CN114773290A

CN114773290A - 一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN114773290A
Application number: CN202210273308.8A
Authority: CN
Inventors: 赵梦; 李飞; 黄山; 陈红; 张敬苗; 张罡
Original assignee: Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University
Current assignee: Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University
Priority date: 2022-03-18
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2022-07-22

Abstract

本发明提供一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用，涉及小分子荧光探针设计合成与生物应用技术领域。通过设计合成了一种黏度响应型小分子荧光探针，能够特异性响应体系微黏度，且随着黏度的增加，荧光强度显著增强，具有激活型响应的特点，可用于体内外黏度的定性/半定量监测。同时，本发明中目标探针具有很好的pH稳定性、光稳定性及细胞毒性，能够满足后续生物学应用的基本要求。本发明合成路线简单，可操作性强，能够特异性靶向细胞内线粒体，同时能够监测药物诱导细胞内线粒体功能障碍导致的黏度异常，具有较强的生物学应用价值。

Description

一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及小分子荧光探针设计合成与生物应用技术领域，具体涉及一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

细胞内黏度对于控制生物大分子相互作用、质量或信号传输和活性代谢物在体内扩散有着不可替代的作用。生物体系的黏度异常能够反映出机体代谢和功能障碍，如：糖尿病、老年痴呆症、动脉粥样硬化和恶性肿瘤。而线粒体基质中异常的粘度变化可引起线粒体自身网络组织的变化，并进一步影响代谢产物的扩散。因此，合理的设计能够半量化/量化活细胞中线粒体粘度变化的分子探针具有重要意义。

对于功能性小分子探针设计而言，具有可旋转共轭双键的分子转子，其分子的某一部分可以自由旋转。同时，在不同的体系微环境中展现出不同的荧光特性，即：在低黏度环境中，分子内的旋转释放的激发态能量会导致显著的荧光降低或猝灭；在高黏度环境中，分子内旋转受到抑制，从而降低非辐射跃迁概率导致荧光增强。因此，设计具有良好生物相容性的分子转子类荧光探针非常适宜作为黏度敏感的分子探针应用于生物体系。

发明内容

针对现有技术不足，本发明提供一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用，在体外条件下，体系微黏度的增加能够有效激活探针的荧光信号，且不受其他生物化学因素的干扰，实现荧光信号从“OFF”到“ON”的转变，利用探针对体系黏度激活响应的特点，进行细胞内共聚焦荧光成像，实现对药物诱导细胞线粒体功能障碍造成黏度变化的动态监测。

为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：

一种新型黏度响应型线粒体靶向荧光探针，其具有如下化学结构式：

所述荧光探针的制备方法为：

(1)甲基苯并噻唑与碘甲烷发生甲基化反应，得到化合物，称为M1；

(2)化合物M1与4-(N,N-二甲基)-2-羟基苯甲醛在弱碱存在下发生缩合反应，得到所述黏度响应型线粒体靶向荧光探针，称为BN(具体BN合成路径见图1)。

优选的，步骤(1)中，甲基苯并噻唑与碘甲烷的甲基化反应在丙酮溶剂中进行，甲基苯并噻唑与碘甲烷的摩尔比为1∶3。

优选的，甲基化反应在氮气保护下进行，甲基化反应为回流反应6h。

优选的，步骤(2)中，化合物M1与4-(N,N-二甲基)-2-羟基苯甲醛反应在乙腈/甲醇的混合溶剂中进行，且弱碱为哌啶，作为催化剂使用，化合物M1与4-(N,N-二甲基)-2-羟基苯甲醛的摩尔比为1：1。

优选的，缩合反应在氮气保护下进行，缩合反应为加热回流反应12h。

所述新型黏度响应型线粒体靶向荧光探针可在体外检测黏度/微黏度、生物体内检测黏度/微黏度、制备线粒体染色试剂盒中、细胞共聚焦荧光成像中应用。

优选的，所述荧光探针在细胞共聚焦荧光成像中的应用中具体应用方式包括：将所述黏度响应型线粒体靶向荧光探针溶液加入细胞中，培养孵化后吸去培养液，然后加入缓冲液，进行荧光检测，完成细胞成像。其原理为使用一种常见的大分子载体类药物制菌霉素，通过改变细胞内线粒体结构引起线粒体肿胀，造成线粒体功能障碍。由于此过程明显导致线粒体黏度增加，因此，使用探针BN对药物诱导细胞线粒体功能障碍造成黏度变化的动态监测。

