CN107407672B - 用于准确和灵敏检测s-期dna合成和细胞增殖的光稳定aie荧光团 - Google Patents

用于准确和灵敏检测s-期dna合成和细胞增殖的光稳定aie荧光团 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种具有AIE特性的生物探针。本发明还提供了其制备方法和用于检测S‑期DNA合成和细胞增殖的用途。所述探针具有叠氮基团，可以与含有端炔基的EdU经由在Cu(I)‑催化配合物进行反应。点击反应后，所述探针变成共价结合至DNA并出现荧光。与商业化的DNA生物探针Alexa647‑叠氮化物染料相比，本发明所述的AIE荧光团表现出更好的光稳定性和灵敏度。

Description

用于准确和灵敏检测S-期DNA合成和细胞增殖的光稳定AIE荧 光团
相关申请
本申请要求于2015年4月13日提交的第62/178,511号美国临时申请的优先权权益。上述申请的全文通过引用的方式结合入本申请。
技术领域
本发明涉及具有AIE特性的生物探针、其制备方法及在检测S-期DNA合成和细胞增殖中的用途。
背景技术
DNA是一类载有遗传指令的生物大分子。DNA对于有机体的发育和功能是重要的。S-期是细胞周期的过程之一，其中发生DNA的合成和复制。由于其生物学的重要性，科学家们付出巨大努力开发技术以更好地理解DNA合成，尤其在复杂生物体系中DNA合成的分子机制。这样积极的努力使得开发出许多小分子报告基因，所述报告基因可通过嵌入结合、静电结合和沟槽结合反应与DNA分子结合。放射性探针为选择性标记有丝分裂活跃细胞的早期方法，但其具有一些缺点。首先，放射性试剂具有危险性，并且其高成本和耗时的过程也限制了它们在快速高通量研究中的应用。标记的DNA的显微图像表现出低分辨率和低信噪比。并且，这些标记技术不允许同时用于表征增殖细胞。另一方面，荧光标记法已广泛用作细胞生物学中的“金标准”方法，这是由于其可提供快速检测、高灵敏度和较低的细胞毒性。例如，将5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU，一种胸苷类似物)结合至新合成的DNA证明其相对于使用放射性核苷类化合物具有许多优点。然而，该BrdU试验也具有一些局限性，例如将DNA变性使其可为抗体所靶向、严苛的处理条件(热、酸和核酸酶)，以及限制抗体通过固定的组织进行渗透。最近，报道了一种使用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU，另一种胸苷类似物)的直接S-期检测方法。在这种方法中，具有端基炔官能团的EdU首次被结合至新合成的DNA。炔单元与具有叠氮基团的荧光染料的点击反应(click reaction)被Cu(I)配合物催化，产生染料标记的双链DNA。不同类型的荧光探针被开发用于监测DNA如Alexa Fluor染料的合成过程，其实例为如下作者所报道：Peter T.Czerney(US8039648B2)，F.Hoffmann-La Roche Ag(WO2012031817A1)和Surbhi Desai(US 20100317045A1)。尽管Alexa Fluor染料在检测DNA合成中具有良好的选择性和灵敏度，但它们通常具有普遍存在的现象，该现象被认为是聚集导致的淬灭剂(ACQ)或浓度淬灭。与上述材料相比，具有聚集诱导发光(AIE)特性的有机分子已表现出更好的光稳定性和灵敏度，这使其成为具有前景的替代物。
发明概述
本发明中，设计和合成了新的荧光探针如可用于点击反应的TPE-Py-N3和Cy-Py-N3。所述探针具有叠氮基团，可与含有端炔基的EdU经由Cu(I)催化配合物进行反应。点击反应后，所述探针变成共价结合至DNA并出现荧光。所述探针由具有AIE特性的化合物构建，叠氮基团用于点击反应。已发现该染料对DNA合成具有高特异性，并具有较高的光稳定性和高耐褪色性。由于以上优势，我们将所述染料用于监控DNA合成的过程。
附图说明
图1：TPE-Py-N3和Cy-Py-N3的合成路线。
图2：Cy-Py-N3在DMSO-d6中的1H-NMR谱图。
图3：Cy-Py-N3的质谱图。
图4：(A)TPE-Py-N3在不同含水分数(fw)的DMSO/水混合物中的PL谱图；(B)(I/I0)值相对于TPE-Py-N3含水混合物组成的图。I0＝纯DMSO溶液中的PL强度。[TPE-Py-N3]＝10μM；激发波长＝405nm。
