CN105968105B - 一种荧光标记探针及其制备方法及对细菌的标记应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种荧光标记探针及其制备方法及对细菌的标记应用。采用有机合成的方法，直接在罗丹明B骨架结构的底环上引入具有荧光性质的、多个杂原子的噁二唑杂环。引入的噁二唑杂环，既作为第二荧光团拓展罗丹明类荧光探针的光谱性质，又通过引入多个杂原子增加形成氢键的位点,利于与生物体作用。在化合物RH‑MCl中，噁二唑环一侧由罗丹明B取代，另一侧由氯甲基取代。化合物RH‑MCl具有良好的水溶性，其对细菌的荧光标记方法简单，容易操作，便于观察、检测。

Description

一种荧光标记探针及其制备方法及对细菌的标记应用
本发明是在天津市应用基础与前沿技术研究计划（合同编号：14JCYBJC23900）的资助下进行的。
技术领域
本发明涉及一种荧光标记探针的制备及细菌荧光标记方法，属于化学生物学领域。
背景技术
荧光探针在分子生物学、微生物学、生物化学、分析化学、化工和医药工业等领域也有着广泛地应用。同时它的发展与生物技术、环境科学、诊断医学等学科紧密相关。随着化学、物理学和生物技术等相关学科的发展与进步，诞生了越来越多的与荧光探针相关的技术，这些技术极大的拓展了荧光探针的应用范围和研究深度，使得荧光探针日益成为现代新技术领域强有力研究手段。这些新研究手段的日益多样化也对荧光分子探针的种类提出了更高的要求。
细菌是一类原核细胞型微生物，因为菌体小、半透明，要想更清楚的观察其大小和形态，需经标记和显微镜放大后才能看到。常用的细菌标记方法有染料标记法，例如单染法、复染法和鉴别染色法，主要有革兰氏染色、美蓝染色、抗酸染色、瑞氏染色和姬姆萨染色等方法，但是对细菌进行荧光标记的报道还不多见。开发荧光探针用于细菌的标记具有重要的意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种具有分子式I的荧光探针及其制备方法。
本发明的第二个目的是利用该荧光探针对几种细菌抹片及细菌悬液进行荧光标记的方法，该方法具有操作方法简单，便于观察、检测的优点。
本发明的第三个目的是公开了氯甲基噁二唑罗丹明化合物在制备细菌荧光探针标记方面的应用。
本发明的第四个目的是公开了荧光探针对几种细菌荧光标记的两种方法。
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：
具有结构式I的氯甲基罗丹明噁二唑（简称RH-MCl），化学名称为 2-氯甲基-5-[罗丹明B-9'-(2''-苯甲酰)基]-1,3,4-噁二唑；
本发明公开了氯甲基噁二唑罗丹明荧光探针的制备方法：
（1）罗丹明酰肼的制备：
取无水乙醇（100ml）置于250ml的烧瓶中，将罗丹明B（5g, 10.4mmol）溶解于乙醇。然后将80%水合肼（8ml, 133mmol）在室温条件下缓慢滴加于混合体系中。滴加完毕后将混合物加热回流。当溶液由暗紫色逐渐变为澄清，TLC监测，反应完毕冷却至室温，减压除去部分溶剂、倒入冰水中，有沉淀产生，抽滤，得到暗黄色固体。
（2）氯甲基噁二唑罗丹明的制备：
将氯乙酸0.76g(0.1g,1.1mmol)和三氯氧磷( 5 ml)混合，加热回流0.5-1小时，之后，分批加入罗丹明B酰肼(0.5g,1.1mmol)，TLC监测，待反应完成后将其冷却，加入少量二氯甲烷到室温并倒入冰水混合物中，调节pH为8，以二氯甲烷萃取粗产物至无机层溶液颜色比有机层溶液颜色深时为止，合并有机层，以5ml×2饱和食盐水洗涤，分离有机相。用无水硫酸镁干燥并静置过夜，滤出干燥剂，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗品用二氯甲烷/甲醇=20:1，柱色谱分离，得到目标化合物RH-MCl。
本发明进一步公开了氯甲基噁二唑罗丹明做为荧光探针对几种细菌进行荧光标记的应用
一、细菌抹片的荧光标记方法，可用于荧光显微镜和共聚焦显微镜观察细菌
①称取0.275gRH-MCl溶于100mlpH7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为5000uM的探针母液，将母液用pH7.4的PBS缓冲溶液稀释成浓度分别为5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM、500uM、1000uM、2000uM的探针溶液。另配制LB液体培养基100ml备用：
