CN102627637B

CN102627637B - 取代苯基罗丹明噁二唑类化合物制备方法与用途

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Publication number: CN102627637B
Application number: CN201210091291.0A
Authority: CN
Inventors: 史学芳; 马媛; 柴璐; 侯志爱; 郭萍; 胡灵敏
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2012-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-03-31
Also published as: CN102627637A

Abstract

本发明公开了取代苯基罗丹明噁二唑化合物的合成与用途，包括：噁二唑化合物I、化合物II以及化合物III，它们都是罗丹明B染料的衍生物，不同的是这三种化合物噁二唑环的另一侧连着不同的4-取代苯基。化合物I、II以及III在水溶液中表现出强烈的荧光，并且具有很好的耐光性，具有细胞荧光染色剂的用途。

Description

取代苯基罗丹明噁二唑类化合物制备方法与用途

本发明是在天津师范大学开发基金（基金号为52XK1102）的资助下进行的。

技术领域

本明发属于化学传感技术应用领域，涉及2-苯基-5-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-1,3,4-噁二唑化合物I、2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-对氯苯基-1,3,4-噁二唑化合物II以及2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-对硝基苯基-1,3,4-噁二唑化合物III的制备方法，及其作为细胞染料的生物染色剂的用途。

背景技术

光学探针作为分析化学、有机化学、光物理化学和超分子化学等多学科交叉的重要研究领域，在生化检测、环境监控、疾病诊断和药物筛选等领域发挥着重要的作用。

随着21世纪生命科学的迅猛发展和相关技术的发展与普及，荧光染料分子探针以其实现细胞内活性小分子“可视化”检测并它们在生物体内的动态变化进行实时监控的本领在生物技术方面被广泛的应用。

罗丹明类化合物因其较大的摩尔消光系数和高的荧光量子产率，更受到了广泛关注，发展了很多基于罗丹明的化学传感器。它们能对完整的活细胞和组织或固定的细胞和组织内各种结构进行定性、定量和定位的测量，功能强大，可操作性强，特别是在活细胞研究方面具有巨大的的优势。

我们利用罗丹明结构上的特点，运用直接合成的方法在母体上引入了噁二唑的杂环，设计并合成了新型的罗丹明类生物荧光探针。由于1,3,4-噁二唑本身缺电子的特性，达到了改变罗丹明类荧光染料分子探针在生物亲和性、水溶性和热稳定性方面的特点。

如目标化合物结构式所示，化合物I、II和III均是未见报道的新化合物。

见附图1、2、3、4。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了具有通式U的化合物及其活性成分化合物I、化合物II以及化合物III的制备方法。

本发明的第二个目的是提供了包含化合物I、化合物II和化合物III用于活体细胞荧光染料方面的用途。

为实现上述目的发明公开了如下的技术内容：

具有结构式U的化合物：

U

其中R分别为氢原子、氯原子或硝基。

典型的化合物为：

具有结构式I的2-苯基-5-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-1,3,4-噁二唑化合物：

I 。

具有结构式II的2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-对氯苯基-1,3,4-噁二唑化合物：

II 。

具有结构式III的2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-对硝基苯基-1,3,4-噁二唑化合物：

III 。

本发明进一步公开了这三个化合物的制备方法，它是按如下的步骤进行：

化合物I的合成步骤：

（1）罗丹明B酰肼的合成

将罗丹明类化合物用乙醇溶解，然后将85%的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3-10小时，反应完成后，冷却至室温，减压除去溶剂，抽滤，蒸馏水洗涤产物3-5次。

（2）目标化合物I的合成

将上述步骤（1）制备的罗丹明酰肼与苯甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，经体积比为二氯甲烷/甲醇100~20 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物I。

化合物II的合成步骤：

（1）罗丹明B酰肼的合成

（2）目标化合物II的合成

将上述步骤（1）制备的罗丹明酰肼与对氯苯甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，经体积比为二氯甲烷/甲醇100~20:1, 柱色谱分离，得到目标化合物II。

化合物III的合成步骤：

（1）罗丹明B酰肼的合成

（2）目标化合物III的合成

将上述步骤（1）制备的罗丹明酰肼与对硝基苯甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，经体积比为二氯甲烷/甲醇100~20:1, 柱色谱分离，得到目标化合物III。

本发明进一步公开了化合物I、II和III在作为细胞荧光染料方面的应用。

本发明所设计的I、II、III化合物的分子结构特征在于：此类不对称的噁二唑化合物的一侧都连有罗丹明B取代，另一侧连有不同的芳香取代基。本发明利用原料罗丹明酰肼中的活性部分内酰肼结构与不同取代的芳香酸反应，同时利用三氯氧磷使其脱水环合，在结构中引入一个新的噁二唑杂环。新化合物具有良好的水溶性，并且有对活体细胞进行荧光染色的用途。

