CN102633789B

CN102633789B - 含有双罗丹明b的化合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN102633789B
Application number: CN201210091284.0A
Authority: CN
Inventors: 史学芳; 马媛; 柴璐; 郭萍; 胡灵敏
Original assignee: Tianjin Normal University
Current assignee: Tianjin Normal University
Priority date: 2012-03-31
Filing date: 2012-03-31
Publication date: 2014-06-25
Anticipated expiration: 2032-03-31
Also published as: CN102633789A

Abstract

本发明公开了一种具有对称结构的2,5-二[罗丹明B-9’-(2’’-苯甲酰)基]-1,3,4-噁二唑荧光染料化合物I及其制备方法与用途。化合物I在水中具有优良的溶解性、表现出强烈的荧光，其水溶液在pH为2-10的区间荧光光谱不发生猝灭，具有作为细胞染料的生物染色剂的应用。化合物I可以由罗丹明B和三氯氧磷直接制备，也可以通过中间体化合物IIN,N’-双罗丹明B基肼制备。本发明进一步公开了结构式I作为细胞染料的生物染色剂方面的应用。

Description

含有双罗丹明B的化合物及其制备方法与应用

本发明是在天津师范大学开发基金（基金号为52XK1102）的资助下进行的。

技术领域

本明发属于化学传感技术应用领域，涉及化合物I 2,5-二[罗丹明B-9’-(2’’-苯甲酰)基]-1,3,4-噁二唑、前体化合物IIN,N’-双罗丹明B基肼化合物，以及它们的制备方法，怀有化合物I作为细胞染料的生物染色剂的用途。

背景技术

荧光染料探针分子的开发与应用研究是化学与生物科学的交叉领域。荧光探针技术是根据分子的光物理和光化学特性，在分子尺度对研究对象进行研究的荧光分析方法，测定荧光探针标记物荧光峰波长或荧光显微成像，即可获得标记物微环境信息。

利用荧光探针进行化学发光成像检测，是实现对生物大分子电泳结果的高速度、高灵敏度、高选择性分析的手段，是替代放射性检测的可靠方法，在分子生物学和医药工业等领域有非常广泛的应用前景。因此，该方法是获得生物细胞状态、分子环境信息的途径，是核酸染色、DNA电泳、DNA测序研究的有力工具，在肿瘤学、免疫学、临床检测、赤潮海洋生物监测等方面具有广泛应用。

荧光探针的发展与化学、生命科学、生物技术等学科紧密相关。荧光免疫技术的发展与普及，使得荧光探针的应用越来越广，对荧光探针染料性能的要求也越来越高，广泛应用于药理学、生理学、分子生物学、细胞生物学、分子遗传学、环境化学等领域。但随着环境、医学、生物等学科的发展，逐渐凸显出罗丹明类染料探针分子对生物体荧光识别标记方面应用的不足，例如：对特定的生物标记选择性不高；探针对光敏感、化学稳定性不佳，在强光检测下容易分解；生理条件下在溶剂中溶解性欠佳；探针对细胞的穿透能力弱等。

在罗丹明B商品化合物的基础上，本发明人设计了如下所示的、具有 I 结构特征的荧光探针染料分子，或通过中间体化合物 II 制备该荧光染料化合物 I。化合物I能够对细胞进行荧光染色，在 pH为2-10 范围内不发生荧光猝灭；如目标化合物结构式所示，化合物 I、II 均是未见报道的新化合物，见图2，图3。

发明内容

本发明的第一个目的是提供了具有通式I、II的化合物。

本发明的第二个目的是提供了具有通式I、II化合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供了包含化合物I用于活体细胞染色的用途。