②从菌种库获得菌种，各取2ul单核增生李斯特菌、铜绿假单胞菌分别接入10mLLB液体培养基中，在37℃，169转/min，过夜培养。取3ml菌液加入离心管中，离心，弃去上清液，用PBS洗涤并重悬菌液。准备透明，洁净，无油渍的载玻片及盖玻片。用灭菌接种环沟取重悬菌液1-2环，在玻片上做直径1cm的涂面，涂片在室温下自然干燥，将干燥好的涂片涂面向上，在火焰上来回通过数次（一般3次），以手背触及玻片微烫为宜。
③将制备好的单核增生李斯特菌、铜绿假单胞菌抹片各9张放置于载玻片架上，每张片上分别滴加浓度为5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM、500uM、1000uM、2000uM 的荧光探针溶液，室温下放置20min，用去离子水冲洗至抹片上无探针溶液。荧光显微镜下观察标记结果，激发光为绿光波段，发射光为红色，可清晰观察到荧光标记后的细菌。
④将制备好的单核增生李斯特菌、铜绿假单胞菌抹片各8张放置于载玻片架上，每张片上滴加浓度为100uM的荧光探针溶液，室温下分别放置0.5min、2min、5min、10min、15min、20min、25min、30min，用去离子水冲洗至抹片上无探针溶液。荧光显微镜下观察标记结果，激发光为绿光波段，发射光为红色，可清晰观察到荧光标记后的细菌。
检测的结果说明：
RH-MCl荧光探针能够标记单核增生李斯特菌、铜绿假单胞菌。探针的最佳浓度范围为50-100uM，最佳标记时间为20min。由图5、图6说明。
二、细菌悬液的荧光标记方法，可用于荧光光谱或流式细胞术检测细菌
①称取RH-MCl 0.055g溶于100mlpH7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为1000uM的探针母液，将母液用pH7.4的PBS缓冲溶液稀释成浓度分别为5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM、400uM、600uM、800uM的探针溶液。另配制LB液体培养基100ml备用。
②取10ul酵母菌接入50mL LB液体培养基中，37℃过夜培养。分别取3ml菌液加入10支离心管中，12000 r/min离心3min，弃去上清液，各管分别加入pH7.4的PBS缓冲溶液1ml，吹洗细菌，离心后去掉上清液，重复吹洗3次。
③在10支吹洗后的酵母菌中分别加入浓度为0（空白对照）、5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM、400uM、600uM、800uM的RH-MCl探针溶液1ml，吹打成细胞悬液，37℃水浴放置20min，12000 r/min离心3min，弃去上清液，各管分别加入pH7.4的PBS缓冲溶液1ml，吹洗细菌，离心后去掉上清液，重复吹洗3次。对此细胞悬液进行荧光光谱扫描测定荧光强度，激发波长500nm，记录发射波长520-650nm区间的光谱图，读最大荧光强度值。
检测的结果说明：
（1）RH-MCl荧光探针能够对酵母菌做荧光标记。
（2）随着RH-MCl探针浓度从0增加到50uM，细菌荧光强度值急剧增大，当浓度达到50uM时，荧光强度值最大；浓度继续增加至800uM,荧光强度变化趋缓并逐渐降低。结果由图11、图12说明。
（3）RH-MCl荧光探针标记细菌的最佳浓度范围为20-50uM。
本发明公开的荧光标记探针及其制备方法及对细菌的荧光标记方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）优化了罗丹明B类荧光染料性能，新型荧光探针引入噁唑杂环，使罗丹明探针骨架具有双荧光团的同时引入N、O杂原子，提供氢键位点，改进探针荧光量子产率及水溶解性；引入苄位氯原子，使探针能够快速进入细菌使细菌具有荧光标记性能。
（2）新型荧光标记探针敏感性强，效率高，对细菌进行荧光标记后容易观察结果。与罗丹明B相比较，标记时间短，所需探针浓度低，对细菌的影响小且标记效果好。
（3）对细菌进行的荧光标记法可应用于荧光显微镜、激光共聚焦显微镜观察以及荧光光谱法、流式细胞术，以便对细菌进行深入研究。
附图说明：
图1、RH-MCl的核磁氢谱；
