CN110687087A - 一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用 - Google Patents
一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110687087A CN110687087A CN201910977175.0A CN201910977175A CN110687087A CN 110687087 A CN110687087 A CN 110687087A CN 201910977175 A CN201910977175 A CN 201910977175A CN 110687087 A CN110687087 A CN 110687087A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- carbon
- adenosine triphosphate
- solution
- rhodamine
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 60
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 title claims abstract description 57
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 title claims abstract description 37
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 title claims abstract description 32
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 13
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 34
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 64
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 64
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 56
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 17
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims description 16
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 15
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims description 12
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 10
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 claims description 10
- VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-tetramine Chemical compound NCCNCCNCCN VILCJCGEZXAXTO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 8
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical group Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 5
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- -1 rhodamine compound Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 2
- MUSLHCJRTRQOSP-UHFFFAOYSA-N rhodamine 101 Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MUSLHCJRTRQOSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N rhodamine 110 Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N)=CC2=[O+]C2=CC(N)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O MYIOYATURDILJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M rhodamine 123 Chemical compound [Cl-].COC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C(C=CC(N)=C2)C2=[O+]C2=C1C=CC(N)=C2 TUFFYSFVSYUHPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 229940043267 rhodamine b Drugs 0.000 claims description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 abstract description 8
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 abstract description 8
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 8
- MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N (1r,4s,5e,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,16s,18r,19s,20r,21e,25s,26r,27s,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trio Polymers O([C@@H]1CC[C@@H](/C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)O[C@H]([C@H]2C)[C@H]1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](C[C@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-WMBHJXFZSA-N 0.000 abstract description 7
- MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N (1s,4r,5z,5'r,6'r,7e,10s,11r,12s,14r,15s,18r,19r,20s,21e,26r,27s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers O([C@H]1CC[C@H](\C=C/C=C/C[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)C(C)C(=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]2C)C1C)CC)[C@]12CC[C@@H](C)[C@@H](CC(C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-DJRUDOHVSA-N 0.000 abstract description 7
- MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N (4Z,18Z,20Z)-22-ethyl-7,11,14,15-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',6,8,10,12,14,16,28,29-nonamethylspiro[2,26-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-4,18,20-triene-27,2'-oxane]-3,9,13-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)\C=C/C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)C\C=C/C=C\C(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-YNZHUHFTSA-N 0.000 abstract description 7
- MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N (5e,5'r,7e,10s,11r,12s,14s,15r,16r,18r,19s,20r,21e,26r,29s)-4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-[(2s)-2-hydroxypropyl]-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers C([C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)/C=C/C(=O)OC([C@H]1C)[C@H]2C)\C=C\C=C\C(CC)CCC2OC21CC[C@@H](C)C(C[C@H](C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-VVXVDZGXSA-N 0.000 abstract description 7
- MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 4-ethyl-11,12,15,19-tetrahydroxy-6'-(2-hydroxypropyl)-5',10,12,14,16,18,20,26,29-nonamethylspiro[24,28-dioxabicyclo[23.3.1]nonacosa-5,7,21-triene-27,2'-oxane]-13,17,23-trione Polymers CC1C(C2C)OC(=O)C=CC(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)C(O)C(C)C(=O)C(C)(O)C(O)C(C)CC=CC=CC(CC)CCC2OC21CCC(C)C(CC(C)O)O2 MNULEGDCPYONBU-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 7
- VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N etoposide Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC([C@@H]2C3=CC=4OCOC=4C=C3[C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H]4O[C@H](C)OC[C@H]4O3)O)[C@@H]3[C@@H]2C(OC3)=O)=C1 VJJPUSNTGOMMGY-MRVIYFEKSA-N 0.000 abstract description 7
- 229960005420 etoposide Drugs 0.000 abstract description 7
