CN108440475A

CN108440475A - 一种区分不同极性脂滴的比率型荧光探针及其制备方法和应用

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Publication number: CN108440475A
Application number: CN201810218645.0A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 阴军玲; 彭敏
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2018-03-16
Filing date: 2018-03-16
Publication date: 2018-08-24
Anticipated expiration: 2038-03-16
Also published as: CN108440475B

Abstract

本发明提供了一种区分不同极性脂滴的荧光探针，化学名称为(E)‑7‑(N,N‑二乙胺基)‑3‑(3‑(4‑(二苯胺)苯基)丙烯酰)‑2H‑苯并吡喃酮；通过N,N‑二乙氨基水杨醛和乙酰乙酸乙酯反应生成3‑乙酰基‑7（二乙胺基）香豆素；上述产物和4‑二苯胺基苯甲醛（4）反应得到。所述荧光探针具有双光子性质以及聚集诱导发光性质；探针整体为电中性可以很好的定位在不同极性的脂滴中。该探针具有低毒性，良好的光学稳定性以及对极性特异性响应；并且实现了在器官和活体内对脂滴极性的检测。本发明同时提供了该探针的合成方法，步骤简单、纯化方便、收率高。

Description

一种区分不同极性脂滴的比率型荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种区分不同极性脂滴的比率型荧光探针及其制备方法和应用，属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

脂滴由磷脂单分子层及中性脂构成的疏水核心构成，并且表面分布有很多蛋白，长期以来，脂滴一直被认为是一种类似于糖原的颗粒，只是用来贮存能量，当细胞需要能量时，用来供给能量，是一个“惰性”的细胞内含物，因而脂滴在很长一段时间内并未受到人们的重视。近年来有关脂滴的研究得到迅速发展。研究表明，脂滴并非细胞内一个简单的能量贮存器，而是一个复杂、活动旺盛、动态变化的多功能细胞器。脂滴的新陈代被与微环境的平衡与许多疾病有关。已经证实脂滴是癌症的重要标志物，尤其脂滴的极性是癌症的一个重要的指标。由于脂滴在癌细胞和正常细胞中的代谢机理不同，导致脂滴的极性在癌细胞比在正常细胞中低。因此，通过检测脂滴极性的来区分癌细胞和正常细胞是很有意义的。

目前，检测脂滴的方法有免疫化学法，染色法，NMR法，拉曼成像法等。在所有检测脂滴的方法中，荧光成像技术被认为是最可靠最适用的方法。荧光成像具有实时检测，定位在亚细胞结构，操作简单以及实现空间分辨等优点。目前已经有很多荧光探针被报道用于脂滴的检测。然而，这些探针具有聚集猝灭，短波长激发，单光子检测等缺点。最主要的是目前的脂滴探针都没有实现通过检测脂滴极性的变化来区分不同细胞。

发明内容

针对现有探针对无法区分不同极性脂滴的问题，本发明提供一种反应灵敏、检测限低、特异性好的可区分不同极性的比率型荧光探针，具有双光子性质。

本发明的另一目的是提供一种简便地合成上述区分不同极性脂滴的比率型荧光探针的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种区分不同极性脂滴的荧光探针，化学名称为(E)-7-(N, N-二乙胺基)-3-(3-(4-(二苯胺)苯基)丙烯酰)-2H-苯并吡喃酮，简称为CTPA，具有如式（I）所示的结构：

式（I）。

一种上述荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）N,N-二乙氨基水杨醛（1）和乙酰乙酸乙酯（2）在哌啶存在下于有机溶剂中室温搅拌，分离纯化得到亮黄色的固体，即3-乙酰基-7（二乙胺基）香豆素（3）；

（2）3-乙酰基-7（二乙胺基）香豆素（3）和4-二苯胺基苯甲醛（4）在哌啶存在下于有机溶剂中加热回流，分离纯化得到(E)-7-(N, N-二乙胺基)-3-(3-(4-(二苯胺)苯基)丙烯酰)-2H-苯并吡喃酮（5）。

所述步骤（1）中，N,N二乙氨基水杨醛和乙酸乙酯的摩尔比为1:1.2。所述步骤（2）中，3-乙酰基-7（二乙胺基）香豆素与4-二苯胺基苯甲醛的摩尔比为1:1。

所述步骤（2）中温度为70-80℃，反应时间为12-24h。

所述有机溶剂优选为乙醇或乙醇与乙腈的混合。优选的，乙醇与乙腈的体积比为1:1。

所述分离纯化步骤可以采用有机化学领域常用的分离纯化方法，如过滤、蒸馏、重结晶、柱色谱分离等。

优选的，步骤（1）中分离提纯步骤为：将反应体抽滤，然后用乙醇加热溶解，待刚好溶解后再冷却，等样品析出后再抽滤。所述乙醇溶解所用的温度为90℃。优选的，步骤（2）中所述分离提纯步骤为：减压蒸馏旋干溶剂得到粗产物后，经柱色谱分离得到提纯产物。所述柱色谱分离的流动相优选为体积比为1:5的石油醚与乙酸乙酯。

