。
总之，本发明所述的探针Ph-Red是一种全新的探针，与其它脂滴荧光探针相比，Ph-Red探针具有超高的染色选择性、较高的信噪比、较高的亮度、较高的光稳定性、较高的细胞膜通透性和较低的细胞毒性等特点。鉴于上述优点，其在细胞脂滴荧光成像方面的应用具有广阔前景。
附图说明
图1：本发明实施例1中制备的荧光探针Ph-Red的核磁氢谱；
图2：本发明实施例1中制备的荧光探针Ph-Red的核磁碳谱；
图3：本发明实施例1中制备的荧光探针化合物3的核磁氢谱；
图4：本发明实施例1中制备的荧光探针化合物3的核磁碳谱；
图5：本发明实施例1中制备的荧光探针化合物5的核磁氢谱；
图6：本发明实施例1中制备的荧光探针化合物5的核磁碳谱
图7：本发明实施例1中制备的荧光探针化合物6的核磁氢谱；
图8：本发明实施例1中制备的荧光探针化合物6的核磁碳谱；
图9：本发明实施例1中制备的荧光探针Ph-Red在甲苯(toluene)中的吸收-发射光谱；
其中，左侧实线部分为吸收光谱，右侧虚线部分为发射光谱。
图10：用不同浓度荧光探针Ph-Red处理HeLa细胞24小时后细胞的存活率；
图11：荧光探针Ph-Red与BODIPY 493/503在HeLa细胞中共定位照片；
其中，第一张照片为488nm激发下500～540nm波段的BODIPY 493/503的成像照片，第二张图为488nm激发下600～640nm波段的Ph-Red的成像照片，第三张照片为前两张照片的叠加。标尺＝10μm。
图12：荧光探针Ph-Red在HeLa细胞中光稳定性的量化图；
其中，图a部分为荧光探针Ph-Red染色HeLa细胞后在同一区域连续成像100张照片中的第1、50和100张照片；图b部分为这100张照片的相对荧光强度随成像张数的变化趋势。标尺10μm。
具体实施方式
实施例1：
2,5-双(环己基氨基)对苯二甲酸二甲酯(Ph-Red)的合成
向双口烧瓶中加入1,4-环己二酮-2,5-二甲酸二甲酯(228mg,1.00mmol)，再加入10mL乙醇和1mL乙酸作为溶剂，搅拌下加入环己胺(0.35mL,3.1mmol)，之后反应体系在空气中回流18小时。冷却至室温后，滤出固体并用乙醇洗，得到208mg(0.535mmol，54％)红色粉末状的Ph-Red。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.37(s,2H),6.85(br,2H),3.95(s,6H),3.42(br,2H),2.09-2.06(m,4H),1.84-1.81(m,4H),1.70-1.68(m,2H),1.52-1.32(m,10H).13C NMR(126MHz,CDCl3):δ168.52,140.05,116.78,114.95,51.86,51.03,33.04,26.02,24.69.
图1为实施例1合成探针Ph-Red的核磁氢谱，图2为实施例1合成探针Ph-Red的核磁碳谱，表明制备得到了目标产物Ph-Red。
我们将上述合成步骤中的环己胺换成相同摩尔数的甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺或正己胺，即可分别得到化合物1、2、3、4、5和6。其中，化合物3、5和6是全新的荧光分子，它们的核磁表征如下：
化合物3：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.23(s,2H),6.74(t,J＝5.1Hz,2H),3.86(s,6H),3.12-3.06(m,4H),1.68-1.59(m,4H),0.99(t,J＝7.4Hz,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3):δ168.52,141.32,116.54,114.07,51.87,45.57,22.59,11.88.
化合物5：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.22(s,2H),6.71(t,J＝5.2Hz,2H),3.86(s,6H),3.14-3.07(m,4H),1.67-1.58(m,4H),1.42-1.33(m,8H),0.95–0.89(m,6H).13C NMR(101MHz,CDCl3):δ168.51,141.32,116.50,114.02,51.86,43.73,29.49,29.07,22.55,14.07.
化合物6：1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.23(s,2H),6.72(s,2H),3.86(s,6H),3.13-3.07(m,4H),1.65-1.58(m,4H),1.45–1.38(m,4H),1.36-1.29(m,8H),0.93–0.88(m,6H).13CNMR(101MHz,CDCl3):δ168.50,141.30,116.55,114.11,51.88,43.80,31.69,29.34,27.00,22.65,14.11.