- 229930191479 oligomycin Natural products 0.000 abstract description 7
- MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N oligomycin A Polymers O([C@H]1CC[C@H](/C=C/C=C/C[C@@H](C)[C@H](O)[C@@](C)(O)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)/C=C/C(=O)O[C@@H]([C@@H]2C)[C@@H]1C)CC)[C@@]12CC[C@H](C)[C@H](C[C@@H](C)O)O1 MNULEGDCPYONBU-AWJDAWNUSA-N 0.000 abstract description 7
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 abstract description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 2
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 abstract description 2
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 11
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 229960001124 trientine Drugs 0.000 description 7
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 4
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 4
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 230000002132 lysosomal effect Effects 0.000 description 3
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N Adenosine Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 240000000233 Melia azedarach Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012984 biological imaging Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 229910052961 molybdenite Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052982 molybdenum disulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002055 nanoplate Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000005062 synaptic transmission Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
- G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
- G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
- G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
- G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用，该方法以柠檬酸，三亚乙基四胺和罗丹明为原料，以乙醇为溶剂，利用微波辅助法制备碳点，实现了溶酶体中三磷酸腺苷的实时动态检测。该碳点可以应用于实时监测药物（如氯喹、依托泊苷、寡霉素等）刺激诱导的溶酶体内三磷酸腺苷浓度变化。该碳点在溶酶体中三磷酸腺苷的检测、药物筛选和治疗方面具有很大的潜力。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料制造领域，具体涉及一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用。
背景技术
三磷酸腺苷是细胞能量的主要来源，在包括动物和植物在内的所有生物系统中都发挥着重要的作用。溶酶体中的三磷酸腺苷在细胞死亡、凋亡和神经传递中起重要作用。因此，实时监测溶酶体三磷酸腺苷浓度的变化至关重要，这为了解细胞作用机制提供了机会，为治疗这些疾病提供了有用的信息。传统的检测三磷酸腺苷的方法主要有：电泳法、色谱法、比色法等，但这些方法存在操作繁琐，成本高，无法进行细胞内三磷酸腺苷检测等不足。荧光法也逐渐应用于细胞内三磷酸腺苷的检测，比如荧光小分子探针和纳米材料。由于在细胞中的保留时间短，荧光小分子探针通常不能长时间跟踪目标，因此在实时反映细胞ATP的变化时会产生一定限制。纳米材料，例如AuNPs和MoS2纳米板，不能直接识别ATP，需要与适体进一步杂交，纯化过程复杂（参见：Jin F.;Zheng J.;Liu C.; Yang S.; Li Y.; LiJ.; Lian Y.; Yang R. Analyst, 2014, 139, 3714; Jia L.; Ding L.; Tian J.; BaoL.; Hu Y.; Ju H.; Yu J. Nanoscale, 2015, 7, 15953.）。因此，建立一种简便的、长时间的溶酶体中三磷酸腺苷检测方法是很重要的。
