CN111333605B - 一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶ⅸ荧光探针 - Google Patents

一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶ⅸ荧光探针 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ荧光探针，该探针基于罗丹明6G荧光母体、连接苯磺胺靶向基团，其结构式如(1)所示，该荧光探针有着高度的细胞膜非渗透性，同时利用苯磺胺与人碳酸酐酶Ⅸ中的锌原子快速配位结合，实现了细胞膜碳酸酐酶Ⅸ的免洗成像。其结构简单、原料廉价易得、合成便捷，在细胞膜碳酸酐酶Ⅸ领域的研究中有着广阔前景。

Description

一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ荧光探针
技术领域
本发明属于荧光探针领域，具体涉及一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ荧光探针。
背景技术
碳酸酐酶是一含锌金属酶，通过催化CO2水化反应及某些脂、醛类水化反应，参与多种离子交换，维持机体内环境稳态，在人体生命活动过程中起着关键性作用。而碳酸酐酶Ⅸ是其家族中一种重要的亚型，在直接由于缺氧导致的肿瘤中过量表达，与肿瘤细胞增殖、细胞黏附、肿瘤进展相关，已被众多科研工作者证实可以作为乏氧肿瘤的标志物。目前关于碳酸酐酶的检测，主要通过免疫印迹法与质谱法，二者均需要进行细胞的裂解，不适合活体细胞的实时监测。
荧光成像技术作为新兴的分析技术，具有高灵敏度和高选择性的优异特点，且可进行实时观察、对生物影响较小，在生物学、医学和环境科学等领域已得到广泛应用。应用荧光成像技术对碳酸酐酶Ⅸ的可视化检测，可以准确、方便、及时地提供人体乏氧肿瘤的诊断信息，为肿瘤治疗带来巨大便利。然而，目前商业化的碳酸酐酶Ⅸ的荧光探针匮乏，不能为乏氧肿瘤的诊断提供有力工具。因此，开发设计可实时监测细胞膜表面碳酸酐酶Ⅸ的荧光探针具有重要意义。
发明内容
本发明提供一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ荧光探针，该探针拥有光稳定性高、亮度高等优势。
本发明提供一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ荧光探针，该探针以罗丹明6G为荧光母体，苯磺胺为识别基团，具体的化学结构如下：
Figure BDA0001910556460000021
其中：n＝0,1,2或3。
该荧光探针具有高度的非渗透性，难以进入细胞，同时通过苯磺胺基团非特异性与人碳酸酐酶Ⅸ中的锌原子配位结合，从而在细胞膜上聚集，实现快速、清晰的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ的成像的目的。
一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ荧光探针的合成方法，其合成路线如下：
Figure BDA0001910556460000022
具体合成步骤如下：
(1)中间体罗丹明6G-羧酸的合成
罗丹明6G溶于乙醇中，加入强碱试剂的水溶液，回流反应5-10h后，减压除去有机溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比20-5:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得到中间体；
其中，罗丹明6G与强碱的质量比为1:0.2-0.4，水与乙醇的体积比为1:5-8，罗丹明6G与乙醇的质量与体积比为1:20-40g/mL；
(2)中间体罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯的合成
将罗丹明6G-羧酸，N-羟基琥珀酰亚胺，缩合试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐依次加入到二氯甲烷中，室温搅拌10-16h；减压除去溶剂得粗产品；
其中，罗丹明6G-羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:0.2-0.4:0.6-0.8，罗丹明6G-羧酸与二氯甲烷的质量与体积比为1:40-60g/mL；
(3)中间体罗丹明6G-甲胺烷基酸得合成
将罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯粗产品、甲胺烷基酸盐酸盐、碳酸钾依次加入到乙腈中，室温搅拌过夜；减压除去溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比50-10:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得紫色固体；
其中，罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯与甲胺烷基酸盐酸盐、碳酸钾的质量比为1:0.3-0.6:0.2-0.4，罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯与乙腈的质量与体积比为10-25:1mg/mL；
(4)探针的合成
将罗丹明6G-甲胺烷基酸、对胺甲基苯磺酸盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、碳酸钾依次加入到N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌两天；减压除去溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比40-3:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得紫色固体；
