CN115650897A - 一种同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针，所述荧光探针的制备方法包括：将化合物1、化合物2a‑e溶解于乙酸酐中后加入乙酸钠或将化合物1、化合物2a‑e溶解于乙醇中后加入吡啶，搅拌反应后冷却至室温，将反应液经真空旋转蒸发仪旋干，经纯化，即得所述同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针。与现有相关探针相比，本发明制得的探针可以实现在活细胞中用两种荧光颜色同时检测Cys和线粒体粘度，并且该探针具有显色强、操作简单、细胞毒性低的特点，有望在同时研究Cys和线粒体粘度的相关疾病和生理过程中得到广泛应用。

Description

一种同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于有机小分子荧光探针制备技术领域，具体涉及一种同时检测铁死亡过程中半胱氨酸和线粒体粘度变化的荧光探针及其制备方法和应用。

背景技术

半胱氨酸(Cys)是一种含巯基的小分子氨基酸，在许多生理和病理过程中起着关键作用。正常水平的Cys(30-200μM)维持各种蛋白质和主要抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)的合成，并在人类代谢中作为硫化物的来源。然而，过量的Cys与类风湿性关节炎、帕金森症和阿尔茨海默症等疾病有关。另一方面，Cys的缺乏会导致生长迟缓、水肿、肝损伤、皮肤损伤和虚弱等。已有报道表明，通过调控Cys的水平可以诱导细胞发生铁死亡。因此，准确评价内源性Cys水平，对于了解其在铁死亡和相关疾病中的生理功能具有特别重要的作用。

其次，细胞内粘度被认为是各种生物系统中一个重要的微环境参数。在生物体中，它决定了物种扩散速率、化学信号传递速率和生物分子间的相互作用。研究表明，病变细胞的细胞质粘度(140cP)明显高于健康细胞(1.2cP)。线粒体作为真核细胞的动力车间，线粒体基质中存在高密度酶和蛋白质，当细胞内粘度发生异常变化时，这些蛋白质的扩散被嵴严重抑制，从而影响线粒体的网状形成和代谢物的扩散速率，导致多种疾病如阿尔茨海默病、动脉粥样硬化、糖尿病和癌症的发生。研究表明，线粒体在半胱氨酸剥夺诱导的铁死亡中扮演重要角色，铁死亡作为一种新的调控细胞死亡的形式，揭示该过程线粒体粘度是否变化将有助于深入了解铁死亡。考虑到生命活动过程中多个分子事件经常同时发生，因此，开发一种可靠的荧光探针以同时揭示铁死亡过程中Cys和线粒体粘度的关系，对铁死亡及其发展机制的研究具有十分重要意义。

荧光技术由于简单、方便、高分辨率等独特的优势，已成为生命科学和医学研究领域的重要工具。近年来已经开发出许多可以检测Cys或粘度的单个荧光探针，但能实现对Cys和粘度同时检测的单一荧光探针还很稀少。原则上，使用两个探针可以同时实现双分析物的视觉跟踪。然而，两种探针的引入使用将涉及光谱重叠、反应交叉、毒性增大等问题，不能真正实现商业应用。

基于此，开发可同时检测Cys和线粒体粘度的单分子荧光探针，实现同时区分和双色成像是现阶段亟待解决的技术难题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种同时检测铁死亡过程中半胱氨酸和线粒体粘度变化的荧光探针，本发明利用线粒体膜电位为负的特点，设计一类带正电荷的有机小分子，通过对分子转子的调控，同时调控探针分子的亲核性，以同时实现粘度和Cys的灵敏性响应。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针，其结构式为：

本发明的目的之二在于提供一种上述荧光探针的制备方法，其合成路线如下：

其中，化合物2a-e结构式为：

进一步的，化合物1的合成步骤为：用滴液漏斗将POCl₃滴入超干DMF中，在0℃搅拌反应30分钟。随后，将超干DMF溶解的6-N,N-二甲基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮缓慢加入上述混合液中，100℃条件下加热反应2小时。反应结束后，待反应液冷却至室温，将反应液缓慢倒入饱和K₂CO₃的冰水中，静置30分钟析出固体。最后，将上述混合液进行真空抽滤处理，得到浅黄色的化合物1固体。化合物1直接用于下一步反应，无需纯化。