为实现上述目的本发明公开了如下的技术内容：

具有结构式I的化合物（2,5-二[罗丹明B-9’-(2’’-苯甲酰基)]-1,3,4-噁二唑）：

Figure 2012100912840100002DEST_PATH_IMAGE002

具有结构式II的化合物（N,N’-双罗丹明B基肼）：

Figure 2012100912840100002DEST_PATH_IMAGE004

本发明进一步公开了化合物I的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）将罗丹明B的乙醇溶液与85%的水合肼反应制备罗丹明B酰肼；其中罗丹明B与85%的水合肼的摩尔比为摩尔比为1 : 1.5~5；

（2）将步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与罗丹明B混合后，溶于三氯氧磷中，加热回流反应后经柱色谱分离，得到目标化合物I；其中罗丹明B酰肼 : 罗丹明B : 三氯氧磷的摩尔比为1 : 1 : 1.5~5。

本发明也公开了化合物I的另外一种制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

将化合物II溶于三氯氧磷中，加热回流反应，经柱色谱分离，得到目标化合物I；其中化合物II与三氯氧磷的摩尔比为1 : 0.5~5。

本发明还公开了化合物II（N,N’-双罗丹明B基肼）的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）将罗丹明B的乙醇溶液与85%的水合肼反应制备罗丹明B酰肼；其中罗丹明B与85%的水合肼的摩尔比为1 : 1.5~5；

（2）将罗丹明B与三氯氧磷反应制备罗丹明B酰氯；其中罗丹明B与三氯氧磷的摩尔比为1 : 1~3.5；

（3）将步骤（1）和（2）制备的罗丹明B酰肼与罗丹明B酰氯以摩尔比为1:1.5~5混合，得到化合物II。

本发明更加详细的公开了2,5-二[罗丹明B-9’-(2’’-苯甲酰)基]-1,3,4-噁二唑I和N,N’-双罗丹明B基肼II的制备方法，它们是按如下的步骤进行：

一、化合物I的合成步骤：

（1）罗丹明酰肼的合成

将罗丹明B用乙醇溶解，然后将85%的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3-10小时，反应完成后，冷却至室温，减压除去溶剂，抽滤，蒸馏水洗涤产物3-5次；

（2）将步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与罗丹明B混合后，溶于三氯氧磷中，加热回流反应后经柱色谱分离，得到目标化合物I。

二、通过中间体化合物II的制备化合物I合成步骤

（1）罗丹明酰肼的合成

将罗丹明B用乙醇溶解，然后将85%的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3-10小时，反应完成后，冷却至室温，减压除去溶剂，抽滤，蒸馏水洗涤产物3次；

（2）罗丹明B 酰氯的制备：

将罗丹明B与三氯氧磷在100℃条件下回流2-10小时，点板检测进程，至原料反应完全，停止加热，减压蒸除多余的三氯氧磷，不经处理直接进行下一步反应；其中罗丹明B与三氯氧磷的摩尔比为1:1-3.5；

（3）中间体II的合成：

将上述步骤（1）和（2）制备的罗丹明B酰肼与酰氯混合溶于四氢呋喃中，常温搅拌，反应完成后，除去溶剂，产物用甲醇或乙醇等醇类重结晶。得到目标化合物II；

（4）目标化合物I的合成：

将上述步骤得到的化合物溶于三氯氧磷中，加热回流，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，硫酸镁干燥过夜，经体积比为二氯甲烷/甲醇100~20 : 1, 柱色谱分离，得到目标化合物I。

本发明进一步公开了2,5-二[罗丹明B-9’-(2’’-苯甲酰)基]-1,3,4-噁二唑化合物I在细胞生物染色方面的用途。

本发明所设计的化合物I、II的分子结构在于具有如下特征：

特征一：在I的结构中，在原料罗丹明B的9-(2’-苯甲酰)基团上，通过有机合成化学反应构造1,3,4-噁二唑环，引入了电负性大的氮原子和氧原子；

特征二：在I的结构中，改变了原料罗丹明B的9-(2’-苯甲酰)基构造，有效阻断了罗丹明B内酯-羧酸平衡，最大程度地降低了罗丹明B类荧光染料在荧光标记时，其荧光光谱发生猝灭的可能性；

特征三：在I的结构中，含有两个罗丹明B分子片单元环，增加了大π共轭体系，利于作为荧光染料发生荧光光谱；

特征四：在I的结构中，与罗丹明B构造不同，是二价的阳离子，使该分子在作为荧光染料对生物客体标记时，利于与其产生弱相互作用力、提高荧光探针标记能性。

特征五：中间体化合物II是具有双罗丹明B单元的双酰肼化合物，是尚未见文献报道的新化合物。

本发明设计、合成的化合物I、II与已经报道的罗丹明B类化合物不同，是具有双罗丹明B分子片段单元罗丹明B类化合物。

化合物I是具有二价阳离子电荷的新类型罗丹明B类荧光染料分子，具有双氧杂蒽环大π共轭体系，以原子经济方式改变了罗丹明B类分子构造，阻断了在使用时因其内酯与羧酸的结构互变导致的荧光猝灭现象，增加了具有光谱特征的1,3,4-噁二唑杂环，利于与生物客体产生弱相互作用，同时，能够与罗丹明B的氧杂蒽环一起更好地调整作为生物荧光标记探针时的光谱性质。

本发明公开的化合物与现有技术相比所具有的积极效果为：

（1）化合物I设计从原子经济学出发，以最简捷的方式，优化了罗丹明B类荧光染料性能，阻断了该类染料普遍存在的因内酯与羧酸互变造成的荧光猝灭现象的发生；

（2）化合物I通过有机合成方法，改变了通常为一价阳离子电荷的罗丹明B类荧光染料为二价阳离子电荷染料分子，利于使用时与客体产生弱相互作用，提高使用效果；

（3）化合物I中增加了氧杂蒽大π共轭体系、噁二唑杂环，利于荧光检测。

附图说明：

图1. 化合物I的结构式；

图2. 化合物II的结构式；

图3. 化合物I的水溶液紫外光谱图；

图4. 化合物I的荧光光谱图；

图5 化合物I的1×10^-5水溶液，在pH = 2-10 范围内在自然光下的成像（灰度）；

图6.化合物I的1×10^-5水溶液在pH = 2-10 范围时、254 nm激发光下荧光成像（灰度）；

图7. 化合物I的细胞荧光染色成像实验一：活细胞组荧光染色成像；

图8. 化合物I的细胞荧光染色成像实验二：固定细胞组荧光染色成像。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。为简单和清楚的目的，以下论述中对公知的技术方法的描述、溶液的配制过程进行不再赘述。其中罗丹明B与所有其他试机均为试剂公司直接购买。

实施例1.

化合物I 2,5-二[罗丹明B-9’-(2’’-苯甲酰)基]-1,3,4噁二唑的合成：

（1）罗丹明酰肼的合成

将5 g（10.4mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将0.9 mL 85%（15.6 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物3次。得产物3.33 g，产率：70 %。

（2）罗丹明B 酰氯的制备

将10.00 g (20.9 mmol) 罗丹明B与3 mL三氯氧磷加入100 mL烧瓶中，在100℃条件下回流2 h，点板检测进程，至原料反应完全，停止加热。减压蒸除多余的三氯氧磷，不经处理直接进行下一步反应。

（3）将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼0.5 g（1.1 mmol）与步骤（2）制备的罗丹明B 酰氯0.55 g（1.1 mmol）混合溶于2 mL三氯氧磷中，加热回流6小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇100：1 柱色谱分离，得到目标化合物I (0.095 g, 收率10%)。¹H NMR: δ(CDCl₃, 400 MHz) 1.342(24H, t), 3.666(16H, q), 6.826(4H, s), 6.928(4H, d, J=8.8Hz), 7.064(4H, d, J=9.2Hz), 7.313(2H, d, J=7.2Hz), 7.731(4H, dm), 8.293(2H, d, J=8.0Hz)。¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ (ppm): 165.32, 158.76, 157.65, 155.49, 133.58, 133.01, 131.21, 131.13, 130.33, 130.11, 114.23, 113.41, 96.24, 52.44, 46.06, 29.52, 12.59。

实施例2

化合物I 2,5-二[罗丹明B-9’-(2’’-苯甲酰)基]-1,3,4-噁二唑的合成：

（1）罗丹明酰肼的合成

将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将8 mL 85%（138.6 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流10小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物5次。得产物4.1 g，产率：87%

（2）罗丹明B 酰氯的制备

将10.00 g (20.9 mmol) 罗丹明B与35 mL三氯氧磷加入100 mL烧瓶中，在100℃条件下回流10小时，点板检测进程，至原料反应完全，停止加热。减压蒸除多余的三氯氧磷，不经处理直接进行下一步反应。

（3）将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼0.5 g（1.1 mmol）与步骤（2）制备的罗丹明B 酰氯0.55 g（1.1 mmol）混合溶于5mL三氯氧磷中，加热回流10小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇20 : 1 柱色谱分离，得到目标化合物(0.27 g, 收率28%)。

实施例3

中间体化合物II N,N’-[罗丹明B-9’-(2-苯甲酰)基]肼的合成：

（1）罗丹明酰肼的合成

将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100 mL的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将0.6 mL 85%（10.4 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流3小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物3次。得产物3.27 g，产率：69%。

（2）罗丹明B 酰氯的制备

将10.00 g (20.9 mmol) 罗丹明B与20 mL三氯氧磷加入100 mL烧瓶中，在100℃条件下回流3h，点板检测进程，至原料反应完全，停止加热。减压蒸除多余的三氯氧磷，不经处理直接进行下一步反应。

（3）化合物II的合成

将上述步骤（1）制备的罗丹明B酰肼0.5 g（1.1 mmol）与步骤（2）制备的罗丹明B 酰氯0.55 g（1.1 mmol）混合溶于四氢呋喃中，常温搅拌8小时，反应完成后，减压除去溶剂，产物用甲醇重结晶。得产物0.26 g，产率：27%。 ¹H NMR: δ(CDCl₃, 400 MHz) 1.184(24H, s), 3.666(16H, d), 6.323(4H, d, J=7.6Hz), 6.444(4H, s), 6.489(4H, d, J=8.8Hz), 7.125(2H, s), 7.465(4H, s), 7.964(2H, s)。

实施例4

中间体化合物II N,N’-[罗丹明B-9-(2-苯甲酰)基]肼的合成：

（1）罗丹明酰肼的合成

将5 g（10.4 mmol）的罗丹明B用100ml的乙醇溶解，放入250 mL的烧瓶中，然后将8 mL 85%（138.6 mmol）的水合肼在室温的条件下逐滴加入到混合体系中，滴加完毕后将混合物加热强回流10小时，当溶液由暗紫色变为澄清的亮橙色时反应完毕，冷却至室温，减压除去溶剂，将1M HCl加入蒸干的混合物中，然后将1M NaOH调节混合物pH到9，抽滤，15 mL蒸馏水洗涤产物3次。得产物4.17 g，产率：88%

（2）罗丹明B 酰氯的制备

将10.00 g (20.9 mmol) 罗丹明B与35 mL三氯氧磷加入100 mL烧瓶中，在100℃条件下回流10h，点板检测进程，至原料反应完全，停止加热。减压蒸除多余的三氯氧磷，不经处理直接进行下一步反应。

（3）化合物I的合成

将上述步骤（1）罗丹明B酰肼0.8 g（1.76 mmol）与步骤（2）罗丹明B 酰氯0.55 g（1.1 mmol）混合溶于四氢呋喃中，常温搅拌8小时，反应完成后，减压除去溶剂，产物用甲醇重结晶。得产物0.40 g，产率：41%。

实施例5

通过中间体化合物II合成目标化合物的方法：

将中间体化合物II 0.088 g溶于2 mL三氯氧磷中，加热回流10小时，反应完成后将其冷却到室温并倒入冰水中，二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥，减压除去溶剂，所得粗品经体积比为二氯甲烷/甲醇20 : 1 柱色谱分离，得到目标化合物I 0.047 g, 收率55 %。

实施例6.