其中，罗丹明6G-甲胺烷基酸与对胺甲基苯磺酸盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、碳酸钾的质量比为1：0.4-0.6：0.4-0.6：0.3-0.5:1-2，罗丹明6G-甲胺烷基酸的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20：1mg/mL。
本发明提供了一种用于识别细胞膜上人碳酸酐酶Ⅸ的荧光探针，该荧光探针具有光稳定高、亮度高等优势，可以进行快速、清晰的乏氧肿瘤细胞膜成像。
本发明的提供一种用于识别人碳酸酐酶Ⅸ的小分子细胞膜蛋白探针的合成方法，该方法具有原料低廉、操作简便等特点。
本发明的荧光探针有着高度的细胞膜非渗透性，同时利用苯磺胺与人碳酸酐酶Ⅸ中的锌原子快速配位结合，实现了细胞膜碳酸酐酶Ⅸ的免洗成像。其结构简单、原料廉价易得、合成便捷，在细胞膜碳酸酐酶Ⅸ领域的研究中有着广阔前景。
附图说明
图1实施例1得到的探针Rho6G-SO2NH2高分辨质谱；
图2实施例1得到的探针Rho6G-SO2NH2在DMSO中的紫外吸收图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；
图3实施例1得到的探针Rho6G-SO2NH2在DMSO中的荧光发射图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μM；
图4实施例1得到的探针Rho6G-SO2NH2在转染人碳酸酐酶Ⅸ的细胞成像图，染料成像浓度为0.5μM；
图5实施例1得到的探针Rho6G-SO2NH2在转染人碳酸酐酶Ⅸ成像后，加入碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺成像图，抑制剂孵育时间1min。
具体实施方法
实施例1
细胞膜人碳酸酐酶Ⅸ的小分子荧光探针Rho6G-SO2NH2的合成方法。
中间体罗丹明6G-羧酸的合成：
Figure BDA0001910556460000051
将1g的罗丹明6G溶于30mL乙醇中，300mg的氢氧化钠溶于5mL水中后缓慢加入到反应混合物中，加热搅拌回流。6h后，点板监测，待反应原料反应完全，停止反应。旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离，用二氯甲烷:甲醇＝5：1(体积比)作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫色固体700mg，产率80％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ8.22(d,J＝6.4Hz,1H),7.80(m,2H),7.36(d,J＝6.8Hz,1H),6.89(d,J＝10.4Hz,4H),3.50(q,J＝7.2Hz,4H),2.15(s,6H),1.35(t,J＝6.8Hz,6H).
中间体罗丹明6G-丁二酰亚胺羧酸酯的合成：
Figure BDA0001910556460000052
称取500mg的罗丹明6G-羧酸和345mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐于25mL的二氯甲烷中，再加入N-羟基丁二酰亚胺125mg，在室温下搅拌12h。停止反应，旋干溶剂得粗产品。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.27(d,J＝7.7Hz,1H),7.91(t,J＝6.9Hz,1H),7.84(t,1H),7.79(s,1H),7.46(d,J＝7.5Hz,1H),6.93(s,1H),6.78(s,2H),3.53–3.46(m,J＝13.5,6.8Hz,2H),2.50(s,3H),2.10(s,2H),1.27(t,J＝7.2Hz,3H).
中间体罗丹明6G-甲胺丁酸的合成：
Figure BDA0001910556460000061
称取288mg的罗丹明6G-丁二酰亚胺羧酸酯和80mg碳酸钾溶解到15mL的乙腈中，再向混合液中加入4-甲氨基丁酸盐酸盐130mg，室温搅拌过夜。减压除去有机溶剂，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝40-10：1(体积比)为洗脱剂，减压除去有机溶剂得紫色固体199mg，产率69％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.88(s,2H),7.77–7.70(m,2H),7.69–7.64(m,1H),7.55–7.49(m,1H),6.94(s,2H),6.86(s,2H),3.48(d,J＝6.9Hz,4H),3.14–3.06(m,2H),2.90(s,3H),2.15(s,6H),1.68(t,J＝7.3Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,8H).
荧光探针Rho6G-SO2NH2的合成：
Figure BDA0001910556460000062
依次称取羧基罗丹明6G-甲胺丁酸103mg，对胺甲基苯磺胺盐酸盐44mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐46mg，1-羟基苯并三唑32mg，碳酸钾110mg，溶于DMF中室温搅拌两天。减压除去DMF后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝30-5：1为洗脱剂，旋干溶剂得紫色固体29mg，产率20％。其核磁谱图氢谱数据如下：
1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.88(d,J＝8.3Hz,2H),7.78(dd,J＝5.6,3.3Hz,2H),7.69(dd,J＝5.6,3.3Hz,1H),7.53(dd,J＝5.7,3.2Hz,2H),7.40(d,J＝8.2Hz,2H),7.34(s,2H),7.05(s,2H),6.87(s,2H),4.38(s,2H),3.50(dd,J＝14.5,7.3Hz,4H),3.37(s,1H),3.29–3.14(m,5H),2.96(s,2H),2.19(s,2H),1.82(t,J＝7.5Hz,2H),1.44–1.32(m,J＝13.1,5.8Hz,8H).
实施例1中得到的探针Rho6G-SO2NH2的高分辨质谱如图1所示，具体数据为：高分辨质谱理论值C38H43N6O5S[M+H]+682.2985,实测值682.3088.
经检测，其结构如上式Rho6G-SO2NH2所示，可以进行细胞膜人碳酸酐酶Ⅸ快速、免洗成像，其光性能如下：
染料分子Rho6G-SO2NH2在二甲亚砜中的吸收与发射光谱测试。取实施例1中得到的罗丹明类荧光探针Rho6G-SO2NH2，溶解于DMSO中配置成2mM的母液。取20μL的母液溶于4mLDMSO溶液中，配置成10μM的测试液，进行吸收和发射光谱测试。
Rho6G-SO2NH2在二甲亚砜中的吸收与发射谱图分别如图2、图3所示：图2和图3分别为实施例1中得到的荧光染料Rho6G-SO2NH2在DMSO中的吸收和荧光发射图，其中吸收为539nm，发射波长为568nm。
实施例2
细胞膜人碳酸酐酶Ⅸ的小分子荧光探针Rho6G-SO2NH2的合成方法。
中间体罗丹明6G-羧酸的合成：
Figure BDA0001910556460000071
将1g的罗丹明6G溶于20mL乙醇中，200mg的氢氧化钠溶于5mL水中后缓慢加入到反应混合物中，加热搅拌回流。5h后，点板监测，待反应原料反应完全，停止反应。旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离，用二氯甲烷:甲醇＝5：1(体积比)作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫色固体600mg，产率69％。
中间体罗丹明6G-丁二酰亚胺羧酸酯的合成：
Figure BDA0001910556460000081
称取500mg的罗丹明6G-羧酸和300mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐于20mL的二氯甲烷中，再加入N-羟基丁二酰亚胺100mg，在室温下搅拌10h。停止反应，旋干溶剂得粗产品。
中间体罗丹明6G-甲胺丁酸的合成：
Figure BDA0001910556460000082
称取200mg的罗丹明6G-丁二酰亚胺羧酸酯和40mg碳酸钾溶解到10mL的乙腈中，再向混合液中加入4-甲氨基丁酸盐酸盐60mg，室温搅拌过夜。减压除去有机溶剂，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝40-10：1(体积比)为洗脱剂，减压除去有机溶剂得紫色固体120mg，产率60％。
荧光探针Rho6G-SO2NH2的合成：
Figure BDA0001910556460000091
依次称取羧基罗丹明6G-甲胺丁酸100mg，对胺甲基苯磺胺盐酸盐40mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐40mg，1-羟基苯并三唑30mg，碳酸钾100mg，溶于5mL的DMF中室温搅拌两天。减压除去DMF后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝30-5：1(体积比)为洗脱剂，旋干溶剂得紫色固体25mg，产率17％。
经检测，其结构如上式Rho6G-SO2NH2所示，可以进行细胞膜人碳酸酐酶Ⅸ快速、免洗成像，其光性能如下：
Rho6G-SO2NH2在二甲亚砜中的吸收与发射波长分别为：吸收波长为539nm，发射波长为568nm。
实施例3
细胞膜人碳酸酐酶Ⅸ的小分子荧光探针Rho6G-SO2NH2的合成方法。
中间体罗丹明6G-羧酸的合成：
Figure BDA0001910556460000092
将1g的罗丹明6G溶于40mL乙醇中，400mg的氢氧化钠溶于5mL水中后缓慢加入到反应混合物中，加热搅拌回流。6h后，点板监测，待反应原料反应完全，停止反应。旋蒸除去溶剂，硅胶柱分离，用二氯甲烷:甲醇＝5：1(体积比)作为洗脱剂，减压除去溶剂得紫色固体672mg，产率77％。
中间体罗丹明6G-丁二酰亚胺羧酸酯的合成：
Figure BDA0001910556460000101
称取500mg的罗丹明6G-羧酸和400mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐于30mL的二氯甲烷中，再加入N-羟基丁二酰亚胺200mg，在室温下搅拌16h。停止反应，旋干溶剂得粗产品。
中间体罗丹明6G-甲胺丁酸的合成：
Figure BDA0001910556460000102
称取200mg的罗丹明6G-丁二酰亚胺羧酸酯和80mg碳酸钾溶解到20mL的乙腈中，再向混合液中加入4-甲氨基丁酸盐酸盐120mg，室温搅拌过夜。减压除去有机溶剂，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝40-10：1(体积比)为洗脱剂，减压除去有机溶剂得紫色固体142mg，产率71％。
荧光探针Rho6G-SO2NH2的合成：
Figure BDA0001910556460000103
依次称取羧基罗丹明6G-甲胺丁酸100mg，对胺甲基苯磺胺盐酸盐60mg，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐60mg，1-羟基苯并三唑50mg，碳酸钾200mg，溶于20mL的DMF中室温搅拌两天。减压除去DMF后，硅胶柱分离，用二氯甲烷：甲醇＝30-5：1(体积比)为洗脱剂，旋干溶剂得紫色固体33mg，产率23％。
经检测，其结构如上式Rho6G-SO2NH2所示，可以进行细胞膜人碳酸酐酶Ⅸ快速、免洗成像，其光性能如下：
Rho6G-SO2NH2在二甲亚砜中的吸收与发射波长分别为：吸收波长为539nm，发射波长为568nm。
实施例4
Rho6G-SO2NH2对活细胞染色后荧光共聚焦成像测试。取实施例1得到的荧光探针Rho6G-SO2NH2加入转染有细胞膜碳酸酐酶Ⅸ蛋白的HeLa细胞培养皿中，染料终浓度为0.5μM。孵育5min后进行共聚焦成像。在上述的培养皿中加入碳酸酐酶的竞争性抑制剂乙酰唑胺，终浓度为0.5μM。孵育1min后进行共聚焦显微镜成像。
Rho6G-SO2NH2对活细胞染色5min后荧光共聚焦成像如图4所示：荧光探针Rho6G-SO2NH2在转染人碳酸酐酶Ⅸ的细胞膜成像图，可以清晰的看见细胞膜荧光成像图。
Rho6G-SO2NH2对活细胞染色5min后加入抑制剂乙酰唑胺的荧光共聚焦成像如图5所示：荧光探针Rho6G-SO2NH2在转染人碳酸酐酶Ⅸ成像后，加入碳酸酐酶抑制剂乙酰唑胺后细胞成像图，明显发现细胞膜表面的荧光探针分子被抑制剂竞争下去，不再有清晰的细胞膜荧光成像，证实该荧光探针能够进行碳酸酐酶Ⅸ蛋白的细胞膜荧光成像。

Claims (3)

1.一种高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ荧光探针，其特征在于该探针的结构如下所示：
Figure FDA0003597938650000011
其中：n＝0,1,2或3。
2.一种如权利要求1所述高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ荧光探针的合成方法，其特征如下步骤所示：
(1)中间体罗丹明6G-羧酸的合成
罗丹明6G溶于乙醇中，加入强碱试剂的水溶液，回流反应5-10h后，减压除去有机溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比20-5:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得到中间体；
其中，罗丹明6G与强碱的质量比为1:0.2-0.4，水与乙醇的体积比为1:5-8，罗丹明6G与乙醇的质量与体积比为1:20-40g/mL；
(2)中间体罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯的合成
将罗丹明6G-羧酸，N-羟基琥珀酰亚胺，缩合试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐依次加入到二氯甲烷中，室温搅拌10-16h；减压除去溶剂得粗产品；
其中，罗丹明6G-羧酸与N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的质量比为1:0.2-0.4:0.6-0.8，罗丹明6G-羧酸与二氯甲烷的质量与体积比为1:40-60g/mL；
(3)中间体罗丹明6G-甲胺烷基酸的合成
将罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯粗产品、甲胺烷基酸盐酸盐、碳酸钾依次加入到乙腈中，室温搅拌过夜；减压除去溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比50-10:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得紫色固体；
其中，罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯与甲胺烷基酸盐酸盐、碳酸钾的质量比为1:0.3-0.6:0.2-0.4，罗丹明6G-琥珀酰亚胺羧酸酯与乙腈的质量与体积比为10-25:1mg/mL；
(4)探针的合成
将罗丹明6G-甲胺烷基酸、对胺甲基苯磺酸盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、碳酸钾依次加入到N,N-二甲基甲酰胺中，室温搅拌两天；减压除去溶剂，硅胶柱分离，洗脱剂为体积比40-3:1的二氯甲烷和甲醇，减压除去溶剂后得紫色固体；
其中，罗丹明6G-甲胺烷基酸与对胺甲基苯磺酸盐酸盐、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、碳酸钾的质量比为1：0.4-0.6：0.4-0.6：0.3-0.5:1-2，罗丹明6G-甲胺烷基酸的质量与N,N-二甲基甲酰胺的体积比为10-20：1mg/mL。
3.根据权利要求2所述高亮度、高稳定性的细胞膜碳酸酐酶Ⅸ荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤(1)中强碱试剂为KOH、NaOH、LiOH，反应时间以点板检测为基准，直到原料反应完全，停止反应。
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