CN113999159B - 一种粘度敏感的荧光探针，其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种结构式(I)所示的粘度敏感的荧光探针，其制备方法及应用。与现有技术相比，本发明荧光探针对粘度变化非常敏感，检测灵敏度高，并且具有优异的水溶性，具有很好的推广应用价值。

Description

一种粘度敏感的荧光探针，其制备方法及应用
技术领域
本发明涉及荧光检测领域，具体提供一种粘度敏感的荧光探针，其制备方法及其应用。
背景技术
粘度是表征流体性质的一项重要参数，在石油、化工、医学、轻工、食品、建材、冶金、航天等领域都需要精确地测量流体的粘度，以达到控制生产流程、保证安全生产、控制与评定产品质量、协助医学诊断及科学研究等目的。粘度的测量是研究和应用各种流体的必要手段。如在医学领域，因为人体血液粘度异常会导致微循环和组织的新陈代谢出现障碍，因而血液粘度的准确测量将有助于病情的及时诊断和疾病的有效预防。
微环境是影响细胞正常生理活动的重要因素，与细胞的增殖、分化、代谢和功能密切相关。微环境的异常变化会导致细胞生理活动紊乱，诱发多种疾病。影响细胞内微环境稳定性的因素主要包括粘度、极性、温度和pH值。任何一个因素的异常变化都会影响微环境的稳定性，因此监测细胞微环境中的各种参数具有重要意义。粘度在其中起着至关重要的作用细胞不同区域的粘度差异很大，因此也会影响每个区域的扩散，如信号传递、物质转运和生化物质之间的相互作用。然而，异常的粘度水平通常与各种疾病有关，如心血管疾病、糖尿病和阿尔茨海默病。
溶酶体和线粒体无疑是两种最重要的细胞器。线粒体作为细胞中重要的能量工厂，参与调节各种细胞功能。最近的研究表明，线粒体与细胞代谢、自噬、衰老和肿瘤发生密切相关。线粒体粘度的异常变化导致一系列疾病，包括胰岛素抵抗、帕金森病和亨廷顿氏病。因此，有必要开发有效的工具来监测微环境中粘度的变化，这对促进疾病预防和开展临床诊断也起着重要作用。
目前，用于检测粘度的工具主要包括落球粘度计、旋转粘度计、毛细管粘度计和阻尼振动粘度计等。这些粘度计可以用来检测宏观材料的粘度，但不适用于微观材料。近年来，研究人员报道了电子顺磁共振、核磁共振和荧光成像等微观粘度检测方法。其中，荧光成像方法因其无创性、高分析灵敏度和优异的时空分辨率等特点而受到越来越多的关注。
发明内容
本发明是针对上述现有技术的不足，提供一种粘度敏感的荧光探针。
本发明进一步的技术任务是提供上述荧光探针的制备方法。
本发明更进一步的技术任务是提供上述荧光探针的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：结构式(I)所示的粘度敏感的荧光探针，
其中，X＝-H或-COOH；
Y＝-H或-C4H8SO3 -。
结构式(I)所示所示探针化合物四苯基部分和吲哚盐部分都能对粘度产生反应。根据这些特征，申请人设计的粘度荧光探针包含四苯基部分和吲哚盐部分。低粘度溶液下四苯基部分和吲哚盐部分的自由旋转，没有荧光；而在高粘度溶液中，旋转被抑制，荧光强度将显著增强。此外，由于吲哚阳离子，该探针还可以定位在线粒体中。
实验发现，羧基和/或磺酸基团的存在，使得本发明探针化合物呈现出了更为优异的水溶性。
因此，作为优选，结构式(I)中X、Y不同时为-H，本发明探针优先为：
或者：
或者：
本发明粘度敏感的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：
S1.苯肼类化合物与3-甲基丁-2-酮反应，脱氨生成2，3，3-三甲基-3H-吲哚类化合物；
S2.步骤S1得到的2，3，3-三甲基-3H-吲哚类化合物与碘乙烷或1，4-丁烷磺酸内酯反应后，再与4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯甲醛反应，得到粘度敏感的荧光探针。
作为优选，步骤S1包括：
S11.苯肼类化合物、3-甲基丁-2-酮和乙酸钠(催化剂)的混合物在冰醋酸中搅拌均匀，然后在加热回流条件下充分反应；
