CN113087692B - 一种同时双色双靶向型荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种能双色同时双靶向线粒体和溶酶体的双色型荧光探针,所述荧光探针的制备方法包括:将化合物A和化合物B溶解于乙酸中,随后加入高氯酸,在110℃、氮气保护条件下搅拌反应4小时,反应完成后冷却至室温,经抽滤、纯化后,即得所述pH敏感型荧光探针。本发明还提供了所述荧光探针在鉴别活性细胞和受损伤细胞中的应用以及在显示细胞自噬过程中溶酶体和线粒体形态变化中的应用。与现有相关探针比,本发明的探针可以实现在活细胞中用两种荧光颜色同时成像溶酶体和线粒体,并且该探针具有显色强、操作简单、细胞毒性低的特点,有望在同时研究溶酶体和线粒体相关的疾病和生理过程中得到广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于有机小分子荧光探针制备技术领域,具体涉及一种同时双色双靶向型荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
细胞内的细胞器由于它们的区域化和功能特异化从而具有精确的分工,不同细胞器有着不同的功能,同时又共同作用维持着细胞的稳态。其中,线粒体是细胞的能量供应场所,溶酶体是细胞内的消化场所。线粒体是细胞的动力车间,除了提供细胞能量外,它们还参与许多其他重要的代谢过程,如钙离子的储存、信号和细胞分化、生长、凋亡和死亡;溶酶体是高度动态的细胞器,通过位于溶酶体腔内的成熟酶负责包括蛋白质和脂类在内的细胞内容物的周转。线粒体和溶酶体功能密切相关,对于维持细胞内稳态至关重要,这两种细胞器的功能障碍在功能和遗传上与多种人类疾病有关。线粒体损伤的积累被认为与衰老、癌症和神经退行性疾病有关。因此,维持线粒体的健康种群对于细胞存活至关重要。
在细胞内,受损和过量的线粒体被选择性地通过自噬(有丝分裂)过程消除,以保持线粒体的质量和数量。这一过程涉及溶酶体,溶酶体是负责废物处理的酸性细胞器,能够分解许多类型的废物材料,包括蛋白质、核酸、碳水化合物、脂类和细胞碎片。有丝分裂是一种特殊的自噬形式,通过这种自噬,细胞去除功能失调的线粒体,并以溶酶体依赖的方式回收其成分。在有丝分裂过程中,受损的线粒体被选择性地封闭在自噬体中,自噬体随后与附近的溶酶体融合形成自溶体,其中线粒体成分被降解。因为自噬与维持细胞稳态和多重疾病相关,因此自噬成为近几年研究的热点。
荧光技术由于简单、方便、高分辨率等独特的优势在生物学研究中得到广泛应用。多色标记可以用于同时观察细胞内不同组分,理论上商业定位剂也能实现不同细胞器同时监测,目前溶酶体商业定位剂主要是利用溶酶体内的酸性微环境在探针中引入碱性基团,通过碱性基团质子化的过程实现溶酶体的定位,但是这样的探针会使溶酶体pH升高,使溶酶体发生病变,不能对溶酶体进行长期的跟踪。同样线粒体商业定位剂主要通过线粒体膜电位实现线粒体的定位,但是这样的探针大量堆积会使线粒体膜电位发生改变,从而使线粒体发生病变,也不能对线粒体进行长期跟踪研究,而且线粒体和溶酶体商业定位剂的光稳定性较差,会带来严重的信号干扰,不利于对它们进行长期的跟踪研究。
目前,已经开发出可以同时靶向线粒体和溶酶体的单个荧光探针。但是,这些探针只能发出单一颜色的荧光,同时观察两种细胞器造成了很大的干扰。在实际应用中,仍需要添加另一种可实现多色成像的商业溶酶体或线粒体靶向的探针,不能真正实现商业应用。基于此,开发可同时靶向线粒体和溶酶体且发出不同颜色的单分子双靶标荧光探针以实现同时区分并双色成像线粒体和溶酶体是现阶段科研研究的目标。本发明利用线粒体和溶酶体内pH相差较大的特点,开发了一类微环境激活型探针,从而实现同时双色成像溶酶体和线粒体。
发明内容
针对现有技术存在的不足,本发明的目的在于提供一种能同时双靶向溶酶体和线粒体的双色型荧光探针及其制备方法,所述荧光探针能够同时双色区分成像线粒体和溶酶体,制备方法简单。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
一种同时双色双靶向型荧光探针,其结构式如下:
其中,R=-H、-CH3O或-N(CH3)2,R1=-H或-OH,R2=-H或-OH,R3=-H或-OH。
本发明还提供一种上述同时双色双靶向型荧光探针的制备方法,其合成路线如下:
优选的,所述同时双色双靶向型荧光探针的制备包括如下步骤:将化合物A和化合物B溶解于乙酸中,随后加入高氯酸,在110℃、氮气保护条件下搅拌反应4小时,反应完成后冷却至室温,将反应后的溶液加入冰水中,经抽滤、纯化后,即得所述同时双色双靶向型荧光探针。
优选的,高氯酸的加入方式为缓慢滴加。
优选的,冷却至室温后,倒入冰水中静置观察是否有固体析出,若有固体析出则进行抽滤、纯化,若无固体析出慢慢加入高氯酸,有固体析出后再进行抽滤、纯化。
优选的,化合物A与化合物B的摩尔量比为1:1,乙酸与高氯酸的体积比为4:1。
优选的,所述纯化以体积比为10:1的二氯甲烷与甲醇混合液为洗脱剂,用200-300目的硅胶层析柱进行纯化。
本发明还要求保护由上述方法制备得到的荧光探针在同时双色成像溶酶体和线粒体中的应用。
优选的,所述应用包括如下步骤:
(1)将制备得到的荧光探针溶于二甲基亚砜溶剂,制成探针母液;
(2)将步骤(1)所得的探针母液加入到待测液或生物样品中;
(3)将探针母液加入不同pH值的待测液中,用荧光光谱仪观察荧光探针的荧光光谱变化,或者将生物样品中的细胞与荧光探针共同孵育,然后在荧光显微镜下拍摄荧光图像,从而得到荧光探针在细胞内对线粒体和溶酶体同时双色成像的荧光图像。
优选的,所述生物样品为活细胞。
优选的,所述荧光光谱的变化指的是荧光光谱中,发射波长和荧光强度的变化,而在碱性pH下的发射波长和荧光强度比酸性pH下的大。
优选的,采用激光共聚焦显微镜观察荧光图像,使用激发波长为552nm和638nm的光源激发,收集的波段分别为562-610nm和650-750nm,短波长在溶酶体内定位,长波长在线粒体内定位,定位系数皮尔森系数都在0.9以上。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
(1)本发明利用细胞线粒体和溶酶体的pH可以引起探针的荧光光谱变化的特性(即不同探针对pH的响应灵敏度不同,不同探针的pKa也不相同),实现了线粒体和溶酶体同时双色成像;同时,申请人创造性的发现本申请制备得到的荧光探针在4.5-6.5时上述荧光探针则能实现同时双色成像。
(2)申请人首次提出了一类能同时区分、双色成像线粒体和溶酶体并揭示两者关系的单分子双靶标荧光探针,在溶酶体中呈现红色荧光,在线粒体中显示深红色,克服了现有技术中双色成像线粒体和溶酶体精度不高、干扰多的特点;此外,本申请制备得到的探针也可以被用来揭示不同细胞内中溶酶体和线粒体的形态、大小以及分布,并能原位或动态监测两者之间的关系,具有良好的应用前景。
(3)本发明制备的荧光探针具有显色强、光稳定性强、定位准确,能实现溶酶体和线粒体的长期定位从而实现亚细胞器的长期跟踪。
(4)本发明提供的荧光探针毒性低、生物相容性好,可以减少两种探针共同染溶酶体和线粒体的繁琐操作,并降低由此引起的细胞毒性。
(5)本发明提供的荧光探针的制备方法工艺简单,可操作性强。
附图说明
图1为实施例3制备得到的荧光探针P4的1H NMR图谱;
图2为实施例3制备得到的荧光探针P4的13C NMR图谱;
图3为实施例3制备得到的荧光探针P4对不同pH缓冲液的滴定紫外和荧光谱图变化的测试结果;
图4为本发明制备得到的荧光探针P1-P5的细胞毒性测试结果;
图5为实施例3制备得到的荧光探针P4共定位实验验证结果;
图6为实施例3制备得到的荧光探针P4在不同pH的细胞中荧光变化的测试结果;
图7为实施例3制备得到的荧光探针P4用于监测MG-123诱导细胞自噬时线粒体形态改变的测试结果;
图8为实施例3制备得到的荧光探针P4用于监测MG-123诱导细胞自噬线粒体和溶酶体的荧光强度变化的测试结果。
具体实施方式
下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已,应该说明的是,下述说明仅仅是为了解释本发明,并非对本发明作任何形式上的限制,凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改,等同变化与修饰,均属于本发明技术方案的范围内。
除特殊说明外,本发明所使用的材料、试剂等均从商业途径得到。其中,商业探针LYDG、商业探针MTDG购买自碧云天生物技术公司。
此外,还需要说明的是,按照基团的组合,本申请至少可以如下五种探针,标记为P1~P5。
相应的结构式如下:
实施例1
一种同时双色双靶向型荧光探针,其结构式如下:
本实施例中,所述同时双色双靶向型荧光探针的具体合成步骤为:
