CN110982513B - 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用 - Google Patents

一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110982513B
CN110982513B CN201911199818.XA CN201911199818A CN110982513B CN 110982513 B CN110982513 B CN 110982513B CN 201911199818 A CN201911199818 A CN 201911199818A CN 110982513 B CN110982513 B CN 110982513B
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
fluorescent carbon
carbon dots
culture solution
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911199818.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN110982513A (zh
Inventor
李朝辉
郭逸菲
孙远强
屈凌波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhengzhou University
Original Assignee
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN201911199818.XA priority Critical patent/CN110982513B/zh
Publication of CN110982513A publication Critical patent/CN110982513A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110982513B publication Critical patent/CN110982513B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/08—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials
    • C09K11/65—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing inorganic luminescent materials containing carbon
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y20/00—Nanooptics, e.g. quantum optics or photonic crystals
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y30/00—Nanotechnology for materials or surface science, e.g. nanocomposites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/02—Use of particular materials as binders, particle coatings or suspension media therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Composite Materials (AREA)
  • Condensed Matter Physics & Semiconductors (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明属于纳米材料制造领域，涉及一种利用微波辅助法制备碳点的方法及应用，特别是指一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用：本发明同时能够检测细胞活性，区分正常细胞与癌细胞以及对肝癌细胞特异性的细胞膜靶向。该方法利用微波辅助法，以柠檬酸，三亚乙基四胺和荧光素为原料，以乙醇为溶剂，DMSO为共溶剂，100‑140℃反应2‑8小时，通过透析、旋蒸，得到荧光碳点。该方法操作简单、原料易得、绿色环保。本发明制备的碳点可同时用于细胞中检测细胞活性，区分正常细胞与癌细胞以及对肝癌细胞特异性的细胞膜靶向。在生物、医疗等领域具有潜在的应用价值。

Description

一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用
技术领域
本发明属于纳米材料制造领域，涉及一种利用微波辅助法制备碳点的方法及其在细胞成像中的应用，特别是指一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用，该荧光碳点集检测细胞活性，区分正常细胞与癌细胞以及在多种癌细胞中特异性区分肝癌细胞三种应用为一体。
背景技术
经过长期的研究，碳点（Carbon Dots， CDs）作为一类粒径较小的新型纳米材料，因其独特的光电性质，在荧光传感、生物标记、癌症诊断、太阳能电池等方面有了广泛的应用。相比于传统的半导体量子点（QDs）和有机染料，碳点原材料来源广泛，环保，具有良好的水溶性以及化学惰性，抗光漂白能力强，光稳定性高，表面易于官能团化，毒性低，生物相容性好制备方法简单等优势在生物标记领域成为研究热点，并被认为是一种最理想的荧光标记和检测材料。（参见：Georgakilas V , Perman J A , Tucek J , et al. Broad Familyof Carbon Nanoallotropes: Classification, Chemistry, and Applications ofFullerenes, Carbon Dots, Nanotubes,Graphene, Nanodiamonds, and CombinedSuperstructures[J]. Chemical Reviews, 2015, 115(11):4744-4822.）。而碳点因其具有低细胞毒性、高稳定性和优异的荧光性质，已成为细胞成像的研究热点，并进一步成为细胞核、溶酶体等细胞器靶向的研究热点。