碳点因其高稳定性和良好的生物相容性，被广泛应用于传感识别和生物成像领域。然而，目前只有少数的碳点被报道用于三磷酸腺苷检测。但是这些碳点无法直接检测三磷酸腺苷，均需进一步连接三磷酸腺苷适配体，该过程操作复杂且纯化困难。而且报道的碳点均呈蓝色荧光，检测范围较窄，不适合用于细胞内三磷酸腺苷的检测（参见：Cheng X.;Cen Y.; Xu G.; Wei F.; Shi M.; Xu X.; Sohail M.; Hu Q.Microchimica Acta,2018, 185, 144; Luo J.; Shen X.; Li B.; Li X.; Zhou X. Microchimica Acta2018, 185,392.）。因此，合成一种能识别溶酶体中三磷酸腺苷的新型长波发射荧光碳点，以达到实现快速进行三磷酸腺苷实时识别的目的是十分必要的。
发明内容
本发明提出了一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用，该方法操作简单、原料易得、绿色环保。本发明还涉及该碳点的应用，即可以应用于细胞溶酶体中三磷酸腺苷的识别。
实现本发明的技术方案是：
一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法，步骤如下：
（1）将柠檬酸、三亚乙基四胺与罗丹明混合置于无水乙醇中，配制成前体混合物，放置于微波管中；
（2）将步骤（1）中的微波反应管放置于微波反应器中，将前体混合物加热到100-135℃，反应0.1-1 h，反应后的产品自然冷却至室温；
（3）将步骤（2）冷却后的产品放入1KDa透析膜中，在乙醇溶液的环境中透析48 h，得到纯化后的碳点溶液；
（4）利用旋转蒸发仪将步骤（3）得到的碳点溶液中的乙醇去除，得到碳点油状物质；
（5）将步骤（4）中的碳点油状物质溶于蒸馏水中，真空冷冻干燥，得到碳点固体。
所述步骤（1）中罗丹明为罗丹明6G，罗丹明B，罗丹明123，罗丹明101，罗丹明110。
所述步骤（1）中柠檬酸、三亚乙基四胺与罗丹明化合物的摩尔比为（100-2）：（100-2）：1。
所述碳点在体外酸性环境中对三磷酸腺苷进行识别，步骤如下：
（1）将碳点的乙醇溶液稀释在Tris-HCl缓冲中，使终浓度为50 μg/ mL，得到混合液A；
（2）将不同浓度的三磷酸腺苷溶液加入到混合液A中，反应一段时间，得到一系列混合液；
（3）将步骤（2）中的混合液放入荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量荧光强度。
所述步骤（1）中Tris-HCl缓冲溶液的浓度为20 mM，pH范围为4.0-6.5。
所述步骤（2）中三磷酸腺苷溶液的浓度为0-5 mM，反应时间为10-60min。
所述步骤（3）中所用激发波长为420-530 nm。
所述碳点在细胞溶酶体中对三磷酸腺苷进行识别，具体步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24h，得到培养液A；
（2）将碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养0.5-12 h，得到培养液B；
（3）将溶酶体染色剂LysoTrackerTM Deep Red加入到步骤（2）得到的培养液B中，孵育10 min，得到培养液C；
（4）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞；用激光共聚焦显微镜成像系统进行拍摄成像。
所述步骤（1）中细胞为HeLa细胞、HepG-2细胞、RAW264.7细胞、HL-7702细胞和3T3细胞中的任意一种；所述步骤（2）中碳点加入后的浓度为10-100 μg/mL。
本发明的有益效果是：本发明利用微波辅助法，以柠檬酸，三亚乙基四胺和罗丹明类物质为原料，以乙醇为溶剂，通过生成含有罗丹明螺内酰胺荧光团的碳点，以实现酸性环境中三磷酸腺苷的检测。该类碳点荧光性质优异，制备简单，环境友好，对三磷酸腺苷的选择性强。同时，该类碳点可以特异性的靶向细胞溶酶体中的三磷酸腺苷，可以应用于实时监测药物（如氯喹、依托泊苷、寡霉素等）刺激诱导的溶酶体内三磷酸腺苷浓度变化。该碳点在溶酶体中三磷酸腺苷的检测、药物筛选和治疗方面具有很大的潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明合成示意图。
图2为实施例1碳点的TEM图。
图3为实施例4碳点在不同浓度三磷酸腺苷溶液中的荧光发射光谱图。
图4为实施例5碳点在细胞溶酶体中对三磷酸腺苷识别，500-600 nm范围内的荧光图像；溶酶体试剂LysoTrackerTM Deep Red在细胞中的染色，650-750 nm范围内的荧光图像；两个荧光图像及明场的叠加图像；方框内为放大图。
图5为实施例5碳点和溶酶体试剂染色图像划线处的荧光强度。
图6为实施例6在氯喹的刺激下，碳点对溶酶体中三磷酸腺苷的响应图片；方框内为放大图。
图7为实施例6在氯喹的刺激下，不同时间的荧光强度。
图8为实施例7和实施例8在依托泊苷和寡霉素的刺激下，碳点对溶酶体中三磷酸腺苷的响应图片。
图9为实施例7和实施例8在依托泊苷和寡霉素的刺激下，碳点对溶酶体中三磷酸腺苷荧光强度图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
碳点的制备方法，包括以下步骤：
将38 mg柠檬酸，50 μL三亚乙基四胺（三亚乙基四胺溶液 密度为0.982 g/mL, 纯度为60%）和9 mg罗丹明6G（摩尔比为10：10：1）加入2 mL乙醇中，配制成前体混合液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将前体混合液加热到130 ℃，反应15分钟。将得到的产物放入透析袋（1 KDa）中，以无水乙醇为透析环境，透析48小时，得到碳点溶液。用旋转蒸发仪将得到的碳点溶液中的乙醇去除，得到碳点油状物质；溶于蒸馏水中，真空冷冻干燥，得到碳点固体。将得到的碳点固体溶于DMSO中，配成10 mg/mL的溶液；再稀释于无水乙醇中，配成1mg/mL的溶液，作为碳点的储存液。
碳点的合成示意图见附图1。碳点的透射电镜图见附图2，说明碳点形成，并且分散均匀。
实施例2
碳点的制备方法，包括以下步骤：
将38 mg柠檬酸，50 μL三亚乙基四胺和44 mg罗丹明6G（摩尔比2：2：1）加入2 mL乙醇中，配制成前体混合液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将前体混合液加热到135 ℃，反应0.1小时。将得到的产物放入透析袋（1 KDa）中，以无水乙醇为透析环境，透析48小时，得到碳点溶液。用旋转蒸发仪将得到的碳点溶液中的乙醇去除，得到碳点油状物质；溶于蒸馏水中，真空冷冻干燥，得到碳点固体。将得到的碳点固体溶于DMSO中，配成10 mg/mL的溶液；再稀释于无水乙醇中，配成1mg/mL的溶液，作为碳点的储存液。
实施例3
碳点的制备方法，包括以下步骤：
将38 mg柠檬酸，50 μL三亚乙基四胺和0.9 mg罗丹明6G（摩尔比100：100：1）加入2 mL乙醇中，配制成前体混合液，放置于微波反应管中；将微波反应管放置于微波反应器中，将前体混合液加热到100 ℃，反应1小时。将得到的产物放入透析袋（1 KDa）中，以无水乙醇为透析环境，透析48小时，得到碳点溶液。用旋转蒸发仪将得到的碳点溶液中的乙醇去除，得到碳点油状物质；溶于蒸馏水中，真空冷冻干燥，得到碳点固体。将得到的碳点固体溶于DMSO中，配成10 mg/mL的溶液；再稀释于无水乙醇中，配成1mg/mL的溶液，作为碳点的储存液。
实施例4
碳点在体外酸性环境中对三磷酸腺苷识别，包括以下步骤：
将碳点乙醇溶液稀释在Tris-HCl缓冲溶液（20 mM，pH 5.0）中，使终浓度为50 μg/ mL。将不同浓度的三磷酸腺苷溶液（0-5 mM）加入到上述溶液中，反应15 min。将混合液放入荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量碳点的荧光强度。
碳点在不同浓度三磷酸腺苷溶液中的荧光发射光谱见附图3，随着三磷酸腺苷浓度的增加，碳点的荧光强度在逐渐上升。
实施例5
碳点在细胞溶酶体中对三磷酸腺苷识别，包括以下步骤：
将HeLa细胞接种于共聚焦皿中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积分数的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成）；将碳点溶液加入到共聚焦皿中，使终浓度为50 μg/mL，在37 oC、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养2 h；为了考察碳点对溶酶体的靶向功能，在共聚焦皿中加入溶酶体染色剂LysoTrackerTM Deep Red，终浓度为50 nM，孵育10 min；用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液；用激光共聚焦显微镜成像系统进行拍摄成像。波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像，对应为碳点染色区域；用波长为638 nm的激光器照射，收取650-750 nm范围内的荧光图像，对应为溶酶体试剂LysoTrackerTM Deep Red染色区域。结果图片见附图4。碳点染色区域与溶酶体试剂染色区域重叠，且划线部分的荧光强度趋势一致（图5），说明碳点很好的对溶酶体中的三磷酸腺苷发生响应。
实施例6
碳点在细胞溶酶体中对三磷酸腺苷识别，包括以下步骤：
将HeLa细胞接种于共聚焦皿中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积分数的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成）；将碳点溶液加入到共聚焦皿中，使终浓度为50 μg/mL，在37 oC、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养2 h；用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍。为了研究氯喹对溶酶体内三磷酸腺苷浓度影响，将氯喹溶液加入到共聚焦皿中，终浓度为3 μM。每隔4分钟用激光共聚焦显微镜成像系统进行拍摄成像。波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像，对应为碳点染色区域。结果图片见附图6和图7。当氯喹在细胞中孵育后，碳点的荧光强度下降，说明氯喹在一定程度上会使溶酶体中三磷酸腺苷浓度下降。而三磷酸腺苷浓度的变化过程，碳点也可以根据荧光强度的改变而表现出来。
实施例7
碳点在细胞溶酶体中对三磷酸腺苷识别，包括以下步骤：
将HeLa细胞接种于共聚焦皿中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积分数的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成）；将依托泊苷（终浓度为100 μM）加入到共聚焦皿中，孵育15 min；将碳点溶液加入到共聚焦皿中，使终浓度为50 μg/mL，在37 oC、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养2 h；用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍，之后加入新鲜的不含酚红的细胞培养液；用激光共聚焦显微镜成像系统进行拍摄成像。波长为488 nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像，对应为碳点染色区域。结果图片见附图8和9。依托泊苷可以刺激细胞内三磷酸腺苷浓度增加。当依托泊苷加入细胞后，碳点的荧光强度升高，说明碳点可以实时反映出溶酶体中三磷酸腺苷的浓度变化。
实施例8
碳点在细胞溶酶体中对三磷酸腺苷识别，包括以下步骤：
将HeLa细胞接种于共聚焦皿中，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h（细胞培养液包含DMEM高糖培养基、10%体积分数的胎牛血清、100 μg/mL青霉素和100 μg/mL链霉素组成）；将寡霉素（终浓度为3 μg/mL）加入到共聚焦皿中，孵育3 h；将碳点溶液加入到共聚焦皿中，使终浓度为50 μg/mL，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养2h；用磷酸盐缓冲液冲洗细胞3遍；用激光共聚焦显微镜成像系统进行拍摄成像。波长为488nm的激光器照射，收取500-600 nm范围内的荧光图像，对应为碳点染色区域。结果图片见附图8和9。寡霉素可以刺激细胞内三磷酸腺苷浓度下降。当寡霉素加入细胞后，碳点的荧光强度降低，说明碳点可以实时反映出溶酶体中三磷酸腺苷的浓度变化。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法，其特征在于步骤如下：
