CN111116696A - 一种三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针的制备和应用 - Google Patents

一种三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针的制备和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及了一种三磷酸腺苷(ATP)近红外纳米荧光探针的制备和应用，该荧光探针的结构由纳米级别的沸石咪唑框架(ZIF‑90)以及其内部包裹的基于罗丹明的近红外荧光团构成。本发明提供了以2‑(4‑二乙氨基‑2‑羟基苯甲酰基)苯甲酸，费舍尔氏醛，二水合乙酸锌，咪唑‑2‑甲醛等为原料合成该荧光探针的制备方法；该荧光探针是一种基于ZIF‑90的三磷酸腺苷近红外荧光探针；首先，该荧光探针合成方法简单，对ATP能产生72倍的荧光增强；其次，该荧光探针对ATP具有相对理想的选择性，不受其他核苷酸以及生物体中常见离子的明显干扰；并且，该荧光探针与ATP作用迅速，响应时间在400s以内；此外，该荧光探针具有较长的近红外发射，应用于活细胞内ATP含量的检测。

Description

一种三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针的制备和应用
技术领域
本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及基于沸石咪唑框架的三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针的制备和应用。
背景技术
三磷酸腺苷(ATP)作为一种重要的多功能生物分子，主要产生于线粒体，参与了能量传递、酶催化、生物合成、细胞内信号传导等多种生物过程(Dennis P.B.,Jaeschke A.,Saitoh M.,Fowler B.,Kozma S.C.,Thomas G.Science.,2001,294,1102-1105；Zhou Y.,Tozzi F.,Chen J.,Fan F.,Xia L.,Wang J.R.,Gao G.,Zhang A.J.,Xia X.F.,BrasherH.,Widger W.,Lee M.E.,Zhang W.H.Cancer Res.2012,72,304-314；Abraham E.H.,Okunieff P.,Scala S.,Vos P.,Oosterveld M.J.,Chen A.Y.,ShrivastavB.Science.1997,275,1324-1326；Szewczyk A.,Pikua S.,Biochim.Biophys.Acta.1998,1365,333-353)。ATP的含量也与许多疾病相关，如特定的缺血、缺氧、血小板聚集、交感神经刺激、炎症等，因此ATP可以作为疾病的标志物(Bush K.T.,Keller S.H.,Nigam S.K.,J.Clin.Invest.2000,106,621-626；Mills D.C.,Robb I.A.,RobertsJ.C.J.Physiol.1968,195,715-729；Evans R.J.,Surprenant A.British journal ofpharmacology,1992,106,242-249；Gorman M.W.,Eric O.F.,CharlesW.B.Clin.Chem.2007,53,318-325；Bours M.J.L.,Swennen E.L.R.,Di Virgilio F.,Cronstein B.N.,Dagnelie P.C.Adenosine,2006,5,358-404；Di Virgilio F.PurinergicSignalling,2005,1,205-205)。开发一种简便的ATP检测方法，能促进我们对ATP相关疾病研究的进一步了解。
近年来，许多ATP检测方法如化学发光法、电化学检测法、荧光法等得到了广泛的应用(Prevost D.,Angers D.A.,Nadeau P.Soil.Biol.Biochem.1991,23,1143-1146；LiX.Y.,Guo X.D.,Cao L.X.,Xun Z.Q.,Wang S.Q.,Li S.Y.,Li Y.,YangG.Q.Angew.Chem.Int.Ed.2014,53,7809-7813；Ma H.,Yang M.,Zhang C.,Ma Y.,Qin Y.,Lei,Z.,Chang L.,Lei L.,Wang T.,Yang Y.J.Mater.Chem.B.2017,5,8525-8531；Yao W.,Wang L.,Wang H.,Zhang X.,Li L.,Biosen.Bioelectron.2009,24,3269-3274)。荧光探针由于其灵敏度高，特异性强，响应快等优点，在生物检测中具有很大优势(Zhu H.,Fan J.,Du J.,Peng X.J.Acc.Chem.Res.2016,49,2115-2126)。然而，目前所研发出来的ATP荧光探针大多发射波长较短，阻碍了其进一步的生物应用(Srivastava P.,Razi S.S.,Ali R.,Srivastav S.,Patnaik S.,Srikrishna S.,Misra A.Biosen.Bioelectron.2015,69,179-185)。因此，研制一种合适的近红外荧光探针来监测体内的ATP水平仍然是非常必要的。
沸石咪唑框架(ZIFs)是近年来迅速发展起来的一种新型有机金属框架，它一般由有机配体和金属离子组合配位而成(Seth S.,Matzger A.J.Cryst.Growth.Des.2017,17,4043-4048；Della Rocca J.,Liu D.,Lin W.Acc.Chem.Res.2011,44,957-968)。由于其孔隙率高、稳定性好、表面改性灵活等优点，广泛应用于气体分离与储存、催化、药物的输送等领域(Venna S.R.,Carreon M.A.J.Am.Chem.Soc.,2009,132,76-78；Phan A.,DoonanC.J.,Uribe-Romo F.J.,Knobler C.B.,O’keeffe M.,Yaghi O.M.Acc.Chem.Res.2009,43,58-67；Jia X.,Yang Z.,Wang Y.,Chen Y.,Yuan H.,Chen H.,Xu X.,Gao X.,Liang Z.,Sun Y.,Li,J.R.,Zheng H.,Cao R.ChemMedChem.2018,13,400-405)。近年来，ZIFs在疾病标志物的检测研究越来越多(Zhang F.M.,Dong H.,Zhang X.,Sun X.J.,Liu M.,YangD.D.,Liu X.,Wei J.Z.ACS Appl.Mater.Interfaces.,2017,9,27332-27337；Guan Q.,Zhou L.L.,Li Y.A.,Dong Y.B.Inorg.Chem.2018,57,10137-10145)，然而，利用ZIFs进行ATP检测的相关报道较少。因此，研发一种基于ZIFs的荧光探针来检测ATP是十分有意义的。
发明内容
根据所提出的要求，本发明人对此进行深入研究，在付出大量创造性劳动后，提供一种基于沸石咪唑框架(ZIF-90)的三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针。
本发明的技术方案是，一种三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针，其结构是由沸石咪唑框架(ZIF-90)和罗丹明的近红外染料(NIR)自组装而成。
一种三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针的制备方法。步骤如下：
1)罗丹明的近红外染料(NIR)制备方法：在100mL圆底烧瓶中，将10当量的环己酮缓慢滴加于20mL浓硫酸中并冷却至0℃，然后，在搅拌下，加入5当量的2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸。将反应混合物加热至90℃，搅拌反应1.5h。停止反应，将所得到的溶液迅速倒入冰水中，然后加入2mL的高氯酸。粗产品经减压抽滤和冷水洗涤后，得到橙色固体中间产物(产率89％)。在100mL圆底烧瓶中，将1当量的中间产物和1当量的费舍尔氏醛溶解在8mL的无水乙酸中，在50℃下搅拌反应1.5h，用8mL水淬灭反应，粗产品经减压抽滤后用硅胶柱层析法提纯，洗脱液比例为二氯甲烷：乙醇(20:1)，减压抽滤除去溶剂，得到深绿色固体产物(产率21％)。
2)三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针(NIR@ZIF-90)的制备方法：在5mL离心管中，将200当量的咪唑-2-甲醛和1当量的近红外荧光染料NIR溶于1～5mL N,N-二甲基甲酰胺。然后，将100当量的二水合乙酸锌溶解于1～5mL N,N-二甲基甲酰胺后倒入离心管内。接着，把离心管放入超声波中振荡5min，倒入5～10mL N,N-二甲基甲酰胺里使产物结构稳定。将所得到的悬浊液进行离心分离后，用乙醇冲洗固体三次。将所得到的固体放入真空干燥箱中25℃干燥24小时，得到绿色固体，即为荧光探针。