细胞活性监测是生物学、病理学和医学基础研究的一项重要任务。细胞凋亡和坏死是多细胞生物中两种程序性死亡方式。细胞凋亡是机体清除多余细胞的正常生理过程，不会引起炎症反应。相比之下，坏死则是机体在病理条件下受到损伤而引起的炎症反应。细胞凋亡和坏死在生物活动中是不可缺少的，其作用包括维持细胞数量和去除生物体中不需要的细胞。目前研究发现，线粒体膜电位（MMP）是细胞凋亡和坏死死亡的主要检查点之一。事实上，在特定情况下，另一种细胞器（溶酶体）的通透性也已被证明会启动细胞死亡途径。溶酶体具有多种水解酶，包括蛋白降解的组织蛋白酶和高质子浓度(pH < 5.5)，其负责细胞和细胞外成分的受控循环。与正常细胞相比，癌细胞中的溶酶体数量更多、体积更大、组织蛋白酶活性更强。癌基因驱动的转化改变了癌细胞的溶酶体膜，使其对溶酶体膜渗透(LMP)敏感，LMP一方面通过向细胞外空间释放组织蛋白酶来促进肿瘤的侵袭和进展；而另一方面，癌细胞的溶酶体膜致敏增加了泄漏的易感性，而根据LMP的程度和向细胞质释放的活性组织蛋白酶的数量，可以触发从典型的凋亡到坏死的各种死亡形态。因此，溶酶体被认为是通过溶酶体细胞死亡(LCD)途径选择性杀伤癌细胞的药理靶点。这提示了LMP诱导的具体策略可能导致新的治疗途径。（参见: Tian M, Ma Yy, et al. Fluorescent Probesfor the Visualization of Cell Viability[J]. American Chemical Society, 2019.Zhang H , Liu J , Liu C , et al. Imaging lysosomal highly reactive oxygenspecies and lighting up cancer cells and tumors enabled by a Si-rhodamine-based near-infrared fluorescent probe[J]. Biomaterials, 2017, 133:60-69.）
癌症已被认为是一种绝症，每天都会有大量的人死于癌症。癌症的早期检查与诊断可以大大提高肿瘤的治愈率,减轻患者的痛苦。当癌症被确诊之后,对肿瘤进行及时的治疗非常重要。利用标记物诊断癌症是近年来获得早期诊断的重要研究课题（Javier Hernández, Thompson I M . Prostate-specific antigen: A review of the validation ofthe most commonly used cancer biomarker[J]. Cancer, 2004, 101(5):894-904.）。虽然大量的肿瘤标志物大大提高了诊断，但目前诊断程序的侵入性以及不方便的性质限制了其应用。而荧光碳点的技术因其高分辨率、易操作和非破坏性等特点而成为体内外生物医学研究的有力工具。其较弱的光漂白、较弱的背景荧光、较深的组织穿透，被认为是生物学研究的首选成像方法，促进了细胞生物学的进展。（Ohsaki Y , Shinohara Y , Suzuki M, et al. A pitfall in using BODIPY dyes to label lipid droplets forfluorescence microscopy[J]. Histochemistry & Cell Biology, 2010, 133(4):477-480.）专利CN201710432058.7公开了一种高荧光量子产率的聚合物碳点、制备方法及其在靶向肿瘤细胞检测方面的应用，该聚合物碳点虽然可用于生物成像，作为癌症诊断和治疗的荧光显像材料来使用，但对pH的变化并没有敏感的响应，并不能用于区分不同的癌细胞。本专利申请的碳点在区分正常细胞和癌细胞有着较明显的应用，这对癌细胞的生长、繁殖、转移和靶向治疗具有重要意义。此外，现有癌症的肿瘤细胞多种多样，每种癌细胞有其自己特有的致癌基因。但目前还没有一种方法能够直观的区分各种癌细胞或某一特定的癌细胞。本发明能够在肝癌细胞中特异性的靶向细胞膜。其在区分肝癌细胞和其他癌细胞中具有潜在的应用价值。
荧光素染料以其摩尔消光系数大、荧光量子产率高、光稳定性强等优势在荧光标记、荧光探针等方面具有广泛的应用。将荧光素直接杂化到碳点的内部或表面，可以得到产率高、具有特定识别性质的荧光碳点（CDs）。
发明内容
本发明提出一种荧光碳点的制备方法及在细胞成像中的应用，解决了现有技术无法通过从溶酶体向细胞核核仁的运动，来辨别肝癌细胞和其它癌细胞 的技术问题；以及通过一种荧光碳点，同时可以解决检测细胞活性，区分正常细胞和癌细胞以及在多种癌细胞中区分肝癌细胞的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种荧光碳点的制备方法，步骤如下：
（1）将柠檬酸、三亚乙基四胺和荧光素混合溶于无水乙醇中，加入共溶剂DMSO，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；
（2）将步骤（1）中的微波反应管放置于微波反应器中，使前体溶液在加热条件下进行反应，反应后的产品自然冷却至室温；
（3）经步骤（2）冷却后的产品用6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒，然后用透析膜透析处理，得到纯化后的CDs溶液；
（4）将步骤（3）得到的CDs溶液旋蒸，得到荧光碳点。
所述步骤（1）中柠檬酸、三亚乙基四胺和荧光素的摩尔质量比为1：（1-5）：（1-5）。
所述步骤（2）中加热温度为100-140 ℃，反应时间为2-8 h。
所述步骤（3）中透析袋规格是1 KDa，透析时间为72 h。
所述碳点在460 nm条件下随着pH的增加，荧光强度减弱；520 nm条件下随着pH的增加，荧光强度增强。
所述的荧光碳点在检测细胞活性中的应用，步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A，其中细胞为HeLa细胞、A549细胞、MCF-7细胞，4T1细胞和Raw264.7细胞中的任意一种；
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）将溶酶体染色剂LysoTrackerTM Deep Red加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15 min，得到培养液C；
（4）将溶酶体染色剂MitoTrackerTM Deep Red加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15 min，得到培养液D；