图3～图8为我们合成的化合物3、5和6的核磁氢谱和碳谱，表明制备得到了目标产物化合物3、5和6。
实施例2：实施例1中制备的荧光探针Ph-Red吸收-发射光谱的测定
用25mL甲苯(toluene)溶剂将实施例1中合成探针Ph-Red配置成10μM浓度的溶液。用紫外-可见分光光度计在300～700nm波段扫描得到吸收光谱，用荧光光谱仪在490nm激发下扫描得到荧光发射光谱，用Origin软件将两组数据做到一张图上，得到如图9所示的Ph-Red荧光探针在甲苯溶剂中的吸收-发射光谱(左侧实线部分为吸收光谱，右侧虚线部分为发射光谱)，说明了荧光探针Ph-Red的吸收-发射峰位以及它的大斯托克斯位移。
实施例3：HeLa细胞的培养
本实施例中所有百分数均为体积分数。
HeLa细胞株是在37℃，含5％CO2的培养箱中进行培养，培养液为内含10％胎牛血清和1％双抗(青链霉素混合液)的高糖DMEM。其中，胎牛血清、双抗和高糖DMEM为直接从生物试剂公司购买得到。
等细胞生长到对数期，我们对细胞进行传代处理：将细胞培养瓶中的培养液吸走后用2mL不含胎牛血清的DMEM培养液洗，将该培养液吸走后用0.5mL胰酶消化处理2分钟，待大部分细胞脱壁后，加入2mL含10％胎牛血清和1％双抗的高糖DMEM培养液吹打均匀，接种至新的细胞培养瓶和培养皿中，放入CO2细胞培养箱培养，培养皿中的细胞待浓度适宜后用于共聚焦成像实验。
实施例4：实施例1中制备的荧光探针Ph-Red细胞毒性的测试
我们使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)对Ph-Red探针进行细胞毒性分析。HeLa细胞接种到96孔板上(每个孔1*104个细胞)，在CO2细胞培养箱中培养24小时。然后我们将其中的60个孔的培养液换成内含不同浓度(0、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0μM)Ph-Red荧光探针和0.5％(体积分数)DMSO的培养液(每种浓度设置10个孔的平行试验)，继续培养24小时，之后向这些孔中加入MTT试剂(每孔10μL)，在CO2细胞培养箱中接着培养4小时。将这些孔中培养液吸走后加入DMSO(每孔100μL)溶解生成的甲瓒结晶，30分钟后用酶标仪在535nm处测量吸光度值。由于只有活细胞才能与MTT试剂作用生成甲瓒晶体，因此我们可以用每组浓度不同孔的吸光度平均值与对照组(探针浓度为0的10个孔)的吸光度平均值作比，计算细胞存活率，结果如图10所示，说明荧光探针Ph-Red细胞毒性很小，5.0μM浓度的荧光探针Ph-Red也不会影响细胞的正常生长。
实施例5：实施例1中制备的荧光探针Ph-Red与BODIPY 493/503在HeLa细胞中共染色实验
我们将HeLa细胞接种在玻璃底的细胞培养皿上，放在CO2细胞培养箱中培养2天。从培养箱中取出后吸走培养皿中的DMEM培养液，加入1mL配好的内含Ph-Red(500nM)、BODIPY 493/503(2μM)和1％DMSO的DMEM培养液，放回CO2细胞培养箱中培养1小时。之后取出，用HBSS细胞培养液洗3遍，之后在HBSS细胞培养液中进行共聚焦成像。如图11所示，我们可以明显观测到实施例1中制备的荧光探针Ph-Red与BODIPY 493/503在HeLa细胞中能实现共定位，且实施例1中制备的荧光探针Ph-Red定位效果优于BODIPY 493/503。
实施例6：实施例1中制备的荧光探针Ph-Red的光稳定性
我们将实施例5中接种了HeLa细胞的细胞培养皿在CO2细胞培养箱中培养2天后取出，吸走DMEM培养液，加入内含200nM实施例1中制备的荧光探针Ph-Red和0.5％DMSO的DMEM培养液，在CO2细胞培养箱中培养1小时后取出，用HBSS细胞培养液洗3遍，之后在HBSS细胞培养液中进行共聚焦成像。我们在同一区域连续成像100次，发现荧光探针Ph-Red的相对荧光强度仍保持在80％以上，如图12所示，说明了其良好的光稳定性。

Claims (3)

1.一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针，其特征在于：其结构式如下所示，
Figure FDA0002966727580000011
其中，R为甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基或环己基。
2.权利要求1所述的一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针在特异性标记HeLa细胞中脂滴中的应用。
3.权利要求1所述的一种基于单苯环骨架的细胞脂滴荧光成像探针在可视化HeLa细胞中脂滴形态和分布中的应用。
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