CN113292571B - 一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞极性与癌症监测技术领域，尤其涉及一种对生物体活细胞极性响应的Turn‑on型荧光分子探针及其制备方法和应用，所述探针的化学结构式如式1所示：
Figure DDA0003119404280000011
本发明的荧光分子探针的发射波长在近红外区域，有较小的荧光背景干扰，其对生物体活细胞极性响应灵敏，可以在数秒内完成，在含有0～100％乙二醇的乙二醇/水极性溶剂中，这种荧光分子探针的荧光强度出现6.2倍的强度变化，表现出双荧光发射峰增强现象，便于疾病的及时发现和早期诊断。同时，这种荧光探针的长波长在近红外部分，对生物活体危害较小。

Description

一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针及 其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及细胞极性与癌症监测技术领域，尤其涉及一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
细胞极性对正常的细胞功能非常重要，在细胞分化、细胞迁移、细胞质分裂、以及组织器官的形成等众多生物学过程起着关键性的作用，而且极性的丢失与癌症等疾病状态有关。例如溶酶体极性缺失可诱导细胞凋亡和死亡，线粒体极性强烈影响体内蛋白质的细胞内转运和生物大分子之间的相互作用。近年来，细胞极性已经成为监测癌症的重要标志之一。现有的细胞器特异性极性探针只具有较短的发射波长(不超过600nm)，导致过度的自体荧光和有限的穿透深度，使得成像实验不够精准并伴有较大的背景干扰。
发明内容
针对上述的问题，本发明提供一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针及其制备方法和应用，该荧光分散紫探针具有较小的荧光背景干扰，可用于荧光成像及克服细胞器特异性极性探针穿透性不足的问题。为实现上述目的，本发明公开如下的技术方案：
在本发明的第一方面，提供一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针，其化学结构式如式1所示：
Figure BDA0003119404260000011
进一步地，所述Turn-on型荧光分子探针为紫色固体，命名为：(E)-2-(2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙基苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三碳烯-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，简称为F496。
在本发明的第二方面，提供一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)将2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐(IR-813高氯盐酸)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷溶解在一起，加入三乙胺，加热反应。
(2)反应结束后将反应液冷却，分离出析出的固体产物，然后用浓盐水洗涤该固体产物，即得目标产物，命名为：(E)-2-(2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙基苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三碳烯-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓，简称为F496。
进一步地，步骤(1)中，以三氯甲烷为所述IR-813高氯盐酸和1,4,7,10-四氮杂环十二烷的共同溶剂，将两种原料溶解在一起。
进一步地，步骤(1)中，所述IR-813高氯盐酸与四氮杂环十二烷的摩尔比为1:5～1:6。
进一步地，步骤(1)中，所述三乙胺的加入比例为IR-813高氯盐酸摩尔量的1.5～2倍。
进一步地，步骤(1)中，所述加热反应的温度为75～85℃，反应时间为11～12h。
进一步地，步骤(2)中，还包括对所述目标产物进行纯化的步骤。优选地，以所述目标产物为粗产物，然后以二氯甲烷/甲醇通过硅胶柱色谱提纯，其中，所述二氯甲烷/甲醇的体积比从100:1～5:1。
在本发明的第三方面，公开所述对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针在生物活体内极性检测、活细胞极性变化检测、荧光成像等中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的荧光分子探针以1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓为荧光基团，该分子能够在基态与激发态时偶极矩发生变化，进而可以响应极性的变化。
(2)本发明的荧光分子探针的发射波长在近红外区域，有较小的荧光背景干扰，其对生物体活细胞极性响应灵敏，可以在数秒内完成，在含有0～100％乙二醇的乙二醇/水极性溶剂中，本发明这种荧光分子探针的荧光强度出现6.2倍的强度变化，表现出双荧光发射峰增强现象，便于疾病的及时发现和早期诊断。同时，这种荧光探针的长波长在近红外部分，对生物活体危害较小。
(3)由于本发明的荧光分子探针在反应前后紫外颜色的变化明显，可供肉眼观测，从而可在不进一步借助检测仪器的情况下进行先期定性判断，使检测更加方便快捷。同时，本发明的荧光分子探针适用于活细胞内极性的检测，进一步推动了有机小分子在生命体微环境中作用的探究。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496的质谱图。