（5）将核染试剂NucRedTM Live 647加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15min，得到混合液E；
（6）将将冰冷的甲醇加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育5 min，得到混合液F；
（7）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
所述的荧光碳点在区分正常细胞与癌细胞中的应用，步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A，其中细胞为3t3细胞或7702细胞；
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
所述的荧光碳点在肝癌细胞特异性的细胞膜靶向中的应用，步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A，其中细胞为HepG-2细胞或SMMC-7721细胞；
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
共聚焦皿中的细胞培养液包括DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
荧光碳点加入后的终浓度为50-100μg/mL。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用微波辅助法，以常见的柠檬酸及三亚乙基四胺为原料，通过加入荧光染料荧光素，成功将荧光染料与碳点直接结合，得到荧光碳点。该类CDs荧光性质优异，制备简单，环境友好。同时，该类碳点可同时用于细胞中检测细胞活性，区分正常细胞与癌细胞以及对肝癌细胞特异性的细胞膜靶向。
2、与其现有的荧光碳点相比，本申请的碳点在细胞成像方面有多重应用。与现有的从线粒体到细胞核的荧光碳点相比，本申请的检测细胞活性是从溶酶体到细胞核核仁，而现有的碳点是从线粒体到细胞核，本申请的荧光碳点指示范围定位更精确靶向性更强。本申请的碳点最大的优势是不仅能够检测细胞活性，同时在对于活的细胞来说，既能够区分正常细胞和癌细胞，也能够区分肝癌细胞和其他癌细胞。在生物、医疗等领域具有巨大的潜在应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1碳点（CDs）制备原理图。
图2为实施例1、2、3和4所制备CDs的紫外吸收光谱图。
图3为实施例1、2、3和4所制备CDs激发发射光谱图。
图4为实施例1制备的CDs的透射电镜图。
图5为实施例1制备的CDs的碳点粒径分布图。
图6为实施例1制备的CDs在不同激发波长下碳点荧光发射图谱（激发波长为420nm，430 nm，440 nm，450 nm，460 nm，470 nm，480 nm，490 nm）。
图7为实施例1制备的CDs在癌细胞中溶酶体靶向识别中的应用，及LysoTrackerTMDeep Red、LysoTrackerTM Deep Red、NucRedTM Live 647染色图和叠加图。
图8为实施例1制备的CDs在固定的HeLa细胞中的细胞成像。
图9为实施例1制备的CDs在3t3正常细胞中的细胞成像。
图10为实施例1制备的CDs在HepG-2肝癌细胞中的细胞成像。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
CDs的制备方法，包括以下步骤：
将30 mg柠檬酸，39 µL三亚乙基四胺和10.4 mg荧光素（摩尔比=1:1:5）混合溶于2mL无水乙醇中，加入20 µLDMSO，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到130oC，反应2 h；得到的产品自然冷却到室温；得到的产品以6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒；用规格是1 KDa的透析膜透析处理72 h，得到纯化后的CDs溶液；将CDs溶液旋蒸，得到CDs固体粉末。CDs溶液的紫外-可见光吸收光谱、激发光谱和荧光发射光谱见附图2-3。由图2可知：本申请的碳点吸收在370 nm和490nm。由图3可知：本申请的碳点发射在461和535 nm；其电镜图及粒径分布图见附图4-5，由图4可知本申请的碳点分散均匀；碳点的平均粒径为8 nm（图5）。其在不同激发下的荧光发射图见附图6，可得出本申请的碳点不具有激发依赖性。
实施例2
CDs的制备方法，包括以下步骤：
将30 mg柠檬酸，78 µL三亚乙基四胺和4.16 mg荧光素（摩尔比=1:2:2）混合溶于2mL无水乙醇中，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到120 ℃，反应6 h；得到的产品自然冷却到室温；将得到的产品以6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒；用规格是1 KDa的透析膜透析处理72 h，得到纯化后的CDs溶液；将CDs溶液旋蒸，得到CDs固体粉末。
实施例3
CDs的制备方法，包括以下步骤：
将30 mg柠檬酸，195 µL三亚乙基四胺和2.08 mg荧光素（摩尔比=1:5:1），配制成前体溶液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将该前体溶液加热到140℃，反应0.5 h；得到的产品自然冷却到室温；将得到的产品以6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒；用规格是1 KDa的透析膜透析处理72 h，得到纯化后的CDs溶液；将CDs溶液旋蒸，得到CDs固体粉末。
实施效果例
CDs应用于细胞中细胞活性检测，包括以下步骤：
