CN102706839B - 水溶性aie发光剂及其在检测和延迟淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化中的用途 - Google Patents

Abstract

一种检测生物样品中淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化的方法，包括使水溶性聚集诱导发光(AIE)发光剂与所述生物样品接触并检测荧光，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：其中A选自-CN或R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为时，R和R’的至少一个不为H。

Description

水溶性AIE发光剂及其在检测和延迟淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化中的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2011年1月31日提交的美国临时申请第61/457,207和2012年1月27日提交的美国部分继续申请13/359,514的优先权权益，所述申请的全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本发明涉及一种水溶性聚集诱导发光(AIE，Aggregation-Induced Emission)发光剂及其在检测和延迟蛋白质的淀粉样纤维化中的用途。

背景技术

蛋白质功能依赖于正确的蛋白质折叠。在真核细胞中，许多新合成的蛋白质被转移入内质网中，在那里它们在一系列分子伴侣和折叠催化剂的帮助下折叠成正确的三维结构(K.Lindorff-Larsen，P. E.Paci，M.Vendruscolo和C.M.Dobson，Trends Biochem.Sci.，2005，30，13)。在这个过程中，不正确折叠的蛋白质将由质量控制机构检测到，然后在细胞质中通过蛋白酶体降解。质量控制过程的失效可导致蛋白质错误折叠和聚集(P.J.Muchowski，Neuron，2002，35，9)。蛋白质聚集成淀粉样原纤维被认为是许多神经变性疾病(包括阿尔兹海默病、帕金森病、朊病毒病和亨廷顿病)的病理学标志(C.M.Dobson，Nature，2003，426，884)。

胰岛素、淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α-突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质是常见的经历原纤维形成的蛋白质。其中，胰岛素被认为是淀粉样纤维化的模型(M.I.Ivanova，S.A.Sievers，M.R.Sawaya，J.S.Wall和D.Eisenberg，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，2009，106，18990)。在糖尿病患者经常注 射胰岛素的部位已经发现胰岛素的淀粉样原纤维(F.E.Dische，C.Wernstedt，G.T.Westermark，P.Westermark，M.B.Pepys，J.A.Rennie，S.G.Gilbey和P.J.Watkins，Diabetologia，1988，31，158)。近来，来自帕金森病患者的血清样品被报道显示出对胰岛素寡聚物和原纤维的自身免疫应答，这表明胰岛素聚集也可能与该疾病有关(K.R.Wilhelm，K.Yanamandra，M.A.Gruden，V.Zamotin，M.Malisauskas，V.Casaite，A.Darinskas，L.Forsgren和L.A.Morozova-Roche，Eur.J.Neurology，2007，14，327)。而且，胰岛素原纤维形成已经成为用于糖尿病治疗的胰岛素的输送和长期储存的障碍(S.Frokjaer和D.E.Otzen，Nat.Rev.Drug Discovery，2005，4，298)。了解胰岛素聚集的分子基础对于淀粉样化过程的建模以及用于糖尿病治疗的输送系统的改善具有重要意义。

胰岛素是一种具有51个残基的激素，其天然形式呈现为基本螺旋的结构(T.L.Blundell，J.F.Cutfield，G.G.Dodson，E.Dodson，D.C.Hodgkin和D.Mercola，Biochem.J.，1971，125，50P)。在生理条件下，胰岛素主要以锌配位六聚体存在。在体外，胰岛素在某些失稳条件(例如升高的温度、低pH、增加的离子强度以及暴露于疏水表面)下可形成淀粉样原纤维(J.Brange，L.Andersen，E.D.Laursen，G.Meyn和E.Rasmussen，J.Pharm.Sci.，1997，86，517)。分子间疏水相互作用或静电吸引是否是胰岛素原纤维形成的驱动力尚无定论(K.Giger，R.P.Vanam，E.Seyrek和P.L.Dubin，Biomacromolecules，2008，9，2338)。然而，通常认为天然结合态(二聚体、四聚体和六聚体)解离成单体是原纤维形成的先决条件(L.Nielsen，R.Khurana，A.Coats，S.Frokjaer，J.Brange，S.Vyas，V.N.Uversky和A.L.Fink，Biochemistry，2001，40，6036)。单体进行部分解折叠，形成中间态，其中它们再结合成稳定的纤维性淀粉样聚集体(L.Skora，S.Becker和M.Zweckstetter，J.Am.Chem.Soc.，2010，132，9223)。

已经通过各种光谱和显微技术研究了胰岛素的淀粉样原纤维形成，包括透射电子显微镜检查(TEM)、原子力显微镜检查(AFM)、实时光散射法、停留比浊法、X-射线衍射法、荧光法、圆二色性(CD)和NMR分光法(L.Skora，S.Becker和M.Zweckstetter，J.Am.Chem.Soc.，2010，132，9223；N.Rubin，E. Perugia，M.Goldschmidt，M.Fridkin和L.Addadi，J.Am.Chem.Soc.，2008，130，4602；M.Mauro，E.F Craparo，A.Podestà，D.Bulone，R.Carrotta，V.Martorana，G.Tiana和P.L.San Biagio，J.Mol.Biol.，2007，366，258；W.Dzwolak，R.Ravindra和R.Winter，Phys.Chem.Chem.Phys.，2004，6，1938；Herland，K.P.R.Nilsson，J.D.M.Olsson，P. P.Konradsson和O. J.Am.Chem.Soc.，2005，127，2317；K.R.Domike和A.M.Donald，Biomacromolecules，2007，8，3930；H.LeVine Iii，Protein Sci.，1993，2，404；P.Pratim Bose，U.Chatterjee，L.Xie，J.Johansson，E. 和P.I.Arvidsson，ACS Chem.Neurosci.，2010，1，315)。在这些技术中，荧光技术是最常用的方法，原因在于其简单快捷。尽管基于蛋白质的内荧光的研究已经被报道，但是它们的荧光通常比较弱并且处于UV区(L.Skora，S.Becker和M.Zweckstetter，J.Am.Chem.Soc.，2010，132，9223)。荧光技术的使用仍然依赖于合适的荧光染料的开发。硫磺素T是在形成于溶液中的淀粉样蛋白的分析中常规使用的一种低分子量染料(H.LeVine Iii，Protein Sci.，1993，2，404；C.Rodríguez-Rodríguez，A.Rimola，L.Rodríguez-Santiago，P.Ugliengo，A. -Larena，H.Gutiérrez-De-Terán，M.Sodupe和P.González-Duarte，Chem.Commun.，46，1156)。近来又报道共轭低聚噻吩、二氟化硼衍生物和若丹明类似物用于体外淀粉样原纤维的定性研究或体内淀粉样斑块的可视化(Y.Liang，D.G.Lynn和K.M.Berland，J.Am.Chem.Soc.，2010，132，6306)。