本发明公开的化合物I、化合物II以及化合物III荧光染料探针化合物与现有技术相比所具有的积极效果为：

（1）优化了罗丹明B类类荧光染料性能，阻断了类似的染料中普遍存在的因其内酯与羧酸构造互变导致的荧光猝灭现象的发生；

（2）在化合物I、II、III中增加了缺电子的噁二唑杂环，增加了罗丹明母体结构的电子传输性能；

（3）在原来染料的大π共轭体系中合成了噁二唑杂环，利于在染色时与客体产生弱相互作用、提高染色与荧光检测效果，并利于荧光或裸眼识别与检测；

（4）本专利中，在染料分子中苯环的4位，分别是氢原子、氯原子、硝基取代，原子及取代基的种类不同，调整了染料分子之间的若相互作用力、电子效应及光谱特征，以利于生物染色标记的不同需要。

附图说明：

图1. 化合物U的结构式；

图2 化合物I的结构式；

图3 化合物II的结构式；

图4. 化合物III的结构式；

图5 化合物I荧光光谱图（激发波长530nm）；

图6. 化合物II荧光光谱图（激发波长530nm）；

图7. 化合物III荧光光谱图（激发波长530nm）；

图8. 化合物III的细胞荧光染色成像实验一：活细胞组荧光染色成像；

图9. 化合物III的细胞荧光染色成像实验二：固定细胞组荧光染色成像。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。为简单和清楚的目的，以下论述中对公知的技术方法的描述、溶液的配制过程进行不再赘述。其中罗丹明B、水合肼、苯甲酸、对氯苯甲酸和对硝基苯甲酸均为试剂公司直接购买。其他有机溶剂经无水处理。

实施例1.

2-苯基-5-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-1,3,4-噁二唑的合成：

化合物I的合成通过以下主要反应制备：

（1）罗丹明B酰肼的合成

将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将0.63 mL 85 %（10.4mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物3次。得产物3.0 g，产率：64.2%。

（2）目标化合物I的合成

将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.54 g苯甲酸（4.4 mmol）混合溶于2 mL三氯氧磷中，加热回流6小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇 = 100 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物(0.36 g, 收率15%)。¹H NMR: δ(CDCl₃, 400 MHz) 1.322(12H, t), 2.403(3H, s), 3.652(8H, d, J=6.8Hz), 6.846(2H, s), 6.924(2H, d, J=9.2Hz), 7.160(2H, d, J=9.6Hz), 7.448(3H, m), 7.535(1H, t), 7.854(2H, d, J=8.0Hz), 7.870(2H, t,), 8.400(1H, t)。质谱理论值：m/z M⁺, 543.3, 测定值, 543.7。

实施例2.

2-苯基-5-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-1,3,4-噁二唑化合物的合成：

（1）罗丹明B酰肼的合成

将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将8 mL 85%（138.6 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热回流10小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物5次。得产物4.25 g，产率：89.7%。

（2）目标化合物I的合成

将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.54 g苯甲酸（4.4 mmol）混合溶于5 mL三氯氧磷中，加热回流10小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇20 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物I为 0.93 g, 收率39%。

实施例3.

2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-对氯苯基-1,3,4-噁二唑的合成：

（1）罗丹明B酰肼的合成

将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将0.63 mL 85 %（10.4mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物3次。得产物3.05 g，产率：64.3%。

（2）目标化合物II的合成

将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.69 g对氯苯甲酸（4.4 mmol）混合溶于2 mL三氯氧磷中，加热回流6小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇=100 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物(0.37 g, 收率14.7%)。¹H NMR: δ(CDCl₃, 400 MHz) 1.317(12H, t), 3.632(8H, q), 6.832(2H, s), 6.941(2H, d, J=9.2Hz), 7.147(2H, d, J=9.6Hz), 7.456(2H, d, J=8.4Hz), 7.475(1H, s), 7.829(2H, d, J=8.8Hz), 7.869(2H, t), 8.387(1H, t)。质谱理论值：m/z M⁺, 577.2, 测定值, 577.5。

实施例4.

2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-对氯苯基-1,3,4-噁二唑的合成：

（1）罗丹明B酰肼的合成

将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将8 mL 85%（138.6 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热回流10小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物5次。得产物4.3 g，产率：90.5%。

（2）目标化合物II的合成

将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.69 g对氯苯甲酸（4.4 mmol）混合溶于5 mL三氯氧磷中，加热回流10小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇 = 20 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物II为 0.99 g, 收率39%。

实施例5.