进一步的，化合物1的合成中，超干DMF和POCl₃的体积用量比为2:1，6-N,N-二甲基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮与POCl₃摩尔用量比为1:4。

进一步的，式FMCV-1a-e的合成包括如下步骤：将化合物1分别和化合物2a-e溶解于乙酸酐中，随后加入乙酸钠，在80℃搅拌条件下反应2小时；冷却至室温，将反应液经真空旋转蒸发仪旋干，经纯化，即得所述同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针。

进一步的，式FMCV-2a-e的合成包括如下步骤：将化合物1分别和化合物2a-e溶解于乙醇中，随后加入吡啶，在80℃搅拌条件下反应4小时；冷却至室温，将反应液经真空旋转蒸发仪旋干，经纯化，即得所述同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针。

进一步的，式FMCV-1a-e的合成中，化合物1与化合物2a或2b或2c或2d或2e的摩尔用量比为1:1，乙酸钠与化合物2a或2b或2c或2d或2e的摩尔用量比为1:1，乙酸酐与乙酸钠的用量比为8mL:1mmol。

进一步的，式FMCV-2a-e的合成中，化合物1与化合物2a或2b或2c或2d或2e的摩尔用量比为1:2，乙醇与吡啶的用量体积比例为50:1。

进一步的，式FMCV-1a-e的合成中，纯化处理的步骤为：以体积比为50:1的二氯甲烷与甲醇混合液为洗脱剂，用200-300目的硅胶层析柱进行纯化。

进一步的，式FMCV-2a-e的合成中，纯化处理的步骤为：以体积比为25:1的二氯甲烷与甲醇混合液为洗脱剂，用200-300目的硅胶层析柱进行纯化。

本发明还要求保护上述方法制备得到的荧光探针在检测铁死亡过程中半胱氨酸和线粒体粘度变化的应用。

进一步的，所述应用包括如下步骤：

(1)将制备得到的荧光探针溶于甲醇或二甲基亚砜溶剂，制成探针母液；

(2)将步骤(1)所得的探针母液加入到待测液或生物样品中；

(3)将不同体积的Cys母液加到探针待测液中，用紫外分光光度计和荧光光谱仪观察荧光探针的紫外吸收光谱和荧光光谱变化；

(4)将探针母液加入不同粘度待测液中，用荧光光谱仪观察荧光探针的荧光光谱变化；

(5)将生物样品中的细胞与荧光探针共同孵育，然后在激光共聚焦显微镜下拍摄荧光图像，从而得到荧光探针在细胞内对Cys和线粒体粘度双通道成像的荧光图像。

进一步的，所述生物样品为活细胞。

进一步的，所述荧光光谱的变化指的是荧光光谱中，发射波长和荧光强度的变化，而探针在粘度更大的溶液中荧光强度更大。

进一步的，采用激光共聚焦显微镜观察荧光图像，使用激发波长为552nm和638nm的光源激发，收集的波段分别为565-630nm和650-750nm，短波长为Cys检测通道，长波长为粘度检测通道，探针定位于线粒体中，定位系数皮尔森系数在0.9以上。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用线粒体膜电位为负的特点，设计带正电荷的荧光探针，通过静电引力作用定位于线粒体，实现对线粒体粘度微环境的检测；同时，探针与Cys响应后与探针本身的荧光发射峰相差60nm,有效地避免了通道串扰问题，实现双通道检测Cys和粘度。

(2)本发明中申请人首次提出了一类能同时区分、双色成像Cys和粘度，揭示两者关系的单分子双色荧光探针，检测Cys在绿色通道，检测线粒体粘度在红色通道，克服了现有技术中双分析物检测精度不高、干扰多的特点；此外，本申请制备得到的探针已被应用于揭示铁死亡模型中两者之间的关系，具有良好的应用前景。

