CN108997195A

CN108997195A - 一种定位脂滴的双光子粘度探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN108997195A
Application number: CN201810954966.7A
Authority: CN
Inventors: 林伟英; 彭敏; 阴军玲
Original assignee: University of Jinan
Current assignee: University of Jinan
Priority date: 2018-08-21
Filing date: 2018-08-21
Publication date: 2018-12-14
Anticipated expiration: 2038-08-21
Also published as: CN108997195B

Abstract

本发明提供了一种可区分不同粘度的双光子荧光探针：，化学名称为3‑（4‑甲醛基苯基）‑9‑乙基咔唑。探针中“苯甲醛”部分与“9‑乙基咔唑”部分通过单键相连，所以在低粘度的情况下，探针几乎没有荧光，在高粘度的体系中，探针会发出很强的荧光。该探针具有较好的灵敏度、良好的光学稳定性以及对粘度特异性响应，实现了对细胞以及斑马鱼内脂滴粘度的检测。该探针由3‑溴咔唑、溴乙烷、4‑甲酰基苯硼酸原料制得，步骤简单、纯化方便、收率高。

Description

一种定位脂滴的双光子粘度探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种区分不同粘度的双光子荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

粘度是衡量一种浓稠流体的流动性和扩散性的主要因素，同时是流体扩散速率的主要参考指标。微环境的粘度在病理学研究中起到非常重要的作用，因为粘度的变化往往会影响细胞微环境中各种新陈代谢的进行。脂滴是一种动力学细胞器，脂滴内的粘度直接影响脂滴的新陈代谢，粘度的异常与许多疾病有关。所以检测细胞中脂滴内的粘度对于临床诊断和病理分析具有重要的意义。

荧光成像技术由于具有实时监测，背景信号低，灵敏度高等优点而成为检测生物分子以及生物微环境重要的一种手段。双光子性质具有高穿透度，对生物样品损伤少等优点而被广泛应用到生物成像中。所以，发展一种新的双光子荧光探针对于检测脂滴内的粘度具有重要意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种可区分不同粘度的双光子荧光探针，该探针可定位于脂滴，且选择性好、灵敏度高。

本发明的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种定位脂滴的双光子粘度探针，化学名称为3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑，简称为CBA，结构式如式（I）：

式（I）。

一种上述双光子粘度探针的合成方法，包括以下步骤：

（1）3-溴咔唑（1）的氢氧化钠溶液于四氢呋喃中室温搅拌，然后与溴乙烷（2）加热反应，分离纯化得到白色固体，即3-溴-9-乙基咔唑（3）：

；

（2）3-溴-9-乙基咔唑（3）与4-甲酰基苯硼酸（4）在碳酸钾和四(三苯基膦)钯存在下于四氢呋喃与水的混合溶剂中加热回流，分离纯化得3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑（5），即探针CBA：

。

步骤（1）中，所述3-溴咔唑：氢氧化钠：溴乙烷的摩尔比为1:2:6。

步骤（1）中，所述搅拌时间为1.5h；所述反应温度为55℃，反应时间为12h。

步骤（1）中，所述分离纯化步骤为：将反应后的体系减压蒸馏，旋干溶剂得到粗产物后，经柱色谱分离得到提纯产物；所述柱色谱分离的流动相优选为体积比为1:30的乙酸乙酯与石油醚。

步骤（2）中，所述3-溴-9-乙基咔唑：碳酸钾：4-甲酰基苯硼酸：四(三苯基膦)钯的摩尔比为1:3:1.2:0.03。

步骤（2）中，所述反应溶剂为四氢呋喃:水=1:3（V:V）的混合溶剂。

步骤（2）中，所述反应在N₂保护下进行。

步骤（2）中，所述反应温度为60℃，反应时间为12h。

步骤（2）中，所述分离纯化步骤为：用二氯甲烷萃取反应后的体系，并用无水硫酸钠除去体系中剩余的少量的水，然后进行减压蒸馏，旋干溶剂得粗产品，经柱色谱分离得到提纯产物；所述柱色谱分离的流动相优选为体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚。

一种上述双光子粘度探针用于检测溶液和脂滴的粘度的应用。

本发明荧光探针的识别机理如下：

由于探针中“苯甲醛”部分与“9-乙基咔唑”部分通过单键相连，所以在低粘度的情况下，苯甲醛可以通过单键自由旋转，使整个探针分子不共平面，探针几乎没有荧光即荧光处于“关闭”状态；当在粘度比较大的体系中时，由于苯甲醛的自由旋转受到限制，使得整个探针分子共平面，探针就会发出很强的荧光，即荧光开关被打开。所以，通过这种“开关型”荧光探针可以检测不同的粘度。