2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-对硝基苯基-1,3,4-噁二唑的合成：

（1）罗丹明B酰肼的合成

将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将0.63 mL 85 %（10.4mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物3次。得产物3.2 g，产率：68%。

（2）目标化合物III的合成

将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.73 g对硝基苯甲酸（4.4 mmol）混合溶于2 mL三氯氧磷中，加热回流6小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇 = 100 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物(0.38 g, 收率14.6%)。1H NMR: δ(CD3Cl, 400 MHz) 1.327(12H, t), 3.660(8H, d, J=5.2Hz), 6.836(2H, s), 6.989(2H, d, J=9.6Hz), 7.165(2H, d, J=9.2Hz), 7.492(1H, t), 7.909(2H, t), 8.152(2H, d, J=6.8Hz), 8.357(2H, d, J=8.0Hz), 8.473(1H, d, J=6.0Hz)。质谱理论值：m/z M⁺, 588.3, 测定值, 588.5。

实施例6.

2-[罗丹明B-(2’’-苯基)]-5-对硝基苯基-1,3,4-噁二唑的合成：

（1）罗丹明B酰肼的合成

将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将8 mL 85%（138.6 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热回流10小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物5次。得产物4.2 g，产率：88.5%。

（2）目标化合物III的合成

将上述步骤（1）中合成的酰肼2 g（4.4 mmol）和0.73 g对硝基苯甲酸（4.4 mmol）混合溶于5 mL三氯氧磷中，加热回流10小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇= 20 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物III为 1.0 g, 收率38.9%。

实施例7.

化合物III的细胞染色及其荧光成像实验：

细胞染色及其染色荧光成像实验材料与方法:

1.1细胞及其培养的方法：

（a）试验的细胞：选用NIH-3T3细胞（小鼠成纤维细胞，为南开大学生命科学学院生物活体材料实验室培养）；

（b）细胞的培养：DMEM（高糖）培养基；10 % 胎牛血清；

（c）细胞铺板过程（24孔）：取生长状态良好的NIH-3T3细胞，制成5x10⁴/ mL 细胞悬液；24孔板每孔加入1.0 mL 细胞悬液。37^oC，5% CO₂条件下培养48小时，分别进行活细胞组、固定后细胞组的细胞染色和荧光成像观察。

1.2 试验用荧光染料样品化合物III溶液配制：

依标准方法，化合物III用1%的醋酸溶液配制成4.0 mg/mL溶液作为试验用样品溶液。

1.3. 细胞荧光染色成像：

（一）活细胞组实验：

（1）吸取经培养48小时后的各孔培养基；

（2）加入200μL/孔试验用化合物III样品溶液，在室温下静置15分钟；

（3）吸取样品溶液，用1%醋酸溶液洗5遍；

（4）使用荧光倒置显微镜观察、照像，荧光激发光波长570 nm。

（二）固定后细胞组：

（1）吸取经培养48小时后的各孔培养基；

（2）于每孔加入10% 的醋酸溶液0.5 mL进行固定；

（3）在 4^oC条件下静置1小时；

（4）使用PBS溶液洗5遍；

（5）加入200μL/孔试验用化合物I样品溶液，于室温下静置15分钟；

（6）吸取样品溶液，使用1% 醋酸溶液洗5遍；

（7）在荧光倒置显微镜下观察、照像，荧光激发光波长为570 nm。

2. 化合物III的细胞染色与荧光成像实验结果与分析：

2.1 荧光成像试验结果显示样品化合物III具有红色荧光成像效果；参见转化为灰度模式的荧光成像照片附图5；

2.2 荧光染色结果表明，固定后细胞组荧光染色成像效果优于活细胞组的染色效果，参见转化为灰度模式的荧光成像照片附图6。

3. 化合物I、化合物II、化合物III具有类似的荧光光谱，对光谱性质影响的主要因素来源于罗丹明和噁二唑。因此，化合物III的荧光染色认为可以代表化合物I和化合物II。

Claims

1.具有结构式I、II、III的化合物：

I

II

III。

2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）将罗丹明B的乙醇溶液与85%的水合肼反应制备罗丹明B酰肼；其中罗丹明B与85%的水合肼的摩尔比1 : 1.5~5；

（2）将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与苯甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应，经柱色谱分离，得到目标化合物I，其中罗丹明B酰肼 : 苯甲酸 : 三氯氧磷的摩尔比为1 : 1 : 0.5~5；

（3）将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与对氯苯甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应，经柱色谱分离，得到目标化合物II，其中罗丹明B酰肼 : 对氯苯甲酸 : 三氯氧磷的摩尔比1 : 1 : 0.5~5；

（4）将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与对硝基苯甲酸混合溶于三氯氧磷中，加热回流，反应，经柱色谱分离，得到目标化合物III，其中罗丹明B酰肼 : 对硝基苯甲酸 : 三氯氧磷的摩尔比1 : 1 : 0.5~5。

3.权利要求1所述I、II和III化合物在细胞荧光染料中的应用。