将HeLa细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养24h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清，100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）；将CDs配制成溶液加入共聚焦皿中，使终浓度为100 μg/mL ，在37℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h；为了考察CDs对活细胞溶酶体靶向识别功能的准确性，在共聚焦培养皿中加入商业化溶酶体染色剂LysTrackerTM Deep Red，终浓度为50 nM，孵育15 min；与其做对照的培养皿加入商业化线粒体染色剂MtioTrackerTM Deep Redn，终浓度为50 nM，孵育15 mi，以及加入核染试剂NucRedTM Live 647 2 d/mL，孵育15min；移去上述的混合液，用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍，加入新鲜的磷酸盐缓冲液。用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。用波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像，对应为商业化溶酶体染色剂LysTrackerTM DeepRed染色区域，商业化线粒体染色剂MtioTrackerTM Deep Red以及核染试剂NucRedTM Live 640，用波长为638 nm的激光器照射，收取650-750nm范围内的荧光图像，对应为染色区域。结果图片见附图7, 本申请的碳点分别与溶酶体（a1），线粒体（b1）以及细胞核（c1）的商业化染料共染，与溶酶体染料（a2）的共染效果较好，有良好的溶酶体靶向功能；而与线粒体（b2）和细胞核（c2）染料共染效果较差；证明了本申请的碳点具有良好的溶酶体靶向性。为了考察CDs能够实现对细胞活性的检测，在共聚焦培养皿中加入1 mL冰冷甲醇，固定5 min，用波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像。结果图片见附图8，本申请的碳点从靶向活细胞的溶酶体移动到了固定细胞（死细胞）的细胞核核仁。
将3t3细胞接种于共聚焦皿中，在37 ℃、5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养24h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清，100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）；将CDs配制成溶液加入共聚焦皿中，使终浓度为100 μg/mL ，在37oC，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h；为了考察CDs能够区分正常细胞与癌细胞的可行性，用波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像。结果图片见附图9，本申请的碳点全染正常细胞3t3细胞，这明显区别于靶向溶酶体的宫颈癌细胞HeLa细胞。
将HepG-2细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清，100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素）；将pH-CDs配制成溶液加入共聚焦皿中，使终浓度为100 μg/mL ，在37℃，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h；为了考察CDs对肝癌细胞细胞膜靶向识别功能的准确性，用波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像。结果图片见附图10，本申请的碳点染色肝癌细胞HepG-2细胞的细胞膜，这明显区别于靶向溶酶体的宫颈癌细胞HeLa细胞。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光碳点的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）将柠檬酸、三亚乙基四胺和荧光素混合溶于无水乙醇中，加入共溶剂DMSO，配制成前体溶液，放置于微波反应管中；
（2）将步骤（1）中的微波反应管放置于微波反应器中，使前体溶液在加热条件下进行反应，反应后的产品自然冷却至室温；
（3）经步骤（2）冷却后的产品用6000 r/min转速离心处理，去除大颗粒，然后用透析膜透析处理，得到纯化后的CDs溶液；
（4）将步骤（3）得到的CDs溶液旋蒸，得到荧光碳点。
2.根据权利要求1所述的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中柠檬酸、三亚乙基四胺和荧光素的摩尔比为1：（1-5）：（1-5）。
3.根据权利要求1所述的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中加热温度为100-140 ℃，反应时间为2-8 h。
4.根据权利要求1所述的荧光碳点的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中透析膜规格是1 KDa，透析时间为72 h。
5.权利要求1-4任一项制备的荧光碳点，其特征在于：所述碳点在460 nm条件下随着pH的增加，荧光强度减弱；520 nm条件下随着pH的增加，荧光强度增强。
6.权利要求5所述的荧光碳点在非疾病的诊断和治疗为目的的检测细胞活性中的应用，其特征在于，步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A，其中细胞为HeLa细胞、A549细胞、MCF-7细胞，4T1细胞和Raw264.7细胞中的任意一种；
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）将溶酶体染色剂LysoTrackerTM Deep Red加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15min，得到培养液C；
（4）将线粒体染色剂MitoTrackerTM Deep Red加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15min，得到培养液D；
（5）将核染试剂NucRedTM Live 647加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育15min，得到混合液E；
（6）将冰冷的甲醇加入步骤（2）得到的培养液B中，孵育5 min，得到混合液F；
（7）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