取192mg化合物A1(分子式为C11H9ClO,1mmol)和162mg化合物B2(分子式为C10H10O2,1mmol)置于圆底烧瓶中,加入20mL的乙酸和5mL的高氯酸,在氮气保护和110℃下搅拌反应4h,反应完毕后冷却至室温,把反应后的液体加入80mL的冰水中,有固体析出,抽滤得固体,即得粗产物,以体积比为10:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂,用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化,即得荧光探针P1。
实施例2
一种同时双色双靶向型荧光探针,其结构式如下:
本实施例中,所述同时双色双靶向型荧光探针的具体合成步骤为:
取235mg化合物A3(分子式为C13H14NClO,1mmol)和162mg化合物B1(分子式为C10H10O2,1mmol)置于圆底烧瓶中,加入20mL的乙酸和5mL的高氯酸,在氮气保护和110℃下搅拌反应4h,反应完毕后冷却至室温,把反应后的液体加入80mL的冰水中,有固体析出,抽滤得固体,即得粗产物,以体积比为10:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂,用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化,即得荧光探针P3。
实施例3
一种同时双色双靶向型荧光探针,其结构式如下:
本实施例中,所述同时双色双靶向型荧光探针的具体合成步骤为:
取235mg化合物A3(分子式为C13H14NClO,100mmol)和162mg化合物B2(分子式为C10H10O2,100mmol)置于圆底烧瓶中,加入20mL的乙酸和5mL的高氯酸,在氮气保护和110℃下搅拌反应4h,反应完毕后冷却至室温,把反应后的液体加入80mL的冰水中,有固体析出,抽滤得固体,即得粗产物,以体积比为10:1的二氯甲烷与甲醇为洗脱剂,用硅胶(200-300目)层析柱进行纯化,得到200mg蓝紫色固体,即得荧光探针P4。
荧光探针P4的1H NMR谱如图1。1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ10.82(s,1H),8.21(s,1H),8.08(dd,J=15.6,8.8Hz,2H),6.93(dd,J=8.6,2.3Hz,1H),6.87(dd,J=9.1,2.5Hz,1H),6.84(d,J=2.2Hz,1H),6.78(d,J=2.3Hz,1H),3.17(s,6H),2.98(d,J=17.7Hz,8H)。
荧光探针P4的13C NMR如图2。13C NMR(150MHz,DMSO-d6)δ165.10,163.31,161.39,155.16,148.23,145.04,143.92,128.72,127.80,127.58,124.77,117.63,116.05,115.92,112.77,112.37,111.21,27.18,26.74,25.62,25.00。
实施例4
将实施例3制备得到的荧光探针P4用于研究不同pH缓冲液的紫外滴定和荧光谱图的变化情况。测试方法如下:配制不同pH值(3.0-10.0)的含10%EtOH的PBS缓冲液,用上述缓冲液配制含10μM P4的测试溶液,将上述溶液用紫外-可见分光光度计和荧光光谱仪测试其吸收光谱和荧光发射光谱,测试结果见图3。
从图3的A图中可以看到,探针P4在564nm处有一个吸收峰,随着pH值从3.0增加到10.0,吸收峰从564nm红移至595nm;同时,吸光度在564nm处逐渐减少,在595nm处逐渐增大。
从图3的B图中可以看到,在580nm的激发下,随着pH值从3.0增加到10.0,荧光强度增强。
实施例5
按照前述制备方法制备得到探针P1~P5,并将其用于细胞毒性测试。测试方法如下:分别将消化好的HeLa细胞悬浮液以每孔1×105个细胞180μL-1的密度接种于96孔培养板中,放入细胞培养箱培养24小时。在显微镜观察细胞密度为80~90%时向每个孔中分别加入20μL P1~5(0、5、10、15、20和25μM)后继续培养24小时后加入10μL浓度为5mg/mL的MTT试剂,孵育4-6小时。除去细胞上清液,每孔加入100mL DMSO,放置于摇床上低速震荡10-15分钟以充分溶解紫色的甲瓒结晶物。通过酶标仪测试甲瓒在570nm处的吸光度并计算细胞的存活率;细胞存活率表示为实验组平均值与空白组平均值的百分比。测试结果如图4所示。
从图中可以看到,探针在细胞内的细胞毒性较弱。
实施例6
将实施例3制备得到的荧光探针P4进行共定位实验验证,确定探针P4能同时染色溶酶体和线粒体。测试方法如下:将Hela细胞贴壁培养于内含10%胎牛血清的低糖培养液中,在37℃,5%CO2的饱和湿度孵箱中培养,每隔2-3天更换培养液,并进行传代培养和将细胞移入共聚焦皿中进行培养。取出1个共聚焦皿将里面培养液换成1mL新鲜培养液,将2mM的P4探针母液,取1μL于共聚焦皿中与浓度为200nM的商业探针LYDG孵育15分钟;再取出1个共聚焦皿将里面培养液换成1mL新鲜培养液,将2mM的P4探针母液,取1μL于共聚焦皿中与浓度为200nM的商业探针MTDG孵育15分钟;将共同染色的Hela细胞进行共聚焦显微镜成像。其中探针P4的红色通道激发波长为552nm,荧光收集波长为562-610nm;深红色通道激发波长为638nm,荧光收集波长为650-750nm;LYDG的激发波长为488nm,荧光收集波长为498-550nm;MTDG的激发波长为488nm,荧光收集波长为498-550nm。测试结果见图5所示。
从图中可以看到,荧光探针P4可以以红色和深红色同时成像溶酶体和线粒体,在溶酶体和线粒体的共定位系数分别为0.90和0.94。
实施例7
将实施例3制备得到的荧光探针P4用于探究不同pH值的细胞中的荧光变化。
测试方法如下:分别取出3个共聚焦皿,换成1mL的新鲜培养液,将2mM的P4探针母液,取1μL于共聚焦皿中孵育15min,将3个共聚焦皿中培养液分别换成1mL的pH值为5.5、7.0、8.5的PBS溶液,再加入10μL母液浓度为10mM的尼日利亚菌素,共同孵育30min。将共染的Hela细胞进行激光共聚焦成像,短波长的激发波长为552nm,荧光收集波长为562-610nm;长波长的激发波长为638nm,荧光收集波长为650-750nm。测试结果见图6所示。
从图中可以看出,随着pH的增大,552nm激发通道荧光强度逐渐减弱,638nm激发通道荧光强度逐渐增强。
实施例8
将实施例3制备得到的荧光探针P4用于监测MG-123诱导细胞自噬时线粒体形态的改变。
测试方法如下:取一个共聚焦皿将里面的培养液换成1mL新鲜培养液,将2mM的P4探针母液,取1μL于共聚焦皿中孵育15min,然后将培养液吸出换成1mL的PBS,在其中加入10μM MG-123,在活细胞工作站中,用双光子激光共聚焦对细胞进行实时监测。细胞的激发波长为638nm,荧光收集波长为650-750nm。测试结果见图7所示。
从图中可以看出,638nm激发时探针P4定位于线粒体,可以实时监测自噬过程中线粒体的形态由丝状变成颗粒状的改变。
实施例9
将实施例3制备得到的荧光探针P4用于监测MG-123诱导细胞自噬线粒体和溶酶体的荧光强度的变化。
测试方法如下:取一个共聚焦皿将里面的培养液换成1mL新鲜培养液,将2mM的P4探针母液,取1μL于共聚焦皿中孵育15min,然后将培养液吸出换成1mL的PBS,在其中加入20μM MG-123,在活细胞工作站中,用激光共聚焦对细胞进行实时监测。用激光共聚焦对Hale细胞进行成像,短波长的激发波长为552nm,荧光收集波长为562-610nm;长波长的激发波长为638nm,荧光收集波长为650-750nm。测试结果见图8所示。
从图中可以看出,溶酶体通道荧光强度逐渐增强,线粒体通道荧光强度逐渐减弱。
最后需要说明的是:以上实施例不以任何形式限制本发明。对本领域技术人员来说,在本发明基础上,可以对其作一些修改和改进。因此,凡在不偏离本发明精神的基础上所做的任何修改或改进,均属于本发明要求保护的范围之内。
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DE10317817A1 (de) * | 2003-04-16 | 2004-11-04 | Chromeon Gmbh | Pyrrolopyrrole als fluoreszente Marker für Biomoleküle und sphärische Partikel |
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