S12.反应完成后，真空除去溶剂，经萃取、柱色谱法纯化、干燥，得到2，3，3-三甲基-3H-吲哚类化合物。
作为优选，步骤S2包括：
S21.步骤S1得到的2，3，3-三甲基-3H-吲哚类化合物与碘乙烷或1，4-丁烷磺酸内酯在溶剂中加热回流条件下反应完全，然后经分离纯化得到中间化合物；
S22.中间化合物与4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯甲醛的混合物在乙醇中加热回流至反应完全，经过滤、柱色谱法纯化、干燥，得到粘度敏感的荧光探针。
本发明结构式(I)所示所示探针化合物对于粘度的变化非常敏感，且具有优异的水溶性，可用于检测有机物粘度、水溶液粘度、细胞内环境粘度或线粒体粘度变化，
其中，X＝-H或-COOH；
Y＝-H或-C4H8SO3 -，且X、Y不同时为-H。
作为优选，结构式(I)所示的探针化合物可用于制备有机物粘度的检测试剂，或者水溶液粘度的检测试剂，或者细胞内环境粘度的检测试剂，或者线粒体粘度变化的检测试剂。
作为优选，待检测物粘度为1cP～825cp时，探针化合物的工作浓度为10-5M。
作为优选，以本发明探针化合物进行粘度检测时，可以以DMSO或水-DMSO为溶剂制备储备液，储备液中探针化合物浓度为10-3M，水-DMSO的体积比为0～9:1。
与现有技术相比，本发明的二硼酸荧光传感器的应用具有以下突出的有益效果：
(一)制备过程中所用试剂危险性低，合成简单，对实验设备要求低。更有利于商业化生产。
(二)羧基和/或磺酸基团的存在，使得探针化合物呈现出优异的水溶性，在磷酸盐缓冲液-DMSO(99:1)的体系中仍能够溶解，表现出极低的荧光发射。这使得探针能够检测水溶液体系的粘度，有助于探针分子的进一步生物学应用。
(三)拥有更大的斯托克斯位移，斯托克斯位移是指荧光光谱相较于吸收光谱的红移。背景干扰低，对生物样品损伤小，样品穿透性强等。
(四)低粘度体系-高粘度甘油体系，荧光开启倍数最高。这意味着本探针对于粘度的变化更为敏感，体系粘度的微弱变化即可带来荧光发射的显著变化。
(五)应用探针2检测粘度与常见检测方法相比具有检测物用量少、检测灵敏度高，适用于少量珍贵样本的粘度测定。
(六)细胞毒性实验中，细胞的存活率更高。加入20μl探针的DMSO溶液(浓度1mM)后，细胞的存活率仍在95％以上。这表明探针分子对细胞无明显毒性作用，因此可以用来检测细胞中的粘度。
附图说明
附图1是实施例化合物C1的氢核磁共振谱图；
附图2是实施例化合物C1的碳核磁共振谱图；
附图3是实施例化合物C1的质谱图；
附图4是实施例化合物C2的氢核磁共振谱图；
附图5是实施例化合物C2的碳核磁共振谱图；
附图6是实施例探针1的氢核磁共振谱图；
附图7是实施例探针1的碳核磁共振谱图；
附图8是实施例探针1的质谱图；
附图9是实施例探针2的氢核磁共振谱图；
附图10是实施例探针2的碳核磁共振谱图；
附图11是实施例探针2的质谱图；
附图12是实施例探针3的氢核磁共振谱图；
附图13是实施例探针3的碳核磁共振谱图；
附图14是实施例探针2在DMSO/磷酸盐缓冲液(1:99，v/v)与DMSO/丙三醇(1:99，v/v)中的紫外-可见吸收光谱及其荧光发射谱图；(图中1、2、3标号分别指探针化合物1、探针化合物2、探针化合物3)
附图15是实施例探针1在磷酸盐缓冲液(下)与丙三醇(上)中的荧光图谱；
附图16是实施例探针2在磷酸盐缓冲液(下)与丙三醇(上)中的荧光图谱；
附图17是实施例探针3在磷酸盐缓冲液(下)与丙三醇(上)中的荧光图谱；
附图18是实施例探针2储备液/丙三醇(1:99，1：999，v/v)中的紫外-可见吸收光谱及其荧光发射谱图；
附图19是实施例探针2在粘度0.92cP～824.0cP的荧光响应图；
附图20是实施例探针2logI670比logη的–Hoffmann图；
附图21是实施例探针2在不同极性的不同溶剂中的荧光响应图；
附图22是实施例探针2在不同比例丙三醇-磷酸盐缓冲液溶液中荧光响应的时间稳定性图；
附图23是在竞争物种共存下，实施例探针2的丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v＝1:1，1％DMSO)在670nm处的荧光响应图；
附图24是实施例探针2加入1μM,5μM,10μM,20μM(10-3M的DMSO溶液)对HeLa细胞的细胞存活率的影响；
附图25是实施例探针2在丙三醇-磷酸盐缓冲液(1:1，v/v)溶液中，405nm、488nm、561nm特定激发波长下的荧光图谱；
附图26是实施例探针2在丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v，1:1)体系中，不同浓度H2O2条件下的荧光响应图；
附图27是实施例探针2在HeLa细胞与H2O2处理过的HeLa细胞中的共聚焦显微镜荧光成像图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为对本发明的限定。
【材料】
用于化合物合成的原料包括4-肼基苯甲酸，苯肼，3-甲基丁-2-酮，碘乙烷，1，4-丁烷磺酸内酯，4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯甲醛，醋酸钠等
甲醇，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醇，冰醋酸，邻二氯苯，丙酮，丙三醇是分析纯的或化学纯的。
荧光实验中使用的干扰物包括D-葡萄糖，D-半乳糖，D-果糖，D-糖胺，D-山梨糖醇，D-阿拉伯糖，D-甘露糖，D-核糖，D-麦芽糖，D-木糖，葡萄糖醛酸，透明质酸，1H-嘌呤-6-胺，腺苷，胞苷，鸟苷，鸟苷，阿糖胞苷，苯酚，对苯二酚，BaCl2，CdCl2，CoCl2，CrCl2，CsCl2，CuCl2，FeCl2，FeCl3，LiCl2，MgCl2，MnCl2，PdCl2，ZnCl2等。
所有试剂均从商业来源获得，并且无需进一步纯化即可使用。
青霉素-链霉素(#15140163，10，000单位/毫升)、杜尔贝科改良的培养基(#11965118，DMEM)、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(#25200-072)和其他细胞培养试剂均来自吉布科BRL(美国纽约州格兰德岛)。胎牛血清(FBS)购自上海VivaCell。HeLa细胞来自王凤山实验室(山东大学)。
【仪器】
DF101S型集热式恒温加热磁力搅拌器、低温恒温搅拌反应浴(郑州长城科工贸有限公司)；旋转蒸发仪(瑞士Buchi)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；Waters2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Nexus 670型傅立叶红外光谱仪(美国尼高力仪器公司Thermo-Nicolet)；RF5301PC荧光分光光度计(日本岛津)；Acance-6002核磁共振波谱测定仪(TMS内标，瑞士Bruker)；精制型柱层层析硅胶(200～300目，青岛海洋化工厂)。
【合成】
合成路线：
i)AcOH,NaOAc,3-methylbutan-2-one.
ii)acetonitrile,Iodoethane,reflux.
iii)1,2-Dichlorobenzene,1,4-butanesultone,reflux.
iv)Ethanol,4-(1,2,2-Triphenylvinyl)benzaldehyde,reflux.
(1)2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸(C1)的合成
将4-羧基苯肼(原料A1，1.83g，12.0mmol)、3-甲基丁-2-酮(4.34g，50.4mmol)和乙酸钠(5.90g，72.0mmol)的混合物在冰醋酸(12ml)中搅拌1小时，然后回流加热过夜。真空除去溶剂后，加入乙酸乙酯混匀后抽滤，除去大部分无机盐类。滤液用柱色谱法(3∶100，甲醇/二氯甲烷)纯化，干燥，得到2(1.80g，8.87mmol，74％)黄色固体，熔点208-210℃.