本发明的有益效果是，一种三磷酸腺苷(ATP)荧光探针的良好的光谱响应性能。首先，研究了该探针的荧光光谱性质，加入ATP之前，荧光探针没有明显的荧光发射；加入ATP之后，在近红外区(750nm)出现了荧光发射峰。并且随着ATP浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断升高。当加入5mM的ATP时，荧光强度增强72倍，因此可以用来检测ATP。该探针在0.05mM到5mM检测范围内与ATP的浓度呈线性关系，这说明该探针在该范围内通过荧光强度来检测到ATP的浓度。其次，研究了探针的紫外吸收光谱，在没有加入ATP时，探针无紫外吸收；加入ATP后，探针在700nm处出现吸收。接着，研究探针的选择性，考察探针与其他核苷酸(ADP,AMP,GTP,CTP,UTP)，生物体中常见的离子(P3O10 5-,P2O7 4-,H2PO4 -,HPO4 -,PO4 3-,Cl-,SO4 2-,NO3 -,CH3COO-,CO3 2-)的荧光响应情况。结果发现，只有ATP能引起荧光光谱强烈改变，而其他检测物对探针的荧光光谱均未产生明显的荧光变化。然后，研究了pH值对荧光探针测定ATP的影响，当pH值介于4.0到8.0之间时，不影响荧光探针对ATP的测定。此外，该荧光探针响应迅速，响应时间在400s以内。
一种三磷酸腺苷荧光探针的应用。在细胞中加入荧光探针，可以观察到的较强的荧光，这说明探针能够检测到细胞中存在的ATP。细胞用三磷酸腺苷双磷酸酶(apyrase)处理抑制细胞内ATP的产生，发现荧光明显减弱。这些结果说明：荧光探针能监控细胞内ATP含量的变化，这为监控人体内和ATP相关病变提供一种可靠的手段。
附图说明
图1为荧光探针的制备路线及与ATP作用示意图。
图2为荧光探针与不同浓度的ATP作用后的荧光光谱图。
横坐标为波长，纵坐标为荧光强度。荧光探针的浓度均为4mg/mL，ATP浓度分别为：0，0.05,0.1,0.3,0.5,1,2,3,4,5mM。荧光激发波长为700nm。
图3为荧光探针对不同ATP浓度的荧光线性响应图。
图4为荧光探针与ATP作用前后的以及探针荧光团的紫外可见吸收光谱图。
图5为荧光探针的选择性图。
荧光探针的浓度为4mg/mL，ATP浓度为5mM，其它分析物浓度均为10mM。
图6为pH对荧光探针的影响图。
图7为荧光探针与不同浓度ATP作用后荧光强度随时间变化的关系曲线图。
图8为细胞毒性试验。横坐标为荧光探针的浓度，纵坐标为细胞的存活率。
图9荧光探针与ATP作用的细胞成像图。(a)空白。(b)细胞用探针(100μg/mL)处理2h。(c)细胞用三磷酸腺苷双磷酸酶处理2h，然后用探针(100μg/mL)处理2h。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明，但不限于此。
实施例1：
荧光探针的制备
罗丹明近红外染料NIR的制备：在100mL圆底烧瓶中，将10当量的环己酮缓慢滴加于20mL浓硫酸中并冷却至0℃，然后，在搅拌下加入5当量的2-(4-二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)苯甲酸。将反应混合物加热至90℃，搅拌反应1.5h。停止反应，将所得到的溶液迅速倒入冰水中，然后加入2mL的高氯酸。粗产品经减压抽滤和冷水洗涤后，得到橙色固体中间产物(产率89％)。在100mL圆底烧瓶中，将1当量的中间产物和1当量的费舍尔氏醛溶解在8mL的无水乙酸中，在50℃下，搅拌反应1.5h后，用8mL水淬灭反应，粗产品经减压抽滤后用硅胶柱层析法提纯，洗脱液比例为二氯甲烷：乙醇(20:1)，减压抽滤除去溶剂，得到深绿色固体产物，即为近红外染料NIR(产率21％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.97(d,J＝9.2Hz,1H),8.28(d,J＝8.0Hz,1H),7.72(t,J＝7.2Hz,1H),7.62(t,J＝7.6Hz,1H),7.57-7.50(m,1H),7.44-7.37(m,2H),7.24(s,2H),7.17(d,J＝7.2Hz,1H),7.08(t,J＝7.2Hz,1H),6.88(d,J＝8.0Hz,1H),6.74(d,J＝7.2Hz,1H),5.43(d,J＝8.8Hz,1H),3.72-3.55(m,4H),3.38(t,J＝7.2Hz,4H),1.80(s,2H),1.65(s,6H),1.28(t,J＝6.8Hz,6H),0.89(t,J＝6.4Hz,3H).MS(TOF,m/z):559.5.
一种三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针(NIR@ZIF-90)的制备：如图1所示，在5mL离心管中，将200当量的咪唑-2-甲醛和1当量的近红外荧光染料NIR溶于1～5mL N,N-二甲基甲酰胺；然后，将100当量的二水合乙酸锌溶解于1～5mL N,N-二甲基甲酰胺后倒入离心管内；接着，把离心管放入超声波中振荡5min，倒入5～10mL N,N-二甲基甲酰胺里使产物结构稳定；将所得到的悬浊液进行离心分离后，用乙醇冲洗固体三次；将所得到的固体放入真空干燥箱中，25℃下干燥24小时，得到绿色固体，即为荧光探针。
实施例2：
荧光探针和ATP溶液配制
探针溶液的制备：称取一定量探针分散在水中，配成4mg/mL的探针溶液。ATP溶液的配制：称取一定量的腺苷-5-三磷酸二钠盐溶解在蒸馏水中，配置成20mM的ATP溶液后，保存在4～8℃的环境中。
