CN108456192B - 双光子荧光钠离子探针及其合成方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于精细化工技术领域，具体涉及一种双光子荧光钠离子探针及其合成方法和应用，所述探针以双氰基二苯代乙烯为双光子荧光母体制备。该探针分子体积小，对钠离子有很好的选择性，而锌、钾、钙、镁、锰、汞等钠离子以外的其他离子对检测没有干扰，可以检测微摩尔浓度的钠离子。探针分子络合钠离子后荧光强度下降，可以对钠离子含量进行双光子荧光检测。双光子荧光显微成像实验表明这类探针对成纤维细胞等细胞或组织渗透性好，本身对细胞没有毒副作用，特别适于细胞内钠离子浓度变化和汞离子分布的检测，在生物、医药领域中具有极大的应用价值。

Description

双光子荧光钠离子探针及其合成方法和应用
技术领域
本发明涉及精细化工领域，具体地说涉及一种双光子荧光钠离子探针及其合成方法和应用。
背景技术
全球经济的发展，带给人们物质生活水平的提高。但也带来了大量的环境问题，例如：金属离子的污染。对于金属离子的检测和监督是现在生物以及医学领域研究的热点问题。以前对于金属离子的检测方式一定程度上损害了细胞，且准确度不够。金属离子荧光探针的发展可以实现对金属离子的专一性检测，在荧光显微镜下进行实时检测，避免了由于大量化学试剂的注入对于细胞的损坏。因此，开发出具有生物相容性、特异性结构和位点识别基元、大的双光子吸收截面、高的荧光量子产率和识别响应性的双光子金属离子荧光探针是必要的。
现有报道的检测金属离子的的双光子荧光探针，如CN201610272352.1(专利1)一种双光子荧光探针及其制备方法和用途，公开了探针的结构式，以及其用于细胞内钯离子分布检测的应用，该探针是以香豆素与罗丹明为母体制成的，侧重于细胞内钯离子分布的监测，且是对HeLa细胞渗透性好；CN201510547069.0(专利2，本发明人之前申请)细胞内汞离子检测与显像用二苯乙烯基双氰基苯双光子荧光探针，公开了该探针的结构式和制备方法，以及细胞内汞离子浓度变化和分布检测的应用，该探针是以二苯乙烯基双氰基苯为母体，通过2,5-二(4-[二(2-氯乙基)氨基]苯乙烯基)对苯二甲腈与巯基乙醇发生亲核取代反应而制备，重点在于同汞离子的络合。CN201210224714.1(专利3)提供一种单\双光子钙离子荧光探针化合物及其制备与应用，是BAPTA-CH3-CHO与4-甲基-N-甲基吡啶碘盐在乙醇溶剂和哌啶催化剂条件下制备得到，侧重于检测动植物、人体细胞、土壤或水体中的钙含量；CN201310326493.3(专利4)涉及一种三苯胺类双光子荧光探针化合物及其制备方法和应用，由4-氯甲基吡啶-2,6-二甲酸二甲酯、三苯基膦、无水苯为原料制成，侧重于银离子检测和pH检测。
另外，硕士论文《对金属离子敏感的荧光探针的制备及其性能研究》(张静静，齐鲁工业大学，2014-06-08)公开了以三苯胺为基本原料，分别合成了探针化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。同时也进行了聚苯乙烯的改性，并在其表面接枝上了氨基。将探针化合物Ⅰ与改性的聚苯乙烯进行希夫碱反应，合成了对金属离子具有识别性能的金属离子聚合物荧光探针。通过紫外光谱以及荧光光谱，对上述产物进行性能测试的结果为：在不同的溶剂中探针Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及PS-探针Ⅰ化合物的紫外以及荧光都呈现不同的变化。除此还进行了专一性以及灵敏性测试，结果显示探针Ⅰ对任何离子均不显示专一性识别，且对特定的离子(如钠离子)的荧光强度呈现非单一性变化(时而增强时而减弱)。因此不能用作特定离子的识别检测。
上市产品如钠离子荧光探针(Na+indicator)-SBFI AM，常用来预测纯化线粒体Na+梯度，检测胞内Na+水平，测定细胞Na+外流，以及与其他荧光指示剂联合使用以分析Na+与Ca2+和Mg2+浓度、胞内pH和膜电位变化的相关性，但SBFI对Na+的选择能力弱于Ca2+指示剂比如Fura-2，只能说可以检测Na+的生理浓度，但还没有达到理想效果，并且，这类AM酯形式的探针水溶性也比较差。