（1）将柠檬酸、三亚乙基四胺与罗丹明混合置于无水乙醇中，配制成前体混合物，放置于微波管中；
（2）将步骤（1）中的微波反应管放置于微波反应器中，将前体混合物加热到100-135℃，反应0.1-1 h，反应后的产品自然冷却至室温；
（3）将步骤（2）冷却后的产品放入1KDa透析膜中，在乙醇溶液的环境中透析48 h，得到纯化后的碳点溶液；
（4）利用旋转蒸发仪将步骤（3）得到的碳点溶液中的乙醇去除，得到碳点油状物质；
（5）将步骤（4）中的碳点油状物质溶于蒸馏水中，真空冷冻干燥，得到碳点固体。
2.根据权利要求1所述的溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中罗丹明为罗丹明6G，罗丹明B，罗丹明123，罗丹明101，罗丹明110。
3.根据权利要求1所述的溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中柠檬酸、三亚乙基四胺与罗丹明化合物的摩尔比为（100-2）：（100-2）：1。
4.权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的碳点在识别三磷酸腺苷中的应用，其特征在于：所述碳点在体外酸性环境中对三磷酸腺苷进行识别。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于步骤如下：
（1）将碳点的乙醇溶液稀释在Tris-HCl缓冲中，使终浓度为50 μg/ mL，得到混合液A；
（2）将不同浓度的三磷酸腺苷溶液加入到混合液A中，反应一段时间，得到一系列混合液；
（3）将步骤（2）中的混合液放入荧光比色皿中，利用荧光分光光度计，测量荧光强度。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中Tris-HCl缓冲溶液的浓度为20 mM，pH范围为4.0-6.5。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述步骤（2）中三磷酸腺苷溶液的浓度为0-5 mM，反应时间为10-60 min。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述步骤（3）中所用荧光分光光度计的激发波长为420-530 nm。
9.权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的碳点在识别三磷酸腺苷中的应用，其特征在于，所述碳点在细胞溶酶体中对三磷酸腺苷进行识别，具体步骤如下：
（1）将细胞接种于共聚焦皿中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养12-24 h，得到培养液A；
（2）将碳点加入到步骤（1）得到的培养液A中，在37 ℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养0.5-12 h，得到培养液B；
（3）将溶酶体染色剂LysoTrackerTM Deep Red加入到步骤（2）得到的培养液B中，孵育10min，得到培养液C；
（4）用磷酸盐缓冲液冲洗细胞；用激光共聚焦显微镜成像系统进行拍摄成像。
10.根据权利要求10所述的应用，其特征在于：所述步骤（1）中细胞为HeLa细胞、HepG-2细胞、RAW264.7细胞、HL-7702细胞和3T3细胞中的任意一种；所述步骤（2）中碳点加入后的浓度为10-100 μg/mL。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910977175.0A CN110687087B (zh) | 2019-10-15 | 2019-10-15 | 一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910977175.0A CN110687087B (zh) | 2019-10-15 | 2019-10-15 | 一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110687087A true CN110687087A (zh) | 2020-01-14 |
| CN110687087B CN110687087B (zh) | 2021-11-23 |
Family
ID=69112657
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910977175.0A Active CN110687087B (zh) | 2019-10-15 | 2019-10-15 | 一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110687087B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115340867A (zh) * | 2022-08-30 | 2022-11-15 | 东南大学 | 绿色荧光碳点GB-CDs制备方法及在检测线粒体中Fe3+和ATP的应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103421495A (zh) * | 2012-05-23 | 2013-12-04 | 中国科学院理化技术研究所 | 有机功能化的发光碳量子点及其制备方法和用途 |
| CN106543226A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-29 | 湘潭大学 | 一种定位线粒体的atp荧光探针的制备及应用 |
| CN106833629A (zh) * | 2017-01-05 | 2017-06-13 | 东南大学 | 一种线粒体靶向荧光碳点及其制备方法和应用 |
| CN109399607A (zh) * | 2018-11-01 | 2019-03-01 | 新乡医学院 | 一种通过微波法快速合成两亲性碳量子点的制备方法 |
| CN109825291A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-05-31 | 山西大学 | 一种氮硫共掺杂的碳量子点及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-10-15 CN CN201910977175.0A patent/CN110687087B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103421495A (zh) * | 2012-05-23 | 2013-12-04 | 中国科学院理化技术研究所 | 有机功能化的发光碳量子点及其制备方法和用途 |
| CN106543226A (zh) * | 2016-10-31 | 2017-03-29 | 湘潭大学 | 一种定位线粒体的atp荧光探针的制备及应用 |
| CN106833629A (zh) * | 2017-01-05 | 2017-06-13 | 东南大学 | 一种线粒体靶向荧光碳点及其制备方法和应用 |
| CN109399607A (zh) * | 2018-11-01 | 2019-03-01 | 新乡医学院 | 一种通过微波法快速合成两亲性碳量子点的制备方法 |
| CN109825291A (zh) * | 2019-04-09 | 2019-05-31 | 山西大学 | 一种氮硫共掺杂的碳量子点及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JIA HUI LIU ET AL: "Mitochondria-targeting single-layered graphene quantum dots with dual recognition sites for ATP imaging in living cells", 《NANOSCALE》 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115340867A (zh) * | 2022-08-30 | 2022-11-15 | 东南大学 | 绿色荧光碳点GB-CDs制备方法及在检测线粒体中Fe3+和ATP的应用 |
| CN115340867B (zh) * | 2022-08-30 | 2023-10-31 | 东南大学 | 绿色荧光碳点GB-CDs制备方法及在检测线粒体中Fe3+和ATP的应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110687087B (zh) | 2021-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wang et al. | Strong acid-assisted preparation of green-emissive carbon dots for fluorometric imaging of pH variation in living cells | |
| CN110982513B (zh) | 一种荧光碳点的制备方法及其在细胞成像中的应用 | |
| CN105693703B (zh) | 一种用于细胞内溶酶体pH成像的新型比率型荧光探针 | |
| CN106905310B (zh) | 一种检测次氯酸的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN108794475B (zh) | 一种传感酒精的荧光碳点、制备方法及其应用 | |
| CN111286324A (zh) | 一种用于检测水环境中次氯酸根的荧光探针及其制备方法与应用 | |
| CN106892947B (zh) | 一种含有(肼基羰基)二茂铁配体的铱配合物及其制备方法和应用 | |
| CN110272734A (zh) | 一种用于no检测的高量子产率碳量子点制备方法及其应用 | |
| CN109342385A (zh) | 一种用于快速检测食品和环境中亚硝酸盐含量的碳量子点及其应用方法 | |
| CN110358535B (zh) | 基于内滤效应检测硫化氢及活细胞内硫化氢成像的荧光碳点纳米探针及其使用方法 | |
| CN105154065B (zh) | 一种快速专一性识别羟基自由基的荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN112500386A (zh) | 基于吡啰红肟的近红外HClO荧光探针、制备及其应用 | |
| CN112794857B (zh) | 一种可用于亚铁离子检测的荧光探针及制备和应用 | |
| CN110687087B (zh) | 一种溶酶体三磷酸腺苷识别碳点的制备方法及应用 | |
| CN104749369A (zh) | 一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法 | |
| CN105527277B (zh) | 一种雌酮分子印迹电化学发光传感器的制备方法及应用 | |
| CN112444505A (zh) | 一种基于双激发比率型上转换荧光探针的胞内检测方法 | |
| CN110642857B (zh) | 一种用于检测粘度和pH的双功能荧光探针及其制备与应用 | |
| CN111573654A (zh) | 用于检测酸性环境pH的绿色荧光碳量子点及其制备方法 | |
| CN110823848B (zh) | 一种细胞内Ag+的荧光成像方法 | |
| CN111072011B (zh) | 一种线粒体-核仁可逆迁移荧光碳点的制备及在监测细胞活性中的应用 | |
| CN114276356B (zh) | 一种线粒体靶向的荧光探针及其合成方法和应用 | |
| CN112679569B (zh) | 一种荧光探针及其制备方法和应用 | |
| CN113943572B (zh) | 一种用于真菌检测的荧光素碳点染色试剂、染色方法和应用 | |
| CN109369565A (zh) | 一种苯并噻唑衍生物及其制备方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |