CN110057804B - 基于n-甲基邻苯二胺盐酸盐的荧光碳点在溶酶体靶向中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于N‑甲基邻苯二胺盐酸盐的荧光碳点在溶酶体靶向中的应用，所述荧光碳点由N‑甲基邻苯二胺盐酸盐溶于无水乙醇中制备得到，该荧光碳点能迅速穿透细胞膜并聚集在溶酶体中，用于活细胞及活体无洗涤溶酶体成像。本发明碳点的合成十分简单，便于操作，且具有荧光基团，具有光稳定性好、量子产率高等优点；本发明能快速进入细胞，并能够天然靶向溶酶体；本发明可在活细胞和活体中进行快速和免洗成像。
Description
技术领域
本发明涉及荧光纳米材料制备领域，具体涉及一种基于N-甲基邻苯二胺盐酸盐的荧光碳点在溶酶体靶向中的应用。
背景技术
溶酶体是几乎存在于所有真核细胞中的单膜结合胞质酸性细胞器。作为细胞的胃，溶酶体在许多生理过程和信号传导途径中起着关键作用，包括细胞内转运、膜循环、内吞、凋亡和自噬。溶酶体功能障碍是溶酶体与神经退行性疾病、脂和葡萄糖代谢紊乱、传染病和多种免疫系统疾病有关。此外，溶酶体在大分子循环、骨重塑、细胞内转运等方面是必不可少的。越来越多的研究集中在溶酶体成像上，以便更好地了解溶酶体的地位和生物学作用。
碳点是一种新型的荧光纳米材料，具有合成容易、成本低、光稳定性好、毒性低、生物相容性好等优点。它能经受长时间光照、多次光激发、酸碱、高盐等多种外界条件的侵蚀。在过度暴露和高浓度的情况下，对活体动物和细胞没有明显的生物毒性，这在生物传感和生物成像领域引起了广泛的关注。溶酶体是最酸性的细胞器（pH 4.5-5.5），由于溶酶体的静电吸引，诸如吗啉和氨基等弱碱性亲脂基团可以在溶酶体中积累和富集。关于碳点固有溶酶体靶向的报道较少，并且存在培养时间长，溶酶体靶向基团后修饰的要求等限制。因此，以CDs为靶点的新型溶酶体是迫切需要的。本发明提供的含有氨基的荧光碳点能迅速穿透细胞膜并聚集在溶酶体中，并可用于活体和固定细胞以及斑马鱼的无洗涤溶酶体成像。
发明内容
本发明提出了一种基于N-甲基邻苯二胺盐酸盐的荧光碳点在溶酶体靶向中的应用，以N-甲基-1,2-苯二胺二盐酸盐反应生成富含氨基的碳点，能迅速穿透细胞膜并聚集在溶酶体中，并可用于活体和固定细胞以及斑马鱼的无洗涤溶酶体成像。
实现本发明的技术方案是：
一种基于N-甲基邻苯二胺盐酸盐的荧光碳点在溶酶体靶向中的应用，所述荧光碳点由N-甲基邻苯二胺盐酸盐溶于无水乙醇中制备得到，该荧光碳点能迅速穿透细胞膜并聚集在溶酶体中，用于活细胞及活体无洗涤溶酶体成像。
所述N-甲基邻苯二胺盐酸盐在无水乙醇中于180℃反应12h制备得到。
其合成路线如下：
。
所述N-甲基邻苯二胺盐酸盐溶于无水乙醇中浓度为0.05mol/L。
所述活细胞为Hela细胞、HepG2细胞、Raw细胞、3t3细胞和HL-7702细胞，活体为野生AB型斑马鱼、野生TU型斑马鱼和野生TL型斑马鱼。
本发明是用于溶酶体靶向的荧光碳点。
上述应用具体包括：
分别观察碳点储存液（即碳点溶于无水乙醇、二甲基亚砜等有机溶剂中）在不同溶剂中荧光强度的变化，荧光碳点的激发波长为430nm。观察碳点孵育的细胞荧光成像图的变化。观察碳点孵育的斑马鱼活体荧光成像图的变化。
荧光光谱的变化为：以430nm光激发时，在不同溶剂中加入碳点储存液，在水溶液中的荧光最低，几乎可以忽略不计，可用于无洗涤成像。
荧光成像图的变化为：用碳点溶液孵育细胞，并用共聚焦显微镜，以激发波长为488 nm光源激发，进行共聚焦成像；用碳点溶液孵育斑马鱼，并用共聚焦显微镜，以激发波长为488 nm光源激发，进行共聚焦成像。
上述应用，具体的，包括以下步骤：
（1）称取碳点，用无水乙醇或其他有机溶剂溶解，准确配制10mg/mL的碳点储存液；
（2）向比色皿中加入2 mL的不同溶剂，加入8μL的碳点储存液，观察荧光强度的变化；
（3）配置不同pH值（2-12）的B-R缓冲溶液，向不同pH的溶液中加入8µL的碳点储存液，观察荧光图谱的变化；
（4）把30μg/mL的荧光碳点与细胞共同孵育，通过共聚焦显微镜观察碳点进入活细胞的时间。
（5）把30μg/mL的荧光碳点与细胞共同孵育10min，通过共聚焦显微镜观察无洗涤成像和洗涤后成像的区别。
（6）把30μg/mL的荧光碳点与细胞共同孵育10min，然后加入溶酶体商染LysoTrackerTM Deep Red，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况。
（7）把30μg/mL的荧光碳点与活体斑马鱼共同孵育10min，通过共聚焦显微镜观察斑马鱼成像。
所述步骤（2）中不同溶剂分别乙酸乙酯、二氯甲烷、二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺、乙二醇、乙醇、乙腈、甲醇和水。
本发明的有益效果是：（1）碳点的合成十分简单，便于操作，且具有荧光基团，具有光稳定性好、量子产率高等优点；（2）本发明能快速进入细胞，并能够天然靶向溶酶体；（3）本发明可在活细胞和活体中进行快速和免洗成像。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是在430nm激发下，40μg/mL碳点在不同pH值的B-R缓冲溶液中的荧光发射光谱图。
图2是在430nm激发下，40μg/mL碳点在565nm处荧光强度随pH值变化图。
图3是30μg/mL碳点进入细胞的时间和荧光强度随时间变化的曲线图。
图4是用PBS洗涤后和无洗涤的30μg/mL碳点细胞成像对比图：(a)共聚焦成像的荧光场（激发波长是488nm，收集波段500nm-600nm）；(b) 共聚焦成像的明场；(c) 共聚焦成像的明场和荧光场的叠加图。
图5是30μg/mL碳点与100nM的溶酶体商染LysoTrackerTM Deep Red的共定位图：(a)碳点共聚焦成像的荧光场（激发波长是488nm，收集波段500nm-600nm）；(b) 商染共聚焦成像的荧光场（激发波长是638nm，收集波段650nm-750nm）；(c) 共聚焦成像的明场和荧光场的叠加图；(d)ROI荧光强度曲线图；(e)共染散点图。
图6是30μg/mL碳点与100nM的溶酶体商染LysoTrackerTM Deep Red的在不同细胞中的共定位图。(A) HepG2细胞，(B) HL-7702细胞，(C) RAW 264.7细胞，(D) 3T3细胞。(a)碳点共聚焦成像的荧光场（激发波长是488nm，收集波段500nm-600nm）；(b) 商染共聚焦成像的荧光场（激发波长是638nm，收集波段650nm-750nm）；(c) 共聚焦成像的明场和荧光场的叠加图；(d)ROI荧光强度曲线图。
图7是斑马鱼与30μg/mL碳点孵育在不同时间（0 min-35min）的成像图（激发波长是488nm,收集波段500nm-600nm）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
碳点的合成，步骤如下：
先称取N-甲基-1,2-苯二胺二盐酸盐固体粉末0.009 g（0.05 mmol），溶解于10 mL无水乙醇中，将其溶液转移至聚四氟乙烯内衬的高压反应釜中，把反应釜置于烘箱中在180℃条件下加热回流12 h，之后将反应釜自然冷却至室温得到棕黑色的溶液。然后用硅胶柱层析法对粗产品进行纯化。以乙酸乙酯为洗脱剂，经真空除溶剂和进一步干燥后，最终得到纯化的碳点。
实施例2
碳点在不同溶剂中的荧光强度变化
向比色皿中分别加入2 mL不同溶剂，加入8µL的碳点储存液，测量荧光图谱。实验结果表明：如表1所示，表1是在430nm激发下，40μg/mL碳点在不同溶剂中的物理数据和荧光强度变化，可以看出碳点在水溶液中的荧光较弱，可以忽略不计，具有细胞成像免洗的潜能。
表1 碳点在不同溶剂中的物理数据和荧光强度变化
实施例3
碳点的快速细胞成像研究
在37 ℃，95 %空气，5 %二氧化碳培养箱中，将Hela细胞接种到含有10 %胎牛血清的激光共聚焦专用培养皿中进行培养。培育24小时后，以激发波长为488 nm光源激发，进行共聚焦成像，观察碳点进入细胞的时间。
如图3所示，在激发波长为488nm能观察到细胞荧光响应；细胞成像数据表明，该碳点能快速进入细胞，具有良好的细胞渗透性。
实施例4
碳点的免洗细胞成像研究
在37 ℃，95 %空气，5 %二氧化碳培养箱中，将Hela细胞接种到含有10 %胎牛血清的激光共聚焦专用培养皿中进行培养。培育24小时后，与30μg/mL的碳点共同孵育10min，用PBS清洗三次后成像；与30μg/mL的碳点共同孵育10min后，直接成像。
如图4所示，实验结果表明，成像过程中洗涤与无洗涤结果并无太大差别，表明碳点具有免洗成像的特质。
实施例5
碳点在不同种类细胞中的成像研究
在37 ℃，95 %空气，5 %二氧化碳培养箱中，将Hela细胞、HepG2细胞、Raw细胞、3t3细胞和HL-7702细胞接种到含有10 %胎牛血清的激光共聚焦专用培养皿中进行培养。培育24小时后，与30μg/mL的碳点共同孵育10min，再用溶酶体商业染料LysoTrackerTM Deep Red孵育20min，进行共聚焦成像。
如图5所示，图5为Hela细胞的共定位图，图6所示为其余细胞的，细胞成像数据表明，该碳点在不同种类细胞中也可靶向溶酶体。
实施例6
碳点的活体成像研究
野生型AB株胚胎购自上海吉尼生物有限公司。在最佳繁殖条件下(28.5℃)培养1日龄斑马鱼胚胎。把30μg/mL的荧光碳点与活体斑马鱼共同孵育10min，以激发波长为488nm光源激发，进行共聚焦成像。
如图7所示，在激发波长为488 nm均能观察到细胞荧光响应。细胞成像数据表明，该碳点能够进行活体成像。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种基于N-甲基邻苯二胺盐酸盐的荧光碳点在溶酶体靶向中的应用，其特征在于：所述荧光碳点由N-甲基邻苯二胺盐酸盐溶于无水乙醇中制备得到，该荧光碳点能迅速穿透细胞膜并聚集在溶酶体中，用于活细胞及活体无洗涤溶酶体成像。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述N-甲基邻苯二胺盐酸盐在无水乙醇中于180℃反应12h制备得到。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述N-甲基邻苯二胺盐酸盐溶于无水乙醇中浓度为0.05mol/L。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述活细胞为Hela细胞、HepG2细胞、Raw细胞、3t3细胞和HL-7702细胞，活体为野生AB型斑马鱼、野生TU型斑马鱼和野生TL型斑马鱼。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于具体步骤如下：
（1）称取荧光碳点，用有机溶剂溶解，配制10mg/mL的碳点储存液；
（2）将30μg/mL碳点储存液与细胞共同孵育10min，通过共聚焦显微镜观察无洗涤成像和洗涤后成像的区别；
（3）将30μg/mL碳点储存液与细胞共同孵育10min，然后加入溶酶体商染LysoTrackerTMDeep Red，通过共聚焦显微镜观察碳点在细胞中的分布情况。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：将30μg/mL碳点储存液与活体共同孵育10min，通过共聚焦显微镜观察活体成像。
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