本发明研究人员此前在对双光子荧光探针的研究过程中，针对细胞内汞离子、锌离子、银离子的检测，细胞内糖链抗原的活性检测以及温度传感检测等方面进行了研究，但基于双氰基二苯代乙烯的用于细胞内钠离子检测与成像的发明未见报道。因此，研究出适合于检测生物体内钠离子的存在、监测细胞内钠离子区域分布和浓度信息并进一步辅助生物、医学、环境等领域的研究，是本领域人员需要不断去探索和创造的内容。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种适用于细胞内钠离子检测与成像用的双光子荧光钠离子探针，该探针基于双氰基二苯代乙烯(DCS)为双光子荧光母体，具有分子体积小、稳定性好、吸收截面大等优点，使探针在钠离子检测过程中特异性强、灵敏度高、准确度高和细胞渗透性好，具有良好的成像清晰度与横纵向分辨率。
具体来说，本发明提供了如下的技术方案：
一种双光子荧光钠离子探针PNa，具有以下分子结构：
Figure BDA0001629888970000031
前述的双光子荧光钠离子探针PNa的合成路线如下：
Figure BDA0001629888970000041
双光子荧光钠离子探针PNa的合成步骤如下：
(1)称取4’-甲酞基苯并-15-冠-5和氢化钠，置于干燥单口烧瓶中，待用；
(2)称取中间体5即1,4-二氰基-2-甲基-5-(二乙基磷酰基甲基)苯溶于四氢呋喃，置于恒压加料器中，将恒压加料器装在单口烧瓶上，并抽真空用氩气保护；
(3)将烧瓶置于冰水浴中，在搅拌和避光的条件下，将含有中间体5的四氢呋喃溶液逐滴滴加到混合液中，滴加时间40～50min；滴加完毕后，室温搅拌反应24h，
(4)反应结束后，真空脱除THF，用二氯甲烷萃提3～4次，每次15～20mL，水洗2～3次，每次10～15mL，加无水氯化钙干燥，过滤，真空脱除溶剂；得粗品经硅胶柱色谱洗脱分离，即得黄色粉末。
其中，所述步骤(1)中4’-甲酞基苯并-15-冠-5与氢化钠的摩尔比为1:1.2～1.5；
所述步骤(2)中，中间体5和四氢呋喃的摩尔体积比为1:9～12。
所述步骤(3)中，搅拌的频率为300r/min。
所述步骤(4)中，洗脱液组成为：V(正己烷):V(乙酸乙酯)＝12～15:1。
如前所述的双光子荧光钠离子探针PNa，应用于探测细胞内钠离子的存在、细胞内钠离子区域分布和浓度信息。
所述的细胞为成纤维细胞。
所述的双光子荧光钠离子探针，其应用方法是：将PNa溶于混合溶液MIS溶液中，采用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液调节pH，在小鼠成纤维细胞培养基中加入1μmol·L-1荧光探针分子PNa，并在30～40℃、含2～10％CO2的细胞培养箱中孵育0.5～1h，取出细胞并用缓冲溶液PBS冲洗3～4次，并于无色血清游离介质中再孵化15～20min，然后用共聚焦激光扫描显微镜(λex＝800nm,～1.5W)将射入的激光共聚焦于细胞上，收集600～650nm通道的荧光，由此获得细胞内钠离子浓度信息，实现对细胞内钠离子的检测和变化情况监测。
其中，所述MIS溶液是由以下体积比的成分组成：生理盐水：乙醇：DMSO：聚氧乙烯＝20：35：30：15。
本发明以双氰基二苯代乙烯为双光子荧光母体，通过特定的合成方法获得能快速、简便、灵敏的用于细胞钠离子检测与成像的双光子荧光钠离子探针(PNa)。该探针分子具有如下特点：
1、本发明双光子荧光探针分子激发和发射光谱在可见光区，能显著地提高成像的清晰度、检测的灵敏度与横纵向分辨率，荧光量子产率高，双光子吸收截面大，分子体积小，并且化学-光稳定性好；
2、探针分子的设计基于分子内电荷转移(ICT)原理，探针分子络合钠离子前后荧光强度发生显著的变化，可以检测钠离子含量。另外探针PNa对各种离子的选择性区别可以直观地用相对强度来进行比较，对钠离子有很好的选择性，银、钙、铬、镁、锰等金属离子对检测没有干扰；
3、探针分子与钠离子之间的解离常数在微摩尔级范围内，可以检测微摩尔浓度的细胞钠离子；
4、探针分子细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，适于细胞内钠离子浓度变化的检测。可共聚焦激光显微镜得到各类活细胞或组织内钠离子的分布荧光图像或假彩比例荧光图像。
其中，研究探针对钠离子选择性的方法是在含有探针分子PNa(探针浓度为1μmol/L)的水中分别加入不同金属离子(离子浓度为20mmol/L)，然后再加入20μmol·L-1Na+，未加钠离子前的探针分子溶液的单光子荧光强度与加钠离子后的单光子荧光强度的差值对前者的比值即为离子对探针分子荧光强度的百分淬灭率，作为判断探针分子对该离子的选择性。