7.权利要求5所述的荧光碳点在非疾病的诊断和治疗为目的的区分正常细胞与癌细胞中的应用，其特征在于步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A，其中细胞为3t3细胞或7702细胞；
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
8.权利要求5所述的荧光碳点在非疾病的诊断和治疗为目的的肝癌细胞特异性的细胞膜靶向中的应用，其特征在于步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A，其中细胞为HepG-2细胞或SMMC-7721细胞；
（2）将荧光碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养4 h，得到培养液B；
（3）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞，之后加入新鲜的磷酸盐缓冲液；用激光共聚焦显微镜进行拍摄成像。
9.根据权利要求6、7或8所述的应用，其特征在于：共聚焦皿中的细胞培养液包括DMEM高糖培养基、10%体积百分数的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
10.根据权利要求6、7或8所述的应用，其特征在于：荧光碳点加入后的终浓度为50-100μg/mL。
CN201911199818.XA 2019-11-29 2019-11-29 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用 Active CN110982513B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911199818.XA CN110982513B (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911199818.XA CN110982513B (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110982513A CN110982513A (zh) 2020-04-10
CN110982513B true CN110982513B (zh) 2022-10-04

Family

ID=70088328

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911199818.XA Active CN110982513B (zh) 2019-11-29 2019-11-29 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110982513B (zh)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112461807B (zh) * 2020-11-26 2021-11-19 山西大学 碳量子点在靶向细胞核仁免洗成像中的应用
CN113372907A (zh) * 2021-06-02 2021-09-10 安徽大学 一种光合菌红光碳点及其制备方法和应用
CN113466015B (zh) * 2021-07-20 2024-03-22 湖南智享未来生物科技有限公司 区别正常细胞和癌细胞的染色试剂及其制备方法和应用
CN115386370A (zh) * 2022-08-30 2022-11-25 东南大学 绿色荧光碳点Mis-mPD-CDs在检测细胞核、微生物、动物和溶液pH值的应用
CN115465853B (zh) * 2022-09-07 2023-06-20 西华大学 一种基于柠檬酸和手性2-氨基-1,2-二苯基乙醇橙光碳点及其制备方法与应用
CN116103041B (zh) * 2023-01-19 2024-01-19 河南大学 一种以药物功能保留策略合成的碳点及其制备方法和应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694116A (zh) * 2013-12-06 2015-06-10 中国科学院大连化学物理研究所 一种靶向活细胞线粒体的碳基荧光探针及其制备
CN104927849A (zh) * 2015-07-08 2015-09-23 安徽工业大学 一种高荧光量子产率蓝色荧光碳量子点的绿色合成方法
CN107998389A (zh) * 2017-11-20 2018-05-08 中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所 一种可生物荧光触发的上转换碳量子点-原卟啉ix复合光敏剂及其制备方法
CN108504349A (zh) * 2018-04-03 2018-09-07 郑州大学 一种罗丹明杂化碳点的制备方法及在线粒体靶向识别中的应用
CN109134371A (zh) * 2018-10-10 2019-01-04 东北大学 荧光比率探针及其合成方法和检测细胞内溶酶体甲醛应用
CN110057804A (zh) * 2019-05-24 2019-07-26 郑州大学 基于n-甲基邻苯二胺盐酸盐的荧光碳点在溶酶体靶向中的应用
CN110117492A (zh) * 2019-04-17 2019-08-13 长春工业大学 一种荧光碳点及其制备方法与应用
CN110174387A (zh) * 2019-06-14 2019-08-27 郑州大学 一种荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104694116A (zh) * 2013-12-06 2015-06-10 中国科学院大连化学物理研究所 一种靶向活细胞线粒体的碳基荧光探针及其制备
CN104927849A (zh) * 2015-07-08 2015-09-23 安徽工业大学 一种高荧光量子产率蓝色荧光碳量子点的绿色合成方法
CN107998389A (zh) * 2017-11-20 2018-05-08 中国人民解放军军事医学科学院卫生装备研究所 一种可生物荧光触发的上转换碳量子点-原卟啉ix复合光敏剂及其制备方法
CN108504349A (zh) * 2018-04-03 2018-09-07 郑州大学 一种罗丹明杂化碳点的制备方法及在线粒体靶向识别中的应用
CN109134371A (zh) * 2018-10-10 2019-01-04 东北大学 荧光比率探针及其合成方法和检测细胞内溶酶体甲醛应用