实施例3：
荧光探针与ATP作用的荧光光谱的测定
图2为荧光探针与ATP作用的荧光光谱，荧光探针的浓度为4mg/L，ATP的浓度依次为0,0.05,0.1,0.3,0.5,1,2,3,4,5mM。激发波长固定为700nm，发射波长范围为720-785nm。狭缝宽度为10.0nm/10.0nm，所用的荧光测定仪器为日立F4600荧光分光光度计。从图2可以看出，加入ATP之前，荧光探针没有明显的荧光发射；加入ATP之后，在近红外区(750nm)出现了发射峰。这是因为ATP与构成探针结构中的Zn2+结合，导致探针的沸石咪唑结构崩塌，从而释放出包裹在其中的荧光团NIR，释放出NIR的近红外荧光。并且随着ATP浓度的增大，探针分子的近红外荧光强度不断增强。当加入5mM的ATP时，荧光强度增强72倍，因此可以用来检测ATP。图3为探针对不同ATP浓度的线性响应图。ATP浓度范围在0.05～5mM时，探针的荧光强度与ATP浓度呈现线性关系，说明探针可以在该浓度范围内定量检测ATP。
实施例4：
荧光探针与ATP作用的紫外可见吸收光谱的测定
图4为荧光探针与ATP作用前后的紫外可见吸收光谱图，荧光探针的浓度为4mg/mL，ATP的加入量为1mM。紫外可见吸收光谱测定用的仪器为安捷伦Cary60紫外可见分光光度计。从图4中可以看出，在没有加入ATP时，探针在无明显吸收；加入ATP后，探针在700nm处出现了吸收峰，且与NIR本身的紫外吸收峰一致，说明ATP导致探针结构崩坍，从而释放出NIR，产生了紫外吸收。
实施例5：
荧光探针对ATP测定的选择性
图5为荧光探针对ATP测定的选择性图。考察在浓度为4mg/mL的荧光探针悬浊液中加入ATP(5mM)及其他核苷酸类(ADP,AMP,GTP,CTP,UTP)，和生物体中常见的离子(P3O10 5-,P2O7 4-,H2PO4 -,HPO4 -,PO4 3-,Cl-,SO4 2-,NO3 -,CH3COO-,CO3 2-)(10mM)的荧光响应情况。从图5中可以看出，只有ATP能引起72倍的荧光增强，而其他检测物对探针的荧光强度没有影响。这些结果表明，荧光探针对ATP有较好的选择性。
实施例6：
溶液pH值对荧光探针测定ATP的荧光性质的影响
考察pH值对荧光探针测定ATP的荧光光谱的影响，其结果如图6。我们研究的pH范围为2.0～12.0，荧光探针的浓度为4mg/mL，ATP的浓度为1mM。从图中可以看出，荧光探针在pH为4.0～10.0的时，荧光强度基本不变，说明pH在此范围内对探针本身没有很大的影响，是比较合适的pH值范围。这非常有利于该探针用于实际样品中ATP的测定。
实施例7：
荧光探针与ATP作用的响应时间的测定
我们研究了荧光探针对ATP的响应时间，其结果如图7。从图中可以看出，该探针对各种浓度ATP的响应时间均在400s以内，这能够满足在实际样品中进行实时监测的要求。从图7我们还可以看出，荧光强度达到最大值后，在之后的时间里，荧光强度不再发生变化，这表明此荧光探针光稳定性较好。
实施例8：
荧光探针在活细胞中的应用
首先，我们做了细胞毒性试验，如图8所示。当加入0～100μg/mL荧光探针，细胞的成活率均在90％以上。这可以说明，该荧光探针毒性较小，可应用于检测活细胞内的ATP。然后，我们研究荧光探针在活细胞中的应用，选择结肠癌细胞HCT116进行共聚焦显微成像，结果如图9所示。在细胞中加入荧光探针(100μg/mL)，可以观察到的较强的荧光，这说明荧光探针与细胞中的ATP作用，产生了荧光(图9b)。由于三磷酸腺苷双磷酸酶能清除细胞内的ATP。细胞用三磷酸腺苷双磷酸酶预先处理2h，然后用探针(100μg/mL)处理2h。荧光明显减弱(图9c)。这些结果说明荧光探针能监控细胞内ATP含量的变化，这为监控人体内和ATP相关的疾病提供了一种可靠的手段。

Claims (3)

1.一种三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针，其结构是由纳米级别的沸石咪唑框架ZIF-90以及其内部包裹近红外荧光染料NIR构成。
2.根据权利要求1所述的一种三磷酸腺苷近红外纳米荧光探针的制备方法，其特征在于，反应步骤如下：
在5mL离心管中，将200当量的咪唑-2-甲醛和1当量的近红外荧光染料NIR溶于1～5mLN,N-二甲基甲酰胺；然后，将100当量的二水合乙酸锌溶解于1～5mL N,N-二甲基甲酰胺后倒入离心管内；接着，把离心管放入超声波中振荡5min，倒入5～10mL N,N-二甲基甲酰胺里使产物结构稳定；将所得到的悬浊液进行离心分离后，用乙醇冲洗固体三次；将所得到的固体放入真空干燥箱中25℃干燥24小时，得到绿色固体，即为荧光探针。
3.根据权利要求1所述的一种三磷酸腺苷荧光纳米探针的应用，其特征在于，所述荧光探针应用于活细胞内的三磷酸腺苷的近红外荧光成像检测。
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