1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm)(图1)：8.00(d,J＝1.7Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,1.7Hz,1H),7.52(d,J＝8.0Hz,1H),2.26(s,3H),1.29(s,6H).13C NMR(151MHz，DMSO-d6)δ(ppm)(图2):192.19,167.94,157.82,146.57,130.08,127.73,123.18,119.56,53.94,40.39,40.25,40.10,39.96,39.82,39.68,39.54,22.73,15.82.HRMS m/z(图3):calculated for C12H14NO2 +[M+H]+:204.1019,found 204.0999.
(2)2，3，3-三甲基-3H-吲哚(C2)的合成
将苯肼(原料A2，1.83g，12.0mmol)、3-甲基丁-2-酮(4.34g，50.4mmol)和乙酸钠(5.90g，72.0mmol)的混合物在冰醋酸(12ml)中搅拌1小时，然后回流加热过夜。真空除去溶剂后，加入乙酸乙酯与蒸馏水，萃取，除去大部分无机盐类。滤液用柱色谱法(2∶100，甲醇/二氯甲烷)纯化，干燥，得到2(1.80g，8.87mmol，74％)棕黄色油状液体。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(ppm)(图4)7.45(d,J＝7.6Hz,1H),7.39(d,J＝6.8Hz,1H),7.28(t,J＝7.6Hz,1H),7.18(t,J＝7.8Hz,1H),2.21(s,3H),1.24–1.22(m,6H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ(ppm)(图5):187.95,154.12,146.35,127.72,125.21,121.96,119.72,53.57,22.98,15.39.
(3)
(E)-5-carboxy-1-ethyl-3,3-dimethyl-2-(4-(1,2,2-triphenylvinyl)styryl)-3H-indol-1-ium(探针1)的合成
将2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸(化合物2，0.4g)和碘乙烷(6ml)的混合物在乙腈(2ml)中加热回流过夜。形成米白色沉淀，过滤，用乙酸乙酯漂洗并干燥，得到0.40克(88％)米白色固体。然后，将先前产物(0.10g，0.43mmol)和4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯甲醛(0.158g，0.44mmol)的混合物在乙醇(4ml)中回流加热过夜。形成橙红色沉淀，过滤，通过柱色谱(8∶100，甲醇/二氯甲烷)纯化，并干燥，得到0.205g(0.35mmol，83％)橙红色固体形式的探针1。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)(图6)δ8.48–8.42(m,2H),8.19(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H),8.05(t,J＝8.1Hz,3H),7.63(d,J＝16.3Hz,1H),7.22–7.14(m,11H),7.06(dd,J＝8.0,1.7Hz,2H),7.01(td,J＝7.9,7.1,1.7Hz,4H),4.72(q,J＝7.2Hz,2H),3.17(s,1H),1.82(s,6H),1.44(t,J＝7.2Hz,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)(图7)δ184.02,166.87,155.36,149.77,144.69,144.14,143.25,143.14,143.12,142.92,140.21,133.03,132.06,131.94,131.22,131.20,131.07,131.03,128.55,128.51,128.34,127.64,127.43,124.48,115.73,112.70,52.94,42.99,25.93,14.13.HRMS m/z(图8):calculated 574.7424,found574.2732.
(4)
(E)-4-(5-carboxy-3,3-dimethyl-2-(4-(1,2,2-triphenylvinyl)styryl)-3H-indol-1-ium-1-yl)butane-1-sulfonate(探针2)的合成
将2，3，3-三甲基-3H-吲哚-5-羧酸(化合物C1，0.41g，2mmol)和1，4-丁烷磺酸内酯(2.70g，20mmol)的混合物在1，2-二氯苯(4ml)中加热回流过夜。形成紫色沉淀，过滤，用丙酮漂洗并干燥，得到0.38克(1.12mmol，56％)紫色固体。然后，将先前产物(0.20g，0.59mmol)和4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯甲醛(0.216g，0.6mmol)的混合物在乙醇(8ml)中回流加热过夜。形成红色沉淀，过滤，通过柱色谱(8∶100，甲醇/二氯甲烷)纯化，并干燥，得到0.31g(0.45mmol，76％)橙红色固体形式的探针2。
1H NMR(400MHz，二甲基亚砜-d6)δ(ppm)(图9)：8.44(d,J＝18.4Hz,2H),8.16(d,J＝8.4Hz,1H),8.09(d,J＝8.1Hz,3H),7.74(d,J＝16.3Hz,1H),7.21–7.13(m,11H),7.07–6.99(m,6H),4.69(t,J＝7.7Hz,2H),2.00–1.93(m,2H),1.91(s,1H),1.82(s,8H),1.23(s,1H).13C NMR(151MHz，二甲基亚砜-d6)δ(ppm)(图10):184.32,166.90,155.49,149.74,144.58,144.44,143.23,143.19,143.06,142.97,140.29,133.12,132.01,131.97,131.22,131.07,130.99,128.56,128.49,128.31,127.64,127.40,124.35,115.98,113.04,50.48,47.29,27.33,26.07,22.64,21.49.HRMS m/z(图11):calculated 681.8470,found681.6639.
(5)
(E)-4-(3,3-dimethyl-2-(4-(1,2,2-triphenylvinyl)styryl)-3H-indol-1-ium-1-yl)butane-1-sulfonate(探针3)的合成
将2，3，3-三甲基-3H-吲哚(化合物C1，0.41g，2mmol)和1，4-丁烷磺酸内酯(2.70g，20mmol)的混合物在1，2-二氯苯(4ml)中加热回流过夜。柱层析分离纯化，得到0.38克(1.12mmol，56％)紫红色油状液体。然后，将先前产物(0.20g，0.59mmol)和4-(1，2，2-三苯基乙烯基)苯甲醛(0.216g，0.6mmol)的混合物在乙醇(3ml)中回流加热过夜。形成红色沉淀，过滤，通过柱色谱(4∶100，甲醇/二氯甲烷)纯化，并干燥，得到0.11g(0.17mmol，62％)橙红色固体形式的TC3。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ(图12)8.35(d,J＝16.2Hz,1H),8.05(d,J＝8.0Hz,2H),8.01–7.97(m,1H),7.89–7.85(m,1H),7.71(d,J＝16.3Hz,1H),7.64–7.59(m,2H),7.22–7.13(m,11H),7.05(d,J＝6.7Hz,2H),7.01(t,J＝6.5Hz,4H),4.68(t,J＝7.8Hz,2H),2.53(t,J＝7.0Hz,2H),1.96(p,J＝7.4Hz,2H),1.81(q,J＝7.1Hz,2H),1.77(s,6H).13CNMR(151MHz,DMSO-d6)δ(图13)182.16,153.87,149.23,144.36,143.26,143.22,143.00,142.90,141.18,140.29,133.14,131.96,131.22,131.20,131.08,130.88,129.91,129.59,128.55,128.49,128.32,127.60,127.39,127.36,123.45,115.92,113.01,52.68,50.53,49.02,47.03,27.49,26.16,22.67.
【光物理分析】
在DMSO中配备探针1、探针2、探针3的储备溶液(10-3M)，取10μL储备溶液加入不同溶剂稀释至1ml，记录探针在DMSO/磷酸盐缓冲液(1:99，v/v)的紫外-可见吸收光谱(图14左侧)及探针在DMSO/磷酸盐缓冲液(1:99，v/v)与DMSO/丙三醇(1:99，v/v)中的荧光发射图谱(图14右侧)。
从图14可以看出，探针1在磷酸盐缓冲液中最大紫外-可见吸收波长分别为450nm；探针2在磷酸盐缓冲液最大紫外-可见吸收波长分别为450nm；探针3在磷酸盐缓冲液中最大紫外-可见吸收波长分别为445nm。探针1的激发波长设定为450nm；探针2的激发波长设定为450nm；探针3的激发波长设定为445nm(狭缝：5nm/5nm)。如图14所示，探针2在磷酸盐缓冲液中的荧光发射微弱，在高粘度的丙三醇体系中其荧光发射强度提升90倍，可见，探针2对于粘度的变化更为敏感，这意味着检测体系粘度的变化带来荧光发射的变化更为显著。
【探针的溶解性】
如附图15、16、17所示，羧基、磺酸基团作为亲水性基团，为本发明探针提供了良好的水溶性，特别是为探针2提供了优异的水溶性。对比单个亲水性基团存在的情况，探针2在水溶液中的荧光强度更低，细微粘度变化引起的荧光强度变化更易检测到。
探针2在DMSO中能够很好的溶解，得到浓度10-3M的储备液。减少DMSO的用量，在水-DMSO(v/v，9:1)的液体中，仍能形成浓度10-3M的储备液。继续加大水的占比，在水-DMSO(v/v，99:1)的液体中，形成过饱和状态，无法制备浓度10-3M的溶液。取10μL储备溶液加入不同溶剂稀释至1ml，记录储备液/磷酸盐缓冲液(1:99，v/v)与储备液/丙三醇(1:99，v/v)中的紫外-可见吸收光谱及其荧光发射图谱。
探针2在水-DMSO(999:1)的体系中表现出极低的荧光发射。从图18可以看出，在粘度体系DMSO含量由百分之一下降到千分之一的情况下，探针的荧光发射强度没有显著变化，这表明探针2化合物生物学应用过程中可进一步减少有机溶剂(DMSO)的用量，给活体细胞或动物带来更小的损伤。
【粘度对荧光发射的影响】
研究了粘度范围为0.92至824.0厘泊的探针2的荧光性质。
如图19所示，在低粘度下，探针2仅在670纳米处显示出微弱的荧光发射。随着粘度的增加，探针2的荧光强度在670纳米处逐渐增加。
如图20所示，荧光强度与甘油比例0-100％范围内探针2符合LogI670和Logη之间的–Hoffmann方程，表现出良好的线性关系，其中R2＝0.9924。因此，探针2可以实现对粘度变化的灵敏定量响应，可以作为监测粘度变化的一种优良的荧光探针。
【溶剂对荧光发射的影响】
对粘度的高选择性对其生物应用至关重要。首先通过研究探针2在不同极性的不同溶剂中的荧光来检验溶剂极性的影响。
如图21所示，探针在99％甘油中显示出非常强的荧光发射，增强了近90倍。它在其他溶剂中显示出非常弱的荧光。当探针2溶解在二甲基亚砜中时，强度略有增加。为了监测二甲基亚砜对粘度检测的影响，测量了1％二甲基亚砜溶液(用于生物研究的浓度)中探针2的荧光。荧光强度很弱，表明少量DMSO不会干扰粘度检测。这些结果表明，溶剂对探针2荧光发射有很弱的影响。
【时间对荧光发射的影响】
荧光寿命是验证探针粘度检测灵敏度的另一种方法，它不受探针浓度、吸收和发射强度的影响。作为荧光探针检测分析物的一个重要方面，探针2的时间依赖性是必须进行的。实验在含1％的有机试剂(DMSO)的丙三醇-磷酸盐缓冲液(pH7.4)体系中进行。
随着溶剂体系粘度的上升，分子内旋转被抑制，探针2的荧光发射明显增强。同时，探针2本身的荧光发射在40分钟内没有明显的变化(图22)，这意味着探针2在检测系统中是稳定的。
【干扰物对荧光发射的影响】
作为荧光探针检测分析物的一个重要方面，为了检测探针2的特异性，在一些可能的竞争物种共存下进行探针2的荧光光谱检测，探针2的丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v＝1:1，1％DMSO)在670nm处的荧光发射。