本发明提供一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针及其制备方法和应用，与现有技术相比优点在于：

(1)本发明中设计合成了一种新型黏度响应型线粒体靶向荧光探针，合成原料易得，方法简便；

(2)本发明中目标探针随着体系微黏度的增加，荧光信号逐渐从“OFF”到“ON”的转变，具有激活型响应的特点；

(3)本发明中目标探针对体系微黏度的响应不受pH等因素的干扰；

(4)本发明中目标探针是离子型小分子探针，具有良好的水溶性和生物相容性，有利于进行后续生物学应用。

(5)本发明中目标探针能够特异性靶向细胞内线粒体，同时能够监测药物诱导细胞内线粒体功能障碍导致的黏度异常。

附图说明：

图1为实施例1中黏度响应型线粒体靶向荧光探针BN的合成示意图。

图2为实施例2中目标探针BN在不同溶剂中的紫外可见吸收光谱。

图3为实施例3中目标探针BN在不同甘油/PBS比例下的荧光发射光谱及线性分析。

图4为实施例4中目标探针BN在不同pH条件下的荧光光谱。

图5为实施例5中目标探针BN的细胞毒性测试及光稳定性测试。

图6为实施例6中目标探针BN的活细胞共聚焦荧光成像。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

黏度响应型线粒体靶向荧光探针的合成：

(1)氮气保护下，50mL圆底烧瓶中加入甲基苯并噻唑0.74g(149.21g/mol,5.0mmol)、碘甲烷2.12g(141.94g/mol,15.0mmol)以及25mL丙酮作为溶剂，混合液磁力搅拌并回流6h。反应完成，冷却至室温，析出固体，抽滤，适量正己烷洗三遍，真空干燥，产物为M1(1.13g，产率：78％)。

(2)氮气保护下，100mL圆底烧瓶中加入M1(1.45g，5.0mmol)、4-(N,N-二甲基)-2-羟基苯甲醛(0.83g，5.0mmol)以及60mL乙腈和甲醇的混合溶剂(体积比1:1)，并加入适量哌啶作为催化剂，混合液磁力搅拌并回流12h。反应完成，旋干溶剂，粗产物柱层析分离纯化(二氯甲烷：甲醇＝10：1，v/v)，产物为浅红色固体(1.18g，产率：54％)。

实施例2：

目标探针BN的溶剂化紫外可见吸收光谱

将上述实施例1中获得的目标探针BN溶于DMSO溶液中，配置成浓度为1×10^-3mol/L的母液。取50μL母液分别加入4500μL的色谱纯溶剂中，按溶剂极性由低到高的顺序为：二氯甲烷，四氢呋喃，乙酸乙酯，乙腈和二甲基亚砜。取适量上述样品于1cm的石英比色皿进行紫外可见吸收光谱测试，测试仪器使用SPECORD S600分光光度计。

检测结果如图2所示，结果表明，目标探针BN在不同极性溶剂中的最大吸收波长在530nm附近，值得注意是的，BN在不同极性的溶剂中，表现出微弱的溶剂化效应，表明化合物BN分子基态与激发态的极性相对较小，因此跃迁能级受溶剂极性影响较弱。

实施例3：

目标探针BN在不同甘油/PBS比例下的荧光发射光谱及线性分析

将上述实施例1获得的目标探针BN溶于DMSO溶液中，配置成浓度为1×10^-3mol/L的母液。

随后，分别配置不同甘油/PBS(V：V)比例的混合溶液，甘油的浓度梯度分别为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和99％，分别取198μL上述混合溶液加入离心管中，随后加入2μL 1×10^-3mol/L的目标探针BN，最终目标探针的浓度为1×10-5mol/L。

取适量上述样品于1cm的石英比色皿进行荧光发射光谱测试，测试仪器使用日立F-7000荧光分光光度计。对于探针所在体系黏度与荧光强度关系的分析中，做出体系黏度的对数Logη与荧光强度的比值I/I0的散点图，分析存在线性关系的黏度范围。

结果如图3所示：随着甘油比例的逐渐增高，荧光强度逐渐增强。

当甘油比例在0％～50％范围时，荧光强度数值增加不明显，当甘油比例在60％～99％范围时，荧光强度数值显著增强。因此，我们可以认为目标探针BN在低黏度范围内，荧光强度随黏度增加较为缓慢，而在高黏度范围内，荧光强度随黏度增加呈现快速增长。值得注意的是，当甘油比例从0％增加到99％时，在601nm处的荧光强度数值由30.3a.u.增加至3696a.u.，增加了121倍。

基于上述探针的荧光强度与所在体系黏度关系的分析，如图3(b)所示，我们做出黏度的对数Logη与比例荧光强度I/I0的散点图，结果显示，在甘油比例为0％～50％范围时，探针的比例荧光强度I/I0与黏度的对数Logη呈现良好的线性关系(R²＝0.960，斜率＝9.308)，表明目标探针BN能够对低粘度体系进行较好的定性甚至是定量分析。

实施例4：

目标探针BN在不同pH条件下的荧光光谱

随后，配置不同pH梯度的PBS溶液，pH值范围为2～11，分别取198μL不同pH值的PBS溶液于离心管中，随后加入2μL 1×10^-3mol/L的目标探针BN，最终目标探针的浓度为1×10^-5mol/L。取适量上述样品于1cm的石英比色皿进行荧光发射光谱测试，测试仪器使用日立F-7000荧光分光光度计。

检测结果如图4所示：在pH数值为2～11范围内，目标探针BN的荧光强度随pH值变化不明显，即探针在强酸/强碱条件下较为稳定，位于601nm处的最佳发射波长与中性pH体系相当，表明目标探针BN具有较好的pH稳定性。

实施例5

目标探针BN的细胞毒性测试及光稳定性测试：

1、细胞毒性实验：

将处于对数生长期的HepG2细胞接种到平底的96孔板中(～1×104个/孔)，在含5％CO2的37℃恒温培养箱中孵育24h。使用新鲜DMEM培养基将探针BN稀释至所需浓度(0、10、20、40、80和160μM)，吸去96孔板中原有培养基，分别加入100μL不同浓度培养基稀释的探针溶液，继续37℃孵育24h。

探针孵育完成，吸去原有培养基，每孔中使用100μL冷的PBS洗涤两遍，再分别加入100μL培养基稀释的MTT溶液(0.5mg/mL)，在5％CO2的37℃恒温培养箱中孵育4h。

孵育完成，小心吸去96孔板中的溶液，并加入100μL的二甲基亚砜溶液，常温震荡5min后使用酶标仪进行测定。以同一实验条件下未经探针处理的细胞群体的吸光度作为参比，利用公式计算细胞成活率。实验重复测定三次。

如图3(a)所示，随着甘油比例的逐渐增高，荧光强度逐渐增强。当甘油比例在0％～50％范围时，荧光强度数值增加不明显，当甘油比例在60％～99％范围时，荧光强度数值显著增强。因此，我们可以认为目标探针BN在低黏度范围内，荧光强度随黏度增加较为缓慢，而在高黏度范围内，荧光强度随黏度增加呈现快速增长。值得注意的是，当甘油比例从0％增加到99％时，在601nm处的荧光强度数值由30.3a.u.增加至3696a.u.，增加了121倍。

2、光稳定性实验：

将上述获得的目标探针BN溶于DMSO溶液中，配置成浓度为1×10^-3mol/L的母液，随后，取2μL的上述母液加入含198μL的PBS溶液的离心管中。使用标准的光漂白方法对待测液进行持续1min的激光辐照，连续照射10次，使用日立F-7000荧光分光光度计记录10次的荧光强度变化。

如图5(b)所示，实验结果表明：随着激光照射时间的增长，荧光强度总体呈现略有下降的趋势，但仍保持在初始荧光强度的80％，具有较好的光稳定性。

实施例6：

目标探针BN的共聚焦荧光成像

1、在共定位实验中，将上述获得的目标探针BN溶于含1％DMSO的PBS溶液中，加入到细胞富集程度达60％的HepG2细胞培养皿中(5μM)，随后将上述培养皿置于恒温培养箱孵育30min。

孵育完成后，吸去培养液，并用PBS缓冲液洗两遍(2×1mL)，并加入1μM线粒体商业染料Mito-Tracker DeepRed，继续孵育15min，孵育完成后使用PBS缓冲液洗两遍(2×1mL)，最后将每个孔注入1mL的PBS缓冲液进行共聚焦荧光成像。

如图6(a)所示，实验结果显示：探针BN能够很好的穿透细胞膜且信号区域集中在胞质，共定位实验结果显示目标探针BN能够对线粒体进行着色，原因可能是由于探针主体结构带1个单位正电荷，而线粒体膜电位带负电，正负电荷相互吸引，导致探针能够很好的着色线粒体结构。

2、在制菌霉素诱导黏度增加实验中，将上述获得的目标探针BN溶于含1％DMSO的PBS溶液中，加入到细胞富集程度达60％的HepG2细胞培养皿中(5μM)，或加入到使用10μM制菌霉素预处理30min的HepG2细胞培养皿中(5μM)。随后，将上述培养皿置于恒温培养箱孵育30min，吸去培养液，并用PBS缓冲液洗两遍(2×1mL)，最后将每个孔注入1mL的PBS缓冲液进行共聚焦荧光成像。

如图6(b)所示，实验结果显示，与没有进行制菌霉素预处理的对照组相比，实验组显示出明显增强的荧光信号，表明探针BN确实能够监测活细胞中线粒体的黏度异常。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针，其特征在于，所述黏度响应型线粒体靶向荧光探针的化学结构式为：

2.一种如权利要求1所述的黏度响应型线粒体靶向荧光探针的制备方法，其特征在于，所述荧光探针的制备方法包括以下步骤：

(1)采用甲基苯并噻唑与碘甲烷发生甲基化反应，得到化合物；

(2)将上述化合物与4-(N,N-二甲基)-2-羟基苯甲醛在催化剂的存在下发生缩合反应，得到目标探针。

3.根据权利要求2所述的一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中甲基化反应在丙酮溶剂中进行，且甲基苯并噻唑与碘甲烷的摩尔比为1∶3。

4.根据权利要求2所述的一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中甲基化反应在氮气保护下进行，甲基化反应为回流反应6h。

5.根据权利要求2所述的一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中的缩合反应在甲醇/乙腈的混合溶剂中进行，且化合物M1与4-(N,N-二甲基)-2-羟基苯甲醛的摩尔比为1：1。

6.根据权利要求2所述的一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针的制备方法，其特征在于：所述催化剂为弱碱，且弱碱为哌啶。

7.根据权利要求2所述的一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针的制备方法，其特征在于：所述缩合反应在氮气保护下进行，缩合反应为加热回流反应12h。

8.如权利要求1或2中任意一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针的应用包括：

Ⅰ、荧光探针在体外检测黏度/微黏度的应用；

Ⅱ、荧光探针在生物体内检测黏度/微黏度的应用；

Ⅲ、荧光探针在制备线粒体染色试剂盒中的应用；

Ⅳ、荧光探针在细胞共聚焦荧光成像中的应用。

9.根据权利要求8所述的一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针的应用，其特征在于，所述荧光探针在细胞共聚焦荧光成像中的应用中具体应用方式包括以下步骤：

①将所述黏度响应型线粒体靶向荧光探针溶液加入细胞中，培养孵化后吸去培养液；

②向其中加入缓冲液，进行荧光检测，完成细胞成像。

10.根据权利要求9所述的一种黏度响应型线粒体靶向荧光探针的应用，其特征在于：所述黏度响应型线粒体靶向荧光探针溶液为含0.1％的DMSO水溶液，使用的细胞为人源肝癌HepG2细胞。