上述荧光探针的合成路线如下：

；

。

一种上述荧光探针用于检测细胞或动物中不同极性脂滴的应用。

上述荧光探针的识别机理如下：

本发明中的探针以香豆素部分为荧光团，三苯胺为极性敏感基团。由于三苯胺与香豆素通过可以自由旋转的单键相连，所以存在由三苯胺向香豆素乙酰基发生分子内扭曲电子转移效应（TICT）。在极性大的介质中，由于存在探针与溶剂的耦极-耦相互作用，使一部分能量通过非辐射的形式消失，以辐射的形式发出的荧光强度会变弱；在激发态时电子离域更加完全，处于更加稳定的状态，电势差小，使波长红移。由于探针分子呈现电中性，所以能很好地定位在脂溶性的脂滴中。由于正常细胞中的脂滴的极性比癌细胞的脂滴的极性大，所以在正常细胞中探针的荧光强度会变弱，波长发生红移；通过两个波长的比值区分不同极性的脂滴细胞。

本发明具有以下优点：

本发明提供了一种能够区分不同细胞中脂滴极性的比率型荧光探针，具有双光子性质以及聚集诱导发光性质；由于探针整体呈现电中性可以很好的定位不同极性的脂滴。该探针具有低毒性，良好的光学稳定性以及对极性特异性响应；并且实现了在器官和活体内对脂滴极性的检测。本发明同时提供了该探针的合成方法，步骤简单、纯化方便、收率高。

附图说明

图1：探针的¹H NMR谱；

图2：探针的¹³C NMR谱；

图3：探针的HRMS图；

图4：探针在不同溶剂中的发射光谱；

图5：探针的选择性；

图6：探针与商业化脂滴探针的共定位；

图7：探针的细胞成像应用；

图8：探针的小鼠成像应用。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。实施例中的化合物号码对应发明内容中化合物的号码。

实施例1 荧光探针CTPA的合成

（1）化合物（3）的合成：

将1.93 g NN-二乙氨基水杨醛（10 mmol）（1）和1.56 g乙酰乙酸乙酯 (12 mmol)加入装有20 mL乙醇的烧瓶中，搅拌均匀后，滴加三滴哌啶室温下搅拌过夜，有大量黄的固体析出来，过滤，用乙醇洗涤，加90℃乙醇至刚好溶解，冷却后重结晶，进行下一步反应。

（2）化合物（5）的合成：

称量0.59 g 3-乙酰基-7（二乙胺基）香豆素（3）（1 mmol），滴加三滴哌啶，和0.273g 4-二苯胺基苯甲醛（1 mmol）于含有化合物（4）的乙醇与乙腈的混合液（1:1）中，升温至80 ℃回流，过夜，有固体析出，减压过滤，用乙醇与乙腈的混合液进行重结晶，得到橘色固体(E)-7-(N, N-二乙胺基)-3-(3-(4-(二苯胺)苯基)丙烯酰)-2H-苯并吡喃酮（6），即荧光探针CTPA，产率90%。

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.58 (s, 1H), 7.82 (d, J = 12.0 Hz, 1H),7.64 (m, 4H), 7.37 (t, J=8.0 Hz, 4H), 7.13 (m, 6H), 6.93 (d, J = 8.0 Hz, 2H),6.82 (dd, J₁ = 10Hz, J₂ =2.0 Hz, 1H), 6.61 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 3.51 (q, J =6.4 Hz, 4H), 1.15 (t, J =8.0 Hz, 6H).

¹³C NMR (100 MHz, Chloroform-d) δ 186.32, 160.85, 158.52, 152.63, 149.87,148.41, 146.92, 143.32, 131.68, 130.02, 129.43, 128.58, 125.36, 123.92,122.38, 121.67, 117.27, 109.92, 108.84, 96.84, 45.28, 12.45.

HRMS (m/z): [M + H]⁺ calcd for C₃₄H₃₀N₂O₃, 515.2314; found, 515.2327。

实施例2 荧光探针在不同溶剂中的发射光谱

配制浓度为1 mM的实施例1合成的荧光探针CTPA的二甲基亚砜 (DMSO) 的测试母液溶液待用。

测试液中，分别取3 mL不同极性的溶剂：二氧六环，乙醚，四氢呋喃（THF），二氯甲烷（DCM），丁醇，丙酮，二甲基亚砜（DMSO），然后加入30 μL的探针母液，使得测试液中，探针的浓度为10 μL，进行荧光扫描（激发波长455nm，检测波段450-750nm）。得各体系中荧光强度。如图4所示，随着溶剂极性的增加，光谱红移，荧光强度变弱。

实施例3 荧光探针对不同分子或离子的选择性

配制浓度为1 mM的实施例1合成的荧光探针CTPA的二甲基亚砜 (DMSO) 的测试母液溶液待用。配制浓度为200 μM的Fe²⁺, H₂O₂, Gys, Gin, GSH, Ser, Thr, Asn, ClO^-, 二氧六环溶液，备用。

在含有3 mL上述所配制的溶液中加入30 μL探针母液，保证待测液最终的浓度为10 μM，然后摇匀，进行发射光谱检测（激发波长455nm，检测波段450-750nm）。以测得的荧光强度与二氧六环的荧光强度的比值（I/I_二氧六环）为纵坐标，以不同分子或离子为横坐标作柱状图，如图5。由图5可知：荧光探针在二氧六环溶液中有强烈荧光；在其他溶液中荧光很弱；说明其他离子，活性氧或氨基酸对探针CTPA的荧光几乎没有影响。

实施例4 荧光探针与商业化脂滴探针的共定位

配制浓度为1 mM的实施例1合成的荧光探针CTPA的二甲基亚砜 (DMSO) 的测试母液溶液待用; 配制浓度为1mM的市售的尼罗红（脂滴的专用定位剂）的二甲基亚砜 (DMSO)的测试母液溶液待用。

将适当密度的小鼠乳腺肿瘤细胞4T1接种到灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37 ℃，5 % CO₂）中培养，待细胞贴壁后，分别加入本发明所述检测极性的荧光探针CTPA 10 μL和市售的尼罗红（脂滴的专用定位剂）溶液5 μL，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，随后进行荧光成像（探针的激发波长：488 nm，发射波段：500-550 nm；尼罗红的激发波长：647 nm，发射波段：663-738 nm），结果如图6所示，其中，（A）为CTPA在绿色通道收集的光；（B）为尼罗红在近红外通道的光；（C）是（A）和（B）的叠加图；（D）为（A）和（B）的光谱强度叠加图。图6中表明该探针与尼罗红的成像位置高度吻合，探针CTPA主要定位在细胞中的脂滴内，因而此探针可以用来检测细胞中脂滴的极性。

实施例5 荧光探针的细胞成像

将适当密度的小鼠乳腺肿瘤细胞4T1和小鼠乳腺上皮细胞3T3分别接种到两个灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37 ℃，5 % CO₂）中培养，待细胞贴壁后，加入本发明所述检测脂滴极性的荧光探针CTPA 10 μM，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，随后进行荧光成像（单光子激发波长：488 nm；双光子激发波长：780 nm；发射波段：500-550nm和570-620 nm），如图7所示，无论是在单光子还是在双光子的成像条件下，肿瘤细胞中的荧光显著比正常细胞的荧光强；在肿瘤细胞中发出很强的绿光和一般强度的红光，在正常细胞中基本不发绿光但较弱的红光，因此正常细胞和肿瘤细胞可以通过两个光强的比值来区分。

实施例6 荧光探针的小鼠成像

分别向正常小鼠的腹部以及肿瘤小鼠的肿瘤处注入100 μL浓度为1 mM的探针母液；30 min后用活体成像仪对小鼠进行成像（激发波长：560 nm，发射波长：620 nm）。如图8所示，肿瘤小鼠肿瘤处的光明显比正常小鼠腹部注入探针的位置对应的光强，说明此探针通过区分不同状态小鼠体内脂滴的极性。

Claims

1.一种区分不同极性脂滴的荧光探针，化学名称为(E)-7-(N, N-二乙胺基)-3-(3-(4-(二苯胺)苯基)丙烯酰)-2H-苯并吡喃酮，具有如式（I）所示的结构：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）N,N-二乙氨基水杨醛和乙酰乙酸乙酯在哌啶存在下于有机溶剂中室温搅拌，分离纯化得到亮黄色的固体，即3-乙酰基-7（二乙胺基）香豆素；

（2）3-乙酰基-7（二乙胺基）香豆素和4-二苯胺基苯甲醛在哌啶存在下于有机溶剂中加热回流，分离纯化得到(E)-7-(N, N-二乙胺基)-3-(3-(4-(二苯胺)苯基)丙烯酰)-2H-苯并吡喃酮。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中，N,N二乙氨基水杨醛和乙酸乙酯的摩尔比为1:1.2；步骤（2）中，3-乙酰基-7（二乙胺基）香豆素与4-二苯胺基苯甲醛的摩尔比为1:1。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中温度为70-80℃；反应时间为12-24h。

5.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，所述有机溶剂为乙醇或乙醇与乙腈的混合。

6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中分离提纯步骤为：将反应体抽滤，然后用乙醇加热溶解，待刚好溶解后再冷却，等样品析出后再抽滤；所述乙醇溶解所用的温度为90℃。

7.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中所述分离提纯步骤为：减压蒸馏旋干溶剂得到粗产物后，经柱色谱分离得到提纯产物。

8.根据权利要求7所述的合成方法，其特征在于，柱色谱分离的流动相为体积比为1:5的石油醚与乙酸乙酯。

9.一种如权利要求1所述的荧光探针用于检测细胞或动物体中不同极性脂滴的应用。