如图23所示(包括1：D-阿拉伯糖，2：D-半乳糖，3：D-甘露糖，4：D-果糖，5：D-核糖，6：D-麦芽糖，7：D-木糖，8：D-葡萄糖，9：D-山梨醇，10：糖胺，11：葡萄糖醛酸，12：透明质酸，13：1H-嘌呤-6-胺，14：腺苷，15：胞苷，16：鸟苷，17：尿苷，18：阿糖胞苷，19：苯酚，20：对苯二酚，21：Ba2+，22：Cd2+，23：Co2+，24：Cr2+，25：Cs2+，26：Cu2+，27：Fe2+，28：Fe3+，29：Li2+，30：Mg2+，31：Mn2+，32：Pd2+，33：Zn2+，34：丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v＝5:5)，35：丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v＝6:4)，36：丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v＝7:3)，37：丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v＝8:2)，38：丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v＝9:1)。)显然，在丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v，1:1)下，探针2对这些分析物(浓度0.8M)几乎不显示荧光响应。然而，在体系丙三醇含量上升的情况下，荧光发射在670nm处增加，证明了探针2对粘度响应的特异性。
【细胞毒性研究】
为了研究探针2在微观环境中的适用性，申请人对探针2进行了细胞毒性分析。通过CCK-8试剂盒测定获得探针2的细胞存活率结果。在DMEM，将HeLa细胞接种到8个96孔板中，密度为8×103个细胞/孔，在37℃下用10％胎牛血清培养24h，然后用含有1、5、10、20μmol/L胎牛血清的100μL新鲜培养基代替培养基培养。10小时后，向每个孔中加入10μL CCK-8溶液，并将平板在培养箱中孵育4小时。最后，用酶联免疫吸附法测定每个孔在450nm处的吸光度。细胞活力通过以下公式计算:细胞存活率(％)＝(处理组吸光度值的平均值)/(对照组吸光度值的平均值)。
如图24所示，HeLa的存活率超过95％，证明探针2对HeLa细胞几乎没有毒性，可以用于细胞成像。
【细胞成像荧光研究】
用探针2检测活体HeLa细胞在生理条件下的粘度变化。用于细胞成像的探针通常需要满足在405、488和561nm激发下产生强荧光的要求。在细胞成像实验之前，使用不同的激发波长来测试探针2在丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v,1：1)溶液中的荧光吸收图谱。
如图25所示，在488nm激发下发现了强荧光发射。因此，488nm的激发波长用于对活细胞成像。
线粒体功能障碍可直接导致多种人类疾病，并伴有线粒体基质粘度增加。为了验证探针2能否通过荧光成像检测活细胞中的线粒体粘度变化，使用H2O2来改变线粒体粘度。因而需要考虑H2O2对于探针2粘度响应的影响，在体外环境研究了丙三醇-磷酸盐缓冲液(v/v，1:1)体系中，不同浓度H2O2的影响。
如图26所示，体系H2O2浓度由0～3×10-3M，探针2的荧光发射强度略有下降；在0～10-3M浓度范围内，探针2的荧光发射强度仅有微小变化。10-3M浓度的H2O2不会影响探针2的荧光发射，因此可以选用该浓度进行待成像细胞的处理。
在37℃下，将HeLa细胞温育至35mm玻璃底培养皿，其中加入1ml含10％FBS和1％青霉素和链霉素的DMEM孵育24小时。然后将HeLa细胞与10个微米探针2在DMEM 37℃孵育1小时，并用新鲜DMEM洗涤6次。随后，空白组的细胞用1ml培养基培养，而模型组的细胞用1ml含1μMH2O2的培养基培养30分钟。然后在共聚焦激光扫描(FLUOVIEW FV3000)下分析样品。
监测线粒体粘度变化的荧光成像如图27-b所示。当用10μM探针2处理HeLa细胞时，在绿色通道中可以观察微弱的绿色荧光。将Hela细胞与10-3M H2O2预培养30分钟，获得了明显的荧光增强(图27-e)。单个细胞区域的荧光密度上升至未经H2O2处理组的四倍。这些结果表明了用探针2可以灵敏地检测活细胞线粒体的粘度变化。

Claims (4)

1.结构式(I)所示的粘度敏感的荧光探针，
其中，X＝-COOH；
Y＝-C4H8SO3 -。
2.结构式(I)所示的化合物用于制备有机物粘度的检测试剂，或者水溶液粘度的检测试剂，或者细胞内环境粘度的检测试剂，或者线粒体粘度变化的检测试剂，
其中，X＝-COOH；
Y＝-C4H8SO3 -。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：待检测物粘度为1cP～825cp时，探针化合物的工作浓度为10-5M。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：以DMSO或水-DMSO为溶剂制备储备液，储备液中探针化合物浓度为10-3M，水-DMSO的体积比为0～9:1。
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