(3)本发明制备的荧光探针具有显色强、光稳定性强、特异性强，能实现线粒体的长期定位，从而实现Cys和线粒体粘度的精准检测。

(4)本发明提供的荧光探针毒性低、生物相容性好，可以减少两种探针进行双分析物检测的繁琐操作，并降低由此引起的细胞毒性。

(5)本发明提供的荧光探针的制备方法工艺简单，可操作性强。

附图说明

图1为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b的¹H NMR图谱；

图2为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b的¹³C NMR图谱；

图3为实施例2制备得到的荧光探针FMCV-2b的¹H NMR图谱；

图4为实施例2制备得到的荧光探针FMCV-2b的¹³C NMR图谱；

图5为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b对不同Cys浓度滴定的紫外和荧光谱图变化的测试结果；

图6为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b对不同粘度响应的荧光谱图变化的测试结果；

图7为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b对不同分析物响应的荧光谱图变化的测试结果；

图8为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b对不同极性溶剂响应的荧光谱图变化的测试结果；

图9为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b对不同pH响应的荧光谱图变化的测试结果；

图10为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b的细胞毒性测试结果；

图11为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b共定位实验验证结果；

图12为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b用于检测细胞中外源性Cys的荧光变化的测试结果；

图13为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b用于检测细胞内源性Cys中荧光变化的测试结果；

图14为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b用于检测制霉菌素和脂多糖诱导细胞粘度变化的测试结果；

图15为实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b用于索拉非尼诱导的细胞铁死亡中Cys和线粒体粘度的测试结果。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

除特殊说明外，本发明所使用的材料、试剂等均从商业途径得到。

实施例1

一种同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针，其结构式为：

本实施例还提供一种上述荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

取263mg的化合物1(分子式为C₁₄H₁₄ClNO₂，用量1mmol)，365mg的化合物2b(分子式为C₁₇H₂₀N⁺·I^-，用量1mmol)和82mg的乙酸钠(分子式为C₂H₃O₂Na，用量1mmol)置于圆底烧瓶中，随后加入8mL乙酸酐，在氮气保护、80℃条件下搅拌反应2h，反应完成后，冷却至室温，将反应液经真空旋转蒸发仪旋干，即得粗产物；随后以体积比为50:1的二氯甲烷与甲醇混合液为洗脱剂，用200-300目的硅胶层析柱对所得粗产物进行纯化，即得所述荧光探针FMCV-1b。

荧光探针FMCV-1b的¹H NMR谱如图1。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.01(s,1H),8.57(d,J＝15.8Hz,1H),8.46(d,J＝8.4Hz,1H),8.31(d,J＝9.0Hz,1H),8.23(d,J＝8.0Hz,1H),8.13(d,J＝11.0Hz,2H),7.80(t,J＝7.0Hz,1H),7.73(t,J＝7.2Hz,1H),7.20(d,J＝15.8Hz,1H),7.09(s,1H),4.77(q,6.8,2H),3.10(s,6H),3.04(t,J＝7.2Hz,2H),2.98(d,J＝7.3Hz,2H),2.01(s,6H),1.51(t,J＝7.2Hz,3H)。

荧光探针FMCV-1b的¹³C谱如图2。¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ189.54,181.28,155.38,147.24,145.61,142.31,138.85,138.84,133.59,133.08,131.70,130.55,129.50,128.95,127.70,127.28,123.58,122.78,122.10,115.76,113.60,112.02,55.42,53.87,44.60,27.64,26.70,23.72,14.26。

HRMS(ESI)Calcd for C₃₁H₃₂ClN₂O⁺([M]⁺):483.2198,Found,483.2193。

实施例2

一种同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针，其结构式为：

本实施例还提供一种上述荧光探针的制备方法，包括如下步骤：

取263mg的化合物1(分子式为C₁₄H₁₄ClNO₂，用量1mmol)，730mg的化合物2b(分子式为C₁₇H₂₀N⁺·I^-，用量2mmol)和12mL乙醇置于圆底烧瓶中，随后加入0.24mL吡啶，在氮气保护、80℃条件下搅拌反应4h，反应完成后，冷却至室温，将反应液经真空旋转蒸发仪旋干，即得粗产物；随后以体积比为25:1的二氯甲烷与甲醇混合液为洗脱剂，用200-300目的硅胶层析柱对所得粗产物进行纯化，即得所述荧光探针FMCV-2b。