本发明的有益效果为：

本发明所提供的区分不同粘度的荧光探针，具有较高的灵敏度，良好的光学稳定性以及对粘度特异性响应；并且实现了在细胞以及斑马鱼内脂滴粘度的检测。同时，本发明提供了该探针的合成方法，步骤简单、纯化方便、收率高。

附图说明

图1是探针的¹H NMR谱；

图2是探针的¹³C NMR谱；

图3是探针在不同粘度体系中的发射光谱；

图4是探针在脂滴中的定位实验

图5是探针的细胞成像应用；

图6是探针在斑马鱼中的成像应用。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 荧光探针CBA的合成

（1）化合物（3）的合成：

将2.46 g 3-溴咔唑（10 mmol）（1）和0.8 g氢氧化钠(20 mmol)加入装有20 mL四氢呋喃的高压管中，室温搅拌，1.5 h后加入6.56g溴乙烷（60 mmol），反应约12 h，反应完成后，将反应后的体系减压蒸馏，旋干溶剂得到粗产物后，以体积比为1:30的乙酸乙酯与石油醚为流动相进行柱色谱分离提纯得3-溴-9-乙基咔唑（3）；

（2）荧光探针CBA（5）的合成：

称量0.274 g 3-溴-9-乙基咔唑（3）（1 mmol），0.18g4-甲酰基苯硼酸（4）（1.2 mmol），37 mg四-（三苯基膦钯）（0.03 mmol），0.445 g碳酸钾（3.23mmol）于四氢呋喃与水=1:3（V:V）的混合溶剂中反应，升温至60 ℃回流，在N₂氛围环境下反应12 h后，用二氯甲烷萃取，并用无水硫酸钠除去体系中剩余少量的水，然后进行减压蒸馏，旋干溶剂得粗产品，以体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚为流动相进行柱色谱分离提纯得3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑（5），即探针CBA。探针¹H NMR谱如图1，¹³C NMR谱如图2；

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.05 (s, 1H), 8.65 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 8.28(d, J = 7.6 Hz, 1H), 8.03 (q, J = 8.8 Hz, 4H), 7.90 (dd, J₁=8.4 Hz, J₂= 2,1H), 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.49 (m, 1H), 7.24(t, J = 7.4 Hz, 1H), 4.48 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 1.33 (t, J = 7.0 Hz, 3H)；

¹³C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 192.34, 146.71, 139.85, 139.52, 134.00 ,129.96, 129.18, 126.79, 125.91, 124.73, 122.72, 122.14, 120.50, 118.97,118.88, 109.47, 109.14, 36.88, 13.49。

实施例2 荧光探针CBA在不同粘度体系中的荧光光谱

配制浓度为1 mM实施例1所得荧光探针的二甲基亚砜（DMSO）的测试母液待用。

测试液中，分别取3 ml不同比例甘油与甲醇的溶剂（甘油:甲醇=0:10，1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1，10:0），然后加入探针母液（终浓度为10 μM），进行荧光扫描（激发波长365 nm，检测波段450-650 nm），测得各体系中相对荧光强度，如图3所示。由图3可知，随着溶剂粘度的增加，相对荧光强度变强。

实施例3 荧光探针对脂滴的共定位成像

将适当密度的Hela细胞接种到灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37 ℃，5 % CO₂）中培养，待细胞贴壁后，同时向细胞中加入粘度荧光探针CBA以及脂滴商业化染料尼罗红，使粘度荧光探针最终浓度为10 μM，尼罗红最终浓度为5 μM。半小时后，弃掉培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞3次，随后进行荧光成像（激发波长：488 nm，绿色通道：500-550 nm；红色通道570 nm-620 nm），结果如图4所示。其中，（a）为CBA在绿色通道的成像图；（b）为尼罗红在红色通道的成像图；（c）是（a）和（b）的叠加图；（d）为（c）图箭头处细胞中两探针的光谱强度叠加图；（e）为（c）图箭头处细胞中两探针的光谱强度分布图；（f）为细胞明场成像图。由图4可知，该探针与尼罗红的成像位置高度吻合，探针CBA主要定位在细胞中的脂滴内，因而本发明的探针可以用来检测细胞中脂滴的粘度。

实施例4 荧光探针在细胞中的成像

配制浓度为1 mM实施例1所得荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用。

将适当密度的Hela细胞接种到灭菌的35 mm成像培养皿中，在CO₂培养箱（温度为37 ℃，5 % CO₂）中培养，待细胞贴壁后，第一组加入10μM粘度荧光探针CBA孵育半小时后进行生物成像（单光子成像：激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm；双光子成像：激发波长780 nm，发射波长：500-550 nm）；第二组先加入10μM粘度刺激物莫能菌素（Monensin），40分钟后再加入10μM粘度荧光探针CBA，孵育半小时后进行生物成像；第三组先加入10μM粘度刺激物制霉菌素（Nystatin），40分钟后加入10μM粘度荧光探针CBA，孵育半小时后进行生物成像；成像结果如图5所示。通过分析比较可以看出无论在单光子还是在双光子条件下，在只有探针的情况下细胞只发微弱的光；在加有探针以及粘度刺激物（莫能菌素，制霉菌素）的情况下细胞发出强烈的绿光；因此不同粘度的细胞可以通过本发明合成的探针进行细胞成像来区分。

实施例5 荧光探针在斑马鱼中的成像

将斑马鱼放入不同组成像盘中，分成四组，第一组仅加入PBS=7.4的缓冲溶液，半小时后进行生物成像；第二组加入10 μM粘度荧光探针CBA孵育半小时后进行生物成像；第三组先加入10 μM粘度刺激物莫能菌素（Monensin），40分钟后再加入10μM粘度荧光探针CBA，孵育半小时后进行生物成像（单光子成像：激发波长：488 nm，发射波长：500-550 nm；双光子成像：激发波长780 nm，发射波长：500-550 nm）；第四组先10 μM粘度刺激物制霉菌素（Nystatin），40分钟后加入10 μM粘度荧光探针CBA，孵育半小时后进行生物成像；成像结果如图6所示。通过分析比较可以看出，无论在单光子还是在双光子条件下，在只有PBS的条件下斑马鱼没有光；在只有探针的情况下斑马鱼只发微弱的光；在加有探针以及粘度刺激物（莫能菌素，制霉菌素）的情况下斑马鱼发出强烈的绿光；因此不同粘度的斑马鱼可以通过本发明合成的探针进行斑马鱼成像来区分。

Claims

1.一种定位脂滴的双光子粘度探针，化学名称为3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑，结构式如式（I）：

式（I）。

2.一种如权利要求1所述的双光子粘度探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）3-溴咔唑（1）的氢氧化钠溶液于四氢呋喃中室温搅拌，然后与溴乙烷（2）加热反应，分离纯化得到3-溴-9-乙基咔唑（3）：

；

（2）3-溴-9-乙基咔唑（3）与4-甲酰基苯硼酸（4）在碳酸钾和四(三苯基膦)钯存在下于四氢呋喃与水的混合溶剂中加热回流，分离纯化得3-（4-甲醛基苯基）-9-乙基咔唑（5）：

。

3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中所述3-溴咔唑：氢氧化钠：溴乙烷的摩尔比为1:2:6。

4.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中所述分离纯化步骤为：将反应后的体系减压蒸馏，旋干溶剂得到粗产物后，经柱色谱分离得到提纯产物；所述柱色谱分离的流动相优选为体积比为1:30的乙酸乙酯与石油醚。

5. 根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（1）中所述搅拌时间为1.5h；所述反应温度为55℃，反应时间为12 h；步骤（2）中所述反应温度为60℃，反应时间为12h。

6.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中所述3-溴-9-乙基咔唑：碳酸钾：4-甲酰基苯硼酸：四(三苯基膦)钯的摩尔比为1:3:1.2:0.03。

7.根据权利要求2中所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中所述反应在N₂保护下进行。

8.根据权利要求2中所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中所述反应溶剂为四氢呋喃:水=1:3（V:V）的混合溶剂。

9.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于，步骤（2）中所述分离纯化步骤为：将反应后的体系用二氯甲烷萃取，并用无水硫酸钠除去体系中剩余的少量的水，然后进行减压蒸馏，旋干溶剂得粗产品，经柱色谱分离得到提纯产物；所述柱色谱分离的流动相优选为体积比为1:20的乙酸乙酯与石油醚。

10.一种如权利要求1所述的双光子粘度探针在检测溶液和脂滴粘度中的应用。