图2、RH-MCl的核磁碳谱；
图3、RH-MCl的飞行时间质谱；
图4、RH-MCl（浓度为20uM）的荧光光谱；
图5荧光显微镜下RH-MCl标记的单核增生李斯特菌（白光和荧光对照）；
图6荧光显微镜下RH-MCl标记的的铜绿假单胞菌（白光和荧光对照）；
图7荧光显微镜下RH-MCl标记的肺炎链球菌（白光和荧光对照）；
图8荧光显微镜下RH-MCl标记的的枯草芽孢杆菌（白光和荧光对照）；
图9荧光显微镜下RH-MCl标记的的志贺氏菌（白光和荧光对照）；
图10荧光显微镜下RH-MCl标记的的酵母菌（白光和荧光对照）；
图11、不同浓度的RH-MCl标记的酵母菌悬液的荧光光谱，其中探针RH-MCl浓度1-9
依次为0、5、10、20、50、100、200、400、800uM；
图12、不同浓度的RH-MCl标记的酵母菌悬液的荧光强度值；
图13、几种细菌标记前后的荧光强度比较；
图14、氯甲基罗丹明噁二唑的结构式。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围，其中的氯乙酸、三氯氧磷、罗丹明B均为市售。
实施例1
荧光探针氯甲基噁二唑罗丹明化合物RH-MCl
荧光探针的合成：
（1）罗丹明酰肼的制备：
取无水乙醇（100ml）置于250ml的烧瓶中，将罗丹明B（5g, 10.4mmol）溶解于乙醇。然后将80%水合肼（8ml, 133mmol）在室温条件下缓慢滴加于混合体系中。滴加完毕后将混合物加热回流。当溶液由暗紫色逐渐变为澄清，TLC监测，反应完毕冷却至室温，减压除去部分溶剂、倒入冰水中，有沉淀产生，抽滤，得到暗黄色固体。
（2）氯甲基噁二唑罗丹明的制备：
将氯乙酸0.76g(0.1g,1.1mmol)和三氯氧磷( 5 ml)混合，加热回流0.5-1小时，之后，分批加入罗丹明B酰肼(0.5g,1.1mmol)，TLC监测，待反应完成后将其冷却，加入少量二氯甲烷到室温并倒入冰水混合物中，调节pH为8，以二氯甲烷萃取粗产物至无机层溶液颜色比有机层溶液颜色深时为止，合并有机层，以5ml×2饱和食盐水洗涤，分离有机相。用无水硫酸镁干燥并静置过夜，滤出干燥剂，减压旋蒸除去多余溶剂，所得粗品用二氯甲烷/甲醇=20:1，柱色谱分离，得到目标化合物RH-MCl。熔点：228-230℃；结构确定见图1、RH-MCl的核磁氢谱；图2、RH-MCl的核磁碳谱。
实施例2
采用上述方法一以100uM浓度的RH-MCl探针依次对①肺炎链球菌，②枯草芽孢杆菌，③志贺氏菌，④酵母菌进行了荧光标记20min，并在荧光显微镜下观察标记结果。菌种均为南开大学泰达生物技术研究院从合作单位或部门获得后自行保藏的菌种。
检测的结果说明：
RH-MCl荧光探针可以对肺炎链球菌、单核李斯特菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，铜绿假单胞菌、志贺氏菌等革兰氏阴性菌及酵母菌等真菌进行荧光标记，在荧光显微镜下可以清晰的观察细菌的形态和轮廓。
实施例3
采用上述方法二以浓度为50uM的探针溶液依次对①肺炎链球菌，②单核增生李斯特菌，③枯草芽孢杆菌，④铜绿假单胞菌，⑤志贺氏菌进行了荧光标记，并进行荧光光谱扫描测定荧光强度。菌种均为南开大学泰达生物技术研究院从合作单位或部门获得后自行保藏的菌种。
检测的结果说明：
RH-MCl荧光探针可以对肺炎链球菌、单核李斯特菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌，铜绿假单胞菌、志贺氏菌等革兰氏阴性菌或阳性菌及酵母菌等真菌进行荧光标记，经荧光分光度计扫描，其荧光强度与未标记细菌的荧光强度比较均显著增高。图13说明。
上述方法中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。所用常规溶液配制方法如下：
（1）pH7.4的PBS溶液配制：
A、0.2M Na2HPO4：称取 71.6g Na2HPO4-12H2O，溶于 1000ml 水 B、0.2M NaH2PO4：称取 31.2g NaH2PO4-2H2O，溶于1000ml 水
取A液190ml，B液810ml，混匀即得。
（2）LB液体培养基：
称取胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，氯化钠10.0g，溶于800.0mL蒸馏水，NaOH调pH值至7.5，加蒸馏水定容至 1000.0mL，121℃，高压灭菌20min。

Claims (2)

1.一种氯甲基噁二唑罗丹明化合物在制备细菌荧光探针方面的应用；所述的细菌选自肺炎链球菌，单核增生李斯特菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌，志贺氏菌，酵母菌；所述的氯甲基噁二唑罗丹明化合物为：
。
2.权利要求1所述的应用，其中荧光探针对细菌荧光标记的两种方法如下：
（1）细菌抹片的荧光标记方法：
①称取RH-MCl 0.275g溶于100mlpH7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为5000uM的探针母液，将该母液用pH7.4的PBS缓冲溶液稀释成浓度分别为5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM、500uM、1000uM、2000uM的探针溶液；
另配制LB液体培养基500ml备用；
②从菌种库获得菌种，各取2ul接入10mL LB液体培养基中，在37℃，169转/min，过夜培养；
取1ml菌液加入1.5ml离心管中，离心，弃去上清液，用PBS洗涤并重悬菌液；
准备透明、洁净、无油渍的载玻片及盖玻片；
用灭菌接种环沟取重悬菌液1-2环，在玻片上做直径1cm的涂面，涂片在室温下自然干燥，将干燥好的涂片涂面向上，在火焰上来回通过3次；
③将制备好的单核增生李斯特菌、铜绿假单胞菌抹片各9张放置于载玻片架上，每张片上分别滴加浓度为5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM、500uM、1000uM、2000 uM的荧光探针溶液，室温下放置20min，用去离子水冲洗至抹片上无探针溶液，荧光显微镜下观察标记结果，激发光为绿光波段，可清晰观察到荧光标记后的细菌，探针最佳浓度为50-100uM；
④将制备好的单核增生李斯特菌、铜绿假单胞菌抹片各8张放置于载玻片架上，每张片上滴加浓度为100uM的荧光探针溶液，室温下分别放置0.5min、2min、5min、10min、15min、20min、25min、30min，用去离子水冲洗至抹片上无探针溶液，荧光显微镜下观察标记结果，激发光为绿光波段，可清晰观察到荧光标记后的细菌，最佳标记时间为20min；
⑤用浓度为100uM的探针溶液依次对肺炎链球菌，枯草芽孢杆菌，志贺氏菌，酵母菌进行了荧光标记，荧光显微镜下观察标记结果，激发光为绿光波段，可清晰观察到荧光标记后的细菌；
此标记方法也可用于共聚焦显微镜对细菌的观察；
（2）细菌悬液的荧光标记方法：
①称取RH-MCl 0.055g溶于100mlpH7.4的PBS缓冲溶液中，配制成浓度为1000uM的探针母液，将母液用pH7.4的PBS缓冲溶液稀释成浓度分别为5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM、400uM、600uM、800uM的探针溶液；另配制LB液体培养基500ml备用；
②取10ul酵母菌接入50ml LB液体培养基中，37℃过夜培养；
分别取3ml菌液加入10支离心管中，12000r/min离心3min，弃去上清液，各管分别加入pH7.4的PBS缓冲溶液1ml，吹洗细菌，离心后去掉上清液，重复吹洗3次；
③在10支吹洗后的酵母菌悬液样品中分别加入浓度为0、5uM、10uM、20uM、50uM、100uM、200uM、400uM、600uM、800uM的RH-MCl探针溶液1ml，吹打成细胞悬液，37℃水浴放置20min，12000r/min离心3min，弃去上清液，各管分别加入pH7.4的PBS缓冲溶液1ml，吹洗细菌，离心后去掉上清液，重复吹洗3次，对此细胞悬液进行荧光光谱扫描，激发波长500nm，记录发射波长520-650nm区间的光谱图，读取最大荧光强度值；
最佳探针浓度范围为20-50uM；
④用浓度为50uM的探针溶液依次对肺炎链球菌，单核增生李斯特菌，枯草芽孢杆菌，铜绿假单胞菌，志贺氏菌进行了荧光标记，并进行荧光光谱扫描测定荧光强度；此标记方法也应用于流式细胞术检测细菌性能。
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