这些荧光染料的大多数都主要由电子供体和受体基团组成，并因此具有(扭型)分子内电荷转移特性。由于对环境的疏水性敏感，经与淀粉样原纤维的富含疏水β-折叠的区域结合，它们的荧光得以增强。当荧光团分子在蛋白质的疏水片上积聚时，它们发生强的π-π叠加相互作用，这通常促进有害的物质例如激发体和激发复合体的形成。这导致发光自我猝灭并使得所述染料对于定量分析不那么具有吸引力(Y.Hong，J.W.Y.Lam和B.Z.Tang，Chem.Commun.，2009，4332)。

蛋白质聚集抑制剂的研究对于理解原纤维形成过程以及对于有效治疗剂的 开发具有重要意义。许多物质，包括小分子、肽和纳米颗粒，已知干涉纤维化过程((a)M.Necula，R.Kayed，S.Milton和C.G.Glabe，J.Biol.Chem.，2007，282，10311；(b)C.Cabaleiro-Lago，F.Quinlan-Pluck，I.Lynch，K.A.Dawson和S.Linse，ACS Chem.Neurosci.，2010，1，279；(c)C.Lendel，C.W.Bertoncini，N.Cremades，C.A.Waudby，M.Vendruscolo，C.M.Dobson，D.Schenk，J.Christodoulou和G.Toth，Biochemistry，2009，48，8322；(d)C.Cabaleiro-Lago，I.Lynch，K.A.Dawson和S.Linse，Langmuir，2010，26，3453)。例如，共聚纳米颗粒被报道促进β2-微球蛋白纤维化，但减缓淀粉样蛋白β肽的聚集(C.Cabaleiro-Lago，F.Quinlan-Pluck，I.Lynch，S.Lindman，A.M.Minogue，E.Thulin，D.M.Walsh，K.A.Dawson和S.Linse，J.Am.Chem.Soc.，2008，130，15437)。阳离子聚苯乙烯纳米颗粒表现出促进和延迟效应，取决于它们在溶液中的表面积。在室温胰岛素在其等电点的聚集在肝素存在的情况下受到抑制。

因此，在现有技术中，对于能够更好地检测和延迟蛋白质的淀粉样纤维化的物质存在持续的需求。

发明内容

本发明涉及一种水溶性聚集诱导发光(AIE，Aggregation-Induced Emission)发光剂，其包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或 R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为 时，R和R’的至少一个不为H。本发明描述的水溶性AIE发光剂具有区分生物样品中淀粉样蛋白质的天然形式和纤维化形式以及延迟淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化的双重功能，能够用作淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化的定量和动力学分析的外部工具以及用作淀粉样蛋白质(例如药用胰岛素)的长期储存和输送的抗淀粉样纤维化剂。

在一个实施方式中，n是1至15、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4或2至3的整数。在另一个实施方式中，n是3。

在一个实施方式中，可用于本发明的碱金属或碱土金属离子选自K⁺、Li⁺、Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺。

在一个具体实施方式中，本发明的水溶性AIE发光剂是具有式II结构的1，2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1，2-二苯基乙烯钠(TPE-SO3)或具有式III结构的1，2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1，2-二氰基乙烯钠。

在一个实施方式中，可用于本发明的淀粉样蛋白质可选自胰岛素、淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α-突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质。

在一个实施方式中，可用于本发明的生物样品选自组织样品、细胞样品、血液、唾液、脊髓液、淋巴液、阴道液、精液和尿液。在一个方面，所述生物样品是尿液。

在一个实施方式中，本发明涉及一种检测生物样品中淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化的方法，包括使水溶性聚集诱导发光(AIE)发光剂与所述生物样品接触并检测荧光，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或 R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为 时，R和R’的至少一个不为H。

在一个方面中，接触步骤在等于或小于所述淀粉样蛋白质的等电点的pH值进行。在进一步的方面中，所述淀粉样蛋白质为胰岛素并且所述接触在等于或小于5.6的pH值进行。

在一个方面中，检测步骤包括测量470nm处的荧光强度。

在一个方面中，荧光增加指示淀粉样纤维化形成。

在一个实施方式中，本发明涉及一种延迟淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化的方法，包括使有效量的水溶性AIE发光剂与淀粉样蛋白质接触以形成稳定化的淀粉样蛋白质，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或 R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R” 选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为 时，R和R’的至少一个不为H。

在一个方面中，所述蛋白质是施用给受试者的药用胰岛素。

在一个方面中，受试者是患有糖尿病的受试者。

在一个实施方式中，本发明涉及一种储存和输送淀粉样蛋白质的方法，其包括使有效量的水溶性AIE发光剂与淀粉样蛋白质接触以形成稳定化的淀粉样蛋白质，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或 R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为 时，R和R’的至少一个不为H。

在一个实施方式中，本发明涉及水溶性AIE发光剂在制备用于诊断受试者中淀粉样变性疾病的药物中的用途，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或 R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为 时，R和R’的至少一个不为H。

在一个方面中，所述淀粉样变性疾病为糖尿病或神经变性疾病。在进一步的方面中，神经变性疾病包括阿尔兹海默病、帕金森病、朊病毒病和亨廷顿病。

在一个实施方式中，本发明涉及水溶性AIE发光剂在制备用于淀粉样蛋白质储存和输送的抗淀粉样纤维化剂中的用途，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或 R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为 时，R和R’的至少一个不为H。

在一个实施方式中，本发明涉及一种用于检测生物样品中淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化、延迟淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化、储存和输送淀粉样蛋白质或诊断受试者中淀粉样变性疾病的组合物，所述组合物包含有效量的水溶性AIE发光剂，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或 R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为 时，R和R’的至少一个不为H。

在一个实施方式中，本发明涉及一种水溶性AIE发光剂，其包含式I骨架结构：

其中A  为-CN，R选自O(CH₂)₃SO₃ ^-R”、O(CH₂)₃N(CH₃)₃ ⁺Br^-、O(CH₂)₃N(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或O(CH₂)₃COOR”，并且R”选自碱金属或碱土金属离子。在一个方面中，水溶性AIE发光剂是1，2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1，2-二氰基乙烯钠。

附图说明

图1：(A)显示在天然和原纤维态的牛胰岛素存在下TPE-SO3的FL谱。(B)显示在不同的原纤维胰岛素(实心圆)和天然胰岛素(空心圆)浓度在470nm处TPE-SO3的FL强度。图1B插图图解了在具有不同的原纤维胰岛素部分摩尔比(fF)的胰岛素混合物中TPE-SO3的荧光强度，其中总蛋白浓度在每轮实验中保持在5μM。I_o＝不存在胰岛素时的FL强度；[TPE-SO3]为5μM；λ_ex＝350nm。

图2显示通过TPE-SO3溶液染色的胰岛素原纤维的荧光显微照片(样品获自图1A)。

图3：(A)示出了在65℃在缓冲溶液(pH1.6)中温育不同时间段的胰岛素的TPE-SO3FL谱。(B)显示以不同的温育时间间隔记录在470nm处胰岛素的TPE-SO3FL强度。所有的测量在PBS缓冲液(pH＝7.0)中进行；[TPE-SO3]＝15μM；[胰岛素]＝5μM，且λ_ex＝350nm。

图4：TPE-SO3浓度对胰岛素纤维化的效应。(A)显示温育胰岛素与不同浓度的TPE-SO3对于胰岛素纤维化的效应；不存在TPE-SO3的情况下胰岛素纤维化的数据被给出用于比较(实心圆)。(B)显示当与胰岛素温育时迟滞期持续时间随着TPE-SO3浓度增加的变化。(C)图解了当与胰岛素温育时纤维化速率(rF，表示为生长期的斜率)随着TPE-SO3浓度增加的变化。胰岛素与0、10、25、50或100μM TPE-SO3在缓冲液中于65℃温育。最终的FL测量：[胰岛素]＝5μM；[TPE-SO3]＝5μM；λ_ex＝350nm。

图5显示TPE-SO3的MTT毒性测试。

图6示出了TPE-SO3对各种蛋白质的荧光行为。

图7示出了TPE-SO3与老化前后的淀粉样蛋白β-肽的发光。

图8示出了在溶菌酶纤维化期间不同浓度的TPE-SO3的荧光增强速率。

图9示出了在不同条件下胰岛素原纤维的形成：A和D是SEM图像，B、C、E和F是TEM图像，它们示出了在不存在(A、B、D和E)和存在(C和F)TPE-SO3的情况下在pH 1.6的缓冲液中于65℃温育1小时(A-C)和7小时(D-F)后的胰岛素。

图10示出本发明的AIE化合物的延迟效应的机理。

具体实施方式

定义

如本文所使用，术语“淀粉样蛋白质”是指在某些失稳条件(例如升高的温度、低pH、增加的离子强度以及暴露于疏水表面)下可形成淀粉样原纤维，例 如胰岛素、淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α-突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质。

如本文所使用，术语“有效量”是指能够发挥本发明的水溶性AIE发光剂的功能的量。本领域技术人员根据说明书的教导，将能够根据实际要求容易地确定本发明的水溶性AIE发光剂的有效量。

如本文所使用，术语“聚集诱导发光(AIE)”是指荧光/发光在聚集体形成或在固态情况下得以开启。当AIE分子溶解于溶剂中时，其是非发光性的。然而，当分子间的旋转/运动受到限制时，发光得以开启。

如本文所使用，术语“荧光强度”是指从荧光分光光度计或荧光显微镜等测量获得的荧光强度。

除非本文另外定义，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域技术人员通常理解的含义。

在本文中，使用术语“包括/包含”来描述各种实施方式。然而，本领域技术人员将理解，在一些具体情况中，实施方式可以被理解为“基本上由......组成”或“由......组成”。

水溶性AIE发光剂

发明人观察到水溶性共轭多烯表现出与在常规荧光团中观察到的现象相反的新现象。聚集开启了其发光而不是猝灭，这使得其从非发光分子变成强的发光体。发明人将这种现象称之为“聚集诱导发光(AIE)”并将这类分子称为AIE发光剂，因为其通过聚集体形成而诱导强发光。聚集态下分子内旋转的限制被认为是新AIE现象的主要原因。用离子或极性官能团修饰本发明的AIE发光剂使其具有水溶性。尽管它们在水性介质中为非发光性的，但这些分子在与生物分子结合后强烈发光，这使得它们可用作生物分析的“开启(turn-on)”探针。在本发明中，发明人开发了淀粉样原纤维分析的AIE生物探针，原因在于其生理学和药学上的重要性。本发明的AIE发光剂能够在生理条件下区分淀粉样蛋白如胰岛素的天然和原纤维形式，并因此可用作淀粉样原纤维形成的定量分析和动力学研究的外部工具。此外，发明人还研究了本发明的AIE发光剂在体外对于淀 粉样纤维化的效应。除了作为指示剂的外部工具，本发明的AIE发光剂还显示出在高温下在低pH值的介质中对于淀粉样纤维化的独特的延迟效应。该延迟效应的程度取决于与淀粉样蛋白质共温育的AIE发光剂的量，两者成比例。

本发明的水溶性AIE发光剂的例子可以为包含式I骨架结构的化合物：

其中A选自-CN或 R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为 时，R和R’的至少一个不为H。本发明的化合物表现出聚集诱导发光。

在一个实施方式中，n是1至15、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4或2至3的整数。在另一个实施方式中，n是3。

在一个实施方式中，碱金属或碱土金属离子选自K⁺、Li⁺、Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺。

在一个具体实施方式中，本发明的水溶性AIE发光剂是具有式II结构的1，2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1，2-二苯基乙烯钠(TPE-SO3)或具有式III结构的1，2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1，2-二氰基乙烯钠。

水溶性AIE发光剂的合成

本发明的水溶性AIE发光剂可根据不同的方法制备。这些合成方法的非限制性实例在下文描述。

方案1：四苯基多烯(TPE)衍生物的合成

方案2：二苯基二氰基多烯衍生物的合成

本发明所属领域的普通技术人员可容易地选择和使用上述方案中描述的前体的合适取代的版本以合成相应的取代产物而无需过多的试验。

水溶性AIE发光剂的用途

本发明描述的水溶性AIE发光剂具有区分生物样品中淀粉样蛋白质的天然形式和纤维化形式以及延迟淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化的双重功能，能够用作淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化的定量和动力学分析的外部工具以及用作蛋白质(例如药用胰岛素)的长期储存和输送的抗淀粉样纤维化剂。

淀粉样原纤维形成的检测

本发明的水溶性AIE发光剂一个实例是1，2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1，2-二苯基乙烯钠(TPE-SO3)，其根据本文所描述的合成方案1进行合成。TPE-SO3的AIE效应是非常特异和灵敏的。如图1A所示，TPE-SO3溶液在不存在蛋白质时是非发光性的。该溶液在加入天然牛胰岛素后在约470nm处保持微弱发光(图1A虚线)。如前所述，天然胰岛素是一种51个残基的激素并呈现为基本螺旋的结构。另一方面，胰岛素在某些条件例如升高的温度和低pH值下胰岛素可在体外形成淀粉样原纤维。因此，当天然胰岛素在高温(例如65℃)和低pH(例如pH 1.6)下加热时，原纤维胰岛素逐渐形成并且TPE-SO3溶液发荧光(图1A实线)。其荧光强度随着原纤维胰岛素浓度的增加而逐渐增强。仔细观察结合等温线，发现在低胰岛素浓度范围(0-5μM)存在线性关系(图1B)。甚至当天然胰岛素的浓度从0变化至100μM时，TPE-SO3的荧光仍保持可忽略不计。此外，TPE-SO3对于原纤维胰岛素的荧光发射被证明不受天然胰岛素的存在所影响(图1B插图)。TPE-SO3的发光随着原纤维胰岛素部分的线性增加而单调递增。

本发明的TPE-SO3具有优异的水溶性，原因在于其磺酸基团。结果，TPE-SO3溶液可用作检测工具来染色淀粉样原纤维并且经染色的淀粉样原纤维在荧光显微镜下可视化，并具有最小的荧光背景噪音(图2)。

TPE-SO3对于天然和原纤维胰岛素的不同FL行为及其高的溶解度清楚地表明其可作为监测淀粉样原纤维形成动力学的外部指示剂。

由于TPE-SO3的磺酸基的低pKa值，TPE-SO3在宽的pH条件下带净负电荷。牛胰岛素的等电点(pI)为pH 5.6，因此在低于pH 5.6的pH值下，胰岛素携带净正电荷。带负电荷的TPE-SO3可因此通过静电吸引力与胰岛素强结合。一旦结合至原纤维胰岛素，则TPE-SO3的运动受到限制，从而从TPE-SO3观察到强荧光。然而，在高于等电点的pH值下，本发明的AIE发光剂如TPE-SO3也是发光性的。尽管这样的环境不利于静电相互作用，但是胰岛素原纤维可提供疏水位点从而为TPE-SO3分子的停泊提供位点。从而，本发明的AIE发光剂如TPE-SO3的不同发光行为允许在各种环境下区分淀粉样蛋白如胰岛素的天然和原纤维态。

由于本发明的AIE发光剂可检测淀粉样原纤维，因此它们可用于诊断淀粉样变性疾病如糖尿病或神经变性疾病。特别地，神经变性疾病可以为阿尔兹海默病、帕金森病、朊病毒病或亨廷顿病。

淀粉样原纤维形成的延迟效应

令人惊讶地，本发明的AIE发光剂对于淀粉样原纤维形成具有延迟效应。在一个实施方案中，将TPE-SO3与胰岛素溶液原位温育已经显示出以浓度依赖的方式延长纤维化的迟滞期并减缓生长期的延伸速率(4A和4B)。胰岛素纤维化的生长速率相对于TPE-SO3的浓度也以指数下降(图4C)。这些结果表明TPE-SO3可干涉天然胰岛素的变性以及胰岛素分子间的相互作用。进一步关于TPE-SO3对于胰岛素原纤维形成的延迟效应的研究表明，该效应在胰岛素原纤维形成的时程中在早期更为显著。本方面的AIE发光剂如TPE-SO3也显示出是非毒性的；在TPE-SO3存在下细胞存活力不受影响或几乎不受影响(图5)。TPE-SO3与药物联合施用是安全的，因此，非毒性的AIE发光剂如TPE-SO3 可用作淀粉样蛋白质稳定剂，例如用于在糖尿病治疗中治疗性胰岛素的长期储存和输送。

机理研究

对于本发明的AIE化合物的发光行为的机理研究将有助于解释本发明的AIE化合物作为纤维化过程的外部报告工具的工作原理。通过发明人在本申请以及在先工作中的实验和理论确证，发明人已经提出分子内运动的限制是AIE效应的主要原因(Y.Hong，J.W.Y.Lam and B.Z.Tang，Chem.Commun.，2009，4332)。本发明的AIE化合物如TPE-SO3是典型的具有优异水溶性的AIE分子。在水性溶液中，TPE-SO3的分子以分离的物质存在，其扭转/旋转运动有效覆盖激发态，从而使得该染料在溶液状态中是非发光的。当结合并于胰岛素原纤维中聚集时，此类运动受到限制，其有效阻断了非放射通道并增加激发子的发射性衰变。由于其它淀粉样蛋白如淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α-突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质具有类似的淀粉状原纤维结构，因此，本发明的AIE化合物同样可用于监测这些淀粉样蛋白的纤维化过程。

图10示出了本发明的AIE化合物的延迟效应的机理。本发明的AIE化合物例如TPE-SO3优先结合至具有暴露的疏水残基的部分解折叠胰岛素链。该结合稳定了部分解折叠的结构，阻止核形成，并抑制其进一步装配成原纤维聚集体。由于本发明的AIE化合物例如TPE-SO3并不结合天然淀粉样蛋白如胰岛素，本发明的AIE化合物例如TPE-SO3不干扰所述蛋白质的生物功能。除了通过结合而直接抑制折叠途径中(on-pathway)中间体，本发明的AIE化合物例如TPE-SO3还可以结合并稳定折叠途径外(off-pathway)中间体，以阻止原纤维生成扩散。由于其它淀粉样蛋白如淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α-突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质具有相似的纤维化过程，本发明的AIE化合物例如TPE-SO3也可延迟这些淀粉样蛋白的纤维化过程，因而代表淀粉样蛋白的一类一般性抗淀粉样纤维化剂。

实施例

下列实施例示例性描述了本发明，并且不意图将本发明限制于此。

一般性信息

TPE-SO3通过实施例1的方法制备。牛胰岛素、淀粉样蛋白β-肽和溶菌酶购自Sigma-Aldrich并直接使用。pH 7.0的磷酸缓冲盐水(PBS)购自Merck。水通过Millipore过滤系统纯化。所有的试验在室温进行，除非另外说明。

UV光谱在Milton Roy Spectronic 3000Array分光光度计上测量，荧光光谱记录于配备有Xenon放电式灯激发的Perkin-Elmer LS 55荧光分光光度计。在96-孔微滴定板中通过Perkin-Elmer Victor^3TM多任务板读数器，采用允许355nm作为激发波长和460nm作为发射波长的滤镜进行荧光分析。

样品制备

将牛胰岛素粉末溶解于25mM NaCl/HCl溶液(pH 1.6，65℃)。使该溶液通过0.45μm过滤器并通过测量其在278nm处的吸收来确定浓度。浓度为1.0mM的TPE-SO3储液通过将合适量的染料溶解于PBS溶液(pH 7.0)而制备。胰岛素原纤维通过将该蛋白质(320μM)在缓冲溶液(pH 1.6)中于65℃温育20h而制备。在TPE-SO3对胰岛素原纤维形成的干扰试验中，合适量的TPE-SO3在温度升高之前被添加至胰岛素溶液。对于荧光测量，在光谱测量之前将纤维化样品超声处理至少10min，以避免大的原纤维聚集体的沉淀。

电子显微镜实验

使用JOEL 2010TEM和JOEL 6700F SEM，分别以200和5kV的加速电压，研究原纤维胰岛素的形态。在原纤维胰岛素形成期间不同时间点收集的试样通过水稀释，然后在台式离心机(Eppendorf 5415D)上离心。除去上清液以减少来自缓冲液中无机盐的干扰。通过将稀释的蛋白质溶液/悬液滴铸(drop-casting)于覆盖有碳涂覆聚乙烯醇缩甲醛(formvar)膜的400-目铜载网。溶剂在室温下在流通的空气下蒸发。

荧光成像

在直式荧光显微镜(Olympus BX41)下，使用激发和发射滤镜：  腔镜(diachronic mirror)＝400nm的组合，对荧光显微照片进行成像。通过将含有胰岛素原纤维和TPE-SO3的溶液滴铸于覆盖有显微镜盖玻片的显微镜 载玻片上来制备样品。使用计算机控制的SPOT电荷耦合器件(CCD)照相机(SPOT RT SE 18Mono)获取图像。

实施例1：1，2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1，2-二苯基乙烯钠(TPE-SO3)的合成

在氮气氛下向100ml圆底烧瓶加入TPE-OH(0.5g，1.37mmol)和20ml无水乙醇。搅拌混合物直到所有的固体消失。逐滴添加NaOEt(0.20g，3.0mmol)在20ml乙醇中的混合物并搅拌1h，使无色溶液变成橙红色。向该溶液添加在20ml乙醇中的0.35g 1，3-丙磺内酯(2.88mmol)。剧烈搅拌混合物12h，从溶液沉淀出白色产物。通过过滤收集该产物，并用乙醇和丙酮洗涤两次，得到白色固体，收率61％。¹H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ(ppm)：7.25-7.13(m，6H)，7.08-7.02(m，4H)，6.95-6.90(m，4H)，6.81-6.73(m，4H)，4.09-4.02(m，4H)，2.66-2.58(m，4H)，2.08-2.02(m，4H).¹³C NMR(DMSO-d6，75MHz)δ(ppm)：157.0，143.9，139.2，135.5，131.9，130.8，127.8，126.2，113.8，66.4，47.9，25.3.MS(TOF)m/e：631.1[(M+2H)+-Na，计算值631.1]，609.2[(M+3H)⁺-2Na，计算值609.1]

实施例2：N，N′-[1，2-二苯基-1，2-双(1，4-苯氧乙基)乙烯基]双(三乙基溴化铵)(TPE-C2N+)的合成

在室温下向在干燥二 烷(20ml)中的氢化钠(84mg)和1，2-双(4-羟苯基)-1，2-二苯乙烯(0.50g)的混合物加入1，2-二溴乙烷(1.50g)。将该混合物加热至回流并搅拌24小时。过滤并浓缩后，分离产物并通过硅胶层析用氯仿/己烷 (1∶1 v/v)作为洗脱剂纯化，得到1，2-双[4-(2-溴乙氧基)苯基]-1，2-二苯乙烯(TPE-C2Br)，收率为32％。

向具有磁性转子的250ml烧瓶装载溶于100ml THF的TPE-C2Br(100mg)。向该溶液中加入三乙胺(5ml)。将该混合物加热至回流并搅拌3天。在该期间，以几个间隔加入10ml的水。将THF和多余的三乙胺蒸发。用氯仿洗涤该水溶液三次。在溶剂蒸发后，用氯仿和丙酮洗涤残余物并接着在50℃下真空干燥过夜。分离得到TPE-C2N+，收率为56％。

TPE-C2Br的表征数据：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：7.10-7.02(m，10H)，6.95-6.92(m，4H)，6.65-6.59(m，4H)，4.15-4.11(m，4H)，3.55-3.49(m，4H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：156.6，144.1，139.8，137.2，132.7，131.5，127.8，126.4，114.0，67.8，29.3.MS(TOF)，m/e：578.03([M]+，计算值578.03)。

TPE-C2N+：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：7.09-7.00(m，10H)，6.97-6.87(m，4H)，6.61-6.54(m，4H)，3.90-3.84(m，4H)，3.45-3.40(m，4H)，2.00-1.97(m，4H)，1.88-1.84(m，4H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：157.9，144.9，140.3，137.2，133.2，132.1，128.3，126.9，114.2，67.3，34.2，30.2，28.6.MS(TOF)，m/e：634.09([M]+，计算值634.09)。

实施例3：N，N′-[1，2-二苯基-1，2-双(1，4-苯氧丁基)乙烯基]双(三乙基溴化铵)(TPE-C4N+)的合成

根据实施例2使用相应的二溴丁烷进行以下化合物的合成：

TPE-C4Br的表征数据：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：7.09-7.00(m，10H)，6.97-6.87(m，4H)，6.61-6.54(m，4H)，3.90-3.84(m，4H)，3.45-3.40(m， 4H)，2.00-1.97(m，4H)，1.88-1.84(m，4H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：157.9，144.9，140.3，137.2，133.2，132.1，128.3，126.9，114.2，67.3，34.2，30.2，28.6.MS(TOF)，m/e：634.09([M]+，计算值634.09)。

TPE-C4N+：¹H NMR(300MHz，d-DMSO)，δ(ppm)：7.25-7.19(m，6H)，7.07-6.92(m，8H)，6.83-6.77(m，4H)，4.04-4.02(m，4H)，3.36-3.29(m，16H)，1.86-1.81(m，8H)，1.34-1.11(m，18H)。¹³C NMR(75MHz，d-DMSO)，δ(ppm)：156.9，143.8，139.3，135.7，132.0，130.7，127.9，126.4，113.7，66.5，55.6，52.0，25.5，18.0，7.2.MS(TOF)，m/e：789.50([M.2H₂O-HBr]+，计算值789.44)。

实施例4：N，N′，N″，N″′-[1，2-四(1，4-苯氧丁基)乙烯基]四(三乙基溴化铵)(N+C4-TPE-C4N+)的合成

向在丙酮中的DHTPE(0.4g，20mmol)和碳酸钾的混合物加入1，4-二溴丁烷(3ml)，将混合物加热至回流并搅拌24h。过滤并浓缩后，分离产物并通过硅胶层析用氯仿/己烷(1∶1 v/v)作为洗脱剂纯化，得到白色粉末的产物1，1，2，2-四(4-(4-溴丁氧基)苯基)乙烷(BrC4-TPE-C4Br)，收率为21％。

BrC4-TPE-C4Br的表征数据：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：7.08-6.99(m，8H)，6.81-6.60(m，8H)，3.94-6.86(m，8H)，3.49-3.42(m，8H)，2.07-2.00(m，8H)，1.92-1.85(m，8H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：157.2，136.6，132.7，129.5，114.3，66.9，33.9，29.9，28.3.MS(FAB)，m/e：937.0([M]+，计算值936.4)。

N+C4-TPE-C4N+：¹H NMR(300MHz，d-DMSO)，δ(ppm)：7.29-7.27(d，1H)，7.10-7.08(d，1H)，6.83-6.80(d，7H)，6.83-6.80(m，7H)，3.91-3.83(m，8H)，3.23-3.18(m，16H)，2.89-2.84(m，8H)，1.70-1.65(m，20H)，1.17-1.06(m， 40H)。¹³C NMR(75MHz，d-DMSO)，δ(ppm)：157.3，135.6，132.6，130.6，114.4，67.2，56.5，52.9，46.5，26.4，18.9，8.0.MS(TOF)，m/e：933.6([M-4Br-3CH₂CH₃]+，计算值933.7)。

实施例5：N，N′，N″，N″′-[1，2-四(1，4-苯氧乙基)乙烯基]四(三乙基溴化铵)(N+C2-TPE-C2N+)的合成

根据实施例4用相应的二溴乙烷进行以下化合物的合成：

BrC2-TPE-C2Br的表征数据：¹H NMR(300MHz，CDCl₃)，δ(ppm)：7.71-7.70(m，1H)，7.54-7.53(m，1H)，7.10-7.07(d，4H)，6.93-6.90(d，3H)，6.84-6.82(d，4H)，6.65-6.63(d，3H)，4.28-4.22(m，8H)，3.63-3.60(m，8H)。¹³C NMR(75MHz，CDCl3)，δ(ppm)：156.7，132.8，130.0，115.0，114.1，68.0，29.6.MS(TOF)，m/e：823.9([M]+，计算值824.2)。

N+C2-TPE-C2N+：¹H NMR(400MHz，D₂O)，δ(ppm)：6.94-6.89(m，8H)，6.67-6.65(m，4H)，4.24-4.23(m，8H)，3.54-3.45(m，8H)，3.30-3.25(m，16H)，3.10-3.05(m，8H)，1.20-1.13(m，36H)。¹³C NMR(100MHz，D₂O)，δ(ppm)：156.2，138.2，133.1，114.5，98.0，61.9，56.0，54.2，54.1，47.4，9.1，7.6.MS(FAB)，m/e：1222.5([M-2H]+，计算值1224.4)。

实施例6：1，2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1，2-二氰基乙烯钠(3)的合成

为制备2，3-二(4-甲氧基苯基)反丁烯二氰(1)，在氮气氛下将4-甲氧基苯基乙腈(3.679g，25mmol)和碘(6.345g，25mmol)溶于250mL三颈圆底烧瓶中的100mL乙醚中。将该溶液混合物冷却到-78℃。在半个小时的时间将在30mL甲醇中的甲醇钠(2.836g，52.5mmol)逐滴加到该溶液混合物中。将得到的混合物温热至0℃保持4小时并用75mL 3％v/v HCl溶液猝灭。过滤沉淀物并分别用水、焦亚硫酸钠、水和乙醇洗涤。通过用DCM和乙醇再结晶纯化粗产物，获得黄绿色晶体。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)，(TMS，ppm)：3.885(s，6H)，6.988-7.039(d，4H)，7.770-7.820(d，4H)。¹³C NMR(CDCl₃，75MHz)，(TMS，ppm)：56.2，115.3，118.0，123.4，125.3，131.1，162.7。

为制备1，2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1，2-二氰基乙烯钠(3)，在氮气氛下将(1)(0.2903g，1mmol)溶于50mL双通阀圆底烧瓶中的10mL蒸馏的DCM中。将三氟二甲基硫醚化硼络合物(5.26mL，50mmol)缓慢加入到该溶液中。将得到的混合物在环境温度下搅拌过夜。在N₂气流中浓缩该溶液并在1M HCl和乙酸乙酯之间分配。合并的有机层随后用H₂O和盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥并浓缩获得2，3-二(4-羟苯基)反丁烯二氰(2)，无需进一步纯化。

接着在N₂气氛中将新鲜制备的(2)溶于100mL的三颈圆底烧瓶中的20mL无水乙醇中。将在20mL乙醇中的乙醇酸钠溶液(0.2g，3.0mmol)在半个小时的时间逐滴加到该混合物中。在室温下搅拌该橙红色溶液1小时。将在20mL乙醇中的1，3-丙磺酸内酯(0.35g，2.9mmol)加到混合物中并搅拌12小时。过滤沉淀物并用乙醇洗涤。粗产物通过用水和丙酮再结晶纯化。¹H NMR(D₂O，300MHz)，(TMS，ppm)：2.15-2.25(m，4H)，2.94-3.07(m，4H)，4.10-4.14(m，4H)，7.02-7.04(d，4H)，7.67-7.76(d，4H).¹³C NMR(D₂O，75MHz)，(TMS，ppm)：24.2，47.8，66.7，115.2，117.4，122.8，124.5，130.5，160.8。

实施例6：TPE-SO3对于胰岛素原纤维高度灵敏和特异

单独的TPE-SO3溶液在不存在蛋白质的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中是非发光性的。该溶液在加入天然牛胰岛素后在约470nm处保持微弱发光。在添加小量原纤维胰岛素后，TPE-SO3溶液变成发光性的(图1A)。已经证明，其发光强度 与原纤维胰岛素浓度成比例，如通过强度随着原纤维胰岛素浓度的增加而逐渐增强所示。仔细观察结合等温线，发现在低胰岛素浓度范围(0-5μM)存在线性关系(图1B)。荧光增强速率(I/I₀)在低原纤维胰岛素浓度下较快，在大于20μM的原纤维胰岛素浓度下接近恒定。甚至当天然胰岛素浓度从0变化至100μM时，TPE-SO3的荧光仍保持可忽略不计(图1B)。

为进一步评价TPE-SO3与胰岛素的淀粉样原纤维的相互作用的特异性，测量了具有不同的原纤维胰岛素部分摩尔比(f_F)的胰岛素混合物中TPE-SO3的荧光强度增强速率，其中总蛋白浓度保持在5μM。结果(图1B插图)显示TPE-SO3的发光随着原纤维胰岛素部分的增加以线性方式单调递增，这表明天然胰岛素的存在不影响通过TPE-SO3检测胰岛素原纤维。

TPE-SO3对于天然和原纤维胰岛素的不同行为使得本发明的化合物可作为监测胰岛素纤维素动力学过程的指示剂。如图3A所示，溶解于HCl/NaCl(pH 1.6)中的胰岛素溶液在65℃温育，该升高的温度和低pH条件促使胰岛素淀粉样原纤维的生长。在室温取出胰岛素溶液试样并用PBS(pH 7.0)稀释。在FL测量之前添加TPE-SO3试样，然后以一定时间间隔测量FL强度，直到60min。所有的测量在PBS缓冲液(pH＝7.0)中进行；[TPE-SO3]＝15μM；[胰岛素]＝5μM，且λ_ex＝350nm。

结果显示，当胰岛素温育短于20min时，无FL信号被记录。在从30min的温育时间开始，溶液变成发光性的并且发光迅速增加并在60min的温育时间时达到最大值。之后，在整个测量中发光光谱保持不变。在不同温育时间荧光强度的变化对应于胰岛素纤维化。在470nm处以不同时间间隔记录的FL强度的变化显示出纤维化过程的3个阶段及其持续时间：(I)迟滞期、(II)生长期和(III)平衡期。从图3B可见，迟滞期在前30min发生，接下来向前到1h是指数生长期，1h温育后，淀粉样原纤维形成达到平衡期。

实施例7：TPE-SO3原位延迟胰岛素纤维化

在TPE-SO3对胰岛素原纤维形成的干扰研究中，在65℃温育之前不同浓度的TPE-SO3与缓冲胰岛素溶液混合并测定纤维化时程期间TPE-SO3的荧光。 令人惊讶地，TPE-SO3的预先温育影响胰岛素原纤维形成的动力学(图4A)。与不存在TPE-SO3的原纤维形成过程相比，TPE-SO3延长了迟滞期并减缓了生长期的延伸速率。当胰岛素与10μM TPE-SO3预混合时，与恒定低FL信号相关的迟滞期从30min延长到2h。指数生长期也从30min延长到90min。为达到平衡期，则需要3h以上，而在不存在TPE-SO3的情况下，仅需1h。

TPE-SO3对于淀粉样原纤维形成的延迟效应随着TPE-SO3的浓度增加而变得更加明显。图4B显示由迟滞期持续时间定义的延迟时间与所温育的TPE-SO3浓度之间的相关性。显示延迟时间随着TPE-SO3浓度的增加而线性延长。在25和50μM TPE-SO3的情况下，延长时间分别为3和6h。TPE-SO3浓度的进一步增加(100μM)则抑制原纤维的形成，如由甚至在20h的温育后FL信号仍无增强所显示。TPE-SO3的延迟效应进一步通过当TPE-SO3浓度变得更高时胰岛素纤维化生长速率(r_F，表示为生长期的斜率)的指数下降加以证实(图4C)。这些结果清楚地表明，TPE-SO3为淀粉样纤维化的内部抑制剂。

来自扫描电子显微镜检查(SEM)和透射电子显微镜检查(TEM)的图像进一步确认了上述观察结果。在TPE-SO3不存在的情况下，在1h温育后在溶液中观察到直径约20nm的淀粉样原纤维(图9A和9B)。然而，在存在TPE-SO3的情况下，在相同条件下没有发现原纤维样的结构(图9C)，这表明纤维化在温育1h后仍处于迟滞期。在温育7h后，在含有和不含有TPE-SO3的温育胰岛素溶液中均观察到成熟的淀粉样原纤维(图9D-F)。

实施例8：使用TPE-SO3成像淀粉样原纤维

用TPE-SO3溶液染色的淀粉样原纤维可在荧光显微镜下可视化。胰岛素原纤维的微聚集体容易被鉴定为来自TPE-SO3的亮绿蓝色发光(图2)。由于TPE-SO3的优异水溶性，荧光背景可被忽略且原纤维样的结构在高放大倍数下可被识别(图2插图)。这些结果证实了TPE-SO3用作来自活体组织切片的蛋白质凝聚的FL染色剂的用途。

实施例9：TPE-SO3对于淀粉样蛋白高度特异

为评价本发明的AIE发光剂的荧光特性对于淀粉样蛋白的特异性，测试了 TPE-SO3针对其它蛋白的荧光强度。浓度为5μM的TPE-SO3储液与浓度为1.0mg/ml的不同蛋白质单体溶液混合。测量不同的TPE-SO3-蛋白质混合物的荧光强度。pH 7.0的PBS缓冲液和TPE-SO3溶液被用作阴性对照。结果(图6)表明TPE-SO3与肝素、脱辅铁蛋白和纤维素酶的混合物的FL强度与单独的TPE-SO3溶液相当；TPE-SO3与木瓜蛋白酶的混合物的FL强度与天然胰岛素单体相当；而TPE-SO3与原纤维胰岛素的混合物则比所测试的其它细胞蛋白质显著更高。

TPE-SO3不仅针对原纤维胰岛素发荧光，而且也针对其它淀粉样蛋白发荧光。如图7所示，在λex＝350nm，采用0.1mg/mL老化前和老化后的淀粉样蛋白β-肽(Aβ)，测量50μM的TPE-SO3的发光。结果表明TPE-SO3的发光在淀粉样蛋白β-肽原纤维形成(即老化)后显著增加。

而且，在4天内在溶菌酶原纤维形成期间在不同时间点(每天采集数据两次)测定了TPE-SO3(10μM、50μM和100μM)的荧光增强速率(图8)。如图8所示，TPE-SO3产生与溶菌酶纤维化对应的荧光曲线，这验证了其可作为监测淀粉样蛋白纤维化的外部指示器。

实施例10：TPE-SO3是非毒性和稳定的

使用MTT测定来评价TPE-SO3的毒性：以每孔每0.1mL 5x10³个细胞将HeLa细胞置于96-孔板中并以不同浓度的TPE-SO3(5、10、20、40和80μM)于37℃处理48小时。在处理后，将含有MTT(5mg/ml)的PBS(20ml)添加到每个孔并将板在37℃温育2-4h。为溶解由活细胞内活性线粒体产生的胞内甲 ，加入洗涤剂(在10mm HCl中的10％w/v十二烷基硫酸钠；每孔100ml)并将板在室温于黑暗中温育过夜。用分光光度计测量板读数器测量在595nm的吸光度，并将其用于相对细胞存活力的计算，而仅用PBS处理的细胞被用作对照(100％存活力)。结果表明TPE-SO3的毒性很小，可忽略不计(图5)。

而且，观察到TPE-SO3化合物在环境条件下稳定存在一年以上，并且其水溶液在4℃冷藏下保持不变六个月以上。除了TPE-SO3对于淀粉样蛋白聚集的内部延迟效应外，其稳定性和非毒性特征证实其在治疗性淀粉样蛋白例如胰岛 素的长期储存和输送中作为抗淀粉样纤维化剂的有用性。

正如对于本领域的技术人员显而易见的，可以做出本发明的许多修改和变化而不背离其精神和范围。本文中所描述的具体实施方案仅以例子的方式给出，并且仅以所附权利要求连同这些权利要求被授予的等效物的整个范围限制本发明。

Claims (31)

1.水溶性聚集诱导发光(AIE)发光剂在延迟生物样品中淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化并区分淀粉样蛋白质的天然形式和纤维化形式中的用途，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为时，R和R’的至少一个不为H。

2.权利要求1所述的用途，其中n是选自1至15、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4或2至3的整数。

3.权利要求1所述的用途，其中n为3。

4.权利要求1至3任一项所述的用途，其中所述碱金属或碱土金属离子选自K⁺、Li⁺、Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺。

5.权利要求1所述的用途，其中所述水溶性AIE发光剂是1,2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1,2-二苯基乙烯钠或1,2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1,2-二氰基乙烯钠。

6.权利要求1-3任一项所述的用途，其中所述淀粉样蛋白质选自胰岛素、淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α-突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质。

7.权利要求1-3任一项所述的用途，其中所述生物样品选自组织样品、细胞样品、血液、唾液、脊髓液、淋巴液、阴道液、精液和尿液。

8.权利要求1-3任一项所述的用途，其中在等于或小于所述淀粉样蛋白质的等电点的pH值进行水溶性聚集诱导发光(AIE)发光剂与生物样品的接触。

9.权利要求8所述的用途，其中所述淀粉样蛋白质为胰岛素并且所述接触在等于或小于5.6的pH值进行。

10.权利要求1-3任一项所述的用途，其中包括测量470nm处的荧光强度。

11.权利要求10所述的用途，其中荧光增加指示淀粉样纤维化形成。

12.一种延迟淀粉样蛋白质的淀粉样纤维化的方法，包括使有效量的水溶性AIE发光剂与淀粉样蛋白质接触以形成稳定化的淀粉样蛋白质，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为时，R和R’的至少一个不为H。

13.权利要求12所述的方法，其中n是选自1至15、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4或2至3的整数。

14.权利要求12所述的方法，其中n是3。

15.权利要求12至14任一项所述的方法，其中所述碱金属或碱土金属离子选自K⁺、Li⁺、Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺。

16.权利要求12所述的方法，其中所述水溶性AIE发光剂是1,2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1,2-二苯基乙烯钠或1,2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1,2-二氰基乙烯钠。

17.权利要求12-14任一项所述的方法，其中所述淀粉样蛋白质选自胰岛素、淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α-突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质。

18.权利要求12-14任一项所述的方法，其中所述淀粉样蛋白质是施用给受试者的药用胰岛素。

19.权利要求18所述的方法，其中所述受试者是患有糖尿病的受试者。

20.一种储存和输送淀粉样蛋白质的方法，其包括使有效量的水溶性AIE发光剂与淀粉样蛋白质接触以形成稳定化的淀粉样蛋白质，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为时，R和R’的至少一个不为H。

21.权利要求20所述的方法，其中n是选自1至15、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4或2至3的整数。

22.权利要求20所述的方法，其中n是3。

23.权利要求20-22任一项所述的方法，其中所述碱金属或碱土金属离子选自K⁺、Li⁺、Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺。

24.权利要求20所述的方法，其中所述水溶性AIE发光剂是1,2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1,2-二苯基乙烯钠或1,2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1,2-二氰基乙烯钠。

25.权利要求20-22任一项所述的方法，其中所述淀粉样蛋白质选自胰岛素、淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α-突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质。

26.水溶性AIE发光剂在制备用于淀粉样蛋白质储存和输送的抗淀粉样纤维化剂中的用途，其中所述水溶性AIE发光剂包含式I骨架结构：

其中A选自-CN或R和R’独立地选自H、XSO₃ ^-R”、XN(CH₃)₃ ⁺Br^-、XN(CH₂CH₃)₃ ⁺Br^-或XCOOR”，其中X选自O(CH₂)_n，n是1至20的整数，R”选自碱金属或碱土金属离子，并且其中当A为-CN时，R不为H，当A为时，R和R’的至少一个不为H。

27.权利要求26所述的用途，其中n是选自1至15、1至12、1至10、1至8、1至6、1至4或2至3的整数。

28.权利要求26所述的用途，其中n为3。

29.权利要求26-28任一项的用途，其中所述碱金属或碱土金属离子选自K⁺、Li⁺、Na⁺、Mg²⁺和Ca²⁺。

30.权利要求26所述的用途，其中所述水溶性AIE发光剂是1,2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1,2-二苯基乙烯钠或1,2-二[4-(3-磺基丙氧基)苯基]-1,2-二氰基乙烯钠。

31.权利要求26-28任一项所述的用途，其中所述淀粉样蛋白质选自胰岛素、淀粉样蛋白β肽、溶菌酶、tau蛋白、α-突触核蛋白、PrP和含多谷氨酰胺的蛋白质。