探针在细胞内探测钠离子性能的实验方法是将含有探针分子的MIS溶液(生理盐水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯(60)蓖麻油(CrEL)组成)加入到培养好的细胞中，在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时，用PBS充分洗涤后，并于无色血清游离介质中再孵化15min，用双光子荧光显微镜成像得到成像照片；向上述含探针的细胞培养液中加入20μmol·L-1Na+后再重复前述的孵育和孵化过程，再进行双光子荧光显微成像，得到细胞内钠离子的分布图像，由此得到钠离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。
探针的应用方法是将溶解于有机溶剂或有机/水混合溶剂中的这类探针加入到被测的含钠离子的细胞的培养液中，使探针浓度在1-10μmol/L，被测细胞与探针在30-40℃和含2-10％CO2的细胞培养箱中孵育0.5-1小时后，探针透过细胞膜，与细胞内钠离子络合发生荧光变化，用PBS溶液充分洗涤后，细胞在双光子荧光显微镜下得到钠离子分布的荧光图像，由此得到钠离子的存在、细胞内的区域分布和浓度信息。最佳孵育条件为：温度为37℃，含5％CO2的细胞培养箱中孵育0.5小时。
本发明涉及的探针分子具有极其重要的应用价值。特别是该系列探针分子检测灵敏度较高，响应时间极短，细胞渗透性良好，对细胞的毒副作用小，使得这类探针作为测定生物体内的钠离子浓度快速变化的试剂是极其有用的。因此，本发明探针具有检测效果明显、离子变化监测灵敏度高等优点，在生物、医药等领域具有较大的实际应用价值。
附图说明
图1是本发明的探针PNa在水中当加入0～108μL Na+(10-5mol.L-1)时的单光子荧光谱图(λex＝348nm)；箭头表示吸收强度与单光子发射强度随钠离子浓度的增加而变化的趋势；横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度；
图2是本发明的探针PNa在水中当加入0～108μL Na+(10-5mol.L-1)时的双光子荧光谱图(λex＝700nm)；
图3是本发明的探针PNa在水中的双光子吸收截面图；
图4是本发明的探针PNa在水中的荧光滴定拟合曲线图图；
图5是本发明的探针PNa(1μmol·L-1)标记的小鼠成纤维细胞的双光子成像照片；其中(a)空白图像；(b–c)是用1μmol·L-1PNa标记的小鼠成纤维细胞在550–650nm处采集的双光子显微照片，具体来说，(b)与(c)分别是在加入20μmol·L-1Na+前后的成像照片；
图6是本发明的探针PNa(c＝1μmol·L-1)在水中单光子荧光猝灭比较图；未填充矩形条是分别加入不同离子(20mmol·L-1)(Ag+,Ca2+,Cd2+,Cr3+,Fe3+,Co2+,Ni2+,Fe2+,Na+,Cu2+,Zn2+,Mn2+,Mg2+,Hg2+,Pb2+,K+和Ba2+)时的单光子荧光猝灭百分率的比较，填充矩形条是紧接着加入20μmol·L-1Na+的单光子荧光猝灭百分率的比较。
具体实施方式
为了使本领域普通技术人员更好的理解本发明，下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1分子结构及合成路线
一种双光子荧光钠离子探针PNa，具有下列分子结构：
Figure BDA0001629888970000081
合成路线为：
Figure BDA0001629888970000091
其中，中间体2、3根据以下文献1合成，中间体4、5根据以下文献2合成：6即4’-甲酞基苯并-15-冠-5购自上海兰浚生物科技有限公司。
[1]H.Huang,Q.He,H.Lin,F.Bai,Z.Sun and Q.Li,Polym.Adv.Technol.,2004,15():84—88
[2]Huang C.,Fan J.,Peng X.,Lin Z.,Guo B.,Ren A.,Cui J.,SunS.,J.Photochem.Photobio.A:Chem.,2008,199(2–3):144—149
实施例2目标化合物PNa的合成
合成方法：准确称取6(296mg，1mmol)和氢化钠(30mg，1.25mmol)置于25mL干燥单口烧瓶中，准确称取5(292mg，1mmol)溶于10mL四氢呋喃，置于恒压加料器中，将恒压加料器装在单口烧瓶上，并抽真空用氩气保护。将烧瓶置于冰水浴中，在强烈搅拌和避光的条件下，将5的四氢呋喃溶液逐滴滴加到混合液中(滴加时间40～50min)。滴加完毕后，室温搅拌反应24h。反应结束后，真空脱除THF，用二氯甲烷萃提(3×15mL)，水洗(3×10mL)，加无水氯化钙干燥。过滤，真空脱除溶剂。粗品经硅胶柱色谱分离〔洗脱液：V(正己烷):V(乙酸乙酯)＝12:1〕。得黄色粉末PNa，产率78％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.977(s,1H),7.576(s,1H),7.184(s,1H),7.164(d,J＝16.4Hz,1H),7.117(d,J＝16Hz,1H),7.113(d,J＝8.8Hz,1H),6.867(d,J＝8.0Hz,1H),4.187(t,J1＝4.0Hz,J2＝7.2Hz,4H),3.941(s,4H),3.764(d,J＝8.4Hz,8H),2.569(s,3H)。13CNMR(CDCl3,100MHz)δ:144.35,143.62,140.27,134.19,131.68,125.33,116.46,115.52,113.91,112.87,111.58,109.22,68.55,68.14,67.35,14.34。MS,m/z:C25H26N2O5(M+)的计算值(实测值)：434.1842(434.1842)。
实施例3探针PNa的水中的光物理性能研究
为了研究探针PNa在水中的荧光强度，设计了如附图1-4所示的实验。在1μmol L- 1PNa的水溶液中，分别测定单光子吸收最大波长
Figure BDA0001629888970000101
单光子发射最大波长
Figure BDA0001629888970000102
荧光量子产率
Figure BDA0001629888970000103
不同双光子激发波长下的双光子吸收截面，并计算出斯托克斯位移(ΔλST)、最大双光子激发波长
Figure BDA0001629888970000104
和最大双光子吸收截面(δmax)。
表1PNa的光物理性质
Figure BDA0001629888970000105
注：a)单光子吸收最大波长(nm)；b)单光子发射最大波长(nm)；
c)荧光量子产率；d)最大双光子激发波长(nm)；
e)斯托克斯位移(nm)；f)最大双光子吸收截面(GM)。
由附图1-4和表1可知，探针PNa发出绿色荧光，斯托克斯位移高达124nm,这可以完全避开入射光对探针自发荧光的干扰，从而提高探针检测的准确度；在水中的荧光量子产率达0.353，一般的探针分子在水相中的荧光量子产率都比较低，这也是难能可贵的，可以提高检测灵敏度与成像清晰度；特别是最大双光子吸收截面竟达1054GM，这能显著提高成像的清晰度与分辨率，从而提高检测的灵敏度与准确度。
实施例4探针PNa对钠离子的选择性研究
结合附图6，使用上述合成的化合物PNa评价对钠离子的选择性。将探针分子PNa(探针浓度为1μmol·L-1)分别加到含有不同金属离子(离子浓度为20mmol/L)的水中，然后再加入20μmol·L-1Na+，钠离子添加前后的探针分子溶液的单光子荧光强度与不同离子溶液的单光子荧光强度的差值对前者的比值即为离子对探针分子荧光强度的百分淬灭率，作为判断探针分子对该离子的选择性。探针单、双光子激发波长分别为348nm与700nm，发射波长为472nm，测试结果显示于图6中。从图中可以看到，探针对钠离子具有很高的选择性，钠离子的加入产生很大的荧光淬灭，另外汞、钾、钙、镁、锰、铁等金属离子对检测没有干扰。
实施例5细胞内钠离子检测与成像研究
小鼠成纤维细胞的培养：
将10％FBS、青霉素(100units/mL)和链霉素(100μg/mL)补加到细胞培养基DMEM(HyClone，Dulbecco's Modified Eagle's Medium，达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基)中并混合均匀，于此溶液中培养小鼠成纤维细胞。成像前两天进行细胞筛选处理。为了标记，先除去培养介质，再换上不含FBS的DMEM介质。
细胞显微成像：
对于双光子体外成像，使用一个激光共聚焦显微镜(Zeiss 510LSM META)，配有飞秒脉冲钛蓝宝石激光器(Mira 900-F,Coherent)，激发光光源为飞秒脉冲激光，激光波长可调范围为700～980nm(λex＝800nm,～1.5W)，配有二色分光镜(HFT 650，Carl Zeiss,Inc.)的显微镜将射入的激光通过一个油浸物镜(NA 1.4)共聚焦于细胞上。激光条码扫描器(LSM510META NLO)采集数据窗口宽度在630nm处是10.7cm，600-650nm的旁路过滤用于收集样品的发射光。双光子激发波长为790nm，收集600～650nm通道的荧光。
将PNa溶于生理盐水、乙醇、DMSO和聚氧乙烯(60)蓖麻油(CrEL)(20/35/30/15,V/V/V/V)组成的混合溶液(简称MIS溶液)中，采用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液调节pH，用此溶液孵化小鼠成纤维细胞，取出细胞并用缓冲溶液洗去多余的PNa，在显微镜下能够看到均匀的绿色荧光，表明PNa能够透过细胞膜，渗透性良好。
图5a)是白光下的成纤维细胞照片；图5b)是在成纤维细胞培养基中加入1μmol·L-1荧光探针分子PNa并在37℃、含5％CO2的细胞培养箱中孵育30min，然后用PBS洗3次，并于无色血清游离介质中再孵化15min后成像照片。所用仪器是共聚焦激光扫描显微镜，20倍目镜。
探针PNA标记后的细胞强烈的绿色荧光，加入20μmol·L-1Na+后并无荧光显示。表明采用本发明探针对钠离子浓度变化检测可行，具有高灵敏度、准确度和分辨率。

Claims (9)

1.一种双光子荧光钠离子探针PNa，其特征在于：所述双光子荧光钠离子探针具有以下分子结构：
Figure FDA0002506137410000011
。
2.一种如权利要求1所述的双光子荧光钠离子探针PNa的合成方法，其特征在于：合成路线如下所示：
Figure FDA0002506137410000012
。
3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：双光子荧光钠离子探针PNa的合成步骤如下：
(1)称取中间体6和氢化钠，置于干燥单口烧瓶中，待用；
(2)称取中间体5溶于四氢呋喃，置于恒压加料器中，将恒压加料器装在单口烧瓶上，并抽真空用氩气保护；
(3)将烧瓶置于冰水浴中，在搅拌和避光的条件下，将含有中间体5的四氢呋喃溶液逐滴滴加到混合液中，滴加时间40～50min；滴加完毕后，室温搅拌反应24h；
(4)反应结束后，真空脱除THF，用二氯甲烷萃提3～4次，每次15～20mL，水洗2～3次，每次10～15mL，加无水氯化钙干燥，过滤，真空脱除溶剂；得粗品经硅胶柱色谱洗脱分离，即得黄色粉末PNa。
4.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述步骤(1)中中间体6与氢化钠的摩尔比为1:1.2～1.5；所述步骤(2)中，中间体5和四氢呋喃的摩尔体积比为1:9～12。
5.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述步骤(3)中，搅拌的频率为300r/min。
6.根据权利要求3所述的合成方法，其特征在于：所述步骤(4)中，洗脱液组成为：V(正己烷):V(乙酸乙酯)＝12～15:1。
7.根据权利要求1所述的双光子荧光钠离子探针PNa或如权利要求2-6任一项所述的合成方法得到的探针PNa的应用，其特征在于：应用于探测细胞内钠离子的存在、细胞内钠离子区域分布和浓度信息，所述的应用为非诊断的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的细胞为成纤维细胞。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述的双光子荧光钠离子探针，其应用方法是：将PNa溶于混合溶液MIS溶液中，采用HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲溶液调节pH，在小鼠成纤维细胞培养基中加入1μmol·L-1荧光探针分子PNa，并在30～40℃、含2～10％CO2的细胞培养箱中孵育0.5～1h，取出细胞并用缓冲溶液PBS冲洗3-4次，并于无色血清游离介质中再孵化15～20min，然后用共聚焦激光扫描显微镜λex＝800nm,～1.5W将射入的激光共聚焦于细胞上，收集600～650nm通道的荧光，由此获得细胞内钠离子浓度信息，实现对细胞内钠离子的检测和变化情况监测；所述MIS溶液是由以下体积比的成分组成：生理盐水：乙醇：DMSO：聚氧乙烯60蓖麻油CrEL＝20：35：30：15。
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