荧光探针FMCV-2b的¹H NMR谱如图3。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.61(d,J＝15.8Hz,1H),8.46(dd,J＝16.3,7.9Hz,4H),8.35–8.30(m,3H),8.25(d,J＝8.0Hz,2H),8.17(dd,J＝9.0,3.1Hz,2H),7.85–7.80(m,2H),7.75(dd,J＝8.0,7.0Hz,2H),7.63(d,J＝16.1Hz,1H),7.26(s,1H),4.85(dd,J＝15.3,7.7Hz,4H),3.13(s,6H),3.11(d,J＝5.9Hz,2H),3.06–3.02(m,2H),2.04(d,J＝5.0Hz,12H),1.57(t,J＝4.9Hz,3H),1.54(t,J＝4.9Hz,3H)。

荧光探针FMCV-1b的¹³C谱如图4。¹³C NMR(101MHz,DMSO-d₆)δ182.36,181.41,157.19,150.74,146.99,145.36,141.70,139.06,138.87,138.82,138.66,133.68,133.63,131.63,130.78,130.66,130.57,129.00,128.96,127.81,127.67,127.27,124.55,123.63,123.53,123.43,117.26,113.69,113.65,112.90,110.93,54.14,53.99,45.10,31.76,29.49,26.66,26.32,14.34。

HRMS(ESI)Calcd for C₄₈H₅₀ClN₃ ²⁺([M]²⁺):351.6841,Found,351.6848。

实施例3

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b用于研究不同Cys浓度滴定的紫外和荧光谱图的变化情况。

测试方法如下：将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b溶于甲醇，制成探针母液，浓度为5mM；然后配制体积比为7:3的标准PBS缓冲液(pH 7.4)和甲醇混合液作为测试溶液，用该测试溶液进一步稀释探针，使其最终浓度为10μM；用二次蒸馏水配制终浓度为20mM的Cys母液，随后向探针待测液中加入不同体积的Cys，用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪测试探针与Cys响应后的吸收光谱和荧光发射光谱，测试结果见图5。

从图5的(a)中可以看到，探针FMCV-1b在560nm处有一个吸收峰，随着Cys的浓度从0增加到450μM，吸收峰从560nm蓝移至540nm；同时，吸光度在560nm处逐渐减少，在540nm处逐渐增大。从图5的(b)中可以看到，在580nm的激发下，随着Cys的浓度从0增加到450μM，705nm处的荧光强度降低，645nm处出现新的峰，并逐渐增强。

实施例4

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b用于研究不同粘度的荧光谱图的变化情况。

测试方法如下：将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b溶于甲醇，制成探针母液，浓度为5mM；用甲醇和丙三醇配制不同体积比的溶液，得到不同粘度值的测试液，用该测试溶液进一步稀释探针，使其最终浓度为10μM；将上述溶液用荧光光谱仪测试其荧光发射光谱，测试结果见图6。

从图6的(a)中可以看到，探针FMCV-1b在580nm的激发下，随着粘度值从0.68cP增加到881.3cP，705nm处的发射峰荧光强度逐渐增强。从图6的(b)中可以看到，探针FMCV-1b的荧光强度(F)与介质粘度(η)的关系用

方程描述(log F＝k logη+C，其中k为染料相关常数，C为浓度和温度常数)，二者关系呈良好的线性关系，说明探针FMCV-1b能准确检测粘度变化。

实施例5

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b用于研究在不同分析物下的荧光谱图的变化情况。

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b溶于甲醇，制成探针母液，浓度为5mM；然后配制体积比为7:3的标准PBS缓冲液(pH 7.4)和甲醇混合液作为测试溶液，用该测试溶液进一步稀释探针，使其最终浓度为10μM；再分别加入不同的氨基酸和生物体内常见离子的水溶液，包括Ala、Met、Pro、Gly、Glu、Arg、Tyr、Trp、Ser、Thr、Asn、Val、Lle、His、GSH、Hcy、Cys、H₂O₂、ClO^-、HS^-、HSO₃ ^-，使其最终浓度为500μM；在荧光光谱仪上测定荧光光谱(激发波长580nm)，绘制加入不同分析物在645nm和705nm处荧光强度比值的柱状图，见图7。

实验证明，其他氨基酸和生物体内常见离子不干扰体系对Cys的检测，即探针FMCV-1b能够特异性响应Cys。

实施例6

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b用于研究在不同极性的溶剂下的荧光谱图的变化情况。

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b溶于甲醇，制成探针母液，浓度为5mM；然后分别用不同极性的溶剂DCM、MeCN、MeOH、DMSO、DMF、PBS、Glycerol进一步稀释探针，使其最终浓度为10μM；将上述溶液用荧光光谱仪测试其荧光发射光谱(激发波长580nm)，绘制加入在不同溶剂中探针在705nm处的荧光强度柱状图，测试结果见图8。

由图8可以看出，探针FMCV-1b在丙三醇的溶剂中表现出极强的荧光，说明探针能对粘度进行特异性的检测。

实施例7

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b用于研究在不同pH值下的荧光谱图的变化情况。

测试方法如下：将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b溶于甲醇，制成探针母液，浓度为5mM；配制不同pH值(pH＝3.0-10.0)的含30％MeOH的PBS缓冲液(pH 7.4)，用上述缓冲液进一步稀释探针，使其最终浓度为10μM。将上述溶液用荧光光谱仪测试其荧光发射光谱，绘制探针FMCV-1b在不同pH值缓冲液下，在705nm处的荧光强度折线图，测试结果见图9。

由图9可以看出，探针FMCV-1b在不同pH值缓冲液中表现出较稳定的荧光强度，说明探针检测不受pH的影响，能够特异性检测Cys和粘度。

实施例8

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b溶于二甲基亚砜(DMSO)，制成探针母液，浓度为5mM，并将其用于细胞毒性测试。

测试方法如下：分别将消化好的L929、L02、HeLa和4T1细胞悬浮液以每孔1×10⁵个细胞180μL^-1的密度接种于96孔培养板中，放入细胞培养箱培养24小时。在显微镜观察4种细胞密度为80～90％时，向各细胞培养板中的孔中分别加入20μL FMCV-1b(0、2、4、6、8和10μM)后继续培养24小时，然后加入MTT试剂(10μL，5mg/mL MTT)孵育4-6小时。除去细胞上清液，每孔加入100mL DMSO，放置于摇床上低速震荡10-15分钟以充分溶解紫色的甲瓒结晶物。通过酶标仪测试甲瓒在570nm处的吸光度并计算细胞的存活率；细胞存活率表示为实验组平均值与空白组谱图的变化情况。

从图10可以看到，探针FMCV-1b在细胞内的细胞毒性较弱，可用于细胞研究。

实施例9

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b进行共定位实验验证，确定探针FMCV-1b能定位于线粒体。

测试方法如下：将4T1细胞贴壁培养于内含10％胎牛血清的低糖培养液中，在37℃，5％CO₂的饱和湿度孵箱中培养，每隔2-3天更换培养液，并进行传代培养和将细胞移入共聚焦皿中进行培养。取出1个共聚焦皿将里面培养液换成1mL新鲜培养液；用DMSO配制5mM的FMCV-1b探针母液，取1μL于共聚焦皿中与商业探针MTG(5μM)孵育15分钟；再取出1个共聚焦皿将里面培养液换成1mL新鲜培养液，取1μL上述的探针母液于共聚焦皿中与商业探针LTG(5μM)孵育15分钟；将共同染色的4T1细胞进行共聚焦显微镜成像。其中探针FMCV-1b的红色通道激发波长为638nm，荧光收集波长为650-750nm；MTG的激发波长为488nm，荧光收集波长为498-550nm。LTG的激发波长为488nm，荧光收集波长为498-550nm；测试结果见图11所示。

从图11可以看到，荧光探针FMCV-1b与线粒体商业定位试剂的共定位系数为0.92，而与溶酶体商业定位试剂的共定位系数仅为0.45，说明荧光探针FMCV-1b定位于细胞线粒体中。

实施例10

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b进行外源性Cys检测。

测试方法如下：将4T1细胞贴壁培养于内含10％胎牛血清的低糖培养液中，在37℃，5％CO₂的饱和湿度孵箱中培养，每隔2-3天更换培养液，并进行传代培养和将细胞移入共聚焦皿中进行培养。取出3个共聚焦皿将里面培养液换成1mL新鲜培养液，将其中一个共聚焦皿直接加入1μL用DMSO配制5mM的FMCV-1b探针母液孵育30分钟后成像。随后的2个共聚焦皿加入10μL二次蒸馏水配制的浓度为50mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)孵育30分钟消耗细胞中的硫醇后，其中一个共聚焦皿直接加入上述配制的1μL探针母液孵育30分钟后成像，另一个共聚焦皿继续加入5μL二次蒸馏水配制的浓度为20mM的Cys溶液孵育30分钟，然后加入上述配制的1μL探针母液孵育30分钟后成像。绿色通道激发波长为552nm，荧光收集波长为565-630nm，红色通道激发波长为638nm，荧光收集波长为650-750nm。测试结果见图12所示。

由图12可以看出，用NEM处理细胞后，探针FMCV-1b的绿色通道没有荧光，而NEM处理再加入Cys后，探针FMCV-1b的绿色通道明显增强，这说明探针FMCV-1b的绿色通道是响应Cys引起的，即探针FMCV-1b可以检测细胞外源性Cys。

实施例11

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b进行内源性Cys检测。

测试方法如下：将4T1细胞贴壁培养于内含10％胎牛血清的低糖培养液中，在37℃，5％CO₂的饱和湿度孵箱中培养，每隔2-3天更换培养液，并进行传代培养和将细胞移入共聚焦皿中进行培养。取出1个共聚焦皿将里面培养液换成1mL新鲜培养液，向其直接加入1μL用DMSO配制5mM的FMCV-1b探针母液，然后直接监测1h成像。绿色通道激发波长为552nm，荧光收集波长为565-630nm，红色通道激发波长为638nm，荧光收集波长为650-750nm。

由图13可以看出，随着监测时间的增加，绿色通道的荧光强度不断增加，这说明探针FMCV-1b不断地与细胞内的Cys反应，即探针FMCV-1b能够检测内源性的Cys。

实施例12

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b进行细胞粘度检测。

测试方法如下：将4T1细胞贴壁培养于内含10％胎牛血清的低糖培养液中，在37℃，5％CO₂的饱和湿度孵箱中培养，每隔2-3天更换培养液，并进行传代培养和将细胞移入共聚焦皿中进行培养。取1个共聚焦皿直接加入1μL用DMSO配制5mM的FMCV-1b探针母液孵育30分钟后成像。随后取出2个共聚焦皿将里面培养液换成1mL新鲜培养液，分别向2个皿中加入1μL用DMSO配制2mM的制霉菌素(Nys)母液，和1μL用PBS配制的2μg/mL的脂多糖(LPS)母液，孵育30分钟，然后加入1μL用DMSO配制5mM的FMCV-1b探针母液继续孵育30分钟，用共聚焦显微镜成像。红色通道激发波长为638nm，荧光收集波长为650-750nm。测试结果见图14所示。

由图14可以看出，Nys和LPS处理后的细胞红色通道荧光明显增强，说明处理后的细胞粘度增加，探针FMCV-1b能通过红色通道检测细胞粘度的变化。

实施例13

将实施例1制备得到的荧光探针FMCV-1b进行细胞铁死亡中Cys和粘度的同时检测。

测试方法如下：将4T1细胞贴壁培养于内含10％胎牛血清的低糖培养液中，在37℃，5％CO₂的饱和湿度孵箱中培养，每隔2-3天更换培养液，并进行传代培养和将细胞移入共聚焦皿中进行培养。取4个皿分别加入2μL用DMSO配制5mM的索拉非尼母液孵育0、2、4、6小时后再加入1μL用DMSO配制5mM的FMCV-1b探针母液继续孵育30分钟后成像。随后再取2个皿，分别加入2μL用DMSO配制50mM的DFO(铁死亡抑制剂)母液和1μL用DMSO配制5mM的Fer-1(铁死亡抑制剂)母液孵育1小时后，再加入上述索拉非尼母液孵育6小时，最后加入1μL探针FMCV-1b母液孵育30分钟后成像。绿色通道激发波长为552nm，荧光收集波长为565-630nm，红色通道激发波长为638nm，荧光收集波长为650-750nm。

由图15可以看出，随着索拉非尼孵育时间的增加，绿色通道的荧光逐渐减弱，而红色通道的荧光逐渐增加，说明探针FMCV-1b能观察到细胞铁死亡过程中Cys减少而线粒体粘度增加。

最后需要说明的是：以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说，在本发明基础上，可以对其作一些修改和改进。因此，凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进，均属于本发明要求保护的范围之内。

Claims (10)

1.一种同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针，其特征在于，其结构式为：

2.一种权利要求1所述同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针的制备方法，其特征在于，其合成路线如下：

其中，化合物2a-e结构式为：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，化合物1的合成步骤为：将POCl₃滴入超干DMF中，在0℃搅拌反应30分钟；随后，将超干DMF溶解的6-N,N-二甲基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮缓慢加入上述混合液中，100℃条件下加热反应2小时；反应结束后，待反应液冷却至室温，将反应液缓慢倒入饱和K₂CO₃的冰水中，静置30分钟析出固体；最后，将上述混合液进行真空抽滤处理，得到所述化合物1；其中，超干DMF和POCl₃的体积用量比为2:1；6-N,N-二甲基-1,2,3,4-四氢-1-萘酮与POCl₃摩尔用量比为1:4。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式FMCV-1a-e的合成包括如下步骤：将化合物1分别和化合物2a-e溶解于乙酸酐中，随后加入乙酸钠，在80℃搅拌条件下反应2小时；冷却至室温，将反应液经真空旋转蒸发仪旋干，经纯化，即得所述同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，式FMCV-2a-e的合成包括如下步骤：将化合物1分别和化合物2a-e溶解于乙醇中，随后加入吡啶，在80℃搅拌条件下反应4小时；冷却至室温，将反应液经真空旋转蒸发仪旋干，经纯化，即得所述同时检测Cys和线粒体粘度的荧光探针。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，式FMCV-1a-e的合成中，化合物1与化合物2a或2b或2c或2d或2e的摩尔用量比为1:1，乙酸钠与化合物2a或2b或2c或2d或2e的摩尔用量比为1:1，乙酸酐与乙酸钠的用量比为8mL:1mmol。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，式FMCV-2a-e的合成中，化合物1与化合物2a或2b或2c或2d或2e的摩尔用量比为1:2，乙醇与吡啶的用量体积比例为50:1。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，式FMCV-1a-e的合成中，纯化处理的步骤为：以体积比为50:1的二氯甲烷与甲醇混合液为洗脱剂，用200-300目的硅胶层析柱进行纯化。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，式FMCV-2a-e的合成中，纯化处理的步骤为：以体积比为25:1的二氯甲烷与甲醇混合液为洗脱剂，用200-300目的硅胶层析柱进行纯化。

10.权利要求2-9任一项所述制备方法制备得到的荧光探针在检测铁死亡过程中半胱氨酸和线粒体粘度变化的应用，包括如下步骤：

(1)将制备得到的荧光探针溶于甲醇或二甲基亚砜溶剂，制成探针母液；

(2)将步骤(1)所得的探针母液加入到待测液或生物样品中；

(3)将探针母液加入不同线粒体粘度值或不同Cys浓度的待测液中，用荧光光谱仪观察荧光探针的荧光光谱变化；或者将生物样品中的细胞与荧光探针共同孵育，然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像，从而得到荧光探针在细胞内对Cys和线粒体粘度成像的荧光图像。

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