化合物I的细胞染色及其荧光成像实验：

1. 细胞染色及其染色荧光成像实验材料与方法

1.1细胞及其培养的方法：

（a）试验的细胞：选用NIH-3T3细胞（小鼠成纤维细胞）；

（b）细胞的培养：DMEM（高糖）培养基；10 % 胎牛血清；

（c）细胞铺板过程（24孔）：取生长状态良好的NIH-3T3细胞，制成5x10⁴/ mL 细胞悬液；24孔板每孔加入1.0 mL 细胞悬液。37^oC，5% CO₂条件下培养48小时，分别进行活细胞组、固定后细胞组的细胞染色和荧光成像观察。

1.2 试验用荧光染料样品化合物I溶液配制：

依标准方法，化合物I用1%的醋酸溶液配制成4.0 mg/mL溶液作为试验用样品溶液。

1.3. 细胞荧光染色成像：

（一）活细胞组实验：

（1）吸取经培养48小时后的各孔培养基；

（2）加入200μL/孔试验用化合物I样品溶液，在室温下静置15分钟；

（3）吸取样品溶液，用1%醋酸溶液洗5遍；

（4）使用荧光倒置显微镜观察、照像，荧光激发光波长570 nm。

（二）固定后细胞组：

（1）吸取经培养48小时后的各孔培养基；

（2）于每孔加入10% 的醋酸溶液0.5 mL进行固定；

（3）在 4^oC条件下静置1小时；

（4）使用PBS溶液洗5遍；

（5）加入200μL/孔试验用化合物I样品溶液，于室温下静置15分钟；

（6）吸取样品溶液，使用1% 醋酸溶液洗5遍；

（7）在荧光倒置显微镜下观察、照像，荧光激发光波长为570 nm。

2. 化合物I的细胞染色与荧光成像实验结果与分析

2.1 荧光成像试验结果显示样品化合物I具有红色荧光成像效果；参见转化为灰度模式的荧光成像照片附图7；2.2 荧光染色结果表明，固定后细胞组荧光染色成像效果优于活细胞组的染色效果，参见转化为灰度模式的荧光成像照片附图8。

Claims

1.具有结构式I的化合物：

I。

2.具有结构式II的化合物：

II 。

3.权利要求1所述化合物I的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）将罗丹明B的乙醇溶液与85%的水合肼反应制备罗丹明B酰肼；其中罗丹明B与85%的水合肼的摩尔比1 ：1.5~5；

（2）将步骤（1）制备的罗丹明B酰肼与罗丹明B混合后，溶于三氯氧磷中，加热回流反应后经柱色谱分离，得到目标化合物I；其中罗丹明B酰肼：罗丹明B：三氯氧磷的摩尔比为1 : 1 : 1.5~5。

4.权利要求1所述化合物I的制备方法，其特征在于按如下的步骤进行：

II；

（2）将罗丹明B与三氯氧磷反应制备罗丹明B酰氯；其中罗丹明B与三氯氧磷的摩尔比为1 : 1-3.5；

（3）将步骤（1）和（2）制备的罗丹明B酰肼与罗丹明B酰氯以摩尔比为1 : 1.5~5 混合，得到化合物II；

（4）将化合物II溶于三氯氧磷中，加热回流反应，经柱色谱分离，得到目标化合物I；其中化合物II与三氯氧磷的摩尔比为1 : 0.5~5。

5.权利要求1所述结构式I化合物在制备作为细胞染料的生物染色剂方面的应用。