图5：(A)Cy-Py-N3在不同含甲苯分数(fT)的DMSO/甲苯混合物中的PL谱图；(B)(I/I0)值相对于Cy-Py-N3含水混合物组成的图。I0＝纯DMSO溶液中的PL强度。[Cy-Py-N3]＝10μM；激发波长＝460nm。
图6：荧光显微镜检测HeLa细胞中S-期DNA合成。通过在含EdU的改性必需培养基中培育6小时，将HeLa细胞用EdU标记。固定的HeLa细胞使用(A-C)TPE-Py-N3和(D-F)Cy-Py-N3在tris缓冲液中染色30分钟，(A和D)为其明场(Bright field)图像，(B和E)为其荧光图像，(C和F)为其合并(Merged)图像。[EdU]＝[TPE-Py-N3]＝[Cy-Py-N3]＝20μM；激发波长：330-385nm(TPE-Py-N3)和520-560nm(Cy-Py-N3)。所有图像使用相同的比例尺＝30μm。
图7：固定的HeLa细胞使用(A和B)TPE-Py-N3和(C和D)Cy-Py-N3染色30分钟，然后使用纯DMSO洗涤，(A和C)为其明场图像，(B和D)为其荧光图像。[TPE-Py-N3]＝[Cy-Py-N3]＝20μM；激发波长：330-385nm(TPE-Py-N3)和520-560nm(Cy-Py-N3)。所有图像使用相同的比例尺＝30μm。
图8：对结合EdU后HeLa细胞随着培育时间增长的定量分析。插图：经TPE-Py-N3染色的细胞核荧光图像。[EdU]＝[TPE-Py-N3]＝20μM；激发波长：330-385nm。所有图像使用相同的比例尺。
图9：使用(A和B)TPE-Py-N3和(C和D)Cy-Py-N3标记的HeLa细胞流式细胞直方图(Flow cytogram)。数据使用405nm、488nm和633nm激光获得并使用FACSAria软件分析。蓝色峰代表G1相，红色峰表明出现G2/M相。
图10：在不同浓度的EdU/染料(1:1，M/M)下培育的HeLa细胞的标准化荧光强度。
图11：使用不同浓度的EdU/TPE-Py-N3(1:1，M/M)染色的HeLa细胞的PL变化。激发波长＝405nm。
图12：使用不同浓度的EdU/Cy-Py-N3(1:1，M/M)染色的HeLa细胞的PL变化。激发波长＝460nm。
图13：使用不同EdU浓度培育的HeLa细胞的细胞活力。
图14：染料标记的HeLa细胞随辐照时间增加的PL变化。激发波长：442nm(TPE-Py-N3)、458nm(Cy-Py-N3)和633nm(Alexa647-叠氮化物)；发射滤光片：450-750nm(TPE-Py-N3)、480-750nm(Cy-Py-N3)和640-750nm(Alexa647-叠氮化物)。辐照时间：5.24s/扫描。激光功率：0.3μW。
图15：在不同次扫描获得的染料标记的固定HeLa细胞荧光图像。激发波长：442nm(TPE-Py-N3)、458nm(Cy-Py-N3)和633nm(Alexa647-叠氮化物)；发射滤光片：450-750nm(TPE-Py-N3)、480-750nm(Cy-Py-N3)和640-750nm(Alexa647-叠氮化物)。辐照时间：5.24s/扫描。激光功率：0.3μW。所有图像使用相同的比例尺。
发明详述
本发明提供一种化合物，其包含选自下列式1-4的骨架结构：
Figure BDA0001432195970000041
其中，R1和R1’彼此独立地选自H、CN、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基，所述每一个基团任选被一个或多个R4取代；
每一个R4独立地选自化学键、卤素、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、烯氧基、环烷基氧基、环烯基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、烷硫基、环烷基硫基、环烯基硫基、杂环基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基和杂芳基氧基、氨基、叠氮基(-N3)、OH、SH、COOH、NCS，所述每一个基团任选进一步被一个或多个R5取代，其中R5任选被R8取代；
每一个R5独立地选自卤素、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、烯氧基、环烷基氧基、环烯基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、烷硫基、环烷基硫基、环烯基硫基、杂环基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基和杂芳基氧基、氨基、叠氮基(-N3)、OH、SH、COOH、NCS；
R2和R3彼此独立地选自R8，或任选被R8取代的R4，条件是R2和R3中的至少一个选自R8或R8取代的R4；
每一个R8独立地选自：
Figure BDA0001432195970000051
每一个L独立地为一个连接基团，优选选自化学键、烷基、烯基例如乙烯基，所述基团任选被一个或多个R4取代；
每一个R6独立地选自烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、烯氧基、环烷基氧基、环烯基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、烷硫基、环烷基硫基、环烯基硫基、杂环基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基和杂芳氧基、氨基，所述每一个基团被至少一个叠氮基取代并且任选进一步被一个或多个R4取代；
每一个R7独立地选自H、CN、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基，所述每一个基团任选被一个或多个R4取代；
R10和R10’彼此独立地选自H、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基，所述每一个基团任选被一个或多个R4取代；
每一个A-独立地选自反离子。
优选地，每一个R6独立地选自叠氮基取代的烷基，所述烷基任选进一步被一个或多个R4取代；和
每一个A-独立地为一价反离子，其选自I-、Cl-、Br-、PF6 -、ClO4 -、BF4 -、BPh4 -、CH3PhSO3 -和其他一价反离子。
根据本发明的实施方案，所述化合物包含选自下式I-VI的骨架结构：
Figure BDA0001432195970000061
其中，Ra、Rb和Rc彼此独立地选自H、CN、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基，所述每一个基团任选被一个或多个R4取代；和
R4独立地具有如上所述的定义。
作为实例，所述化合物可选自如下的Cy-Py-N3和TPE-Py-N3：
Figure BDA0001432195970000071
本发明还提供制备上述化合物的方法，包括如下式1-1、2-1、3-1或4-1化合物作为叠氮基受体与叠氮基供体进行叠氮化反应：
Figure BDA0001432195970000072
其中，R11和R11’彼此独立地选自H、CN、烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基，所述每一个基团任选被一个或多个R4取代；
R21和R31彼此独立地选自R4或者R8’，条件是R2’和R3’中的至少一个选自R8’或R8’取代的R4；
每一个R8’独立地选自：
Figure BDA0001432195970000073
每一个R6’独立地选自被烷基、烯基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基、杂芳基、烷氧基、烯氧基、环烷基氧基、环烯基氧基、杂环基氧基、芳基氧基、杂芳基氧基、烷硫基、环烷基硫基、环烯基硫基、杂环基硫基、芳基硫基、杂芳基硫基和杂芳基氧基、氨基，所述每一个基团被至少一个离去基团取代并且任选进一步被一个或多个R4取代；
所述离去基团优选选自卤素；和
其他基团独立地具有如上所述的定义。
根据本发明，叠氮基供体可选自任意一种适于上述叠氮化反应的常见叠氮化试剂或其任意混合物。作为实例，叠氮基团供体可以为叠氮化钠NaN3。
本发明还提供一种生物探针或者AIE荧光团(AIEgen)，其具有选自上述式1-4的骨架结构。
本发明还提供一种检测DNA合成和/或者细胞增殖的方法，特别是体外检测肿瘤细胞如HeLa细胞或者MCF-7的S-期DNA合成和/或细胞增殖的方法，所述方法包括将所述化合物、生物探针或AIE荧光团与细胞核内的DNA共价结合。
根据本发明的方法，所述化合物、生物探针或AIE荧光团通过点击反应与细胞核内的DNA共价结合。
根据本发明，所述方法包括下列步骤：
1)使用所述化合物、生物探针或AIE荧光团处理细胞；和
2)通过荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜检测细胞成像。
在一些实施方案中，上述方法也可用于活细胞追踪。
本发明还提供所述化合物、生物探针或AIE荧光团在检测DNA合成和/或细胞增殖中的用途，特别是在体外检测肿瘤细胞如HeLa细胞或MCF-7的S-期DNA合成和/或细胞增殖中的用途。
本发明还提供所述化合物、生物探针或AIE荧光团用于活细胞追踪的用途。
与Alexa-叠氮染料(商业化的DNA生物探针)相比，所述AIE荧光团表现出更好的光稳定性和灵敏度。
术语和定义
为了本发明的目的，除非有特殊说明，所述取代基具有如下含义：
术语“卤素”、“卤原子”或者“卤代”代表氟、氯、溴和碘，特别是氯或氟，优选为氟。
术语“烷基”代表具有具体指明的碳原子数的直链或支链烷基，例如C1-C10烷基是指具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基。如果没有具体指明碳原子数，术语“烷基”通常代表具有1-40，特别是1-30，优选1-20个碳原子的直链或支链烷基。特别地，烷基具有1、2、3、4、5或6个碳原子(“C1-C6烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基。优选地，烷基含有1、2或3个碳原子(“C1-C3烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
术语“烯基”应被理解为，优选意指直链或支链的一价烃基，其含有一个双键并且具有2个或者更多个碳原子(例如“C2-C6烯基”)。所述烯基例如为乙烯基、烯丙基、(E)-2-甲基乙烯基、(Z)-2-甲基乙烯基或异丙烯基。
术语“烷氧基”应当理解为优选意指式-O-烷基的直链或者支链的饱和一价烃基，其中术语“烷基”具有上述定义，例如为甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、戊氧基、异戊氧基、己氧基或其异构体。特别地，“烷氧基”为“C1-C6烷氧基”、“C1-C4烷氧基”、“C1-C3烷氧基”、甲氧基、乙氧基或丙氧基，优选为甲氧基、乙氧基或丙氧基。进一步优选为“C1-C2烷氧基”，特别是甲氧基或乙氧基。
术语“烷硫基”应当理解为优选意指式-S-烷基的直链或者支链的饱和一价烃基，其中术语“烷基”具有上述定义。
术语“环烷基”应当理解为优选意指直链或者支链的饱和一价单环烃环，其含有例如3、4、5、6、7或8个碳原子。C3-C8环烷基例如为单环烃环，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。特别地，所述环烷基为C4-C6环烷基、C5-C6环烷基或环己基。例如，术语“C3-C6环烷基”应理解为优选意指饱和一价单环烃环，其含有例如3、4、5或6个碳原子。具体而言，C3-C6环烷基为单环烃环，例如环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
术语“环烷基氧基”应理解为优选意指式-O-环烷基的基团，其中术语“环烷基”具有如上所述的定义。
术语“环烷基硫基”应理解为优选意指一个为通式-S-环烷基的基团，其中，术语“环烷基”具有上述定义。
术语“环烯基”应理解为优选意指非芳香单环烃环，其含有一个或多个双键，例如环丙烯基、环丁烯基、环戊烯基、环己烯基或者环庚烯基，其中所述环与该分子其余部分间的键可以为所述环的任意碳原子，所述碳原子可以为饱和或者非饱和的碳原子。
术语“烯氧基”应理解为优选意指式-O-环烷基的基团，其中，术语环烷基具有上述定义。
术语“杂环基”应理解为优选意指饱和或部分不饱和的一价单环或双环烃环，其含有例如3、4、5、6、7、8或9个碳原子并且进一步含有1、2或者3个选自氧、硫或氮的含杂原子基团。特别地，术语“杂环基”应理解为意指“4-10元杂环”。优选地，本文使用的“杂环基”是非芳香性的。
所述杂环例如为单环杂环如氧杂环丁烷基、吖丁啶基、四氢呋喃基、吡咯烷基、1,3-二氧戊环基、咪唑烷基、吡咯烷基、噁唑烷基、异噁唑烷基、1,4-二氧六环基、吡咯啉基、四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、1,3-二噻烷基、硫代吗啉、哌嗪基或喹核碱基(chinuclidinyl)。任选地，所述杂环基可含有一个或多个双键，例如4H-吡喃基、2H-吡喃基、2,5-二氢-1H-吡咯基、1,3-间二氧杂环戊烯基、4H-1,3,4-噻二嗪基、2,5-二氢呋喃基、2,3-二氢呋喃基、2,5-二氢噻吩基、2,3-二氢噻吩基、4,5-二氢噁唑基、4,5-二氢异噁唑基或4H-1,4-噻嗪基，或者其可以与苯并结构稠合。
特别地，术语“杂环基”应理解为含有3、4或5个碳原子和1、2或3个上述含杂原子基团的杂环(“4至8元杂环”)。更特别地，所述环可含有4或5个碳原子和1、2或3个上述含杂原子基团(“5-至8-元杂环”)。更特别地，所述杂环是“6元杂环”，其应被理解为含有4个碳原子和2个上述含杂原子基团，或为含有5个碳原子和1个上述含杂原子基团，优选4个碳原子和2个上述含杂原子基团。
术语“杂环基氧基”应理解为优选意指式-O-杂环基的基团，其中术语“杂环基”具有上述定义。
术语“杂环基硫基”应理解为优选意指式-S-杂环基的基团，其中术语“杂环基”具有上述定义。
术语“芳基”应理解为优选意指一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，所述烃环具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子(“C6-C14芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“C6芳基”)，例如苯环，或联苯基；或具有9个碳原子的环(“C9芳基”)，例如茚满基或者茚基；或具有10个碳原子的环(“C10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢化萘基或萘基；或具有13个碳原子的环(“C13芳基”)，例如芴基；或者具有14个碳原子的环(“C14芳基”)，例如蒽基。
术语“杂芳基”应理解为优选意指一价单环、双环或三环芳香环系，所述环系具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子(“5-14元杂芳基”，例如6元杂芳基)，特别是5或6或9或10个碳原子，并且其含有至少一个杂原子，所述杂原子可以相同或者不同。所述杂原子例如可以为氧、氮或硫，并且在每一种情况下可以和苯并结构稠合。特别地，杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、噻-4H-吡唑基等，以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并三唑基、吲唑基、吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基等；或者吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基等，以及它们的苯并衍生物；或邻二氮杂萘基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基(naphthpyridinyl)、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、呫吨基(xanthenyl)或恶庚因基(oxepinyl)等。
术语“5-元杂芳基”应理解为优选意指一价芳香环系，所述环系具有5个环原子和并且含有至少一个杂原子，所述杂原子可以相同或不同。杂原子例如为氧、氮或硫。特别地，“5-元杂环基”选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、四唑基。
术语“6元杂芳基”应理解为优选意指一价芳香环系，所述环系具有6个环原子和并且含有至少一个杂原子，所述杂原子可以相同或不同。杂原子例如为氧、氮或硫。特别地，“6元杂环基”选自吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基。
一般而言，除非另有说明，杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如其位置异构体。因此，就一些说明性的非限制性实例而言，术语吡啶基或吡啶亚基包括吡啶-2-基、吡啶-2-基亚基、吡啶-3-基、吡啶-3-基亚基、吡啶-4-基、吡啶-4-基亚基；或者，术语噻吩基或噻吩亚基包括噻吩-2-基、噻吩-2-基亚基、噻吩-3-基、噻吩-3-基亚基。
术语“芳氧基”或“杂芳氧基”应理解为优选意指式-O-芳基或-O-杂芳基的基团，其中术语“芳基”或“杂芳基”分别具有上述定义。
术语“芳基硫基”或者“杂芳基硫基”应理解为优选意指式-S-芳基或-S-杂芳基，其中术语“芳基”和“杂芳基”分别具有上述定义。
本文使用的数值范围“1-10”以及其所包含的亚范围应理解为意指具有限定数量的1-10个(即1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)原子，如碳原子的基团。
术语“任选取代”意指可选地被具体的基团、取代基或部分结构取代。
如本文所使用的，术语“一个或多个”，例如在本发明通式化合物的取代基定义中，应理解为意指“1、2、3、4或5个，特别是1、2、3或4个，更特别是1、2或3个，更进一步特别是1或2”。
本发明还包括本发明化合物的所有适宜的同位素变体。本发明化合物的同位素变体定义为所述化合物中的至少一个原子被原子序数相同，但原子质量与自然界中通常或主要发现的原子质量不同的原子替换。可结合至本发明化合物中的同位素实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴和碘的同位素。
具体实施方式
从下文对目前优选的实施方案所进行的结合附图的详细说明中，本发明上述的以及其他的特性和优势将变得更加明确。这些详细说明和附图仅是对本发明的说明，而并非对由权利要求及其等价方案所限定的本发明保护范围的限制。
除非另有说明，本文中的材料和试剂均为市售商品，或可由本领域技术人员根据现有技术制备。
材料
叠氮化钠、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)、甲醛、TritonX-100、二甲亚砜(DMSO)、硫酸铜(II)(CuSO4)、抗坏血酸、牛血清白蛋白(BSA)均购自Sigma-Aldrich。
改性的必需培养基(MEM)、5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)和Alexa647-叠氮化物得自Invitrogen。
胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶-EDTA溶液购自Life Technologies。四氢呋喃(THF)在氮气下从二苯甲酮钠(sodium benzophenone ketyl)中蒸馏后立即使用。
Milli-Q水由Milli-Q Plus System(美国Millipore公司)提供。
仪器
1H NMR谱图使用Bruker AV 400NMR光谱仪检测，DMSO-d6为溶剂，四甲基硅烷(TMS；δ＝0)作为内标。
UV光谱使用Milton Roy Spectronic 3000Array分光光度计检测。光致发光光谱(PL)使用Perkin-Elmer LS 55分光荧光计记录。
高分辨质谱图(HRMS)得自GCT Premier CAB 048质谱仪，采用MALDI-TOF模式。
实施例1制备
1.合成Cy-Py-N3
Cy-Py-N3根据图1所示的合成路线合成。向装有冷凝器的100mL两颈圆底烧瓶中加入Cy-Py-I(50.0mg,0.08mmol)的乙腈溶液(5mL)和叠氮化钠(20.5mg,0.32mmol)。回流8小时后，混合物冷却至室温并倒入乙醚中。生成的沉淀通过抽滤收集，重新溶解于5mL KPF6的饱和丙酮溶液中。所得混合物搅拌1小时。溶剂蒸发后，形成深红色沉淀物。沉淀物用水洗3次，收率95％。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ(ppm)：9.09-9.07(d,2H,J＝6.8Hz),8.57-8.55(d,2H,J＝6.8Hz),8.20-8.18(d,2H,J＝8.4Hz),8.05(s,1H),7.93-7.91(m,4H,),6.84-6.82(d,2H,J＝8.8Hz),4.60-4.57(t,2H,J＝7.2Hz),3.40-3.33(t,2H,J＝6.4Hz),3.04(s,6H),2.02-1.95(m,2H),1.59-1.52(m,2H).HRMS(MALDI-TOF):m/z 423.2243(M+,calcd.423.5322)(图2和图3)。
2.合成TPE-Py-N3
TPE-Py-N3根据Org.Biomol.Chem.,2013,11,7289-7296制备并合成。
终产品通过HRMS、1H NMR光谱充分表征，由光谱中获得对应其结构的满意结果。我们进一步研究了TPE-Py-N3和Cy-Py-N3的光学特性。
TPE-Py-N3和Cy-Py-N3在DMSO溶液中的紫外-可见(UV-vis)吸收光谱和光致发光(PL)光谱分别如图4和图5所示。TPE-Py-N3在DMSO溶液中最大吸收和发射波长分别位于406nm和600nm。TPE-Py-N3这样大的斯托克斯(Stokes)位移(>200nm)是由于其延伸的共轭以及由电子供体TPE部分向电子受体吡啶单元的分子内电荷转移(ICT)效应。由于生物成像通常使用405nm作为激发源，采用405nm的激发光用于PL检测。已知AIE分子在溶液中发光较弱或不发光，但在固态或聚集态发射较强荧光。为检验TPE-Py-N3是否具有AIE活性，我们记录了不同含水分数(fw)的TPE-Py-N3的DMSO/水混合物的PL谱图。从图4的PL谱图可以看出，纯DMSO溶液中的发光较弱，且当将最高80％的水加入DMSO溶液时，发光逐步减弱。然而，当fw进一步增加时，PL迅速增加。在含水量为99％时，发射强度比纯DMSO溶液中高六倍以上。通过图5的Cy-Py-N3PL谱图观测到相同的AIE特性。明显地，TPE-Py-N3和Cy-Py-N3具有AIE活性。
实施例2Cy-Py-N3和TPE-Py-N3的应用
1.细胞培养
人类宫颈癌细胞(HeLa)系由美国Type Culture Collection提供。HeLa细胞在含有10％热灭活FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素(Thermo Scientific)的MEM中培养，并且在37℃含有5％CO2的湿化孵化器中保持。在实验之前，细胞预先培养至达到融合。
2.使用EdU标记HeLa细胞和细胞固定
HeLa细胞在增补10％FBS、青霉素和链霉素的MEM中的盖玻片上生长。将浓度范围为10μM至200μM的EdU加入到培养基中，持续时间为1至24小时。EdU标记完成后，使用含有4％甲醛的PBS固定细胞20分钟。
3.荧光染料染色
固定后，使用含有3％BSA的PBS冲洗细胞一次，然后加入0.5％的Triton X-100，保持30分钟。细胞在1-200μM的荧光染料(10-100mM DMSO储备溶液)、100mM Tris缓冲液(pH＝8.5)、1mM CuSO4和50-100mM抗坏血酸中培育30分钟。每次的染色混合物为新制备，并在加入抗坏血酸后立即用于细胞染色。
4.细胞成像
荧光标记的细胞安装在标准的安装介质上，然后通过荧光显微法(BX 41显微镜)成像。条件：激发波长＝330-385nm，双色镜＝400nm，发射长通滤波器＝420nm(TPE-Py-N3)；激发滤色片＝540-580nm，双色镜＝600nm，发射长通滤波器＝610nm(Cy-Py-N3)。
5.光稳定性测试
荧光标记的细胞使用受激发射损耗(STED)超级分辨率激光扫描显微镜成像。激发波长：442nm(TPE-Py-N3)、458nm(Cy-Py-N3)和633nm(Alexa647-叠氮化物)；发射滤光片：450-750nm(TPE-Py-N3)、480-750nm(Cy-Py-N3)和640-750nm(Alexa647-叠氮化物)。激光功率统一为0.3μW。
6.流式细胞术测试
HeLa细胞在一个35mm的陪替氏培养皿中预先培育以实现期望的融合，并使用EdU培育指定的时间。培育完成后，HeLa细胞使用胰蛋白酶处理，使用PBS洗涤两次。使用BectonDickinson FACSAria IIIu流式细胞分析仪进行流式细胞分析。平均荧光通过计数10,000次测定。
7.细胞毒性研究
使用MTT试验评价EdU的细胞毒性。细胞接种在96孔板(Costar,IL,美国)，强度为5×103细胞/mL。培育24小时后，细胞暴露于37℃下培养基中一系列剂量的EdU中。培育24小时后，将新制备的MTT溶液(5mg/mL于PBS中)加入到每一个孔中。培育4小时后，加入含有10％SDS和0.01M HCl的100μL增溶溶液，以溶解紫色晶体。培育4小时后，使用Perkin-ElmerVictor酶标仪监测MTT在595nm处的吸光度。通过经EdU培育的细胞与仅使用培养基培育的细胞的吸光度来表达细胞活力。每个实验至少进行三次。
总结
1.细胞核成像
首次对两种AIE荧光团在增殖HeLa细胞中DNA合成的检测能力进行了研究。当DNA合成开始时，细胞接受溶剂中的EdU。叠氮基团TPE-Py-N3和Cy-Py-N3随后可以在Cu(I)配合物的存在下与EdU的炔基反应。该反应对DNA进行荧光标记并且使细胞核发光。为实现该目的，HeLa细胞在含有EdU的改性必需培养基中培育6小时。然后，它们被固定，然后使用AIE荧光团在含有CuSO4和抗坏血酸的Tris缓冲溶液中染色30分钟。
如图6中的荧光图像所示，HeLa细胞的细胞核在光激发下发出强光。相比之下，经过相同的染色条件，作为对照的无EdU标记的HeLa细胞没有表现出可检测到的荧光(图7)。
该结果表明，细胞核荧光来源于DNA的合成和EdU的结合，并且原因可能不是细胞核被AIE荧光团直接染色。当EdU的培育时间缩短至3小时时，细胞核的PL实际上可以被识别(图8)。
当然，当EdU的培育时间越长，细胞核的发光越强。约50％的细胞在EdU结合5小时后进行DNA合成。TPE-Py-N3和Cy-Py-N3随EdU培育时间逐渐的PL增强表明，AIE荧光团能够用来监测DNA合成的过程以及细胞增殖。另一方面，在EdU的存在下细胞循环过程可以使用流式细胞仪进行追踪。在细胞增殖过程中有四种明显的阶段，即为G1期(Gap 1)，S-期(DNA合成)，G2期(Gap2)和M期(有丝分裂)。非增殖的细胞处于G1期。当细胞发生DNA复制和分裂时，细胞进入G2/M期。S-期位于G1期和G2期之间。如图9所示，检测到G1期和G2/M期两个明显的峰。G1期和G2期之间较短的阶段为S-期。
2.浓度相关的检测
为了理解荧光强度与EdU/染料(1:1,M/M)浓度之间的关系，我们使用10μM至200μM不同浓度的EdU/染料处理HeLa细胞相同的标记时间。
由图10所示的结果可知，HeLa细胞的荧光随着EdU/染料的浓度从10μM增加至100μM而增强(图11和12)。
当使用Alexa647-叠氮化物(一种市售染料)取代AIE荧光团时观察到相同的现象，但是浓度范围更窄(10μM至40μM)。进一步增加EdU/染料的浓度会导致PL强度急剧下降。这主要由于Alexa647-叠氮化物的ACQ效应。相比之下，TPE-Py-N3和Cy-Py-N3表现出AIE特性。它们在高浓度下形成聚集物，其发光比它们的单个分子形式更强。尽管在高EdU/染料浓度(200μM)下出现小的发射下降，这可能是由于细胞环境的复杂性，但是AIE荧光团相较于Alexa647-叠氮化物更宽的工作浓度范围和更强的发射使它们成为DNA合成检测中更有前景的候选物。当EdU在高浓度下使用时可能诱发毒性。
为了确定EdU的结合是否会影响细胞活力和DNA复制的动力学，使用MTT试验评价EdU的细胞毒性。当将高达200μM的EdU加入到培养基中时，细胞活力没有明显变化(图13)。这个结果进一步证实，Alexa647-叠氮化物的PL下降仅仅是由于其ACQ效应，而与EdU的结合无关。
3.光稳定性
为了定量研究两种荧光染料和Alexa647-叠氮化物的光稳定性，细胞使用共聚焦显微镜连续扫描。HeLa细胞首先使用20μM的EdU培育24小时，然后分别使用20μM的TPE-Py-N3、Cy-Py-N3和Alexa647-叠氮化物染色30分钟。分别使用442nm、458nm和633nm通道辐照经TPE-Py-N3、Cy-Py-N3和Alexa647-叠氮化物染色的细胞。三种不同通道的激发功率借助功率计进行统一(0.3μW)。初始强度参照HeLa细胞的第一次扫描，所述HeLa细胞使用这三种荧光染料染色，并且计算荧光信号损失的百分比。
由图14所示，在总辐照时间5分钟内进行50次扫描后，没有观测到TPE-Py-N3和Cy-Py-N3明显的PL损失，然而在Alexa647-叠氮化物中记录到高于80％的信号损失。如图15的荧光图像所示，经AIE荧光图案染色的HeLa细胞的细胞核仍可清楚观测到。这些结果表明，本发明的AIE荧光团表现出远高于Alexa647-叠氮化物的耐光致褪色性。

Claims (4)

1.一种化合物在制备生物探针或AIE荧光团中的用途，其中所述生物探针或AIE荧光团用于检测DNA合成和/或者细胞增殖；
所述化合物选自如下的Cy-Py-N3和TPE-Py-N3：
Figure FDA0002632153600000011
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物探针或AIE荧光团用于体外检测肿瘤细胞的S-期DNA合成和/或细胞增殖，所述检测的方法包括将权利要求1中的化合物与细胞核内的DNA共价结合。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述肿瘤细胞选自HeLa细胞或者MCF-7。
4.根据权利要求3所述的用途，其中所述检测的方法包括如下步骤：
1)使用所述化合物处理细胞；和
2)通过荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜检测细胞成像。
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