图2为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496的核磁H谱。
图3为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496的核磁C谱。
图4为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496对体外极性测试溶液的荧光滴定图。
图5为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496在465nm波长处对体外极性测试溶液荧光强度的线性图。
图6为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496在645nm波长处对体外极性测试溶液荧光强度的线性图。
图7为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496在最大、最小的极性测试溶液中的紫外吸收图。
图8为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496对不同极性测试溶液的荧光寿命图。
图9为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496对不同pH测试溶液的荧光滴定图。
图10为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496对不同黏度测试溶液的荧光滴定图。
图11为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496对不同极性溶剂的荧光滴定图。
图12为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496对海拉细胞的共聚焦图谱。
图13为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496对海拉细胞的共聚焦图谱的强度图。
图14为本发明第一实施例制备的荧光分子探针F496对细胞的存活率柱状图。
具体实施方式
在接下来的描述中进一步阐述了本发明的具体细节用于充分理解本发明。本发明中的说明书所使用的术语只是为了用于说明本发明的优点和特点，不是旨在于限制本发明。
除非另行定义，本发明中所使用的所有专业与科学术语属于本发明的技术领域的技术人员所理解的含义相同。如无特殊说明，本发明所使用的药品或试剂均按照产品说明书使用或采用所属领域的常规使用方法。
正如前文所述，现有的细胞器特异性极性探针只具有较短的发射波长，导致过度的自体荧光和有限的穿透深度，为此，本发明提出了一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针及其制备方法，现根据说明书附图和具体实施方式对该方法作进一步说明。
需要说明的是，下列实施例中，高效液相-质谱分析是利用Agilent1100质谱系统(Agilent、USA)，并配备脱气装置、四元泵、自动进样器。
高效液相色谱分离是借助Hypersil GOLDC18柱(2.1mm×50mm、1.8μmi.d.、Agilent、USA)来完成。
荧光检测是利用日立HitachiF-4600荧光光谱仪来进行，激发和发射狭缝宽度均为10.0nm，电压400V，扫描速度2400纳米/分。
荧光成像观测是通过Olympus Fluo View FV1000(日本)共聚焦来进行，用40倍物镜观察。
目标产物的分离纯化采用薄层色谱硅胶柱实现，其中填料为300-400目。
第一实施例
一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型近红外荧光分子探针的制备，参考路线1，包括以下步骤：
(1)按照1:5的摩尔比，将2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐(IR-813高氯盐酸)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷加入到烧瓶中，然后加入三氯甲烷作为溶剂，再滴加IR-813高氯盐酸摩尔量的1.5倍的三乙胺，，在80℃的加热条件下反应12h。
(2)反应结束，让反应液冷却到室温，待固体产物析出完全后，过滤出析出的固体产物，用浓度为350g/L的浓盐水水洗该产物，得到粗产物。
(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从100:1-5:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体，即为荧光分子探针：(E)-2-(2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙基苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三碳烯-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓,命名为F496。
Figure BDA0003119404260000051
对本实施例制备的荧光分子探针F496进行检测，结果如图1至图3所示，分别为F496的质谱图、核磁H谱、核磁C谱，可以看出，本实施例成功地合成了所述荧光分子探针F496，其结构式为：
Figure BDA0003119404260000052
第二实施例
一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型近红外荧光分子探针的制备，参考路线1，包括以下步骤：
(1)按照1:6的摩尔比，将2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐(IR-813高氯盐酸)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷加入到烧瓶中，然后加入三氯甲烷作为溶剂，再滴加IR-813高氯盐酸摩尔量的2倍的三乙胺，在85℃的加热条件下反应11h。
(2)反应结束，让反应液冷却到室温，待固体产物析出完全后，过滤出析出的固体产物，用浓度为350g/L的浓盐水水洗该产物，得到粗产物。
(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从100:1-5:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体，即为荧光分子探针：(E)-2-(2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙基苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三碳烯-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓,命名为F496。
第三实施例
一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型近红外荧光分子探针的制备，参考路线1，包括以下步骤：
(1)按照1:6的摩尔比，将2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐(IR-813高氯盐酸)和1,4,7,10-四氮杂环十二烷加入到烧瓶中，然后加入三氯甲烷作为溶剂，再滴加IR-813高氯盐酸摩尔量的1.8倍的三乙胺，在75℃的加热条件下反应12h。
(2)反应结束，让反应液冷却到室温，待固体产物析出完全后，过滤出析出的固体产物，用浓度为350g/L的浓盐水水洗该产物，得到粗产物。
(3)对所述粗产物以二氯甲烷/甲醇(体积比从100:1-5:1)通过硅胶柱色谱提纯，得到紫色固体，即为荧光分子探针：(E)-2-(2-(2,3,4,5,6,7,8,9,13,14-十氢-12H-1,10-乙基苯并[k][1,4,7,10]四氮杂环十三碳烯-15-基)乙烯基)-1,1,3-三甲基-1H-苯并[e]吲哚-3-鎓,命名为F496。
性能测试：
对第一实施例制备的荧光分子探针F496的各项性能进行测试，具体包括：
1、建立该荧光分子探针F496对极性的滴定线性曲线，步骤包括：
(1)配制：pH＝7.40、浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液、分子探针F496浓度为1mM的二甲基亚砜(DMSO)溶液，备用。
(2)分别配制水与乙二醇不同比例(10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10)的极性测试溶液，分别置于试管内，然后在每个试管中加入所述缓冲盐溶液、二甲基亚砜溶液各10μl，混合均匀后，在荧光比色皿中完成荧光测定。
通过荧光分光光度计测试荧光强度，得到荧光强度比值，检测细胞极性的荧光强度的激发波长为400nm。
分别以乙二醇的含量为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于极性、荧光强度比值的线性方程，图4是荧光探针F496对体外极性测试溶液的荧光滴定图；图5和图6是分子探针F496对体外极性荧光强度的线性图。从图中可以看出该探针对极性表现出良好的线性关系，说明其具有检测极性的能力。
2、检测所述荧光探针F496在最小、最大极性测试溶液的紫外吸收，步骤包括：
取上述步骤(2)中水与乙二醇比例分别为：10:0和0:10的极性测试溶液，分别置于试管内，然后再分别加入10μl浓度为1mM的F496的二甲基亚砜溶液，混合均匀，在比色皿中完成测样，得到两份样品，分贝测试其紫外吸收图谱，结果如图7所示，其表示分子探针F496在最大、最小的极性测试溶液中的紫外吸收图，其中最小极性为水，最大极性为乙二醇，该探针针对极性能够表现出明显的紫外变化，说明探针能够响应极性。
3、检测所述荧光探针F496对不同极性的荧光寿命，步骤包括：
(1)配制：pH＝7.40、浓度为20mM的PBS缓冲盐溶液；分子探针F496浓度为1mM的二甲基亚砜溶液，备用。
(2)分别配制水与乙二醇不同比例(10:0、9:1、8:2、7:3、6:4、5:5、4:6、3:7、2:8、1:9和0:10)的极性测试溶液，分别置于试管内，然后在每个试管中加入所述缓冲盐溶液、二甲基亚砜溶液各10μl，混合均匀后，然后在荧光比色皿中完成荧光测定。
通过荧光分光光度计测试荧光强度，检测细胞极性的荧光强度的激发波长为400nm。
得到荧光探针F496对不同极性的荧光寿命图，结果如图8所示，该探针对不同极性表现出明显的荧光寿命变化，说明该探针对极性表现出良好的响应。
4、所述分子探针F496对不同pH测试溶液的荧光滴定，步骤包括：
(1)配制：pH分别为4、5、6、7、8、9、10的缓冲溶液、分子探针F496浓度为1mM的二甲基亚砜溶液，备用。
(2)在每份所述盐酸水溶液中加入10μL所述二甲基亚砜溶液，混合均匀，得pH分别为4、5、6、7、8、9、10的酸碱测试溶液，然后在荧光比色皿中完成荧光测定。
通过荧光分光光度计测试荧光强度，检测细胞极性的荧光强度的激发波长为400nm。
分别以发射波长为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于pH-荧光强度相关图谱，结果如图9所示，该探针针对4～10范围内的pH并没有表现出明显的变化，说明其对pH具有稳定性。
5、所述分子探针F496对不同黏度测试溶液的荧光滴定，步骤包括：
(1)配制：甘油含量分别为0％、5％、10％、20％、30％、40％、50％的甘油水溶液、分子探针F496浓度为1mM的二甲基亚砜溶液，备用。
(2)在每份所述甘油水溶液中加入10μL所述二甲基亚砜溶液，然后分别加入分子探针F496母液10μL，混合均匀，得甘油含量分别为0％、5％、10％、20％、30％、40％、50％的黏度测试溶液，然后在荧光比色皿中完成荧光测定。
通过荧光分光光度计测试荧光强度，检测细胞极性的荧光强度的激发波长为400nm。
分别以发射波长为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于黏度-荧光强度相关图谱，结果如图10所示，该探针针对不同黏度没有表现出明显的变化，说明该探针针对极性能够表现出良好的特异性。
6、所述分子探针F496对不同极性溶剂的荧光滴定，步骤包括：
(1)配制：常见的有机溶剂(如图11所示)作为常见的极性检测溶液；分子探针F496浓度为1mM的二甲基亚砜溶液，备用。
(2)在每份2mL的所述有机溶剂中加入10μL二甲基亚砜溶液，混合均匀，得常见有机溶剂测试溶液(即不同极性溶剂)，然后在荧光比色皿中完成荧光测定。
通过荧光分光光度计测试荧光强度，检测细胞极性的荧光强度的激发波长为400nm。
分别以发射波长为横坐标，以荧光强度比值为纵坐标，得到关于有机溶剂-荧光强度相关图谱，结果如图11所示，该探针能够针对不同极性的有机溶剂表现出合理的变化，说明该探针对极性表现出良好的响应。
7、所述分子探针F496对海拉细胞成像测试，步骤包括：
(1)配制：分子探针F496浓度为1mM的二甲基亚标准溶液(简称为测试培养液)，浓度为1μg/ml的莫能菌素溶液备用。
(2)细胞培养：将复苏好的海拉细胞进行培养，培养基包含10％牛胚胎血清、1％双抗、89％DMEM、在37℃，5％CO2的环境中培养24h，得到长势良好的细胞，待用。
(3)将海拉细胞和凋亡细胞分别置入培养基中培育，共分别培养3组，每组培养基中接种量为2×107～9×107个/mL，培育24h，分成正常细胞A，凋亡细胞B和正常细胞C三组，其中：A组海拉细胞只加入10μM的所述测试培养液孵育30min；B组凋亡的海拉细胞先使用15μM的莫能菌素培养30min，然后再用10μM的测试培养液孵育30min；C组细胞先使用2μM制霉菌素孵育30min，然后再用10μM的测试培养液孵育30min。
对所述A、B、C组海拉细胞进行共聚焦激光荧光成像，得到三组细胞的共聚焦图谱和荧光图像的强度图，结果分别如图12和图13所示，图中比例尺为10μm。该探针能够在绿色通道和红色通道针对极性表现出良好的响应，能够应用到检测细胞的极性实验中。
8、检测所述分子探针F496对细胞存活率的影响，步骤包括：
(1)在细胞培养液中分别加入浓度分别为0M、5M、10M、20M、30M、50M的所述分子探针F496，然后在37℃，5％CO2的培养箱中培养24h。
(2)完成后，将25μL4-甲基噻唑基四唑MTT(浓度为5mg/mL)加入到细胞培养液中继续培养4h，通过MTT比色皿法来评估细胞存活率，以不加分子探针F496的细胞组存活率为100％，不同浓度分子探针F496加入的实验组相关数据绘制相对做柱状图，结果图14所示，该探针即使在非常高的浓度下，依然具有非常低的毒性。
以上所述仅说明了本发明的几个实施方式，并不能因此而理解是对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的其他人员来说，在不脱离本发明的构思和范围的情况下，还可进行修改替换改进等，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的专利保护范围应以所描述的权利要求为准。

Claims (9)

1.一种对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针，其化学结构式如式1所示：
Figure 827232DEST_PATH_IMAGE001
式1。
2.根据权利要求1所述的对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针，其特征在于，所述荧光分子探针为紫色固体。
3.权利要求1或2所述的对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐、1,4,7,10-四氮杂环十二烷溶解在一起，加入三乙胺，加热反应；
（2）反应结束后将反应液冷却，分离出析出的固体产物，然后用浓盐水洗涤该固体产物，即得。
4.权利要求3所述的对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，以三氯甲烷为所述2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐和1,4,7,10-四氮杂环十二烷的共同溶剂，将两种原料溶解在一起。
5.权利要求3所述的对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐与四氮杂环十二烷的摩尔比为1:5~1:6。
6.权利要求3所述的对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述三乙胺的加入比例为2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氢-1,1,3-三甲基-2H-苯[E]-吲哚乙基二烯]-1-环己烯]-乙烯]-1,1,3-三甲基-1H-苯[E]吲哚高氯酸盐摩尔量的1.5~2倍。
7.权利要求3所述的对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，所述加热反应的温度为75~85℃，反应时间为11~12h。
8.权利要求3-7任一项所述的对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，还包括对所述固体产物进行纯化的步骤。
9.权利要求8所述的对生物体活细胞极性响应的Turn-on型荧光分子探针的制备方法，其特征在于，以所述固体产物为粗产物，然后以二氯甲烷/甲醇通过硅胶柱色谱提纯，所述二氯甲烷、甲醇体积比为100:1~5:1。
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