CN110117492A (zh) * 2019-04-17 2019-08-13 长春工业大学 一种荧光碳点及其制备方法与应用
CN110057804A (zh) * 2019-05-24 2019-07-26 郑州大学 基于n-甲基邻苯二胺盐酸盐的荧光碳点在溶酶体靶向中的应用
CN110174387A (zh) * 2019-06-14 2019-08-27 郑州大学 一种荧光碳点在天然靶向溶酶体中的应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A functional preservation strategy for the production of highly photoluminescent emerald carbon dots for lysosome targeting and lysosomal pH imaging;QianQian Zhang等;《Nanoscale》;20181231;第10卷(第30期);第14705-14711页 *
Highly Photoluminescent Carbon Dots for Multicolor Patterning, Sensors, and Bioimaging;Shoujun Zhu等;《Angew. Chem. Int. Ed.》;20130228;第52卷(第14期);第3953-3957页 *
Investigation from chemical structure to photoluminescent mechanism: a type of carbon dots from the pyrolysis of citric acid and an amine;Yubin Song等;《J. Mater. Chem. C》;20151231;第3卷(第23期);第5976-5984页 *
Retrosynthesis of Tunable Fluorescent Carbon Dots for Precise Long-Term Mitochondrial Tracking;Xin Geng等;《Small》;20190604;第15卷(第48期);第1-8页 *
荧光碳点的生物效应及其应用研究进展;胡旭虎等;《中国科学:化学》;20160523;第46卷(第07期);第665-676页 *
高效橘色荧光碳量子点的合成及其在细胞成像中的应用;丁媛媛等;《山西大学学报（自然科学版）》;20181231;第41卷(第04期);第764-771页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110982513A (zh) 2020-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110982513B (zh) 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用
Xu et al. Fluorescent and photoacoustic bifunctional probe for the detection of ascorbic acid in biological fluids, living cells and in vivo
CN110982520B (zh) 一种硼氮共掺杂碳量子点及其制备和应用
Kang et al. A near-infrared fluorescent probe for ratiometric imaging peroxynitrite in Parkinson's disease model
CN105295909A (zh) 一种苯二胺与柠檬酸制备细胞显影用碳量子点标记探针的方法
CN105802611B (zh) 一种比率型纳米硅量子点荧光探针及其制备方法和应用
CN110272734A (zh) 一种用于no检测的高量子产率碳量子点制备方法及其应用
CN112745303B (zh) 一种乏氧荧光探针及其应用
CN113354640B (zh) 一种基于苝酰亚胺的核仁靶向光热试剂的制备方法和应用
CN107469079B (zh) 一种t1-mri成像引导下的光动治疗剂制备方法
CN109369719A (zh) 一种用于碱性磷酸酶检测的分子探针及制备方法与应用
CN105884734A (zh) 一种快速检测硝基还原酶的双光子荧光探针
CN110885675B (zh) 纳米荧光探针及制备方法与其在检测高尔基体中hno的应用
CN112047979A (zh) 荧光探针Mito-HNO及其制备方法与其在检测线粒体中HNO的应用
Zhu et al. Ultra-bright carbon quantum dots for rapid cell staining
CN114736675A (zh) 用于超快细胞染色的碳量子点双光子荧光染料
CN109504363A (zh) 一种近红外二区成像造影剂的制备方法和用途
CN115385861B (zh) 一种荧光探针及其制备方法和应用
CN113461063B (zh) 一种二氧化锰纳米酶的制备方法及其应用
Chen et al. Cytidine mediated AuAg nanoclusters as bright fluorescent probe for tumor imaging in vivo
Luo et al. Highly sensitive and biocompatible tyrosinase sensor based on one-step synthesis of carbon dots
CN109276714A (zh) 一种Zn2+掺杂超小粒径普鲁士蓝纳米探针的制备方法
Zhang et al. Hypochlorite-Activatable Persistent Luminescence Nanoprobe for Assisted Tumor Resection
CN110687087A (zh) 一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用
Yu et al. A highly selective and sensitive upconversion nanoprobe for monitoring hydroxyl radicals in living cells and the liver

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant