CN114276356B - 一种线粒体靶向的荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及荧光探针技术领域，特别涉及一种线粒体靶向的荧光探针及其合成方法和应用。所述荧光探针为紫色固体，简称为Cy₁₃₂₁，Cy₉₇₂。合成方法包括如下步骤：(1)将酰氯类化合物用恒压滴压漏斗滴入F₄₉₆中，加入三乙胺，冰浴滴加，常温反应，(2)反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪旋干，即得固体产物。所述荧光探针用于活细胞内线粒体荧光显微成像，用于体外极性检测细胞变化。本发明所提供的一种用于线粒体靶向荧光探针的长波长在近红外部分，在细胞中毒性低，对生物体活细胞危害较小。其次，本发明应用于靶向活细胞中的线粒体，进一步推动了生物小分子在生命体中作用的探究。

Description

一种线粒体靶向的荧光探针及其合成方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光探针技术领域，特别涉及一种线粒体靶向的荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术

线粒体是一种存在于大多数细胞中的关键细胞器，细胞生命活动所需的能量95％来自线粒体，因此其又有“细胞动力工厂”之称。线粒体还参与诸如细胞信息传递、细胞分化和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细胞周期的能力。因此，监测线粒体自身及内部环境变化对深入揭示生物体生命活动规律有着至关重要的作用。

近年来，荧光探针技术因其优异的灵敏度、高的时间和空间分辨率、非侵入性和实时原位成像而受到特别关注。目前，用于细胞内线粒体靶向成像的荧光探针种类还不是很多；有的探针不仅灵敏度不高，而且合成步骤复杂。

因此，开发一种易于合成、具备低毒性，且能够简易快速靶向线粒体的荧光探针具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明提供一种合成步骤简易、荧光寿命好、生物毒性低，具备对极性变化的高灵敏性和较小的荧光背景干扰，可用于荧光成像及克服细胞器极性探针穿透性不足的线粒体靶向的荧光探针及其合成方法和应用。

本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种线粒体靶向的荧光探针，所述荧光探针为紫色固体，化学结构式如式Ⅰ所示：

式I中，R为胆固醇甲酰氯或棕榈酰氯。

进一步的，

所述胆固醇甲酰氯和棕榈酰氯结构式分别为，

所述荧光探针为式I-1或I-2所示化合物中的一种，所述式I-1简称为Cy₁₃₂₁，所述式I-2简称为Cy₉₇₂

线粒体靶向的荧光探针的合成方法，包括如下步骤：

(1)将酰氯类化合物用恒压滴压漏斗滴入F₄₉₆中，加入三乙胺，冰浴滴加，常温反应，

(2)反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪旋干，即得固体产物。

进一步的，所述F₄₉₆为(E)-2-(2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙基苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三碳烯-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，结构式如下Ⅱ所示：

进一步的，

所述胆固醇甲酰氯或棕榈酰氯，以及F₄₉₆分别溶解于二氯甲烷后，再将两种原料进行滴加反应。

进一步的，

所述胆固醇甲酰氯与F₄₉₆的摩尔比为9:1～10:1，

所述三乙胺的加入比例为胆固醇甲酰氯摩尔量的1.3～1.5倍，

所述反应的温度为25～28℃，反应时间为6.5～7h，滴加时间为30～40min。

进一步的，

所述棕榈酰氯与F₄₉₆的摩尔比为16:1～17:1，

所述三乙胺的加入比例为棕榈酰氯摩尔量的1.0～1.2倍，

所述反应的温度为25～28℃，反应时间为4.5～5h，滴加时间为10～20min。

进一步的，步骤(2)中，还包括对所述产物进行纯化，

所述固体产物为粗产物，以二氯甲烷与甲醇的体积比为200:1～15:1通过硅胶柱色谱提纯。

一种线粒体靶向的荧光探针的应用，所述荧光探针用于活细胞内线粒体荧光显微成像，用于体外极性检测细胞变化。

进一步的，

所述荧光探针与商用细胞器探针对海拉细胞进行共定位检测，步骤包括：

(1)配制：荧光探针浓度为1mM的二甲基亚砜溶液，即测试培养液；线粒体荧光探针浓度为200μM的二甲基亚砜溶液；细胞核荧光染料浓度为1mg/mL的超纯水溶液；溶酶体荧光探针浓度为50nM的培养基溶液，即Lyso-Tracker Red工作液，

(2)细胞培养：将复苏好的海拉细胞进行培养，培养基包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％DMEM、在37℃，5％CO₂的环境中培养24h，得到长势良好的细胞；将上述培养基中培育24h的海拉细胞置入六孔板中，用包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％DMEM的培养基、在37℃，5％CO₂的环境中继续培养24h，每孔接种量为2×10⁵～8×10⁵孔/mL，备用；

(3)将六孔板中培育24h的海拉细胞分为ABC三组，其中：A组海拉细胞加入2μM的所述测试培养液和200nM的所述线粒体荧光探针共孵育20min；B组海拉细胞使用2μM的所述测试培养液和10μg/mL的所述细胞核荧光染料共孵育20min；C组海拉细胞使用2μM的所述测试培养液和50nM的所述溶酶体荧光探针分别孵育20min，

(4)培养20min后，弃掉培养基，用3mL pH＝7.4的PBS缓冲液淋洗细胞3次，最后在六孔板中加入3mL pH＝7.4的PBS缓冲液,进行荧光成像，探针为红色通道，激发波长488nm，收集波段630-754nm；线粒体探针为绿色通道，激发波长546nm,收集波段550-630nm；细胞核探针为蓝色通道，激发波长405nm,收集波段400-500nm；溶酶体探针为绿色通道，激发波长546nm,收集波段550-630nm，

(5)对所述A、B、C组海拉细胞进行共聚焦激光荧光成像，得到三组细胞的共聚焦图谱，通过市售线粒体、细胞核和溶酶体探针标记细胞器，考察荧光探针的靶向分布特性。

本发明一种线粒体靶向的荧光探针及其合成方法和应用的有益效果是：

(1)本发明所提供的用于线粒体靶向荧光探针，能够在活细胞中标记线粒体；并且对极性响应灵敏，在含有0～100％四氢呋喃的四氢呋喃/二甲基亚砜极性溶剂中，荧光分子探针的荧光强度出现6.8倍的强度变化，并表现出双荧光发射峰比率型变化。

(2)本发明所提供的用于线粒体靶向荧光探针具有良好的生物膜透性，大的斯托克斯位移，信噪比低，荧光背景干扰小等优势。同时，制备方法简单易行、成本低，经济技术效果明显。

(3)本发明所提供的用于线粒体靶向荧光探针的长波长在近红外部分，在细胞中毒性低，对生物体活细胞危害较小。其次，本发明应用于靶向活细胞中的线粒体，进一步推动了生物小分子在生命体中作用的探究。

附图说明

图1为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁的质谱图；

图2为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁的核磁H谱；

图3为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁的核磁C谱；

图4为本发明实施例1制备的分子探针F₄₉₆的质谱图；

图5为本发明实施例4制备的荧光探针Cy₉₇₂的质谱图；

图6为本发明实施例4制备的荧光探针Cy₉₇₂的核磁H谱；

图7为本发明实施例4制备的荧光探针Cy₉₇₂的核磁C谱；

图8为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁对体外极性测试溶液的荧光滴定图；

图9为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁在461nm波长处对体外极性测试溶液荧光强度的线性图；

图10为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁在649nm波长处对体外极性测试溶液荧光强度的线性图；

图11为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁对体外极性测试溶液的紫外吸收图；

图12为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁对体外极性测试溶液的荧光寿命图；

图13为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁对不同极性测试溶液的紫外吸收和荧光光谱结合图；

图14为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁对不同pH测试溶液的柱状图；

图15为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁对不同极性测试溶液的荧光滴定图；

图16为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁对海拉细胞的共聚焦图谱；

图17为本发明实施例1制备的荧光探针Cy₁₃₂₁对细胞的存活率柱状图；

图18为本发明实施例4制备的荧光探针Cy₉₇₂对体外极性测试溶液的荧光滴定图；

图19为本发明实施例4制备的荧光探针Cy₉₇₂在463nm波长处对体外极性测试溶液荧光强度的线性图；

图20为本发明实施例4制备的荧光探针Cy₉₇₂在648nm波长处对体外极性测试溶液荧光强度的线性图；

图21为本发明实施例4制备的荧光探针Cy₉₇₂对不同极性测试溶液的紫外吸收图；

图22为本发明实施例4制备的荧光探针Cy₉₇₂对海拉细胞的共聚焦图谱；

图23为本发明实施例4制备的荧光探针Cy₉₇₂对细胞的存活率柱状图。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述：

实施例1：

线粒体靶向的荧光探针的制备方法，具体合成路线如下：

具体步骤包括：

(1)按照10:1的摩尔比，将10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯[a]菲-2-基碳酰氯(胆固醇甲酰氯)用恒压滴压漏斗滴入F₄₉₆中，其中胆固醇甲酰氯和F₄₉₆在进行滴加前用二氯甲烷分别溶解；再加入胆固醇甲酰氯摩尔量的1.3倍的三乙胺，在25℃的条件下反应6.5h。

(2)反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪旋干，即得粗产物。

(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从200:1～15:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体，即为荧光探针：(E)-2-(2-(4,7-双(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊基[a]菲-2-基)氧基)羰基)-2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙醇苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三烷-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，命名为Cy₁₃₂₁。

所述F₄₉₆具体合成步骤包括：

(1)按照1:5的摩尔比，将2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐(IR-813高氯盐酸)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷加入到烧瓶中，然后加入三氯甲烷作为溶剂，再滴加IR-813高氯盐酸摩尔量的1.8倍的三乙胺，在80℃的加热条件下反应12h。

(2)反应结束后，将反应液冷却到室温，待固体产物析出完全后，过滤出固体产物，用浓度为350g/L的浓盐水水洗该产物，得到粗产物。

(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从100:1-5:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体F₄₉₆。

结果如图4所示，对所得紫色固体进行电喷雾质谱分析。因此，可确定上述紫色固体产物即为(E)-2-(2(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙基苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三碳烯-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，其化学结构式如下式(II)所示：

对本实施例制备的荧光探针Cy₁₃₂₁进行电喷雾质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱分析，具体波谱特性如下：

(1)其电喷雾质谱如图1所示。

(2)其核磁共振氢谱如图2所示。

¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ8.00(s,1H),7.79(s,2H),7.48(s,1H),7.28(s,2H),7.15(s,1H),6.93(s,1H),5.33(s,1H),5.26(s,1H),4.56-4.22(m,4H),3.94(s,6H),3.72(s,4H),3.35(s,2H),3.28(s,4H),2.49(s,2H),2.26(s,7H),1.90(s,7H),1.81(s,9H),1.45(s,14H),1.29(s,8H),1.16-0.74(m,44H),0.63(s,9H).

(3)其核磁共振碳谱如图3所示。

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ:155.55,154.05,140.78,139.40,130.67,129.99,129.90,128.58,127.48,123.63,122.69,121.74,117.69,109.15,75.05,59.45,58.85,56.60,56.11,53.45,50.03,49.82,49.04,42.27,39.69,39.50,38.79,36.95,36.53,36.43,36.16,35.77,31.86,29.97,28.39,28.32,28.22,28.20,28.00,24.29,23.82,22.82,22.56,21.04,19.39,18.71,11.87.

可以看出，本实施例成功地合成了所述荧光探针Cy₁₃₂₁。

性能测试：

1、建立该荧光探针Cy₁₃₂₁对极性的滴定线性曲线，步骤包括：

(1)配制：荧光探针Cy₁₃₂₁浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液，备用。

(2)分别配制四氢呋喃与二甲基亚砜不同比例(10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10)的极性测试溶液，分别置于试管内，然后在每个试管中按比例分别加入四氢呋喃和二甲基亚砜共2mL，Cy₁₃₂₁浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液各2μL，混合均匀后，在荧光比色皿中完成荧光测定。

通过FLS1000-stm测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测的激发波长为380nm。

分别以发射波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，得到关于不同极性测试溶液有关的波长-荧光强度的荧光滴定图，图8是荧光探针Cy₁₃₂₁对体外极性测试溶液的荧光滴定图；分别以四氢呋喃的含量为横坐标，以荧光强度为纵坐标，图9和图10是分子探针Cy₁₃₂₁对体外极性荧光强度的线性图。从图中可以看出该探针对极性表现出良好的线性关系，说明其具有检测极性的能力。

2、建立该荧光探针Cy₁₃₂₁对极性测试溶液的紫外吸收曲线，步骤包括：

将四氢呋喃与二甲基亚砜不同比例(10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10)的极性测试溶液，分别置于试管内，然后再分别加入Cy₁₃₂₁浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液各2μL，混合均匀，在比色皿中完成紫外吸收测定，结果如图11所示，其表示荧光探针Cy₁₃₂₁在体外极性测试溶液中的紫外吸收图，其中最小极性为四氢呋喃，最大极性为二甲基亚砜，该探针对极性能表现出明显紫外变化，说明探针能够对极性响应。

3、检测所述荧光探针Cy₁₃₂₁在不同极性测试溶液下的荧光寿命，步骤包括：

(1)配制：荧光探针Cy₁₃₂₁浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液，备用。

(2)分别配制四氢呋喃与二甲基亚砜不同比例(10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10)的极性测试溶液，分别置于试管内，然后在每个试管中按比例分别加入四氢呋喃和二甲基亚砜共2mL，Cy₁₃₂₁浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液各2μL，混合均匀，在荧光比色皿中完成荧光寿命测定。

通过FLS1000-stm测试荧光寿命，检测细胞极性的荧光强度的激发波长为380nm。

得到荧光探针Cy₁₃₂₁对不同极性的荧光寿命图，结果如图12所示，该探针对不同极性测试溶液表现出明显的荧光寿命变化，说明该探针对极性表现出良好的响应。

4、所述荧光探针Cy₁₃₂₁对不同极性溶剂的紫外吸收和荧光光谱，步骤包括：

(1)配制：常见的有机溶剂(如图13所示:DMSO(a),THF(b)，DCM(C)，TCM(d)，MeCN(e)和EtOH(f))作为常见的极性检测溶液；荧光探针Cy₁₃₂₁浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液，备用。

(2)在每份2mL的所述有机溶剂中加入2μL浓度为10mM的二甲基亚砜溶液，混合均匀后，得常见有机溶剂测试溶液(即不同极性溶剂)，然后在荧光比色皿中完成荧光和紫外的测定。

通过FLS1000-stm测试荧光强度；通过UV-3600Plus测定紫外吸收图谱，检测细胞极性的荧光强度的激发波长为380nm。

分别以发射波长为横坐标，以荧光强度和吸收度为纵坐标，得到关于有机溶剂的波长-荧光强度和紫外吸收的相关图谱。结果如图13所示，该探针具备大的斯托克斯位移，使得信噪比低，荧光背景干扰小等优势。

5、所述荧光探针Cy₁₃₂₁对不同pH测试溶液的荧光滴定，步骤包括：

(1)配制：pH分别为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5和10的缓冲溶液(Tris-HCl:EtOH＝1:1)、荧光探针Cy₁₃₂₁浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液，备用。

(2)在每份2mL的缓冲溶液(Tris-HCl:EtOH＝1:1)中加入Cy₁₃₂₁浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液各2μL，混合均匀，得pH分别为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5和10的酸碱测试溶液，然后在荧光比色皿中完成荧光测定。

通过荧光分光光度计测试荧光强度，检测细胞极性的荧光强度的激发波长为380nm。

分别以pH为横坐标，以荧光相对强度为纵坐标，得到关于pH-荧光相对强度相关的柱状图，结果如图14所示，该探针在pH为2～10范围内荧光强度没有表现出明显的变化，说明其对pH具备稳定性。

6、所述荧光探针Cy₁₃₂₁对不同极性溶剂的荧光滴定，步骤包括：

(1)配制：常见的有机溶剂(如图15所示)作为常见的极性检测溶液；荧光探针Cy₁₃₂₁浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液，备用。

(2)在每份2mL的所述有机溶剂中加入2μL二甲基亚砜溶液，混合均匀后，得常见有机溶剂测试溶液(即不同极性溶剂)，在荧光比色皿中完成荧光测定。

通过FLS1000-stm测试荧光强度，检测细胞极性的荧光强度的激发波长为380nm。分别以发射波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，得到关于有机溶剂的波长-荧光强度相关图谱，结果如图15所示，该探针能够针对不同极性的有机溶剂表现出合理的变化，说明该探针对极性表现出良好的响应。

7、检测所述荧光探针Cy₁₃₂₁对细胞存活率的影响，步骤包括：

(1)在细胞培养液中分别加入浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM和100μM的所述荧光探针Cy₁₃₂₁，然后在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h。

(2)完成后，将25μL的4-甲基噻唑基四唑MTT(浓度为5mg/mL)加入到细胞培养液中继续培养4h，通过MTT比色皿法来评估细胞存活率，以不加荧光探针Cy₁₃₂₁的细胞组存活率为100％，不同浓度荧光探针Cy₁₃₂₁加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图，结果图17所示，该探针即使在非常高的浓度下，仍具备非常低的毒性。

荧光探针Cy₁₃₂₁与商用细胞器探针对海拉细胞进行共定位测试，步骤包括：

(1)配制：荧光探针Cy₁₃₂₁浓度为1mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液(简称为测试培养液)；线粒体荧光探针(Mito-Tracker Red CMXRos)浓度为200μM的二甲基亚砜(DMSO)溶液；细胞核荧光染料(Hoechst 33342)浓度为1mg/mL的超纯水(H₂O)溶液；溶酶体荧光探针(Lyso-Tracker Red)浓度为50nM的培养基溶液，即Lyso-Tracker Red工作液，备用。

(2)细胞培养：将复苏好的海拉细胞进行培养，培养基包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％DMEM、在37℃，5％CO₂的环境中培养24h，得到长势良好的细胞；将上述培养基中培育24h的海拉细胞置入六孔板中，用包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％DMEM的培养基、在37℃，5％CO₂的环境中继续培养24h，每孔接种量为2×10⁵～8×10⁵孔/mL，备用。

(3)将六孔板中培育24h的海拉细胞分为三组(组A，组B，组C)，其中：A组海拉细胞加入2μM的所述测试培养液和200nM的所述线粒体荧光探针共孵育20min；B组海拉细胞使用2μM的所述测试培养液和10μg/mL的所述细胞核荧光染料共孵育20min；C组海拉细胞使用2μM的所述测试培养液和50nM的所述溶酶体荧光探针分别孵育20min。培养20min后，弃掉培养基，用3mL的PBS(pH＝7.4)缓冲液淋洗细胞3次，最后在六孔板中加入3mL的PBS(pH＝7.4)缓冲液,进行荧光成像(探针为红色通道，激发波长488nm，收集波段630-754nm；线粒体探针为绿色通道，激发波长546nm,收集波段550-630nm；细胞核探针为蓝色通道，激发波长405nm,收集波段400-500nm；溶酶体探针为绿色通道，激发波长546nm,收集波段550-630nm)。

对所述A、B、C组海拉细胞进行共聚焦激光荧光成像，得到三组细胞的共聚焦图谱，通过市售线粒体、细胞核和溶酶体探针标记细胞器，考察Cy₁₃₂₁的靶向分布特性，结果分别如图16所示，图中比例尺为10μm，Cy₁₃₂₁的荧光信号与市售线粒体的荧光探针信号高度重合，采用ImageJ软件进行共定位分析，得到两者的共定位相关系数值为0.91；而Cy₁₃₂₁与细胞核和溶酶体的共定位相关系数值为0.13和0.22，表明Cy₁₃₂₁具有较好的线粒体靶向性能。

实施例2：

线粒体靶向的荧光探针的制备方法，具体合成路线与实施例1相同，具体步骤包括：

(1)按照9:1的摩尔比，将10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯[a]菲-2-基碳酰氯(胆固醇甲酰氯)用恒压滴压漏斗冰浴滴入到F₄₉₆中，其中胆固醇甲酰氯和F₄₉₆在进行滴加前用二氯甲烷分别溶解；再加入胆固醇甲酰氯摩尔量的1.5倍的三乙胺，在28℃的条件下反应7h。

(2)反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪旋干，即得粗产物。

(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从200:1～15:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体，即为荧光探针：(E)-2-(2-(4,7-双(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊基[a]菲-2-基)氧基)羰基)-2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙醇苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三烷-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，命名为Cy₁₃₂₁。

实施例3：

线粒体靶向的荧光探针的制备方法，具体合成路线与实施例1相同，具体步骤包括：

(1)按照10:1的摩尔比，将10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊二烯[a]菲-2-基碳酰氯(胆固醇甲酰氯)用恒压滴压漏斗冰浴滴入到F₄₉₆中，其中胆固醇甲酰氯和F₄₉₆在进行滴加前用二氯甲烷分别溶解；再加入胆固醇甲酰氯摩尔量的1.4倍的三乙胺，在23℃的条件下反应6.5h。

(2)反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪旋干，即得粗产物。

(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从200:1～15:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体，即为荧光探针：(E)-2-(2-(4,7-双(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚烷-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊基[a]菲-2-基)氧基)羰基)-2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙醇苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三烷-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，命名为Cy₁₃₂₁。

实施例4：

线粒体靶向的荧光探针的制备方法，具体合成路线如下：

具体步骤包括：

(1)按照17:1的摩尔比，将棕榈酰氯用恒压滴压漏斗冰浴滴入到F₄₉₆中，其中棕榈酰氯和F₄₉₆在进行滴加前用二氯甲烷分别溶解；再加入棕榈酰氯摩尔量的1.1倍的三乙胺，在25℃的条件下反应4.5h。

(2)反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪旋干，即得粗产物。

(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从200:1～15:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体，即为荧光探针：(E)-2-(2-(4,7-二棕榈酰基-2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙醇苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三烷-15-基)乙烯基-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，命名为Cy₉₇₂。

对本实施例制备的荧光探针Cy₉₇₂进行电喷雾质谱、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱分析，具体波谱特性如下：

(1)其电喷雾质谱如图5所示。

(2)其核磁共振氢谱如图6所示。

¹HNMR(500MHz,CDCl₃)δ:8.09(d,J＝7.8Hz,1H),7.86(t,J＝8.7Hz,2H),7.58-7.53(m,1H),7.39-7.34(m,1H),7.32(d,J＝11.2Hz,1H),7.22-7.18(m,1H),6.96(s,1H),5.42(t,J＝12.4Hz,1H),4.86(dd,1H),4.40(s,3H),4.32-4.24(m,2H),4.18(d,J＝6.7Hz,2H),4.04-3.93(m,4H),3.74(d,J＝10.2Hz,4H),3.42(d,J＝6.7Hz,9H),2.53-2.45(m,3H),2.28(ddd,7H),1.95(d,J＝10.3Hz,3H),1.87(t,J＝11.2Hz,3H),1.63(s,4H),1.56-1.44(m,4H),1.26(s,23H),1.14(d,12H),0.88(s,9H).

(3)其核磁共振碳谱如图7所示。

¹³C NMR(126MHz,CDCl₃)δ:174.82,173.56,172.80,168.76,154.40,140.67,139.08,130.72,130.05,129.88,128.79,128.48,127.42,123.70,121.72,117.53,109.34,107.07,92.07,65.57,59.57,58.84,51.75,49.85,49.13,47.25,44.09,43.56,32.98,32.54,31.88,30.00,29.67,29.59,29.49,29.43,29.33,28.38,28.21,25.67,25.19,24.30,23.68,22.65,14.09.

可以看出，本实施例成功地合成了所述荧光探针Cy₉₇₂。

性能测试：

1、建立该荧光探针Cy₉₇₂对极性的滴定线性曲线，步骤包括：

(1)配制：荧光探针Cy₉₇₂浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液，备用。

(2)分别配制四氢呋喃与二甲基亚砜不同比例(10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10)的极性测试溶液，分别置于试管内，然后在每个试管中按比例分别加入四氢呋喃和二甲基亚砜共2mL，Cy₉₇₂浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液各2μL，混合均匀后，在荧光比色皿中完成荧光测定。

通过FLS1000-stm测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测的激发波长为380nm。

分别以发射波长为横坐标，以荧光强度为纵坐标，得到关于不同极性测试溶液有关的波长-荧光强度的荧光滴定图，图18是荧光探针Cy₉₇₂对体外极性测试溶液的荧光滴定图；分别以四氢呋喃的含量为横坐标，以荧光强度为纵坐标，图19和图20是分子探针Cy₉₇₂对体外极性荧光强度的线性图。从图中可以看出该探针对极性表现出良好的线性关系，说明其具有检测极性的能力。

2、建立该荧光探针Cy₉₇₂对极性测试溶液的紫外吸收曲线，步骤包括：

取四氢呋喃与二甲基亚砜比例为10:0和0:10的溶液共2份作为极性测试溶液，分别置于试管内，然后再分别加入Cy₉₇₂浓度为10mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液各2μL，混合均匀，在比色皿中完成紫外吸收测定，结果如图21所示，其表示荧光探针Cy₉₇₂在体外极性测试溶液中的紫外吸收图，其中最小极性为四氢呋喃，最大极性为二甲基亚砜，该探针对极性能表现出明显紫外变化，说明探针能够对极性响应。

3、所述荧光探针Cy₉₇₂与商用细胞器探针对海拉细胞进行共定位测试，步骤包括：

(1)配制：荧光探针Cy₉₇₂浓度为1mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液(简称为测试培养液)；线粒体荧光探针(Mito-Tracker Red CMXRos)浓度为200μM的二甲基亚砜(DMSO)溶液；细胞核荧光染料(Hoechst 33342)浓度为1mg/mL的超纯水(H₂O)溶液；溶酶体荧光探针(Lyso-Tracker Red)浓度为50nM的培养基溶液，即Lyso-Tracker Red工作液，备用。

(2)细胞培养：将复苏好的海拉细胞进行培养，培养基包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％DMEM、在37℃，5％CO₂的环境中培养24h，得到长势良好的细胞；将上述培养基中培育24h的海拉细胞置入六孔板中，用包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％DMEM的培养基、在37℃，5％CO₂的环境中继续培养24h，每孔接种量为2×10⁵～8×10⁵孔/mL，备用。

(3)将六孔板中培育24h的海拉细胞分为三组(组A，组B，组C)，其中：A组海拉细胞加入2μM的所述测试培养液和200nM的所述线粒体荧光探针共孵育20min；B组海拉细胞使用2μM的所述测试培养液和10μg/mL的所述细胞核荧光染料共孵育20min；C组海拉细胞使用2μM的所述测试培养液和50nM的所述溶酶体荧光探针分别孵育20min。培养20min后，弃掉培养基，用3mL的PBS(pH＝7.4)缓冲液淋洗细胞3次，最后在六孔板中加入3mL的PBS(pH＝7.4)缓冲液,进行荧光成像(探针为红色通道，激发波长488nm，收集波段630-754nm；线粒体探针为绿色通道，激发波长546nm,收集波段550-630nm；细胞核探针为蓝色通道，激发波长405nm,收集波段400-500nm；溶酶体探针为绿色通道，激发波长546nm,收集波段550-630nm)。

对所述A、B、C组海拉细胞进行共聚焦激光荧光成像，得到三组细胞的共聚焦图谱，通过市售线粒体、细胞核和溶酶体探针标记细胞器，考察Cy₉₇₂的靶向分布特性，结果分别如图22所示，图中比例尺为10μm，Cy₉₇₂的荧光信号与市售线粒体的荧光探针信号高度重合，采用ImageJ软件进行共定位分析，得到两者的共定位相关系数值为0.89；而Cy₉₇₂与细胞核和溶酶体的共定位相关系数值为0.14和0.21，表明Cy₉₇₂具有较好的线粒体靶向性能。

4、检测所述荧光探针Cy₉₇₂对细胞存活率的影响，步骤包括：

(1)在细胞培养液中分别加入浓度分别为0μM、10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM和100μM的所述荧光探针Cy₉₇₂，然后在37℃，5％CO₂的培养箱中培养24h。

(2)完成后，将25μL的4-甲基噻唑基四唑MTT(浓度为5mg/mL)加入到细胞培养液中继续培养4h，通过MTT比色皿法来评估细胞存活率，以不加荧光探针Cy₉₇₂的细胞组存活率为100％，不同浓度荧光探针Cy₉₇₂加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图，结果图23所示，该探针即使在非常高的浓度下，仍具备非常低的毒性。

本发明的探针长波长在近红外区域，在细胞中毒性低，对生物体活细胞危害较小；其具备良好的生物膜透性，大的斯托克斯位移，信噪比低，有较小的荧光背景干扰。本发明的探针对生物体活细胞极性响应灵敏，在含有0～100％四氢呋喃的四氢呋喃/二甲基亚砜极性溶剂中，这类荧光探针的荧光强度出现6.8倍的强度变化，表现出双荧光发射峰比率型变化。最后，本发明可应用于靶向活细胞中的线粒体，进一步推动了有机小分子在生命体微环境中作用的探究。

实施例5：

线粒体靶向的荧光探针的制备方法，具体合成路线与实施例4相同，具体步骤包括：

(1)按照16:1的摩尔比，将棕榈酰氯用恒压滴压漏斗冰浴滴入到F₄₉₆中，其中棕榈酰氯和F₄₉₆在进行滴加前用二氯甲烷分别溶解；再加入棕榈酰氯摩尔量的1.2倍的三乙胺，在28℃的条件下反应5.0h。

(2)反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪旋干，即得粗产物。

(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从200:1～15:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体，即为荧光探针：(E)-2-(2-(4,7-二棕榈酰基-2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙醇苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三烷-15-基)乙烯基-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，命名为Cy₉₇₂。

实施例6：

线粒体靶向的荧光探针的制备方法，具体合成路线与实施例4相同，具体步骤包括：

(1)按照17:1的摩尔比，将棕榈酰氯用恒压滴压漏斗冰浴滴入到F₄₉₆中，其中棕榈酰氯和F₄₉₆在进行滴加前用二氯甲烷分别溶解；再加入棕榈酰氯摩尔量的1.0倍的三乙胺，在23℃的条件下反应4.5h。

(2)反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪旋干，即得粗产物。

(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从200:1～15:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体，即为荧光探针：(E)-2-(2-(4,7-二棕榈酰基-2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙醇苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三烷-15-基)乙烯基-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，命名为Cy₉₇₂。

上述实施例中，高效液相-质谱分析是利用Agilent1100质谱系统(Agilent、USA)，并配备脱气装置、四元泵、自动进样器。

荧光检测是利用FLS1000-stm来进行，激发和发射狭缝宽度为1.5nm。同时，利用FLS1000-stm获得了荧光寿命。

荧光成像观测是通过LSM880NLO(德国)双光子共聚焦显微镜来进行，用40倍物镜观察。目标产物的分离纯化采用薄层色谱硅胶柱实现，其中填料为300-400目。

在本发明的制备方法中，各种材料的加成顺序和具体反应步骤可由本领域技术人员进行调整，不仅适用于实验室的小规模制备，也适用于化工厂的工业化大规模生产。在工业批量生产中，具体反应参数可由本领域技术人员通过实验确定。

若无特殊说明，上述实施例中所用的实验方法，均为常规方法。

若无特殊说明，上述实施例中所用到的试剂、材料等，均可从商业途径获到或由商业途径所获原料合成。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (6)

1.一种线粒体靶向的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针为紫色固体，化学结构式如式Ⅰ所示：

式I中，R为胆固醇甲酰氯或棕榈酰氯；

所述胆固醇甲酰氯和棕榈酰氯结构式分别为，

所述荧光探针为式I-1或I-2所示化合物中的一种，所述式I-1简称为Cy₁₃₂₁，所述式I-2简称为Cy₉₇₂

2.根据权利要求1所述的线粒体靶向的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将胆固醇甲酰氯或棕榈酰氯用恒压滴压漏斗滴入F₄₉₆中，加入三乙胺，冰浴滴加，常温反应，

(2)反应结束后，将反应液用旋转蒸发仪旋干，即得固体产物；

所述F₄₉₆为(E)-2-(2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙基苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三碳烯-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，结构式如下Ⅱ所示：

3.根据权利要求2所述的线粒体靶向的荧光探针的合成方法，其特征在于：

所述胆固醇甲酰氯或棕榈酰氯，以及F₄₉₆分别溶解于二氯甲烷后，再将两种原料进行滴加反应。

4.根据权利要求2所述的线粒体靶向的荧光探针的合成方法，其特征在于：

所述胆固醇甲酰氯与F₄₉₆的摩尔比为9:1～10:1，

所述三乙胺的加入比例为胆固醇甲酰氯摩尔量的1.3～1.5倍，

所述反应的温度为25～28℃，反应时间为6.5～7h，滴加时间为30～40min。

5.根据权利要求2所述的线粒体靶向的荧光探针的合成方法，其特征在于：

所述棕榈酰氯与F₄₉₆的摩尔比为16:1～17:1，

所述三乙胺的加入比例为棕榈酰氯摩尔量的1.0～1.2倍，

所述反应的温度为25～28℃，反应时间为4.5～5h，滴加时间为10～20min。

6.根据权利要求2所述的线粒体靶向的荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤(2)中，还包括对所述产物进行纯化，

所述固体产物为粗产物，以二氯甲烷与甲醇的体积比为200:1～15:1通过硅胶柱色谱提纯。